治疗肝内胆管细胞癌的药物

1.本发明属于医学和药学领域，涉及用于治疗肿瘤的药物，具体涉及用于治疗肝内胆管细胞癌的药物。


背景技术：

2.肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma icca)是起源于肝内胆管上皮的恶性肿瘤，是发病率仅次于肝细胞肝癌的第二大肝脏原发恶性肿瘤，约占肝脏原发恶性肿瘤的10％-15％，近年来发病率呈上升趋势。由于其发病隐匿，细胞学及病理学诊断敏感性不高等特点，大多数病人被确诊时已是疾病进展期。目前icca的诊断主要依赖于病人症状体征，ct/mri等影像学检查，ca-19-9等血清学指标，缺乏敏感特异的诊断标记物，大多数病人被发现时已处于疾病进展期，失去根治性切除机会，icca病人预后极差，手术切除肿瘤被认为是主要治疗手段，但只有约35％的早期病人具有根治性切除的指证。单纯的化学药物治疗应用于肝内胆管细胞癌的效果不佳，目前仍缺乏根治icca的药物治疗手段。icc的发病高峰是55岁到75岁，不到10％的病例发生在45岁之前。对年龄大于45岁合并高危因素的人群进行定期筛查，有助于icc的早期诊断和及时治疗。与肝细胞肝癌男性高发不同，icc男女发病比例约为2:3。黄志强院士在《肝胆管外科的发展方向》一文中指出，我国的胆管癌患者占全世界的55％[参见：黄志强.肝胆管外科的发展方向[j].外科理论与实践,2011,16(4):329-331]。考虑到icc在胆管癌中的占比，可知我国的icc患者基数也是相当庞大的。本病恶性度高，预后不佳，少有长期生存者。icc早期无明显临床症状，多数患者发现时已失去手术时机，因此对icc的早期诊断和及时治疗提出了更高的要求。外科手术是延长icc患者生存期的首选治疗方式，根治性手术切除范围取决于癌肿的部位与大小，方式包括左、右半肝切除、左、右肝大部切除、肝叶楔形切除、肝段切除等。根治性手术切除术可明显延长患者生存期。而行姑息性外科切除、保守治疗及未治疗者均无5年生存者。icc具有淋巴侵袭性，较易发生淋巴结转移。icc术后复发率较高。因肿瘤体积较大或位置不适合手术的患者，应先行药物化疗，使肿瘤降期后再行相关手术治疗。影响icc的治疗效果和复发的因素争议较多，且icc患者发现时多已失去手术时机及术后复发率高，因此临床医生需要选择合适的辅助治疗方式以达到治愈或减少复发的目的。术后辅以化疗应该要比单纯手术效果更好，存在淋巴结转移和(或)血管侵犯时则需行化学药物治疗。单纯化学药物治疗主要应用于有肝外转移、失去其他治疗措施可能的患者。因为此时化学药物治疗成为延长患者生存期的可能途径，但目前现有化学药物治疗应用于icc的效果并不佳。因此研究和寻找治疗icc的有效化学药物是当前面临的重要课题。


技术实现要素：

[0003]
本发明的任务是提供一种用于治疗肿瘤的药物，具体是用于治疗肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma icca)的药物。
[0004]
实现本发明的技术方案是：
[0005]
本发明提供的用于治疗肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma icca)的药物是细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)广泛性抑制剂roniciclib。
[0006]
细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)广泛性抑制剂roniciclib分子式为c
18h21
f3n4o
3s
，分子量为430.44，化学结构式如下式所示：
[0007][0008]
生命科学试剂供应商如上海陶素生化、mce(medchemexpress)均可提供该抑制剂。
[0009]
本发明揭示，细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)广泛性抑制剂roniciclib具有显著抑制肿瘤细胞生长、显著抑制肿瘤细胞迁移和显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长的作用，能用于制备治疗肿瘤的药物。
[0010]
本发明的一个实施例将肝内胆管癌细胞株hccc-9810细胞以1000个细胞/孔铺于96孔细胞培养板中，加入100μl含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基(采购于hyclone公司)，在37℃含5％co2培养箱中培养16小时后，换入100μl含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基；将该96孔细胞培养板分为两个区域，一个区域加入溶于二甲基亚砜(dmso)溶剂的母液为10mm的roniciclib(mce公司，货号：hy-13914)2.5x10-4
μl至终浓度为25nm作为实验组；于另一区域中加入不含roniciclib的二甲基亚砜(dmso)溶剂2.5x10-4
μl作为未加药处理组；将该96孔细胞培养板，在37℃含5％co2培养箱中培养五天，于第五天采用cck8方法检测细胞增殖情况，该结果显示，roniciclib能显著抑制肿瘤细胞生长，见图2和实施例1中的表1。
[0011]
本发明的另一个实施例将hccc-9810细胞以4x105个细胞/孔铺于6孔板中，在37℃5％co2培养箱中培养16小时待细胞贴壁后，换入1.5ml含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基，加入溶于二甲基亚砜(dmso)溶剂的母液为10mm的roniciclib 3.75x10-3
μl至终浓度为25nm培养24小时后，弃去上清，收集细胞并计数，将1x10
5 hccc-9810细胞重悬于200μl无血清的rpmi1640培养基中，铺至transwell细胞迁移板(corning公司，货号3422)8μm上层小室，在下层小室中加入500μl含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，将同一块6孔板分为两区，于另一区中加入不含roniciclib的二甲基亚砜(dmso)溶剂3.75x10-3
μl作为未加药处理组，同样培养条件及时间处理后，收集细胞以同样的细胞数量和条件铺入同一块transwell细胞迁移板不同上层小室，下层小室加入同条件培养基后，将该板于37℃含5％co2培养箱中培养24小时后，用0.5％结晶紫对迁移过聚碳酸酯膜的细胞进行染色，光学显微镜统计细胞数表明roniciclib能显著抑制肿瘤细胞迁移，见图3和实施例2中的表2。
[0012]
本发明的又一个实施例将4x10
6 hccc-9810细胞重悬于100μl pbs中注射至5周龄雌性裸鼠皮下，裸鼠随机分为两组，每组8只，待肿瘤生长至60mm3体积时，将roniciclib用
dmso溶解成600x母液后，加入磺丁基倍他环糊精钠配成1.5mg/kg的剂量，采用1ml注射器配合12号灌胃针对荷瘤裸鼠进行灌胃200μl体积，每隔1天灌胃1次，共灌胃7次作为实验组，另一组用同样型号的灌胃针给予200μl体积的dmso母液和磺丁基倍他环糊精钠稀释液灌胃同等次数作为未给药处理组，停止灌胃后继续饲养裸鼠8天后处死，实验期间每5天测量肿瘤体积，处死裸鼠后剥离肿瘤并称重，结果表明roniciclib能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的体积大小和重量，见图4、图5和实施例3中的表3、表4。
[0013]
本发明研究结果显示细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)广泛性抑制剂roniciclib能显著抑制肝内胆管癌细胞的生长、迁移及其皮下肿瘤的生长。以roniciclib为药物活性成份，加入制药学上可接受的添加剂或/和赋形剂或/和载体，可以制成用于治疗肝内胆管细胞癌的药物制剂，如片剂、颗粒剂、液体制剂等。
附图说明
[0014]
图1：roniciclib化学结构式。
[0015]
图2：cck8实验检测肝内胆管癌细胞增殖。实验重复三次，结果表明，与未加药处理组相比，roniciclib显著抑制肿瘤细胞hccc-9810生长。ctrl，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。absorbance，cck8实验吸光值。***p《0.001。
[0016]
图3：transwell细胞迁移实验检测肝内胆管癌细胞迁移。实验重复三次，结果表明，与未加药处理组细胞相比，roniciclib显著抑制肿瘤细胞hccc-9810迁移。mock，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。number of migrated 9810cells，迁移过聚碳酸酯膜的hccc-9810细胞数量。***p《0.001。
[0017]
图4：裸鼠皮下成瘤后给予灌胃给药处理以检测药物疗效实验。动物实验期间每5天测量肿瘤的长径和宽径，按公式：体积＝0.52x长x宽2计算肿瘤体积，结果表明roniciclib能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的体积大小。ctrl，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。days，天数。tumor volume(mm3)，肿瘤体积(立方毫米)。***p《0.001。
[0018]
图5：处死裸鼠后剥离肿瘤并称重，结果表明roniciclib能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的重量。ctrl，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。tumor weight(g)，肿瘤瘤重(克)。***p《0.001。
具体实施方式
[0019]
实施例1：roniciclib显著抑制肿瘤细胞生长
[0020]
将肝内胆管癌细胞株hccc-9810细胞以1000个细胞/孔铺于96孔细胞培养板中，加入100μl含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基(采购于hyclone公司)，在37℃含5％co2培养箱中培养16小时后，换入100μl含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基；将该96孔细胞培养板分为两个区域，一个区域加入溶于二甲基亚砜(dmso)溶剂的母液为10mm的roniciclib(mce公司，货号：hy-13914)2.5x10-4
μl至终浓度为25nm作为实验组；于另一区域中加入不含roniciclib的二甲基亚砜(dmso)溶剂2.5x10-4
μl作为未加药处理组；将该96孔细胞培养板，在37℃含5％co2培养箱中培养五天，于第五天采用cck8方法检测细胞增殖情况，该结果显示，roniciclib能显著抑制肿瘤细胞生长，见图2和表1。
[0021]
表1:展示了未加药处理组和roniciclib处理组的cck8检测细胞增殖的三次重复
实验结果。ctrl，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。absorbance，cck8实验吸光值。
[0022]
absorbancectrlroniciclib11.4590.03421.4340.03731.5310.000
[0023]
实施例2：roniciclib显著抑制肿瘤细胞迁移
[0024]
将hccc-9810细胞以4x105个细胞/孔铺于6孔板中，在37℃含5％co2培养箱中培养16小时待细胞贴壁后，换入1.5ml含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基，加入溶于二甲基亚砜(dmso)溶剂的母液为10mm的roniciclib 3.75x10-3
μl至终浓度为25nm培养24小时后，弃去上清，收集细胞并计数，将1x10
5 hccc-9810细胞重悬于200μl无血清的rpmi1640培养基中，铺至transwell细胞迁移板(corning公司，货号3422)8μm上层小室，在下层小室中加入500μl含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，将同一块6孔板分为两区，于另一区中加入不含roniciclib的二甲基亚砜(dmso)溶剂3.75x10-3
μl作为未加药处理组，同样培养条件及时间处理后，收集细胞以同样的细胞数量和条件铺入同一块transwell细胞迁移板不同上层小室，下层小室加入同条件培养基后，将该板于37℃含5％co2培养箱中培养24小时后，用0.5％结晶紫对迁移过聚碳酸酯膜的细胞进行染色，光学显微镜统计细胞数表明roniciclib能显著抑制肿瘤细胞迁移(图3，表2)。
[0025]
表2:未加药处理组和roniciclib处理组在transwell实验中细胞的迁移数量，实验重复三次，共选取六个观察视野。mock，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。
[0026][0027]
实施例3：roniciclib显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长
[0028]
将4x10
6 hccc-9810细胞重悬于100μl pbs中注射至5周龄雌性裸鼠皮下，裸鼠随机分为两组，每组8只，待肿瘤生长至60mm3体积时，将roniciclib用dmso溶解成600x母液后，加入磺丁基倍他环糊精钠配成1.5mg/kg的剂量，采用1ml注射器配合12号灌胃针对荷瘤裸鼠进行灌胃200μl体积，每隔1天灌胃1次，共灌胃7次作为实验组，另一组用同样型号的灌胃针给予200μl体积的dmso母液和磺丁基倍他环糊精钠稀释液灌胃同等次数作为未给药处理组，停止灌胃后继续饲养裸鼠8天后处死，实验期间每5天测量肿瘤体积，处死裸鼠后剥离肿瘤并称重，结果表明roniciclib能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的体积大小和重量(图4，图5，表3，表4)。
[0029]
表3：对照组和roniciclib处理组裸鼠皮下肿瘤的体积大小数据。ctrl，未加药处
理组。roniciclib，roniciclib实验组。days，天数。volume(mm3)，肿瘤体积(立方毫米)。
[0030][0031][0032]
表4：处死裸鼠后对照组和roniciclib处理组中剥离肿瘤的重量大小数据。ctrl，未加药处理组。roniciclib，roniciclib实验组。weight(g)，肿瘤瘤重(克)。
[0033]
weight(g)ctrlroniciclib10.400.2020.420.1830.580.0540.420.0550.360.0060.200.0070.250.0080.200.00