在乙酰乳酸脱羧酶基因座敲入的微生物的制作方法

在乙酰乳酸脱羧酶基因座敲入的微生物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年6月6日提交的第63/035,739号美国临时专利申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。
3.政府权利
4.本公开是在美国能源部授予的第de-ee0007566号援助协议授予的政府支持下进行的。政府对本公开享有一定的权利。
技术领域
5.本技术涉及基因工程微生物和这些微生物用于从包含二氧化碳(co2)、一氧化碳(co)和/或氢气(h2)的底物发酵生产产物的用途。


背景技术：

6.缓解迫切的气候变化需要大幅减少温室气体(ghg)的排放，所述ghg如通过煤和石油等化石燃料的燃烧生成的那些。虽然燃料和化学品的可持续来源目前不足以显著取代对化石碳的依赖性，但是气体发酵最近已成为用于将如co、co2和/或h2的气体生物固定成可持续燃料和化学品的替代性平台。具体地，气体发酵技术可以利用包含气化的含碳物质(例如，市政固体废物或农业废物)或工业废气(例如，来自钢厂或炼油厂)在内的广泛范围的原料来产生乙醇、喷气燃料和各种其它产品。仅靠气体发酵就可以取代30％的原油使用量并使全球co2排放量减少10％，但是，与任何破坏性技术一样，在充分发挥这一潜力之前，必须克服许多技术挑战。
7.具体地，对于从气态底物生产天然和非天然产物，仍然需要具有改进稳定性的额外微生物。
附图说明
8.图1是描绘具有破坏的乙酰乳酸脱羧酶基因(δbuda)和破坏的伯仲醇脱氢酶基因(δsecadh)的微生物发酵的一组图。上图示出了代谢物的产量(乙醇和乙酸盐)。下图示出了气体消耗和产量(co、co2和h2)。
9.图2是描绘在质粒上表达丙酮途径(thla、ctfab、adc)的δbudaδsecadh微生物发酵的一组图。丙酮途径受p
fer
启动子的控制。上图示出了代谢物的产量(乙醇、乙酸盐和丙酮)。下图示出了气体消耗和产量(co、co2和h2)。
10.图3是描绘在乙酰乳酸脱羧酶基因(buda)基因座处敲入丙酮途径(thla、ctfab、adc)的δsecadh微生物发酵的一组图。丙酮途径受p
buda
启动子和p
fer
启动子的控制。上图示出了代谢物的产量(乙醇、乙酸盐、丙酮丙酮)。下图示出了气体消耗和产量(co、co2和h2)。
11.图4是描绘在双功能醛醇脱氢酶(adhe1 adhe2)基因座和功能性伯仲醇脱氢酶(secadh)基因敲入丙酮途径(thla,ctfab,adc)的微生物发酵的一组图。伯仲醇脱氢酶(secadh)将丙酮转化为异丙醇，因此该菌株产生异丙醇而不是丙酮。丙酮途径受p
adhe1/e2
启
动子和p
fer
启动子的控制。上图示出了代谢物的产量(乙醇、乙酸盐、丙酮和异丙醇)。下图示出了气体消耗和产量(co、co2和h2)。
具体实施方式
12.乙酰乳酸脱羧酶是形成2,3-丁二醇(2,3-bdo)的关键步骤(《应用与环境微生物学(appl env microbiol)》，80:3394-3405，2014)，已证明敲除该酶可消除2,3-bdo的产生(wo 2013/115659)。为了引导通量流向其它异源产物，如丙酮，敲除乙酰乳酸脱羧酶预计会增加这些异源产物的产量。
13.然而，本发明人发现情况并非必然如此。具体地，本发明人发现，在乙酰乳酸脱羧酶基因座敲入负责产生异源产物的基因是实现稳定发酵和高产物滴度的关键。
14.提供了一种基因工程微生物，其包含在乙酰乳酸脱羧酶基因座处敲入dna。在一个实施例中，dna全部或部分替换乙酰乳酸脱羧酶基因的编码区。在一个实施例中，dna不替换乙酰乳酸脱羧酶启动子。
15.在一个实施例中，乙酰乳酸脱羧酶具有由ec 4.1.1.5定义的活性，即(s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸
←→
(r)-2-乙偶姻 co2。在一个实施例中，乙酰乳酸脱羧酶是buda。在一个实施例中，buda包含seq id no:3。
16.在进行敲入后，微生物通常不具有功能性乙酰乳酸脱羧酶基因，从而微生物将表达乙酰乳酸脱羧酶并且不会产生如2,3-丁二醇的产物。
17.在一个实施例中，敲入的dna编码一种或多种酶。在一个实施例中，这些酶对于微生物而言是非天然的，即不是天然存在于微生物中的。在一个实施例中，这些酶对于微生物而言是天然的，即天然存在于微生物中，并且简单地将酶的另一个拷贝添加到微生物的基因组中。
18.在一个实施例中，由敲入的dna编码的酶受乙酰乳酸脱羧酶启动子(例如，p
buda
)的控制。在一个实施例中，dna包含启动子，如p
fer
启动子。在一个实施例中，酶受乙酰乳酸脱羧酶启动子和至少一种其它启动子两者的控制。在一个实施例中，酶受p
buda
和p
fer
两者的控制。
19.在一个实施例中，丙酮途径在乙酰乳酸脱羧酶基因座处被敲入。丙酮途径可以包含硫解酶、coa转移酶和脱羧酶。在一个实施例中，脱羧酶是乙酰乙酸脱羧酶或α-酮异戊酸脱羧酶。例如，丙酮途径可以包含thla、ctfab和adc或thla、ctfab和kivd。如果存在，伯仲醇脱氢酶，如secadh，会将丙酮转化为异丙醇。在编码该酶的基因中引入破坏性突变(例如，敲除突变)将导致丙酮的产生，而该酶的表达将导致异丙醇的产生。因此，取决于宿主微生物的遗传背景，丙酮途径的引入将导致丙酮或异丙醇的产生。wo 2012/115527中描述了生产丙酮和异丙醇的微生物工程。wo 2015/085015中描述了敲除伯仲醇脱氢酶活性的微生物工程。
20.在一个实施例中，微生物包含丙酮途径并且还包含伯仲醇脱氢酶基因中的破坏性突变，使得微生物产生丙酮。在一个实施例中，微生物包含丙酮途径并且还包含功能性伯仲醇脱氢酶，使得微生物产生异丙醇。
21.事实上，敲入的dna基本上可以编码任何酶或酶途径。例如，由敲入的dna编码的酶能够产生1-丁醇、丁酸盐、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、异丙醇、脂质、3-羟基丙酸
盐、萜烯、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸盐衍生产物、3-羟基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸、异丁烯、己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、异戊酸盐、异戊醇或单乙二醇。
22.在一个实施方式中，微生物是固定c1的微生物。在一个实施方式中，微生物是伍德-永达尔(wood-ljungdahl)微生物。在一个实施方式中，微生物是细菌。在一个实施方式中，微生物是选自醋酸杆菌属(acetobacterium)、碱杆菌属(alkalibaculum)、布劳特氏菌属(blautia)、丁酸杆菌属(butyribacterium)、梭菌属(clostridium)、真杆菌属(eubacterium)、穆尔氏菌属(moorella)、产醋杆菌属(oxobacter)、鼠孢菌属(sporomusa)和嗜热厌氧杆菌属(thermoanaerobacter)的属的成员。
23.还提供了一种生产产物的方法，其包含在气态底物的存在下培养微生物。在一个实施例中，气态底物包含c1碳源，该c1碳源包含co、co2和/或h2。在一个实施方式中，所述气态底物包括合成气或工业废气。在一个实施例中，产物是1-丁醇、丁酸盐、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、异丙醇、脂质、3-羟基丙酸盐、萜烯、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸盐衍生产物、3-羟基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸、异丁烯、己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、异戊酸盐、异戊醇或单乙二醇。
24.定义和背景
25.除非另有定义，否则贯穿本规范所使用的以下术语定义如下：
26.术语“发酵”应解释为在底物中产生化学变化的代谢过程。例如，发酵过程接收一种或多种底物并通过利用一种或多种微生物来产生一种或多种产物。术语“发酵”、“气体发酵”等应解释为接收一种或多种底物如通过气化产生的合成气并通过利用一种或多种c1固定型微生物来产生一种或多种产物的过程。优选地，发酵过程包含使用一种或多种生物反应器。发酵过程可以描述为“分批”或“连续”。“分批发酵”用于描述这样的发酵过程：其中生物反应器填充有原材料例如碳源以及微生物，其中产物在生物反应器中保留到直到发酵完成。在“分批”过程中，在发酵完成之后，提取产物并在下一“分批”开始之前清洁生物反应器。“连续发酵”用于描述这样的发酵过程：其中发酵过程持续较长时间段，并且产物和/或代谢物在发酵期间提取。优选地，发酵过程是连续的。
27.当用于指微生物时，术语“非天然存在的”旨在意指微生物具有在所参考物种的天然存在的菌株(包含所参考物种的野生型菌株)中未发现的至少一种基因修饰。非天然存在的微生物通常在实验室或研究机构中开发。
28.术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程”泛指通过人工对微生物的基因组或核酸的操作。同样，术语“经基因修饰的”、“经基因改变的”或“经基因工程化的”是指含有这种基因修饰、基因改变或基因工程的微生物。这些术语可用于区分实验室产生的微生物与自然存在的微生物。基因修饰的方法包含例如异源基因表达、基因或启动子插入或缺失、核酸突变、经改变的基因表达或失活、酶工程、定向进化、基于知识的设计、无规诱变方法、基因改组和密码子优化。
29.如梭菌(clostridia)的微生物的代谢工程可以极大地扩展其产生除天然代谢物(如乙醇)以外的许多重要燃料和化学分子的能力。然而，直到最近，梭菌仍被认为係基因难处理的，并且因此通常禁止进行广泛的代谢工程改造工作。近年来，已经开发了用于梭菌的
基因组工程改造的多种不同方法，包含基于内含子的方法(clostron)(kuehne,《菌株工程工作：方法和方案(strain eng:methods and protocols)》,389-407,2011)、等位基因交换法(ace)(heap,《核酸研究(nucl acids res)》,40:e59,2012；ng,《公共科学图书馆：综合(plos one)》,8:e56051,2013)、三重杂交(liew,《微生物学前沿(frontiers microbiol)》,7:694,2016)、通过i-scei介导的方法(zhang,《微生物学方法杂志(journal microbiol methods)》,108:49-60,2015)、mazf(al-hinai,《应用与环境微生物学(appl environ microbiol)》,78:8112-8121,2012)或其它方法(argyros,《应用与环境微生物学》,77:8288-8294,2011)、cre-lox(ueki,《分子生物技术(mbio)》,5:e01636-01614,2014)以及crispr/cas9(nagaraju,《生物燃料生物技术(biotechnol biofuels)》,9:219,2016)。然而，由于缓慢而费力的循环时间以及这些基因技术跨物种的可转移性的限制，以迭代方式引入多于几个基因改变仍然极具挑战性。此外，尚未充分了解梭菌中的c1代谢，以至于无法可靠地预测将使趋于产物合成的c1摄取、转化和碳/能量/氧化还原流最大化的修饰。因此，在梭菌中引入目标路径仍是繁琐且耗时的工艺。
[0030]“重组”指示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰、基因工程或基因重组的产物。通常，术语“重组”是指含有衍生自多个来源，如两种或更多种不同的微生物菌株或物种的基因材料或由其编码的核酸、蛋白质或微生物。
[0031]“野生型”是指区别于突变形式或变体形式的有机体、菌株、基因或其存在于自然中时的特征的典型形式。
[0032]“内源性”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。举例来说，内源基因是天然存在于衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中的基因。在一个实施例中，内源基因的表达可以由外源调控元件，如外源启动子控制。
[0033]“外源”是指起源于本公开的微生物之外的核酸或蛋白质。举例来说，可以人工或重组产生外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。也可以从异源微生物中分离外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。外源核酸可以调整以整合到本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中例如在质粒中保持染色体外状态。
[0034]“异源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中不存在的核酸或蛋白质。举例来说，异源基因或酶可以衍生自不同的菌株或物种并被引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。异源基因或酶可以以其存在于不同菌株或物种中的形式被引入本公开的微生物或在本公开的微生物中表达。可替代地，可以某种方式修饰异源基因或酶，例如通过对其进行密码子优化以用于在本公开的微生物中表达或通过对其进行工程化以改变功能，如以逆转酶活性方向或改变底物特异性。
[0035]
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。这些术语指任何长度的核苷酸的聚合形式，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微-rna(mirna)、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列
的分离dna、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸或核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分结合来进一步修饰。
[0036]
如本文所使用，“表达”是指多核苷酸从dna模板转录的工艺(如转录为mrna或其它rna转录物)和/或经转录mrna随后翻译成肽、多肽或蛋白质的工艺。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。
[0037]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包括经修饰氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分结合。如本文所使用，术语“氨基酸”包含天然和/或非天然或合成的氨基酸，包含甘氨酸和d或l光学异构体两者以及氨基酸类似物和肽模拟物。
[0038]“酶活性”或简称“活性”广义上是指酶促活性，包含但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此，“增加”酶活性包含增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。类似地，“降低”酶活性包含降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可用性。
[0039]“突变”是指与衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物相比，在本公开的微生物中已被修饰的核酸或蛋白质。在一个实施方式中，突变可以是编码酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一个实施方式中，突变可以是酶中一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。
[0040]
具体地，“破坏性突变”是减少或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以部分灭活、完全灭活或删除基因或酶。破坏性突变可以是减少、防止或阻断酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可以是敲除(ko)突变。这种破坏也可能是降低但不完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性的敲低(kd)突变。虽然ko通常可以有效地提高产物产量，但有时会带来生长缺陷或遗传不稳定性的不利影响，尤其是对于非生长耦合产物而言。所述破坏性突变可以包含例如编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变、引入产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸、或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如，反义rna、sirna、crispr)。可以使用本领域已知的任何方法引入破坏性突变。
[0041]
破坏性突变的引入导致本公开的微生物不产生目标产物或基本上不产生目标产物，或者与衍生出本公开的微生物的亲本微生物相比目标产物的量减少。举例来说，本公开的微生物可能不产生目标产物，或者可能产生比亲本微生物少至少约1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的目标产物。举例来说，本公开的微生物可能产生小于约0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/l的目标产物。
[0042]“敲入”是指一种基因工程方法，其涉及在基因座中取代dna或在基因座中插入新的dna。通常，敲入将用一个或多个不同的基因替换一个基因。例如，乙酰乳酸脱羧酶(buda)基因可以全部或部分被一种或多种不同基因替换。在一个实施例中，仅替换基因的编码区。在一个实施例中，基因的整个操纵子被替换，包括任何启动子区。
[0043]“密码子优化”是指核酸例如基因的突变，用于优化或改进特定菌株或物种中的核
酸转译。密码子优化可以产生更快的翻译速率或更高的翻译准确性。在一个优选的实施例中，本公开的基因被密码子优化用于在梭菌属(特别是产乙醇梭菌(clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(clostridium ljungdahlii)或拉氏梭菌(clostridium ragsdalei))中表达。在另一优选的实施例中，本公开的基因被密码子优化用于在以dsmz保藏号dsm23693保藏的产乙醇梭菌lz1561中表达。
[0044]“过表达”是指与衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物相比本公开的微生物中的核酸或蛋白质的表达增加。过表达可以通过本领域已知的任何手段实现，包含修饰基因拷贝数、基因转录速率、基因转译速率或酶降解速率。
[0045]
术语“变体”包含其序列不同于参考核酸和蛋白质的序列如现有技术中公开的或本文例举的参考核酸和蛋白质的序列的核酸和蛋白质。本公开可以使用执行与参考核酸或蛋白质基本相同的功能的变体核酸或蛋白质实践。例如，变体蛋白质可以进行与参考蛋白质基本上相同的功能或催化与参考蛋白质基本上相同的反应。变体基因可以编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变体启动子可以具有与参考启动子基本上相同的能力来促进一种或多种基因的表达。
[0046]
此类核酸或蛋白质在本文中可以称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体可以包含等位基因变体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变体的实例。这些同源基因包含如丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(clostridium beijerinckii)或扬氏梭菌的物种中的同源基因，其详细信息可在如genbank或ncbi的网站上公开获得。功能等效变体还包含其序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变体将与参考的核酸优选地具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变体与参考的蛋白质优选具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的氨基酸同一性(同源性百分比)。可以使用本领域已知的任何方法评估变体核酸或蛋白质的功能等效性。
[0047]
可以使用本领域已知的任何方法将核酸递送到本公开的微生物。例如，核酸可以作为裸核酸递送或者可以用一种或多种试剂如脂质体配制。适当时，核酸可以是dna、rna、cdna或其组合。在某些实施方式中可以使用限制性抑制剂。另外的载体可以包含质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在优选实施例中，使用质粒将核酸递送到本公开的微生物。举例来说，转化(包含转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或缀合来实现。在具有活性限制酶系统的某些实施例中，可能有必要在将核酸引入到微生物中之前使核酸甲基化。
[0048]
此外，可以将核酸设计成包括调控元件，如启动子以增加或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想情况下，启动子是伍德-隆达尔(wood-ljungdahl)途径启动子、铁氧还蛋白启动子、丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、rnf复合操纵子启动子、atp合酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
[0049]“微生物”是微观有机体，具体地是细菌、古菌、病毒或真菌。本公开的微生物通常是细菌。如本文所使用的，对“微生物”的叙述应被视为涵盖“细菌”。
[0050]“亲代微生物”是为生成本公开的微生物所使用的微生物。亲本微生物可以是天然
存在的微生物(即，野生型微生物)或先前已经修饰的微生物(即，突变或重组微生物)。本公开的微生物可以被修饰成表达或过表达在亲本微生物中未表达或过表达的一种或多种酶。类似地，本公开的微生物可以被修饰成含有亲代微生物所不含的一个或多个基因。本公开的微生物还可以被修饰成不表达或表达在亲代微生物中表达的较低量的一种或多种酶。在一个实施例中，亲代微生物是产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌(clostridium ragsdalei)。在优选实施例中，亲代微生物是产乙醇梭菌lz1561，其根据《布达佩斯条约(budapest treaty)》的条款于2010年6月7日由位于德国布伦瑞克省d-38124inhoffenstraβe 7b(inhoffenstraβe 7b,d-38124braunschweig,germany)的德国微生物菌种保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh，dsmz)保藏在一致登录号dsm23693下。此菌株在国际专利申请第pct/nz2011/000144号中进行了描述，所述国际专利申请以wo 2012/015317公开。
[0051]
术语“衍生自”指示核酸、蛋白质或微生物从不同的(例如，亲代或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或改编，以产生新的核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或改编通常包含核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。通常，本公开的微生物衍生自亲代微生物。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌lz1561，其保藏在dsmz登录号dsm23693下。
[0052]
本公开的微生物可以基于功能特性进一步分类。例如，本公开的微生物可以是或可以衍生自c1固定型微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌(ethanologen)、一氧化碳营养菌(carboxydotroph)和/或甲烷氧化菌。表1提供了微生物的代表性列表并标识了其功能特性。
[0053][0054]1伍氏醋酸杆菌可以从果糖中产生乙醇，但不能从气体中产生乙醇。
[0055]2尚未研究大梭菌是否可以依靠co生长。
[0056]3已报告，热醋穆尔氏菌中的一种菌株穆尔氏菌huc22-1从气体中产生乙醇。
[0057]4尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠co生长。
[0058]5尚未研究森林土壤醋酸鼠孢菌是否可以依靠co生长。
[0059]6尚未研究球形鼠孢菌是否可以依靠co生长。
[0060]“伍德-永达尔”是指碳固定的伍德-永达尔途径，如例如由ragsdale,《生物化学与生物物理学报(biochim biophys acta)》,1784:1873-1898,2008所描述的。“伍德-永达尔微生物”可预见地指代含有伍德-永达尔途径的微生物。一般来说，本公开的微生物含有天然伍德-永达尔途径。在本文中，伍德-永达尔途径可以是天然的未经修饰的伍德-永达尔途径，或者所述伍德-永达尔途径可以是有一定程度的基因修饰(例如，过表达、异源表达、敲除等)的伍德-永达尔途径，只要所述伍德-永达尔途径仍然起作用以将co、co2和/或h2转化
为乙酰辅酶a即可。
[0061]“c1”是指单碳分子，例如co、co2、ch4或ch3oh。“c1氧化物”是指也包括至少一个氧原子的单碳分子，例如co、co2或ch3oh。“c1碳源”是指用作本公开的微生物的部分或唯一碳源的单碳分子。例如，c1碳源可以包括co、co2、ch4、ch3oh或ch2o2中的一种或多种。优选地，c1碳源包括co和co2中的一种或两种。“c1固定型微生物”是能够从c1碳源产生一种或多种产物的微生物。本公开的微生物通常是c1固定型细菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的c1固定型微生物。
[0062]“厌氧菌”是不需要氧气即可生长的微生物。如果氧气超过某一阈值存在，则厌氧菌可能会产生不良反应或甚至死亡。然而，一些厌氧菌能够耐受低水平的氧气(例如，0.000001-5％的氧气)。本公开的微生物通常是厌氧菌。在一优选实施例中，本公开微生物来源于表1中所鉴别的厌氧菌。
[0063]“产乙酸菌”是使用伍德-永达尔途径作为其进行能量保存和合成乙酰辅酶a和乙酰辅酶a衍生的产物如乙酸盐的主要机制的专性厌氧细菌(ragsdale,《生物化学与生物物理学报》,1784:1873-1898,2008)。具体地，产乙酸菌使用伍德-永达尔途径作为(1)用于从co2还原合成乙酰辅酶a的机制、(2)末端电子接受能量保存过程、(3)用于在细胞碳的合成中固定(同化)co2的机制(drake,产乙酸菌原核生物(acetogenic prokaryotes),见于《原核生物(the prokaryotes)》,第3版,第354页,纽约,纽约州,2006)。所有天然存在的产乙酸菌都是c1固定型、厌氧型、自养型和非甲烷氧化型。本公开的微生物通常是产乙酸菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的产乙酸菌。
[0064]“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。本公开的微生物通常是产乙醇菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的产乙醇菌。
[0065]“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养菌使用无机碳源，如co和/或co2。本公开的微生物通常是自养菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的自养菌。
[0066]“一氧化碳营养菌”是能够利用co作为碳和能量的唯一来源的微生物。本公开的微生物通常是一氧化碳营养菌。在优选实施例中，本公开的微生物衍生自表1中标识的一氧化碳营养菌。
[0067]“甲烷氧化菌”是能够利用甲烷作为碳和能量的唯一来源的微生物。在某些实施方式中，本公开的微生物是甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其它实施方式中，本公开的微生物不是甲烷氧化菌或不衍生自甲烷氧化菌。
[0068]
更广泛地说，本公开的微生物可以衍生自表1中标识的任何属或种。例如，微生物可以是选自由以下组成的组的属的成员：醋酸杆菌属、碱杆菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属和嗜热厌氧杆菌属。具体地，微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲代细菌：伍氏醋酸杆菌、巴氏碱杆菌、长生布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍嗜热厌氧菌。
[0069]
在优选实施例中，本公开的微生物衍生自包括物种产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏
梭菌的梭菌属簇。这些物种最初由以下报告和表征：abrini,《微生物学文献集(arch microbiol)》,161:345-351,1994(产乙醇梭菌)；tanner,《国际系统细菌学杂志(int j system bacteriol)》,43:232-236,1993(扬氏梭菌)；以及huhnke,wo 2008/028055(拉氏梭菌)。
[0070]
这三个物种有许多相似之处。具体地，这些物种都是梭菌属的c1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和一氧化碳营养型成员。这些物种具有类似的基因型和表型以及类似的能量保存和发酵代谢模式。此外，这些物种聚集在具有99％以上同一性的16s rrna dna的梭菌rrna同源群i中，其dna g c含量为约22-30mol％，是革兰氏阳性，具有类似的形态和大小(对数生长细胞介于0.5-0.7x 3-5μm之间)，具有嗜温性(在30-37℃下生长最佳)，具有约4-7.5的类似ph范围(最佳ph为约5.5-6)，缺乏细胞色素并通过rnf复合物保存能量。此外，在这些物种中已示出了羧酸到其对应的醇的还原(perez,《生物技术与生物工程(biotechnol bioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些物种还都示出在含co气体上的强自养性生长、产生乙醇和乙酸盐(或乙酸)作为主要发酵产物并且在某些条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。
[0071]
然而，这三种物种也有许多不同之处。这些物种分离自不同的来源：来自兔子肠道的产乙醇梭菌、来自鸡圈废物的扬氏梭菌以及来自淡水沉积物的拉氏梭菌。这些物种在各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)和其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的利用方面有所不同。此外，这些物种在针对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)的营养缺陷型方面有所不同。虽然已经发现这些基因和蛋白质的一般结构和数量在所有物种中都是相同的，但是这些物种在伍德-永达尔途径基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列方面存在差异(《生物技术最新观点(curr opin biotechnol)》,22:320-325,2011)。
[0072]
因此，总的来说，产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的特性中的许多特性并不对所述物种具有特异性，而是梭菌属的c1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和一氧化碳营养型成员的这一簇的一般特性。然而，由于这些物种实际上是不同的，因此这些物种中的一种物种的基因修饰或操作在这些物种的另一种物种中可能不具有相同的作用。例如，可以观察到生长、性能或产物产生的不同。
[0073]
本公开的微生物还可以衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。产乙醇梭菌的分离株和突变体包含ja1-1(dsm10061)(abrini,《微生物学文献集》,161:345-351,1994)、lz1560(dsm19630)(wo 2009/064200)和lz1561(dsm23693)(wo2012/015317)。扬氏梭菌的分离株和突变体包含atcc 49587(tanner,《国际系统细菌学杂志(int j syst bacteriol)》,43:232-236,1993)、petct(dsm13528，atcc 55383)、eri-2(atcc55380)(us 5,593,886)、c-01(atcc 55988)(us 6,368,819)、o-52(atcc 55989)(us 6,368,819)和ota-1(tirado-acevedo,《使用扬氏梭菌从合成气中产生生物乙醇(production of bioethanol from synthesis gas using clostridium ljungdahlii)》,博士论文,北卡罗莱纳州立大学(north carolina state university),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包含pi 1(atcc baa-622、atcc pta-7826)(wo 2008/028055)。
[0074]“底物”是指本公开的微生物的碳源和/或能量来源。底物通常呈气态并且包括c1碳源，例如co、co2和/或ch4。优选地，底物包括co或co co2的c1碳源。底物可以进一步包括其
它非碳组分，如h2、n2或电子。
[0075]
底物通常包括至少一定量的co，如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％的co。底物可以包括一定范围的co，如约20-80mol％、30-70mol％或40-60mol％的co。优选地，底物包括约40-70mol％的co(例如，钢厂或高炉气)、约20-30mol％的co(例如，碱性氧气炉气)或约15-45mol％的co(例如，合成气)。在一些实施方式中，底物可以包括相对较低量的co，如约1-10mol％或1-20mol％的co。本公开的微生物通常将底物中的co的至少一部分转化为产物。在一些实施方式中，底物不包括或基本上不包括(《1mol％)co。
[0076]
底物可以包括一定量的h2。例如，底物可以包括约1、2、5、10、15、20或30mol％的h2。在一些实施方式中，底物可以包括相对较高量的h2，如约60、70、80或90mol％的h2。在另外的实施方式中，底物不包括或基本上不包括(《1mol％)h2。
[0077]
底物可以包括一定量的co2。例如，底物可以包括约1-80mol％或1-30mol％的co2。在一些实施方式中，底物可以包括小于约20、15、10或5mol％的co2。在另一个实施方式中，底物不包括或基本上不包括(《1mol％)co2。
[0078]
尽管底物通常是气态的，但底物也可以以替代形式提供。举例来说，可以使用微泡分散发生器将底物溶解在用含co气体饱和的液体中。通过另外的实例，底物可以吸附到固体载体上。
[0079]
底物和/或c1碳源可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源获得的废气，例如来自汽车废气或生物质气化。在某些实施方式中，工业过程选自由以下组成的组：如炼钢厂制造等黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方式中，可以使用任何便利的方法从工业过程中捕获底物和/或c1碳源，然后将获底物和/或c1碳源排放到大气中。
[0080]
底物和/或c1碳源可以是合成气，如通过煤炭或精炼残余物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化或天然气的重整而获得的合成气。在另一个实施例中，合成气可以从市政固体废物或工业固体废物的气化中获得。
[0081]
底物的组成可能对反应的效率和/或成本有重大影响。举例来说，氧气(o2)的存在可以降低厌氧发酵工艺的效率。取决于底物的组成，可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何不期望的杂质，如毒素、不期望的组分或灰尘颗粒，和/或增加期望组分的浓度。
[0082]
在某些实施方案中，发酵在不存在碳水化合物底物(诸如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素)的情况下进行。
[0083]
可以用气体流培养本公开的微生物以产生一种或多种产物。举例来说，本公开的微生物可以产生或可以被工程化以产生乙醇(wo 2007/117157)、乙酸盐(wo 2007/117157)、1-丁醇(wo 2008/115080、wo 2012/053905和wo 2017/066498)、丁酸盐(wo 2008/115080)、2,3-丁二醇(wo 2009/151342和wo 2016/094334)、乳酸盐(wo 2011/112103)、丁烯(wo 2012/024522)、丁二烯(wo 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(wo 2012/024522和wo 2013/185123)、乙烯(wo 2012/026833)、丙酮(wo 2012/115527)、异丙醇(wo 2012/115527)、脂质(wo 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-hp)(wo 2013/180581)、萜烯，包含异戊二烯(wo 2013/180584)、脂肪酸(wo 2013/191567)、2-丁醇(wo 2013/185123)、1,2-丙二醇(wo 2014/036152)、1-丙醇(wo 2017/066498)、1-己醇(wo 2017/066498)、1-辛醇(wo 2017/066498)、分支酸盐衍生产物(wo 2016/191625)、3-羟基丁酸酯(wo 2017/066498)、1,
3-丁二醇(wo 2017/066498)、2-羟基异丁酸或2-羟基异丁酸(wo 2017/066498)、异丁烯(wo 2017/066498)、己二酸(wo 2017/066498)、1,3-己二醇(wo 2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(wo 2017/066498)、2-丁烯-1-醇(wo 2017/066498)、异戊酸盐(wo 2017/066498)、异戊醇(wo 2017/066498)和单乙二醇(wo 2019/126400)。在某些实施方式中，微生物生物质本身可以被视为产物。这些产物可以被进一步转化，以产生柴油、喷气燃料和/或汽油中的至少一种组分。另外，可以进一步处理微生物生物质以产生单细胞蛋白(scp)。
[0084]“天然产物”是由未经基因修饰的微生物产生的产物。例如，乙醇、乙酸盐和2,3-丁二醇是产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”是由经基因修饰的微生物产生的产物，而不是由衍生出经基因修饰的微生物的未经基因修饰的微生物产生的产物。
[0085]“选择率”是指目标产物的产量与微生物所产生的全部发酵产物的产量的比率。本公开的微生物可以被工程化以便以特定选择率或最小选择率产生产物。在一个实施方式中，目标产物占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施方式中，目标产物占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少10％，使得本公开的微生物针对目标产物的选择率为至少10％。在另一个实施方式中，目标产物占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少30％，使得本公开的微生物针对目标产物的选择率为至少30％。
[0086]
通常，在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包含由一个或多个容器、塔或管路布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(cstr)、固定化细胞反应器(icr)、滴流床反应器(tbr)、气泡柱、气升式发酵器、静态混合器或适合气液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方式中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所用，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵工艺的生长阶段和产物生物合成阶段两个。
[0087]
培养通常在含有足以允许微生物生长的营养素、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域众所周知的。
[0088]
培养/发酵应当期望地在用于产生目标产物的适当条件下进行。培养/发酵通常在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包含压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基ph、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器的话)、接种物水平、用于确保处于液相的气体不会变成限制的最大气体底物浓度以及用于避免产物抑制的最大产物浓度。
[0089]
一个实施例是一种基因工程微生物，其包含在乙酰乳酸脱羧酶基因座处敲入dna。
[0090]
根据实施例所述的微生物，其中所述dna替换所述乙酰乳酸脱羧酶基因的编码区。
[0091]
根据实施例所述的微生物，其中所述dna不替换乙酰乳酸脱羧酶启动子。
[0092]
根据实施例所述的微生物，其中所述微生物不产生2,3-丁二醇。
[0093]
根据实施例所述的微生物，其中所述dna编码一种或多种酶。
[0094]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶对于所述微生物而言是非天然的。
[0095]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶对于所述微生物而言是天然
的。
[0096]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶受乙酰乳酸脱羧酶启动子的控制。
[0097]
根据实施例所述的微生物，其中所述dna包含启动子。
[0098]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶受乙酰乳酸脱羧酶启动子和至少一种其它启动子两者的控制。
[0099]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶包含硫解酶、coa转移酶和选自乙酰乙酸脱羧酶或α-酮异戊酸脱羧酶的脱羧酶。
[0100]
根据实施例所述的微生物，其中所述微生物产生丙酮和异丙醇中的一种或多种。
[0101]
根据实施例所述的微生物，其中所述微生物进一步包含伯仲醇脱氢酶基因中的破坏性突变。
[0102]
根据实施例所述的微生物，其中所述一种或多种酶能够产生1-丁醇、丁酸盐、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、异丙醇、脂质、3-羟基丙酸盐、萜烯、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸盐衍生产物、3-羟基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸、异丁烯、己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、异戊酸盐、异戊醇或单乙二醇。
[0103]
根据实施方式所述的微生物，其中所述微生物是c1固定型微生物。
[0104]
根据实施例所述的微生物，其中所述微生物为伍德-隆达尔微生物。
[0105]
根据实施方式所述的微生物，其中所述微生物是细菌。
[0106]
根据实施例所述的微生物，其中所述微生物是选自醋酸杆菌属、碱杆菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属和嗜热厌氧杆菌属的属的成员。
[0107]
一个实施例是一种生产产物的方法，其包含在气态底物的存在下培养根据权利要求1所述的微生物。
[0108]
根据实施例所述的方法，其中所述气态底物包含c1碳源，所述c1碳源包含co、co2和/或h2。
[0109]
根据实施方式所述的方法，其中所述气态底物包括合成气或工业废气。
[0110]
根据实施例所述的方法，其中所述产物是1-丁醇、丁酸盐、丁烯、丁二烯、甲基乙基酮、乙烯、丙酮、异丙醇、脂质、3-羟基丙酸盐、萜烯、异戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、1-丙醇、1-己醇、1-辛醇、分支酸盐衍生产物、3-羟基丁酸酯、1,3-丁二醇、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸、异丁烯、己二酸、1,3-己二醇、3-甲基-2-丁醇、2-丁烯-1-醇、异戊酸盐、异戊醇或单乙二醇。
[0111]
实例
[0112]
以下实例进一步说明本公开，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
[0113]
实例1
[0114]
这个实例描述了一种δbudaδsecadh微生物。
[0115]
乙酰乳酸脱羧酶是形成2,3-丁二醇(2,3-bdo)的关键步骤(《应用与环境微生物学》，80:3394-3405，2014)，已证明敲除该酶可消除2,3-bdo的产生(wo 2013/115659)。为了引导通量流向其它异源产物，如丙酮，预计敲除相应的buda基因会提高产量。
[0116]
在已经含伯仲醇脱氢酶(secadh)基因敲除(δsecadh)(wo 2015/085015)的产乙醇梭菌菌株中敲除buda以产生δbudaδsecadh菌株。如前所述(wo 2013/115659)进行了buda的敲除。
[0117]
分离单菌落，并重新划线到新鲜的合适的选择平板上，然后筛选双交换事件。再次对pcr产物大小正确的双交换事件进行重新划线以确保质粒丢失。将正确的菌落挑入液体培养基中并制备冷冻原液。通过全基因组测序确认基因型，通过生长研究和连续搅拌釜反应器(cstr)运行检查表型。如图1所示，观察到代谢物产量和气体消耗/产量的波动。
[0118]
实例2
[0119]
这个实例描述了从质粒表达丙酮途径(thla、ctfab、adc)的δbudaδsecadh微生物。
[0120]
进一步修饰实例1的δbudaδsecadh微生物以引入含有丙酮途径(thla、ctfab、adc)的质粒。与具有相同途径和相同生长条件但没有敲除buda的亲本δsecadh菌株相比，该菌株产生更少的丙酮。这是令人惊讶的，因为预计buda的敲除会将碳通量从2,3-bdo重定向到其它代谢物，如丙酮和/或乙醇。
[0121]
此外，该菌株在具有以下气体混合物的cstr中生长不佳或表现出稳定的丙酮产量：50％co 10％h2，30％co2，余量为n2(图2)。同样，在生长期间中观察到一种振荡模式：产生的峰和谷、co和氢的吸收与乙酸盐和co2产生的谷和峰相协调。
[0122]
实例3
[0123]
该实例描述了一种δsecadh微生物，其在乙酰乳酸脱羧酶(buda)处敲入丙酮途径(thla、ctfab、adc)基因座。
[0124]
使用buda ko质粒作为骨架构建了buda基因座处丙酮途径敲入的ki/ko质粒，并将丙酮途径插入buda ko质粒的5'和3'buda ko同源臂之间。丙酮途径包含受pfer启动子控制的thla、ctfab和adc。使用geneart无缝克隆和组装试剂盒(赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))组装完整的ki/ko质粒。正确的ki/ko质粒通过pcr筛选和测序确认。
[0125]
获得ki突变体的过程与之前在构建buda ko菌株中描述的过程相同，产生在buda基因座处引入丙酮途径的δbudaδsecadh菌株。进行pcr筛选，培养具有正确大小的pcr产物的菌落，分离基因组dna并进行全基因组dna测序以确认基因型。
[0126]
菌株在具有以下气体混合物的cstr中生长：50％co 10％h2，30％co2，余量为n2。该菌株生长良好并产生高水平的丙酮(图3)。
[0127]
实例4
[0128]
该对比实例描述了具有功能性伯仲醇脱氢酶(secadh)和在双功能醛醇脱氢酶(adhe1 adhe2)基因座处敲入丙酮途径(thla、ctfab、adc)的微生物。伯仲醇脱氢酶(secadh)将丙酮转化为异丙醇，因此该菌株产生异丙醇而不是丙酮。
[0129]
用与上述类似的步骤将丙酮途径插入到adhe1 adhe2基因座。通过pcr扩增同源臂，并通过测序确认基因型。
[0130]
该菌株在cstr中生长不佳并且不能很好地产生异丙醇或乙醇(图4)。在反应器中需要大约6天的时间才能获得足够的细胞生物质来大量生产乙醇和异丙醇。在为期两周的实验过程中，发酵不稳定。因此，在adhe1 adhe2基因座处的敲入不会带来与在buda基因座
处的敲入相同的益处。
[0131]
实例5
[0132]
这个实例描述了其它基因或途径在buda基因座的整合。
[0133]
伍德-永达尔微生物已经被工程化以生产各种非天然产物，包括1-丁醇(wo 2008/115080、wo 2012/053905和wo 2017/066498)、丁酸盐(wo 2008/115080)、丁烯(wo 2012/024522)、丁二烯(wo 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(wo 2012/024522和wo 2013/185123)、乙烯(wo 2012/026833)、丙酮(wo 2012/115527)、异丙醇(wo 2012/115527)、脂质(wo 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-hp)(wo 2013/180581)、萜烯(包括异戊二烯)(wo 2013/180584)、脂肪酸(wo 2013/191567)、2-丁醇(wo 2013/185123)、1,2-丙二醇(wo 2014/036152)、1-丙醇(wo 2017/066498)、1-己醇(wo 2017/066498)、1-辛醇(wo 2017/066498)、分支酸盐衍生产物(wo 2016/191625)、3-羟基丁酸酯(wo 2017/066498)、1,3-丁二醇(wo 2017/066498)、2-羟基异丁酸酯或2-羟基异丁酸(wo 2017/066498)、异丁烯(wo 2017/066498)、己二酸(wo 2017/066498)、1,3-己二醇(wo 2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(wo 2017/066498)、2-丁-1-醇(wo 2017/066498)、异戊酸盐(wo 2017/066498)、异戊醇(wo 2017/066498)和单乙二醇(wo 2019/126400)。这些基因或途径中的任一个都可以在buda基因座处敲入以产生具有改进性能的菌株。
[0134]
在一个实施例中，敲入dna编码3-羟基丁酸酯途径，该途径包含例如thla和hbd。在一个实施例中，敲入dna编码另一种3-羟基丁酸酯途径，该途径包含例如thla、ctfab和hbd。在一个实施例中，敲入dna编码丁醇途径，该途径包含例如thla、hbd、bcd和etfab。在一个实施例中，敲入dna包含甲羟戊酸途径，该途径包含例如thla、hmgs和hmgr。这些途径可能受一种或多种启动子(例如，p
buda
和/或p
fer
)的控制下。
[0135]
本文引用的所有参考文献(包含出版物、专利申请和专利)均通过引用特此并入，其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应被视为承认现有技术形成了任何国家中所涉及领域中公知常识的一部分。
[0136]
除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包含但不限于”)。术语“基本上由
……
组成”将组合物、过程或方法的范围限制在特定的材料或步骤，或者限制在那些对组合物、过程或方法的基本和新颖特性没有实质性影响的材料或步骤。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，术语“约”是指所指定范围、值或结构的
±
20％，除非另有指示。
[0137]
除非本文中另有指示，否则本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独地指出落入所述范围内的每个单独的值的速记方法并且每个单独的值并入本说明书中，如同所述值在本文中被单独地叙述一样。例如，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围、整数范围、大小范围或厚度范围应被理解为包含所叙述范围内的任何整数的值并且在适当的情况下包含其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
[0138]
除非本文中另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以
以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对本公开的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的元件指示为实践本公开所必须的。
[0139]
本文描述了本公开的优选实施方式。在阅读前文描述后，对本领域的普通技术人员而言，那些优选实施方式的变型可以变得显而易见。诸位发明人预期技术人员可以在适当时采用此类变型，并且诸位发明人旨在使本公开以与本文具体描述的方式不同的其它方式来进行实践。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包含所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能变型中的任何组合。