可电离的阳离子脂质类似物材料及其在作为药物递送载体中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及可电离的阳离子脂质类似物材料及其在药物递送载体中的应用。


背景技术：

2.生物大分子药物是指利用现代生物技术方法生产的源自生物体内或体外合成用于疾病的诊断、预防或治疗的生物大分子，主要包括蛋白质、多肽、抗体、核酸等，其在生物生命活动中发挥了重要作用。生物大分子药物具有靶点选择性好、效能高，在临床治疗中表现出疗效确切、副作用小的优势，已逐渐成为药物发展的重要研究方向。然而，相较于小分子药物，生物大分子药物存在尺寸和分子量较大，其表面电荷为负或带有正电荷，难以跨过目标细胞的细胞膜，进入细胞内部等问题。为实现生物大分子药物的高效传递，研究者们做了大量的努力，目前已开发了诸多生物大分子药物递送载体，包括脂质体、阳离子高分子、纳米颗粒等，但这些载体仍存在递送效率不高等问题。如何提高生物大分子药物的递送效果，在递送过程中如何保持活性稳定，成功地与体内多种生物屏障相容，实现准确的递送进入细胞发挥作用等问题仍是生物大分子药物递送系统研究的难点和发展方向。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种可电离的阳离子脂质类似物材料，所述阳离子脂质类似物材料能够高效实现生物大分子药物的胞内递送。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
5.一种可电离的阳离子脂质类似物材料，其具有如式(i)所示结构：
[0006][0007]
式(i)中，m1独立地选自支链烷基、苯基或含杂原子的芳香基；
[0008]
m2为r1为烷基，r2为烷基，r3为烷基或苯基，或r2与r3连接为环基或杂环基；
[0009]
m3独立地选自直链烷基、直链烯基或
[0010]
m4独立地选自直链烷基、含醚键的直链烷基或含有含n杂环的烷基。
[0011]
本发明的阳离子脂质类似物材料中，m2含有叔胺基团，保证了材料具有ph敏感性和正电荷可调性； m3含有直链烷基、直链烯基或通过调控其链长，可以调控材料的疏水性。本发明通过合理化设计，合成制备了上述一系列阳离子脂质类似物材料，该阳离子脂质类似物材料能够与蛋白质、核酸等生物大分子药物结合并形成复合物，实现生物大分
子药物的高效胞内递送。
[0012]
本发明的阳离子脂质类似物材料作为药物尤其是生物大分子药物胞内递送的载体，递送效率高，递送过程中对细胞产生的毒性小，药物递送至细胞内仍可以保持药物的生物活性。并且，本发明的阳离子脂质类似物材料作为载体材料能够对多种蛋白质、核酸分子适用，是一种具有普适性的高效生物大分子药物胞内递送载体。
[0013]
进一步地，上述式(i)中，m1为被取代基α取代的烷基、苯基或含杂原子的芳香基，所述取代基包括甲基，更进一步地，m1为
[0014]
进一步地，上述式(i)中，m2为为m2更优选为所获得的阳离子脂质类似物材料的细胞内蛋白递送效率较高。
[0015]
进一步地，上述式(i)中，m3为碳原子数为7-19的直链烷基、碳原子数为17的直链烯基或进一步地，m3为为
[0016]
进一步地，上述式(i)中，m4为碳原子数为6的直链烷基、碳原子数为4-8的含醚键的直链烷基或含有含n杂环的烷基，进一步地，m4为为所获得的阳离子脂质类似物材料的细胞内蛋白递送效率较高。
[0017]
进一步地，所述的阳离子脂质类似物材料具有如下72种结构中的任一种：
[0018]
[0019][0020]
发明人经过试验发现，上述筛选得到的72种小分子阳离子脂质类似物材料可与蛋白模型药物共组装形成尺寸小、稳定的纳米复合物，实现多种正、负电性蛋白质的胞内递送，且递送至细胞内的蛋白质能够保持着生物活性，具有治疗效果。另外，这72种小分子阳离子脂质类似物材料还可以与多种核酸分子结合形成纳米颗粒，实现高效的质粒dna、mrna和sirna的胞内递送。
[0021]
本发明还提供了上述阳离子脂质类似物材料的制备方法，具体方法为：将醛类化合物和胺类化合物加入到有机溶液中，反应10-120min后依次加入羧酸类化合物和异氰化合物，并于4-60℃反应6-72h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，得到所述阳离子脂质类似物材料。
[0022]
本发明采用醛类化合物、胺类化合物、羧酸类化合物和异氰化合物为原料，通过ugi反应合成小分子阳离子脂质类似物材料。本发明的阳离子脂质类似物材料的反应条件温和，合成工艺简单、稳定性好，合成的小分子阳离子脂质类似物材料毒性低，可将多种药物高效递送到细胞内。
[0023]
进一步地，在所述阳离子脂质类似物材料的制备方法中，采用甲醇和二氯甲烷的
混合液作为流动相的条件下进行色谱柱分离。
[0024]
进一步地，在所述阳离子脂质类似物材料的制备方法中，所述醛类化合物、胺类化合物、羧酸类化合物和异氰化合物的摩尔比为0.1-1:0.1-1:0.1-1:0.1-1；更进一步地，摩尔比为1:1:1:0.5。
[0025]
进一步地，在所述阳离子脂质类似物材料的制备方法中，所述醛类化合物选自如下化合物a1-a3中的任一种：
[0026][0027]
更进一步地，所述醛类化合物为化合物a1；
[0028]
所述胺类化合物选自如下化合物r1-r11中的任一种：
[0029][0030]
所述羧酸类化合物选自如下化合物chs、c18-1、c18-2或c8-c20中的任一种：
[0031][0032]
所述异氰化合物选自如下化合物i1、i2-1、i2、i2-3、i3中的任一种：
[0033][0034]
本发明还提供了上述阳离子脂质类似物材料在作为药物载体中的应用。本发明的小分子阳离子脂质类似物材料能够通过与多种蛋白质相互作用形成稳定且利于细胞摄入的复合物，该复合物能够有效的通过细胞融合和/或细胞内吞等途径跨过细胞膜，并且避开和/或逃逸了内涵体，将蛋白质递送到细胞内，且递送至细胞内的蛋白质仍保留生物学活性，同时阳离子脂质类似物材料在递送过程中没有对细胞产生毒性，具有优异的生物相容性。此外，本发明的阳离子脂质类似物材料还可以高效结合质粒dna、mrna、sirna 等核酸分子，且其在多种细胞上可递送不同的质粒dna，均具有较高的转染效率，甚至达到或高于目前商业化转染试剂的水平。可见，本发明设计的阳离子脂质类似物材料可作为药物特别是生物大分子的胞内递送载体，为生物大分子药物的治疗应用提供了有效的工具。
[0035]
本发明还提供了一种药物递送系统，所述药物递送系统包括载体以及包裹或装载于所述载体的药物，所述载体选用上述的阳离子脂质类似物材料。
[0036]
所述药物递送系统对于药物的种类没有限制，包括但不限于生物药物、化学药物中的一种或两种，具体地，所述生物药物包括但不限于核酸、多肽、蛋白和疫苗中的一种或多种；所述化学药物包括但不限于抗肿瘤小分子药物、荧光素和淋巴示踪剂中的一种或多种。
[0037]
为进一步提高所述药物递送系统的靶向性和递送效果，所述载体还可以直接复合或化学缀合靶向性配基，具体地，所述靶向性配基包括但不限于寡核苷酸类适配子、抗体分子、抗体片断、天然产生的受体表面结合物或多肽等。所述靶向性配基可以采用一种或多种化学修饰方式制备或合成，其中化学修饰方式包括但不限于氟代修饰、甲氧基修饰、氨基修饰、锁核酸、糖基化、氨基化或磷酸化等修饰形式。
[0038]
在不对本发明产生不利影响的范围内，所述药物递送系统还可以进一步含有任选的药学上可接受的辅料以制备成溶液型液体制剂、高分子溶液剂、乳剂、混悬剂、散剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂等给药制剂，所述辅料包括但不限于赋形剂、粘合剂、稀释剂和崩解剂中的一种或多种。
[0039]
需要说明的是，本文所用术语“递送”或者“胞内递送”指的是使药物从细胞的外部进入到细胞的内部，使其局限在细胞溶质中或在细胞的细胞器内。
[0040]
本文所用术语阳离子脂质类似物材料与蛋白质和核酸等生物大分子药物“复合”或者阳离子脂质类似物材料与生物大分子形成“复合物”指的是阳离子脂质类似物材料与蛋白质、核酸等生物大分子药物间的相互作用，其足够稳定以使生物大分子药物与阳离子脂质类似物材料结合从而将其递送到细胞内。
[0041]
本文所用术语“纳米颗粒”是粒径不超过1μm的颗粒。
[0042]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0043]
本发明采用醛类化合物、胺类化合物、羧酸类化合物和异氰化合物为原料，通过ugi反应合成小分子阳离子脂质类似物材料。本发明的阳离子脂质类似物材料的反应条件温和，合成工艺简单、稳定性好，合成得到的小分子阳离子脂质类似物材料生物相容性良好，能够实现多种药物安全、高效的胞内递送。
附图说明
[0044][0045]
图1为阳离子脂质类似物材料i2-1r2c18a1的质谱(a)和核磁共振氢谱(b)。
[0046]
图2为阳离子脂质类似物材料i2r2c18a1的质谱(a)和核磁共振氢谱(b)。
[0047]
图3为阳离子脂质类似物材料i2-3r2c18a1的质谱(a)和核磁共振氢谱(b)。
[0048]
图4为不同阳离子脂质类似物材料递送bsa-fitc后hela细胞内的荧光标记蛋白平均荧光强度。实验中i1r1c12a1、i2r1c14a1和i2r3c16a1的剂量为1微克/孔；i1r2c14a1、i1r2c16a1、i1r2c18a1、 i1r3c18a1、i1r11c18a1、i2r1c12a1、i2r1c20a1、i2r2c16a1、i2r3c18a1、i2r11c14a1、i2r11c16a1 和i2r11c18a1的剂量为2微克/孔；i1r3c14a1、i1r3c16a1、i1r3c20a1、i1r11c14a1、i1r11c16a1、 i1r11c20a1、i2r2c18a1、i2r2c20a1、i2r3c20a1和i2r11c20a1的剂量为4微克/孔；i1r1c14a1、 i1r1c16a1、i1r1c18a1、i1r1c20a1、i1r2c12a1、i1r2c20a1、i1r3c12a1、i1r5c12a1、i1r5c14a1、 i1r5c16a1、i1r5c18a1、i1r5c20a1、i1r11c12a1、i2r1c16a1、i2r1c18a1、i2r2c12a1、i2r2c14a1、 i2r3c12a1、i2r3c14a1、i2r5c12a1、i2r5c14a1、i2r5c16a1、i2r5c18a1、i2r5c20a1和i2r11c12a1 的剂量为8微克/孔。bsa-fitc的剂量为2微克/孔。
[0049]
图5为不同阳离子脂质类似物材料递送bsa-fitc后hela细胞的荧光标记蛋白阳性率。其中，实验条件分别与图4描述的保持一致。
[0050]
图6为具有不同烷基链长度的阳离子脂质类似物材料递送bsa-fitc后hela细胞内的荧光标记蛋白的平均荧光强度。其中，阳离子脂质类似物的剂量为4微克/孔，bsa-fitc的剂量为2微克/孔。
[0051]
图7为i2-1r2c18a1、i2r2c18a1以及i2-3r2c18a1对应的bsa-fitc胞内递送效率(a)以及相应复合物的粒径分布(b)。
[0052]
图8为i2-1r2c18a1递送bsa-fitc至不同类型的细胞的激光共聚焦结果。
[0053]
图9为i2r2c16a1、i2r2c17a1、i2r2c18a1、i2r2c19a1、i2r2c20a1及其分别与bsa-fitc复合物的细胞毒性结果。
[0054]
图10为i2r2c18a1、i2-1r2c18a1以及阳性对照对负电荷蛋白藻红蛋白的胞内递送效率。
[0055]
图11为i2-1r2c18a1对负电荷蛋白超氧化物歧化酶的胞内递送效率。
[0056]
图12为i2-1r2c18a1对负电荷蛋白卵清蛋白的胞内递送效率。
[0057]
图13为i2-1r2c18a1对负电荷蛋白绿色荧光蛋白的胞内递送效率。
[0058]
图14为i2-1r2c18a1对正电荷蛋白细胞色素c的胞内递送效率。
[0059]
图15为i2-1r2c18a1对正电荷蛋白溶菌酶的胞内递送效率。
[0060]
图16为递送蛋白β-半乳糖酶后hela细胞内的β-半乳糖酶的活性结果。其中，阳离子脂质类似物的剂量为4微克/孔，β-半乳糖酶的剂量为4微克/孔。
[0061]
图17为i2-1r2c18a1递送蛋白皂草素后hela细胞的细胞活性结果。其中，阳离子脂质类似物的剂量为3微克/孔。
[0062]
图18为不同阳离子脂质类似物材料转染表达gfp的质粒dna的阳性率结果。其中i2r11c14a1和 i2r11c18-2a1的剂量为0.5微克/孔；i1r2c14a1、i2r1c16a1、i2r1c18a1、i2r1c18-1a1、i2r1c18-2a1、 i2r2c18-2a1、i2r3c14a1、i2r3c16a1和i2r3c18-2a1的剂量为1微克/孔；i1r2c16a1、i1r2c18-1a1、 i1r2c18-2a1、i1r3c14a1、i1r3c16a1、i1r3c18-2a1、i1r11c14a1、i1r11c16a1、i1r11c18a1、 i1r11c18-1a1、i1r11c18-2a1、i2r1c14a1、i2r2c14a1、i2r2c16a1、i2r2c18-1a1、i2r3c18a1、 i2r3c18-1a1和i2r11c16a1的剂量为2微克/孔；i1r1c16a1、i1r2c18a1、i1r3c12a1、i1r3c18a1、 i1r3c18-1a1、i1r11c12a1、i2r2c18a1、i2r11c12a1、i2r11c18a1和i2r11c18-1a1的剂量为4微克/ 孔；i1r1c12a1、i1r1c14a1、i1r1c18a1、i1r1c18-1a1、i1r1c18-2a1、i1r2c12a1、i1r5c12a1、 i1r5c14a1、i1r5c16a1、i1r5c18a1、i1r5c18-1a1、i1r5c18-2a1、i2r1c12a1、i2r2c12a1、i2r3c12a1、 i2r5c12a1、i2r5c14a1、i2r5c16a1、i2r5c18a1、i2r5c18-1a1和i2r5c18-2a1的剂量为8微克/孔。
[0063]
图19为不同阳离子脂质类似物材料转染表达荧光素酶的质粒dna后，hela细胞的荧光素酶表达量的检测结果。
[0064]
图20为不同添加量的i2r3c18-1a1转染表达gfp的质粒dna至不同类型细胞的激光共聚焦结果。
[0065]
图21为不同阳离子脂质类似物材料转染egfp-mrna的阳性率结果。其中i1r2c14a1、i1r2c18-1a1、i1r2c18-2a1、i1r11c14a1、i2r2c14a1、i2r2c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c16a1、i2r3c18a1、 i2r3c18-1a1、i2r3c18-2a1、i2r11c14a1、i2r11c16a1、i2r11c18-1a1和i2r11c18-2a1的剂量为1 微克/孔；i1r1c12a1、i1r1c14a1、i1r1c16a1、
i1r1c18a1、i1r1c18-1a1、i1r1c18-2a1、i1r2c12a1、 i1r2c16a1、i1r2c18a1、i1r3c12a1、i1r3c14a1、i1r3c16a1、i1r3c18a1、i1r3c18-1a1、i1r3c18-2a1、 i1r5c12a1、i1r5c14a1、i1r5c16a1、i1r5c18a1、i1r5c18-1a1、i1r5c18-2a1、i1r11c12a1、i1r11c16a1、 i1r11c18a1、i1r11c18-1a1、i1r11c18-2a1、i2r1c12a1、i2r1c14a1、i2r1c16a1、i2r1c18a1、 i2r1c18-1a1、i2r1c18-2a1、i2r2c12a1、i2r2c16a1、i2r2c18a1、i2r3c12a1、i2r3c14a1、i2r5c12a1、 i2r5c14a1、i2r5c16a1、i2r5c18a1、i2r5c18-1a1、i2r5c18-2a1、i2r11c12a1和i2r11c18a1的剂量为2微克/孔。
[0066]
图22为不同阳离子脂质类似物材料转染egfp-mrna的平均荧光强度。其中，实验条件与图21保持一致。
[0067]
图23为i2r2c18-2a1、i2r3c18-2a1、i2r11c18-2a1转染egfp-mrna至dc2.4细胞的激光共聚焦结果，商品化转染试剂lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0068]
图24为不同添加量的i2r2c18-1a1、i2r3c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c18-2a1转染sirna的基因沉默结果。
具体实施方式
[0069]
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0070]
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071]
实施例1阳离子脂质类似物材料的合成与表征
[0072]
本发明的阳离子脂质类似物材料的合成路线为：
[0073][0074]
其中，胺类化合物m
2-nh2为如下化合物r1-r11中的任一种；羧酸类化合物为如下化合物 c8-c20、chs中的任一种；醛类化合物为如下化合物a1-a3中的任一种；异氰化合物为如下化合物i1-i3中的任一种；
[0075][0076]
本实施例的阳离子脂质类似物材料的制备方法具体为：分别将1mmol的异丁醛和1mmol的胺类化合物加入到0.5ml甲醇溶液中，反应60min后依次加入1mmol羧酸类化合物和0.5mmol异氰化合物，并于40℃反应12h，反应结束后经层析色谱柱分离提纯产物，其中，流动相采用甲醇和二氯甲烷的混合液。
[0077]
本实施例采用的原料及合成的阳离子脂质类似物材料结构如表1所示。
[0078]
表1
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096][0097]
选取阳离子脂质类似物i2-1r2c18a1、i2r2c18a1和i2-3r2c18a1作为代表材料，并对其结构进行表征。其中，i2-1r2c18a1的质谱和核磁共振氢谱的谱图如图1所示；i2r2c18a1的质谱和核磁共振氢谱的谱图如图2所示；i2-3r2c18a1的质谱和核磁共振氢谱的谱图如图3所示。核磁共振氢谱和质谱的结果与预期阳离子脂质类似物材料的结构一致。
[0098]
实施例2
[0099]
本实施例以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(bsa-fitc)作为蛋白模型研究阳离子脂质类似物材料在细胞内蛋白递送方面的应用效果。
[0100]
具体实验方法如下：提前将hela细胞接种在24孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，将不同的阳离子脂质类似物材料(0.25-8微克/孔)分别与bsa-fitc(2微克/孔)在50微升hepes缓冲液中混合后，再稀释到450微升无血清的dmem培养基中，即可得到蛋白/阳离子脂质类似物复合物溶液。将hela细胞的培养基去掉，使用pbs清洗一遍后加入蛋白/阳离子脂质类似物复合物溶液，培养4小时后，采用流式细胞仪分析细胞内的荧光强度以及阳性细胞率。本实验以商品化蛋白递送试剂作为阳性对照。
[0101]
图4～5结果显示，本发明的阳离子脂质类似物材料在胞内递送bsa-fitc方面均具有一定效果，尤其是异氰化合物为i2，胺类化合物为r2、r3或r11时，所合成的多数阳离子脂质类似物材料的递送效率明显优于商品化蛋白递送试剂
[0102]
本实验以i2r2c14a1、i2r2c15a1、i2r2c16a1、i2r2c17a1、i2r2c18a1、i2r2c19a1、和i2r2c20a1 作为代表，比较具有不同长度的烷基链的阳离子脂质类似物材料的细胞蛋白平均荧光强度。图6结果表明，本发明可通过增加羧酸类化合物的烷基链长度来调整阳离子脂质类似物材料的疏水性，且阳离子脂质类似物材料的细胞内蛋白递送效率也随着烷基链长度的增加而提高，并在羧酸类化合物的烷基链的碳原子数为 18时达到平台值。
[0103]
本实验以i2-1r2c18a1、i2r2c18a1和i2-3r2c18a1作为代表，测定了蛋白/阳离子脂质类似物复合物的粒径，由图7结果可知，i2-1r2c18a1、i2r2c18a1以及i2-3r2c18a1均具有较好的细胞内蛋白递送效率(阳离子脂质类似物剂量为4微克/孔，bsa-fitc的剂量为2微克/孔)，并且其与bsa蛋白质形成尺寸较小且分布均一的复合物，复合物的粒径约为500纳米。
[0104]
实施例3i2-1r2c18a1在不同类型细胞内蛋白递送效果
[0105]
本实验以i2-1r2c18a1作为代表性的阳离子脂质类似物材料，探究阳离子脂质类似物材料在不同类型细胞内的蛋白递送效果。
[0106]
本实验参照实施例2的方法制备bsa-fitc/i2-1r2c18a1复合物溶液，其中i2-1r2c18a1为4微克/ 孔，bsa-fitc为4微克/孔，分别在人肾上皮细胞(hek-293t)、人胰腺癌细胞(bxpc3)、小鼠巨噬细胞 (raw 264.7)、小鼠树突状细胞(dc 2.4)、人脐静脉内皮细胞(huvec)、小鼠间充质干细胞(msc) 中加入bsa-fitc/i2-1r2c18a1复合物溶液，培养4小时后，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内的fitc 荧光信号。
[0107]
图8结果表明，i2-1r2c18a1可转染bsa-fitc至上皮细胞：人肾上皮细胞(hek-293t)；癌细胞：人胰腺癌细胞(bxpc3)；免疫细胞：小鼠巨噬细胞(raw 264.7)、小鼠树突状细胞(dc 2.4)；内皮细胞：人脐静脉内皮细胞(huvec)以及干细胞：小鼠间充质干细胞(msc)。可见，i2-1r2c18a1在不同类型的细胞内均展现出良好的蛋白递送效果。
[0108]
实施例4阳离子脂质类似物材料及其蛋白复合物的细胞毒性测试
[0109]
本实验选择蛋白递送效率较高的i2r2c16a1、i2r2c17a1、i2r2c18a1、i2r2c19a1、i2r2c20a1作为代表性的阳离子脂质类似物材料，用mtt实验检测蛋白/阳离子脂质类似物对hela细胞的毒性，具体实验方法为：hela细胞铺在96孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，随后将细胞培养基去掉，换成1 微克/孔的阳离子脂质类似物材料或bsa-fitc/阳离子脂质类似物复合物(阳离子脂质类似物材料与 bsa-fitc的质量比为2:1)并培养4小时，然后将材料洗掉，并换成dmem培养基培养20小时，最后使用mtt检测细胞存活率。
[0110]
图9结果表明，本发明的阳离子脂质类似物材料及其蛋白复合物具有良好的生物
相容性。
[0111]
实施例5阳离子脂质类似物材料对不同蛋白质的胞内递送效果
[0112]
本实验研究了阳离子脂质类似物材料分别对藻红蛋白(r-pe)、超氧化物歧化酶、卵清蛋白、绿色荧光蛋白、细胞色素c和溶菌酶的胞内递送效果，本实验参照实施例2的方法制备蛋白/阳离子脂质类似物复合物溶液，并研究其在hela细胞内的递送效果。
[0113]
其中，i2r2c18a1、i2-1r2c18a1以及阳性对照对负电荷蛋白藻红蛋白的递送效果如图10 所示；i2-1r2c18a1对负电荷蛋白超氧化物歧化酶的递送效果如图11所示；i2-1r2c18a1对负电荷蛋白卵清蛋白的递送效果如图12所示；i2-1r2c18a1对负电荷蛋白绿色荧光蛋白的递送效果如图13所示； i2-1r2c18a1对正电荷蛋白细胞色素c的递送效果如图14所示；i2-1r2c18a1对正电荷蛋白溶菌酶的递送效果如图15所示。上述结果表明，本发明的阳离子脂质类似物材料可以将不同分子量、不同带电性质的蛋白质，例如牛血清白蛋白、藻红蛋白、超氧化物歧化酶、卵清蛋白、绿色荧光蛋白、细胞色素c以及溶菌酶高效递送进入细胞，可见本发明的阳离子脂质类似物材料在蛋白药物胞内递送方面具有普适性。
[0114]
实施例6 i2-1r2c18a1递送β-半乳糖酶(β-gal)并检测其在细胞内的活性
[0115]
hela细胞与β-gal、β-gal/pulsin或β-gal/i2-1r2c18a1培养4小时后，使用pbs清洗细胞；按照说明书使用β-半乳糖酶原位检测试剂盒检测细胞内的β-半乳糖酶的活性。本实验以商品化的蛋白转染试剂作为阳性对照。
[0116]
维持化合物的生物活性是生物活性分子递送的重要原则。由图16结果可知，i2-1r2c18a1可以将β-gal 高效递送至细胞中并维持其生物学活性，且效果显著优于商品化蛋白递送试剂
[0117]
实施例7 i2-1r2c18a1递送皂草素(saporin)至hela细胞并检测细胞活性
[0118]
hela细胞与saporin或saporin/i2-1r2c18a1孵育4小时后，换成完全培养基后继续培养20小时，使用mtt法检测细胞活性。
[0119]
图17结果表明，saporin自身对细胞显示出微小的毒性；而i2-1r2c18a1由于其高效的蛋白质递送效率，有效地将saporin递送到细胞内，且递送细胞内的saporin具有治疗功能，可以有效杀伤肿瘤细胞。
[0120]
实施例8表达绿色荧光蛋白(gfp)的质粒dna转染实验
[0121]
本实验使用表达绿色荧光蛋白(gfp)的质粒dna作为报告基因，在hela细胞检测阳离子脂质类似物材料的基因转染效率，具体方法如下：
[0122]
将hela细胞接种在24孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，将不同的阳离子脂质类似物材料(0.25-8 微克/孔)和表达绿色荧光蛋白的质粒dna(0.5微克/孔)在40微升醋酸钠缓冲液(25mm，ph 5.2)中混合后静置10分钟，再稀释到460微升opti-mem培养基中，即可得到负载质粒dna的阳离子脂质类似物复合物颗粒溶液。将hela细胞的培养基去掉，使用pbs清洗一遍后加入复合好的颗粒溶液，培养24 小时后采用流式细胞仪分析细胞内的质粒dna转染效率。以商业化基因转染试剂lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0123]
由图18结果可知，本发明的阳离子脂质类似物材料能够转染表达gfp的质粒dna至hela细胞，实现高效的基因转染，尤其是i1r2c14a1、i1r2c18-2a1、i1r11c14a1、i2r1c14a1、i2r1c16a1、 i2r1c18-1a1、i2r1c18-2a1、i2r2c14a1、i2r2c16a1、i2r2c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c16a1、 i2r3c18a1、i2r3c18-1a1、i2r3c18-2a1、i2r11c14a1、i2r11c16a1、
i2r11c18a1、i2r11c18-1a1、 i2r11c18-2a1的转染效率能够达到或高于商品化转染试剂lipofectamine 2000。
[0124]
实施例9表达荧光素酶(luminescence)的质粒dna转染实验
[0125]
本实施例以表达荧光素酶的质粒dna作为报告基因，在hela细胞检测阳离子脂质类似物材料的基因转染效率，具体操作方法如下：将hela细胞接种在96孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，分别将不同的阳离子脂质类似物材料和表达荧光素酶的质粒dna(0.5微克)在40微升醋酸钠缓冲液(25mm， ph 5.2)中混合后静置10分钟，再稀释到460微升opti-mem培养基中，即可得到负载质粒dna的阳离子脂质类似物复合物颗粒溶液。将hela细胞的培养基去掉，使用pbs清洗一遍后加入125微升复合好的颗粒溶液。培养24小时后，弃掉培养溶液，充分裂解后加入50微升/孔的底物，使用多功能酶标仪检测荧光素酶的表达量。
[0126]
由图19结果可知，i2r3c18a1、i2r1c18-1a1、i1r11c14a1、i2r11c18-2a1、i1r2c14a1、i2r1c14a1、 i2r1c16a1、i2r3c18-2a1、i2r2c18-2a1、i2r2c16a1、i2r3c16a1、i2r2c18-1a1、i2r3c18-1a1的转染效率能够达到或高于商品化转染试剂lipofectamine 2000。
[0127]
实施例10i2r3c18-1a1转染表达gfp的质粒dna至不同类型细胞的效果
[0128]
本实验以i2r3c18-1a1作为代表性的阳离子脂质类似物材料，以表达gfp的质粒dna作为报告基因，探究不同添加量的阳离子脂质类似物材料(0.5-3微克/孔)在不同类型细胞内的质粒dna(0.5微克/孔) 转染效果。以商业化基因转染试剂lipofectamine 2000作为阳性对照。本实验方法参照实施例8的方法制备负载表达gfp的质粒dna的i2r3c18-1a1颗粒溶液，分别在dc2.4、raw 264.7、a549、bxpc3和 hela细胞中加入负载表达gfp的质粒dna的i2r3c18-1a1颗粒溶液复合物溶液，培养24小时后，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内的质粒dna转染效率。
[0129]
图20结果表明，i2r3c18-1a1材料可转染表达gfp的质粒dna至肿瘤细胞以及免疫细胞。
[0130]
实施例11表达增强绿色荧光蛋白(egfp)mrna转染实验
[0131]
本实验选用egfp-mrna作为模型mrna，在dc 2.4细胞检测阳离子脂质类似物材料的mrna转染效率，具体操作方法如下：
[0132]
将dc 2.4细胞接种在48孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，将不同的阳离子脂质类似物材料(0.25
–
2微克/孔)和表达egfp的mrna(0.2微克/孔)在20微升醋酸钠缓冲液(25mm，ph 5.2)中混合后静置10分钟，再稀释到230微升opti-mem培养基中，即可得到负载mrna的复合颗粒。将hela 细胞的培养基去掉，使用pbs清洗一遍后加入复合好的颗粒溶液，培养24小时后采用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜观察细胞内的mrna转染效率。以商业化基因转染试剂lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0133]
图21～23结果显示，本发明的阳离子脂质类似物材料可将表达egfp的mrna转染至dc 2.4细胞，尤其i1r2c14a1、i1r2c16a1、i1r2c18a1、i1r2c18-1a1、i1r2c18-2a1、i1r11c14a1、i1r11c16a1、 i1r11c18a1、i2r1c14a1、i2r1c16a1、i2r1c18-1a1、i2r2c14a1、i2r2c16a1、i2r2c18a1、i2r2c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c14a1、i2r3c16a1、i2r3c18a1、i2r3c18-1a1、i2r3c18-2a1、i2r11c14a1、 i2r11c16a1、i2r11c18a1、i2r11c18-1a1、i2r11c18-2a1的mrna转染效率可达到或高于商品化转染试剂lipofectamine 2000。
[0134]
实施例12小干扰核酸(sirna)转染实验
[0135]
本实验选择了i2r2c18-1a1、i2r3c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c18-2a1作为代表性的阳离子脂质类似物材料，选定稳定表达荧光素酶报告基因的a549细胞(a549-luc)作为模型细胞，特异性靶向荧光素酶报告基因的si rna序列作为模型si rna，研究阳离子脂质类似物材料的sirna转染与递送效果，具体操作方法如下：
[0136]
将表达荧光素酶的a549细胞(a549-luc)接种在96孔板上并在细胞培养箱中培养12小时，将不同的材料(0.5
–
3微克/孔)和sirna在40微升醋酸钠缓冲液(25mm，ph 5.2)中混合后静置10分钟，再稀释到460微升opti-mem培养基中，即可得到负载sirna的复合颗粒(sirna最终浓度为100nm)；将 a549-luc细胞的培养基去掉，使用pbs清洗一遍后加入125微升复合好的颗粒溶液；培养48小时后，弃掉培养溶液，充分裂解后加入50微升/孔的底物，使用多功能酶标仪检测荧光素酶的表达量。
[0137]
图24结果表明，i2r2c18-1a1、i2r3c18-1a1、i2r2c18-2a1、i2r3c18-2a1可将sirna转染到细胞内，特异性地沉默荧光素酶报告基因的表达，且随着阳离子脂质类似物材料添加量增加，基因沉默效率提高。
[0138]
此外，发明人在前期的研究中发现，将上述实施例1中的异丁醛替换为时，所制备得到的阳离子脂质类似物材料也具有细胞毒性低的特点，且以异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白 (bsa-fitc)作为蛋白模型，这些阳离子脂质类似物材料在hela细胞内也均具有一定的蛋白胞内递送效果；或者使用表达绿色荧光蛋白(gfp)质粒dna或者表达荧光素酶(luminescence)的质粒dna为报告基因，在hela细胞检测阳离子脂质类似物材料的基因转染效率，这些材料也显示出一定效果。因此，可以推测这些阳离子脂质类似物材料也可以作为蛋白、核酸等生物大分子药物递送载体。
[0139]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。