一种Claudin18.2VLP产品的冻干方法与流程

一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法
技术领域
1.本发明提供了一种冻干方法，具体地，涉及一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法。


背景技术：

2.claudins是一个蛋白质家族，其作用是维持控制细胞间分子交换的紧密连接。广泛分布于胃、胰腺和肺组织，可用于诊断和治疗。
3.cldn18.2亚型是一种胃特异性亚型，自从sahin发现cldn18.2是一种高度选择性的分子，并且只在癌细胞中广泛表达，它就成为一种理想的靶点。
4.cldn18.2通常埋藏在胃粘膜中，正常组织中的单克隆抗体基本上接触不到，恶性肿瘤的发生会导致紧密连接的破坏，使肿瘤细胞表面的cldn18.2表位暴露出来，成为特定的靶点。因此，cldn18.2赋予靶向治疗的特异性。最近发现在胰腺癌(50％)、食管癌和肺癌中的表达也显示了诊断和治疗其他肿瘤的潜力。
5.vlp(virus-like particles)是一种由单个或多个结构蛋白(如衣壳蛋白)，自我组装形成的与天然病毒颗粒结构类似的纳米级蛋白颗粒，这些颗粒高度重复且有序，不具有病毒遗传物质，不能自我复制，易侵染进入细胞。vlp明确的结构、稳定性、非感染性以及包封分子的能力，在生物技术、化学和治疗等领域有着广泛的应用。
6.cldn18.2在her-2阴性胃癌患者中是一个很有前途的靶点，不仅选择性高，而且在人群患病率方面也很有潜力，是胃癌靶向治疗的理想补充。(包膜)vlp技术，是将聚集在细胞膜表面的构象完整的膜蛋白，组装在类病毒颗粒表面，从而获得可溶性的、高浓度的、正确折叠的完整多次跨膜蛋白。
7.而claudin18.2是四次跨膜蛋白，通过常规方法进行体外表达纯化得到全场跨膜蛋白是比较困难的，所以利用vlp技术可获得的claudin18.2的全长跨膜蛋白，获得的claudin18.2vlp具有完整表位，利于筛选识别靶标天然构象的功能性抗体。但claudin18.2vlp热稳定差，不易长期保存等问题。较理想的解决办法是进行制品的冻干保存，这样既可以延长保存期，有便于运输，利于生产。


技术实现要素：

8.本发明旨在克服上述缺陷，通过使用冷冻干燥技术将热稳定性差的claudin18.2vlp蛋白产品制成干粉，便于保存和运输。
9.冷冻干燥技术是先将制品冻结成固态，把物质的大量水分在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，物质本身留在冻结的冰架子中，从而使得干燥制品不失原有的固体骨架结构，保持物料原有的形态,且制品复水性极好。
10.具体的方法为：
11.本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：包括冻干工序；
12.上述冻干工序，包括升华干燥阶段；
13.其中，上述升华干燥阶段：将完成预冻阶段后的产品的真空度在1-10分钟内降至0-10帕斯卡后，在五个温度节点进行梯级升华干燥；
14.上述五个温度节点之间的温差为10-30℃；
15.上述五个温度节点的温度范围在-60℃～35℃之间选择。
16.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
17.上述五个温度节点，包含第一温度节点，第二温度节点，第三温度节点，第四温度节点，第五温度节点；
18.其中，上述第一温度节点选自-55℃～-45℃；
19.上述第二温度节点选自-35℃～-25℃；
20.上述第三温度节点选自-15℃～-5℃；
21.上述第四温度节点选自0℃～10℃；
22.上述第五温度节点选自20℃～30℃。
23.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
24.上述第一温度节点选为-50℃；
25.上述第二温度节点选为-30℃；
26.上述第三温度节点选自-10℃；
27.上述第四温度节点选为5℃；
28.上述第五温度节点选为25℃。
29.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
30.上述升华干燥的具体方法为：
31.s1.升温时间为150-200分钟，最终温度为-30℃，保温9-16小时；
32.s2.升温时间为1-10s，最终温度为-10℃，保温1-2小时；
33.s3.升温时间为1-10s，最终温度为5℃，保温1-2小时；
34.s4.升温时间为1-10s，最终温度为25℃，保温3-8小时。
35.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
36.上述预冻阶段：将产品于4℃保温1-2小时后，在30-50分钟从4℃降温至-50℃，在-50℃的温度下保温1-3h，将产品冻结完全。
37.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
38.还包括预处理工序；
39.上述预处理工序，在冻干工序之前进行；
40.上述预处理的工序包括如下步骤：
41.s0-1.向将蛋白原液中补加冻干保护剂；
42.s0-2.将s1的混合液分装至容器中。
43.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
44.上述冻干保护剂的补加终浓度为6-8％。
45.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
46.上述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇。
47.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
48.完成升华干燥阶段后，放掉真空，取出产品，在无菌环境下将产品进行压塞和轧盖，此时便完成claudin18.2 vlp的冻干成品。
49.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
50.上述冻干后的产品，其蛋白含量100ug，蛋白纯度》95％。
51.进一步地，本发明提供的一种claudin18.2 vlp产品的冻干方法，其特征在于：
52.将claudin18.2 vlp替换成任意其他蛋白。
附图说明
53.图1.本实施例1提供的冻干产品的外观结果；
54.图2.本实施例1提供的冻干产品的elisa检测结果；
55.图3.本实施例1提供的冻干品的高效液相色谱检测结果；
56.图4.对比实验结果。
具体实施方式
57.在具体的实施方式种，用于claudin18.2 vlp产品的冻干工序中；
58.包括预冻阶段和升华干燥阶段；
59.该预冻阶段：将产品于4℃保温1-2小时后，以30-50分钟的降温速率从4℃降温至-50℃，在-50℃的温度下保温1-3h，将产品冻结完全。
60.该升华干燥阶段：将完成预冻阶段后的产品的真空度在1-10分钟内降至0-10帕斯卡后，在五个温度节点进行梯级升华干燥；
61.该五个温度节点，包含第一温度节点，第二温度节点，第三温度节点，第四温度节点，第五温度节点；
62.第一温度节点选自-55℃～-45℃；
63.第二温度节点选自-35℃～-25℃；
64.第三温度节点选自-15℃～-5℃；
65.第四温度节点选自0℃～10℃；
66.第五温度节点选自20℃～30℃。
67.具体方法为：
68.步骤1.升温时间为150-200分钟，最终温度为第二温度节点，保温9-16小时；
69.步骤2.升温时间为1-10s，最终温度为第三温度节点，保温1-2小时；
70.步骤3.升温时间为1-10s，最终温度为第四温度节点，保温1-2小时；
71.步骤4.升温时间为1-10s，最终温度为第五温度节点，保温3-8小时。
72.基于上述方法，制备的冻干产品蛋白含量100ug，蛋白纯度》95％。
73.最有方案如下：
74.实施例1、claudin18.2 vlp产品的冻干
75.claudin18.2 vlp(产品号：cld-he1822，human claudin 18.2 protein-vlp)产品的冻干方法，包括以下步骤：
76.s1.将蛋白原液中补加终浓度为8％的海藻糖(可用甘露醇替代)；
77.s2.将蛋白混合液分装至2ml的西林瓶中，将液面体积不要超过西林瓶的1/3；
78.s3.将分装好的claudin18.2 vlp产品进行冻干，冻干主要包括3个阶段，分别是预冻阶段，升华干燥阶段和解析干燥阶段以及冻干后保存。
79.预冻阶段是先将冷冻干燥机降温至4℃后，将产品放至冷冻干燥机中，将冷冻干燥机4℃保温1-2h,以30-50min(最优选45min左右)的降温速率从4℃降温至-50℃，在-50℃的温度下保温1-3h(最优选3h左右)，将产品冻结完全；
80.升华阶段是将真空度1-10min内降至0-10帕斯卡，设置5个温度点，分别为-50℃，-30℃，-10℃，5℃25℃.预冻阶段结束后，开启隔板加热，将隔板温度设置成-30℃，升温时间为150-200min(最优选180min左右)，温度显示器显示温度为-30℃时，维持9-16h(最优选10h左右)；再将隔板温度升温至-10℃，维持2h左右此时干燥面基本到达瓶底；将隔板温度设定为5℃，维持2h；再将隔板温度控制设定为25℃，直至隔板温度到达25℃维持5h,冻干结束；
81.放掉真空，取出产品，再无菌环境下将产品进行压塞和轧盖，此时便完成claudin18.2 vlp的冻干成品。
82.实施例2、claudin18.2 vlp的冻干成品检测
83.随机抽取不同批次的冻干品，分别以下几个方面进行检测，结果表明成品外观的合格率》95％，蛋白含量100ug，蛋白纯度》95％，蛋白活性检测和蛋白原液一致。
84.具体如下：
85.外观检测：观察claudin18.2 vlp的冻干成品是否有鼓包，凹陷，缺损，喷瓶等现象，若无则判断为合格。本品外观如图1所示，外观合格率达到》95％以上。
86.纯度检测：高效液相色谱检测，结果如图2所示。
87.蛋白活性检测：elisa检测，结果如图3所示。
88.对比实验1：
89.以实施例的实验条件为基准，仅降低海藻糖的用量，使其为5％，从活性数据来看(图4中的4#)，活性影响不大，但外观不好，有塌陷。
90.对比实验2：
91.采用现有的工艺，即、在预冻阶段采用液氮进行冷冻，从活性数据来看(图4中的5#)，活性影响不大，但外观不好，有鼓包
92.对比实验3:
93.对节点的工艺条件进行调整，进行了如下对比试验发现，本发明提供的节点条件为最佳组合，对比实验如下：
94.对比3-1：分装好的样品先用液氮预冻完全，再将样品放至冷冻干燥机里，冻干程序如下：
95.第一温度节点选自-55℃～-45℃
ꢀꢀ
保温2h；
96.所述第二温度节点选自-30℃
ꢀꢀ
保温15个小时；
97.所述第三温度节点选自0℃
ꢀꢀ
保温2h；
98.所述第四温度节点选自25℃
ꢀꢀ
保温6h；
99.实验结果：鼓包，塌陷和萎缩
100.对比3-2：分装好的样品先用液氮预冻完全，再将样品放至冷冻干燥机里，冻干程序如下：
101.第一温度节点选自-50℃
ꢀꢀꢀ
保温2.5h；
102.第二温度节点选自-30℃
ꢀꢀ
保温1h(升温速率30min)；
103.第三温度节点选自-50℃
ꢀꢀ
保温1.5h；
104.第四温度节点选自-30℃
ꢀꢀ
保温15个小时；
105.第五温度节点选自0℃
ꢀꢀ
保温2h；
106.第六温度节点选自25℃
ꢀꢀ
保温6h；
107.实验结果：鼓包，塌陷和萎缩
108.对比3-3：分装好的样品直接放至冷冻干燥机里，冻干程序如下：
109.第一温度节点选自4℃
ꢀꢀ
保温1h；
110.第二温度节点选自-50℃
ꢀꢀ
保温3h；
111.第三温度节点选自-30℃
ꢀꢀ
保温10个小时；
112.第四温度节点选自-10℃
ꢀꢀ
保温2h；
113.第五温度节点选自5℃
ꢀꢀ
保温2h
114.第六温度节点选自25℃
ꢀꢀ
保温5h；
115.实验结果：分层
116.对比3-4：分装好的样品直接放至冷冻干燥机里，冻干程序如下：
117.第一温度节点选自-50℃
ꢀꢀ
保温5h；
118.第二温度节点选自-30℃
ꢀꢀ
保温15h(升温速率3h)；
119.第三温度节点选自5℃ 保温2h；
120.第四温度节点选自25℃
ꢀꢀ
保温6h；
121.实验结果：鼓包，分层。
122.实施例3、
123.以human cd40蛋白(货号：cd4-hm140，恺佧生物的产品)进行替代，以实施例1的方法进行了实验。
124.产品结果如下：
125.结果表明成品外观的合格率》95％，蛋白含量100ug，蛋白纯度》95％，蛋白活性检测和蛋白原液一致。
126.经实验发现，该方法对于缓冲体系是pbs的蛋白效果很好，但对于复杂缓冲体系的，外观效果略差于pbs体系的蛋白。