T细胞淋巴瘤的指标的检测方法及其应用

t细胞淋巴瘤的指标的检测方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及t细胞淋巴瘤的指标的检测方法及其应用。


背景技术：

2.t细胞淋巴瘤是由作为淋巴细胞之一的t细胞的癌变产生的。产生t细胞淋巴瘤的部位大体分为淋巴系统组织和淋巴外器官(结外器官)这两种。淋巴系统组织是承担排除病原体(例如，细菌或病毒)等免疫功能的组织或器官。作为淋巴系统组织的具体例，可以举出淋巴结、存在于胸部附近的胸腺、脾脏以及扁桃体等。作为淋巴外器官的具体例，可以举出骨髓、肺、大肠、小肠以及皮肤等。淋巴系统组织以及淋巴外器官分布于全身，因此，t细胞淋巴瘤有可能产生于全身的所有部位。
3.产生于皮肤的t细胞淋巴瘤被称为皮肤t细胞淋巴瘤(cutaneous t cell lymphoma：ctcl)。作为ctcl中包括的疾病的具体例，可以举出蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
4.作为t细胞淋巴瘤的诊断，可以举出基于病变部的视诊的诊断、以及使用了采自病变部的组织的生物体组织诊断等。作为生物体组织诊断的具体例，可以举出基于基因分析的诊断(参照专利文献1和2)、以及基于采自病变部的组织中的t细胞的癌变检查的诊断等。作为检查t细胞癌变的方法的具体例，可以举出对癌变t细胞的标志物分子ccr4进行荧光染色的方法等(参照专利文献3)。另外，进行了通过使用抗ccr4抗体的以ccr4阳性细胞为靶标的给药来对t细胞淋巴瘤进行治疗的研究。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：wo2014/178432
8.专利文献2：日本特表2005-518790号公报
9.专利文献3：日本特表2013-517464号公报


技术实现要素：

10.发明所要解决的课题
11.癌细胞发生各种各样的变化，同时其恶性程度也发生变化。如果能够在各种阶段(例如，早期)检测出癌细胞，则有可能能够容易地治疗癌症。因此，需要开发出一种用于诊断t细胞淋巴瘤的指标的新检测方法。
12.本发明的一个实施方式是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种t细胞淋巴瘤的指标的新检测方法。
13.根据本发明，可以提供一种t细胞淋巴瘤的指标的新检测方法。
14.用于解决课题的手段
15.本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果新发现了乙酰化微管蛋白在t
细胞淋巴瘤中大量表达，由此完成了本发明。
16.即，为了解决上述课题，本发明的一个实施方式包括以下构成。
17.[1]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法包括对采自被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0018]
[2]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒具备抗乙酰化微管蛋白抗体。
[0019]
[3]本发明的一个方式的检测方法是用于评价药剂给药后的被测体中的t细胞淋巴瘤的抑制效果的指标的检测方法，其中，包括对采自药剂给药后的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0020]
[4]本发明的一个方式的评价方法为评价被测试样是否是对t细胞淋巴瘤具有抑制作用的物质的评价方法，其中，包括：使被测试样与采自罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞接触的步骤；和对上述接触了被测试样的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0021]
[5]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的治疗剂含有抑制乙酰化微管蛋白的凝集的试剂和/或抑制微管蛋白的乙酰化的试剂作为有效成分。
[0022]
发明的效果
[0023]
根据本发明的一个方式，可以提供一种t细胞淋巴瘤的指标的新检测方法。
附图说明
[0024]
图1的(a)～(d)是对本发明的实施方式的乙酰化微管蛋白阳性细胞的细胞表面标志物表达方式进行分析的图像。
具体实施方式
[0025]
下面，对本发明的一个实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限定于以下说明的各构成，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，将不同实施方式和实施例中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式和实施例也包含在本发明的技术范围中。另外，本说明书中所记载的全部文献在本说明书中作为参考文献引入。本说明书中，关于数值范围，在记为“a～b”时，该记载是指“a以上b以下”。
[0026]
[1.t细胞淋巴瘤的指标的检测方法]
[0027]
本发明的一个实施方式的“t细胞淋巴瘤的指标的检测方法”可以是“用于诊断t细胞淋巴瘤的指标的检测方法”，可以是“用于诊断t细胞淋巴瘤的数据的取得方法”，也可以是“用于诊断t细胞淋巴瘤的辅助方法”。
[0028]
本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法包括对采自被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。作为上述t细胞淋巴瘤，可以举出例如蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
[0029]
(被测体)
[0030]
被测体没有特别限定，可以举出例如人以及非人动物。非人动物没有特别限定，可以举出例如实验动物、宠物以及家畜，更具体而言，可以举出小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、山羊、猪以及马。上述被测体也可以为从上述人或非人动物采集的组织(例如，皮肤组织)。
[0031]
(t细胞)
[0032]
作为检测乙酰化微管蛋白的t细胞，没有特别限定，可以举出例如cd4

t细胞、ccr4

t细胞、cd8

t细胞、cd4

ccr4

t细胞、cd8

ccr4

t细胞以及cd4

cd8

ccr4

t细胞。需要说明的是，cd4和cd8为t细胞的表面抗原，ccr4为存在于t细胞中的趋化因子受体。
[0033]
已知ccr4在恶性程度高的癌中高频率表达。因此，检测乙酰化微管蛋白的t细胞可以为cd4

t细胞、cd8

t细胞、ccr4

t细胞、cd4

ccr4

t细胞、cd8

ccr4

t细胞或cd4

cd8

ccr4

t细胞。若使用cd4

t细胞或cd8

t细胞作为检测乙酰化微管蛋白的t细胞，则能够诊断早期t细胞淋巴瘤。若使用ccr4

t细胞作为检测乙酰化微管蛋白的t细胞，则能够诊断晚期t细胞淋巴瘤。若使用cd4

ccr4

t细胞或cd8

ccr4

t细胞作为检测乙酰化微管蛋白的t细胞，则能够诊断早期t细胞淋巴瘤和晚期t细胞淋巴瘤两者。
[0034]
上述从被测体采集t细胞的方法没有特别限定，例如，从被测体采集组织(例如，皮肤组织)的切片，以包含在该组织中的状态采集t细胞即可。
[0035]
(乙酰化微管蛋白)
[0036]
微管是主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白的聚合物形成的圆筒形状的蛋白质纤维。在微管中经常发生α-微管蛋白和β-微管蛋白的聚合和解聚，通过该聚合和解聚的平衡控制了细胞的形态以及细胞的运动。
[0037]
已知微管受到各种修饰，作为该修饰的示例，可以举出微管蛋白的乙酰化。认为微管蛋白的乙酰化促进微管蛋白的聚合，由此使微管的弹性、微管对微管崩解的抵抗力、以及细胞对从外部施加于细胞的力的抵抗力增加。
[0038]
由本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法检测出的乙酰化微管蛋白可以为α-微管蛋白、β-微管蛋白、γ-微管蛋白、δ-微管蛋白或ε-微管蛋白被乙酰化而成的微管蛋白，这些之中，优选α-微管蛋白被乙酰化而成的微管蛋白。若为该构成，则能够提供精度高的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法。
[0039]
乙酰化微管蛋白可以为所有生物种的微管蛋白、所有亚型的微管蛋白、或者这些微管蛋白的变体被乙酰化而成的微管蛋白。
[0040]
例如，人的α-微管蛋白以“登录号：nm 006009.4”登录于genebank中。乙酰化微管蛋白可以是下述(1)或(2)的蛋白质被乙酰化而成的。需要说明的是，被乙酰化的氨基酸可以是从序列号1所示的氨基酸序列的氨基端数起第40位的赖氨酸：
[0041]
(1)由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0042]
(2)由序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成且具有微管形成活性(或者与β-微管蛋白的聚合活性)的蛋白质。
[0043]
上述(1)的蛋白质相当于人的α-微管蛋白(登录号：nm 006009.4)。另一方面，上述(2)的蛋白质相当于人以外的生物种的α-微管蛋白、人或人以外的生物种的α-微管蛋白的亚型或它们的变体。作为(2)的蛋白质，可以举出例如微管蛋白α1a、微管蛋白α1b、微管蛋白α1c、微管蛋白α2、微管蛋白α3c/d、微管蛋白α4a以及微管蛋白α-8链亚型1等。
[0044]
本说明书中，“1个或多个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加”没有特别限定，是指优选20个以下、更优选15个以下、更优选10个以下、更优选9个以下、更优选8个以下、更优选7个以下、更优选6个以下、更优选5个以下、更优选4个以下、更优选3个以下、更优选2个以下、最优选1个以下的氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加。
[0045]
蛋白质是否具有“微管形成活性(或者与β-微管蛋白的聚合活性)”可以通过使该蛋白质在所期望的细胞内表达，利用细胞染色等方法检测该蛋白质是否被引入微管的结构内来进行确认。若能通过细胞染色等方法确认该蛋白质被引入微管的结构内，则可以判定该蛋白质具有“微管形成活性(或者与β-微管蛋白的聚合活性)”。
[0046]
由本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法检测出的乙酰化微管蛋白中，被乙酰化的氨基酸以及氨基酸的位置没有限定。例如，在人的α-微管蛋白(登录号：nm 006009.4，换言之，由序列号1所示的氨基酸序列构成的蛋白质)中，在从氨基端数起位于第40位的赖氨酸(k40)处发生乙酰化和脱乙酰化。因此，由本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法检测出的乙酰化微管蛋白优选为该赖氨酸(k40)被乙酰化的微管蛋白。
[0047]
(乙酰化微管蛋白的检测)
[0048]
对乙酰化微管蛋白进行检测的步骤只要是能够检测出乙酰化微管蛋白的步骤即可，用于检测乙酰化微管蛋白的具体方法没有限定。
[0049]
作为对乙酰化微管蛋白进行检测的步骤，可以举出例如通过使用了抗乙酰化微管蛋白抗体的免疫学方法或质谱法对乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。以下，对各方法进行说明。
[0050]
《a.免疫学方法》
[0051]
免疫学方法只要是使用抗乙酰化微管蛋白抗体对乙酰化微管蛋白进行检测的方法即可，具体方法没有特别限定。作为免疫学方法，可以举出例如免疫组织染色法、免疫细胞染色法、蛋白免疫印迹法以及流式细胞术法。这些免疫学方法是公知的，因此省略对这些免疫学方法的详细情况的说明。
[0052]
抗乙酰化微管蛋白抗体只要是与上述乙酰化微管蛋白特异性结合的抗体即可，没有特别限定。作为该乙酰化微管蛋白抗体，可以举出例如单克隆抗体、多克隆抗体、以及这些抗体的片段(例如，fab片段、f(ab’)2片段以及单链抗体)。
[0053]
单克隆抗体例如可以通过在所期望的培养基中对产生针对乙酰化微管蛋白的单克隆抗体的杂交瘤进行培养而得到培养上清，根据需要对该培养上清进行提纯而得到。杂交瘤可以通过将乙酰化微管蛋白给药至动物(例如小鼠、大鼠)的静脉内、皮下或腹腔内，之后由该动物得到抗体产生细胞，使该抗体产生细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到。
[0054]
多克隆抗体例如可以通过将乙酰化微管蛋白给药至动物(例如兔)的静脉内、皮下或腹腔内，之后由该动物得到血清，根据需要对该血清进行提纯而得到。
[0055]
fab片段例如可以通过将针对乙酰化微管蛋白的单克隆抗体利用木瓜蛋白酶进行消化，根据需要对该消化产物进行提纯而得到。
[0056]
f(ab’)2片段例如可以通过将针对乙酰化微管蛋白的单克隆抗体利用胃蛋白酶进行消化，根据需要对该消化产物进行提纯而得到。
[0057]
单链抗体例如可以通过将含有核酸构建体(其是将编码针对乙酰化微管蛋白的单克隆抗体的轻链可变区的核酸、编码接头的核酸、和编码该单克隆抗体的重链可变区的核酸连接而成的)的噬菌粒载体导入至宿主细胞中，在该宿主细胞内表达由核酸构建体编码的多肽，根据需要对该多肽进行提纯而得到。
[0058]
乙酰化微管蛋白的检测可以通过检测由与抗乙酰化微管蛋白抗体(一次抗体)直
接结合的标志物、或与抗乙酰化微管蛋白抗体所结合的二次抗体直接结合的标志物生成的信号来进行。另外，也可以基于由该标志物生成的信号的强度来检测乙酰化微管蛋白的浓度。
[0059]
作为上述标志物，可以举出例如酶、酶底物、放射性同位素、发光物质以及荧光色素。
[0060]
作为上述酶，可以举出例如过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。这些酶与抗体的结合可以通过使用交联剂(例如，马来酰亚胺化合物和n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物)的公知方法来进行。
[0061]
作为上述酶底物，可以根据所使用的酶来使用公知的物质。例如，在使用过氧化物酶作为酶的情况下，使用邻苯二胺(opd)或四甲基联苯胺(tmb)等，在使用碱性磷酸酶作为酶的情况下，可以使用氯化硝基四氮唑蓝(nbt)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酶对甲苯胺盐(bcip)的混合底物等。
[0062]
作为上述放射性同位素，可以举出例如
125
i、3h、
35
s以及
14
c等在通常的放射免疫分析中使用的放射性同位素。
[0063]
作为上述发光物质，可以举出例如异鲁米诺、吖啶酯以及光泽精等。
[0064]
作为上述荧光色素，可以举出例如fitc(异硫氰酸荧光素异构体-i)、hex(6-羧基-2’,4’,7’,4,7,-六荧光素、绿色荧光色素)、ned(黄色荧光色素)、fam(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素、蓝色荧光色素)、pet(红色荧光色素)、vic(绿色荧光色素)、liz(橙色荧光色素)、荧光素(fluorescein)、罗丹明(rhodamin)、alexa fluor、cy dye、qd(量子点)以及hilyte fluor等。
[0065]
《b.质谱法》
[0066]
质谱法只要是能够检测出质量由于乙酰化而增加的微管蛋白的方法即可，具体方法没有特别限定。作为质谱法，可以举出例如影像质谱法。
[0067]
影像质谱法是通过将利用质谱仪的物质鉴定(质谱)与利用显微镜的试样观察进行组合而使试样表面的目标成分的有无和分布可视化的方法。
[0068]
上述质谱法可以利用任意方法进行。具体而言，上述质谱法可以通过试样的电离、电离试样的分离和分离后的试样的检测来进行。
[0069]
作为将试样电离的方法，没有特别限定，例如，可以根据试样的形态使用基质辅助激光解吸电离法(matrix assisted laser desorption ionisation：maldi)、激光解吸电离法、溅射(二次离子发射)法、高速原子碰撞法、电喷射电离法、解吸离子电喷雾电离法、扫描型探针电喷雾电离法、大气压化学电离法、大气压直接电离法、感应耦合等离子体法、电子电离法、化学电离法、场解吸法等任意的方法。
[0070]
作为将电离后的试样分离的方法，没有特别限定，可以举出例如飞行时间型、磁偏转型、四极型、离子阱型以及傅利叶变换离子回旋加速器共振型等分离方法。
[0071]
作为检测电离后的试样的方法，没有特别限定，可以举出例如使用电子倍增管、微通道板以及法拉第杯等的检测方法。
[0072]
另外，上述质谱法也可以是将上述电离方法中的任意方法、上述分离方法中的任意方法和上述检测方法中的任意方法适当组合而成的质谱法。具体而言，作为上述质谱法，可以举出二次离子质谱法(secondary ion mass spectrometry：sims)、飞行时间型质谱法
(time of flight mass spectrometry：tof-ms)以及maldi-tof-ms等。
[0073]
[2.t细胞淋巴瘤的检查试剂盒]
[0074]
本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒具备抗乙酰化微管蛋白抗体。作为上述t细胞淋巴瘤，可以举出例如蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
[0075]
本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒也可以具备结合有标记物质的抗乙酰化微管蛋白抗体。本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒也可以具备(i)作为一次抗体的抗乙酰化微管蛋白抗体；和(ii)用于检测该一次抗体的标记物质或结合有标记物质的二次抗体。需要说明的是，已经对抗乙酰化微管蛋白抗体的详细情况进行了说明，因此，此处省略其说明。
[0076]
本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒可以具备为了进行上述免疫学方法所需要的二次抗体、显色试剂、封闭试剂、缓冲液、微板和/或管等。
[0077]
根据本发明的一个实施方式的检查试剂盒，能够迅速且简便地对乙酰化微管蛋白进行检测。
[0078]
[3.用于评价t细胞淋巴瘤的抑制效果的指标的检测方法]
[0079]
本发明的一个实施方式的检测方法是用于评价药剂给药后的被测体中的t细胞淋巴瘤的抑制效果的指标的检测方法，其中，包括对采自药剂给药后的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。根据该构成，能够判定给药至被测体的药剂是否对t细胞淋巴瘤的治疗有效。进而，根据该判定结果，能够容易地选择(i)继续进行给药中的药剂的给药；或者(ii)中止给药中的药剂的给药，开始其他药剂的给药。
[0080]
作为上述t细胞淋巴瘤，可以举出例如蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
[0081]
本说明书中，“t细胞淋巴瘤的抑制效果”是指：杀死构成t细胞淋巴瘤的t细胞的效果；使构成t细胞淋巴瘤的t细胞恢复为正常t细胞的效果；或者抑制构成t细胞淋巴瘤的t细胞的恶性化的效果(例如，防止或减少恶性肿瘤标志物表达的效果)。
[0082]
上述药剂没有特别限定，可以举出例如无机化合物和有机化合物。药剂可以以原本的状态使用，也可以以溶解于溶剂中的状态使用。作为该溶剂，可以举出例如生理盐水、磷酸缓冲生理盐水以及水。
[0083]
上述被测体没有特别限定，可以举出例如人以及非人动物。非人动物没有特别限定，可以举出例如实验动物、宠物以及家畜，更具体而言，可以举出小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、山羊、猪以及马。上述被测体也可以为从上述人或非人动物采集的组织(例如，皮肤组织)。
[0084]
从被测体采集t细胞的方法没有特别限定，例如，从被测体采集组织(例如，皮肤组织)的切片，以包含在该组织中的状态采集t细胞即可。
[0085]
对t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的方法没有特别限定，例如，使用上述《a.免疫学方法》的栏或《b.质谱法》的栏中说明的方法即可。
[0086]
本发明的一个实施方式的检测方法可以在对采自药剂给药后的被测体的t细胞中
的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤之后，具有基于检测结果对药剂给药后的被测体中的t细胞淋巴瘤的抑制效果进行评价的步骤。
[0087]
在评价步骤中，例如，将采自药剂给药后的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量与采自药剂给药前的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量(对照)进行比较。若采自药剂给药后的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量比采自药剂给药前的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量减少，则可以判定该药剂的给药具有t细胞淋巴瘤的抑制效果。需要说明的是，“t细胞中的乙酰化微管蛋白的量”可以以“表达乙酰化微管蛋白的t细胞的数量”或“表达乙酰化微管蛋白的t细胞的比例”的方式算出。另外，也可以基于上述对照设定规定的阈值来进行评价。
[0088]
[4.物质的评价方法]
[0089]
本发明的一个实施方式的评价方法为评价被测试样是否是对t细胞淋巴瘤具有抑制作用的物质的评价方法，其中，包括：使被测试样与采自罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞接触的步骤；和对上述接触了被测试样的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。根据该构成，能够容易地筛选t细胞淋巴瘤的治疗剂。
[0090]
作为上述t细胞淋巴瘤，可以举出例如蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
[0091]
本说明书中，“对于t细胞淋巴瘤的抑制效果”是指：杀死构成t细胞淋巴瘤的t细胞的效果；使构成t细胞淋巴瘤的t细胞恢复为正常t细胞的效果；或者抑制构成t细胞淋巴瘤的t细胞的恶性化的效果(例如，防止或减少恶性肿瘤标志物表达的效果)。
[0092]
上述被测试样没有特别限定，可以举出例如无机化合物、有机化合物、植物提取物、微生物提取物以及各种细胞的培养上清。被测试样可以以原本的状态使用，也可以以溶解于溶剂中的状态使用。作为该溶剂，可以举出例如生理盐水、磷酸缓冲生理盐水以及水。
[0093]
上述被测体没有特别限定，可以举出例如人以及非人动物。非人动物没有特别限定，可以举出例如实验动物、宠物以及家畜，更具体而言，可以举出小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、山羊、猪以及马。上述被测体也可以为从上述人或非人动物采集的组织(例如，皮肤组织)。
[0094]
从被测体采集t细胞的方法没有特别限定，例如，从被测体采集组织(例如，皮肤组织)的切片，以包含在该组织中的状态采集t细胞即可。
[0095]
使被测试样与t细胞接触的方法没有特别限定，可以在使被测试样与t细胞接触后将该t细胞培养所期望的时间。需要说明的是，在该培养的期间，可以使t细胞与被测试样不接触，也可以使t细胞与被测试样接触。需要说明的是，培养时间没有特别限定，可以为1天～3天、可以为1天～7天、也可以为7天以上。
[0096]
对t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的方法没有特别限定，例如，使用上述《a.免疫学方法》的栏或《b.质谱法》的栏中说明的方法即可。
[0097]
本发明的一个实施方式的评价方法可以在对接触了被测试样的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤之后，具有基于检测结果评价被测试样是否是对t细胞淋巴瘤具有抑制作用的物质的步骤。
[0098]
在评价步骤中，例如，将采自接触了被测试样的罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细
胞中的乙酰化微管蛋白的量与采自未接触被测试样的罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量(对照)进行比较。若采自接触了被测试样的罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量比采自未接触被测试样的罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白的量减少，则可以判定该被测试样是对t细胞淋巴瘤具有抑制作用的物质。需要说明的是，“t细胞中的乙酰化微管蛋白的量”可以以“表达乙酰化微管蛋白的t细胞的数量”或“表达乙酰化微管蛋白的t细胞的比例”的方式算出。另外，也可以基于上述对照设定规定的阈值来进行评价。需要说明的是，“罹患t细胞淋巴瘤的被测体”可以为同一被测体，也可以为不同的被测体，但从更准确地评价物质的方面出发，优选为同一被测体。
[0099]
[5.t细胞淋巴瘤的治疗剂]
[0100]
本发明的一个实施方式的t细胞淋巴瘤的治疗剂含有抑制微管蛋白的聚合的试剂、抑制微管蛋白的乙酰化的试剂、和/或抑制乙酰化微管蛋白的凝集的试剂作为有效成分。
[0101]
作为上述抑制微管蛋白的聚合的试剂，可以举出例如asmp-3(产品名：安丝菌素p-3(ansamitocin p-3)，产自珍贵束丝放线菌(actinosynnema pretiosum))、地美可辛(产品名：秋水仙胺(colcemid))、秋水仙碱(产品名：秋水仙碱(colchicine)，产自秋水仙(colchicum autumnale))、微管减少剂(diminisher of microtubule)；2-(1r-异丙基-2-羟乙基氨基)-6-(3-氨基苯硫基)-9-异丙基嘌呤；ng72(产品名：diminutol)、(5s)-1-[(2s)-o-(n,n-val-val-n-me-val-pro-pro)-2-羟基异戊酰基]-2-氧代-4-甲氧基-5-苄基-3-吡咯啉(产品名：海兔毒素15(dolastatin 15))、nsc 698666(产品名：印丹诺辛(indanocine))、10-[(3-羟基-4-甲氧基亚苄基)]-9(10h)-蒽酮(产品名：微管聚合抑制剂(tubulin polymerization inhibitor))、(e)-1,3-二氢-6-甲氧基-3-(3,4,5-三甲氧基亚苄基)-1h-吲哚-2-酮(产品名：微管聚合抑制剂ii(tubulin polymerization inhibitor ii))、康普瑞汀(combrestatin)、2-甲氧基雌二醇、甲氧基苯磺酰胺类、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、海兔毒素类(dolastatins)、软海绵素类(halichondrins)、哈米特林类(hemiasterlins)以及大环内酯52。
[0102]
作为上述抑制微管蛋白的乙酰化的试剂，可以举出例如n-(1h-苯并三唑-1-基)-2,4-二氯苯甲酰胺；1-(2,4-二氯苯甲酰基)-1h-苯并三唑(产品名：itsa1)、以及α-微管蛋白n-乙酰转移酶(atat1)的抑制剂。
[0103]
本发明的一个实施方式的治疗剂中包含的有效成分的量没有特别限定，优选的是，在将治疗剂整体设为100质量％的情况下，可以为0.001质量％～100质量％、可以为0.01质量％～100质量％、可以为0.1质量％～100质量％、可以为0.1质量％～95质量％、可以为0.1质量％～90质量％、可以为0.1质量％～80质量％、可以为0.1质量％～70质量％、可以为0.1质量％～60质量％、可以为0.1质量％～50质量％、可以为0.1质量％～40质量％、可以为0.1质量％～30质量％、可以为0.1质量％～20质量％、也可以为0.1质量％～10质量％。
[0104]
只要不改变其治疗功能，t细胞淋巴瘤的治疗剂也可以包含其他成分。该其他成分只要是药学上允许的成分即可，可以举出例如缓冲剂、ph调节剂、等渗剂、防腐剂、赋形剂、载体、稀释剂、溶剂、增溶剂、稳定剂、抗氧化剂、高分子量聚合物、填充剂、粘合剂、表面活性
剂以及稳定剂等。
[0105]
作为上述缓冲剂，可以举出磷酸、磷酸盐、硼酸、硼酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、乙酸、乙酸盐、碳酸、碳酸盐、酒石酸、酒石酸盐、ε-氨基己酸以及氨基丁三醇等。作为上述磷酸盐，可以举出磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾以及磷酸氢二钾等。作为上述硼酸盐，可以举出硼砂、硼酸钠以及硼酸钾等。作为上述柠檬酸盐，可以举出柠檬酸钠、柠檬酸二钠以及柠檬酸三钠等。作为上述乙酸盐，可以举出乙酸钠和乙酸钾等。作为上述碳酸盐，可以举出碳酸钠和碳酸氢钠等。作为上述酒石酸盐，可以举出酒石酸钠和酒石酸钾等。
[0106]
作为上述ph调节剂，可以举出盐酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠以及氢氧化钾等。
[0107]
作为上述等渗剂，可以举出离子性等渗剂(氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等)以及非离子性等渗剂(甘油、丙二醇、山梨糖醇、甘露醇等)。
[0108]
作为上述防腐剂，可以举出苯扎氯铵、苯扎溴铵、苄索氯铵、山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯以及氯丁醇等。
[0109]
作为上述抗氧化剂，可以举出抗坏血酸、生育酚、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、异抗坏血酸钠、没食子酸丙酯以及亚硫酸钠等。
[0110]
作为上述高分子量聚合物，可以举出甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧基乙烯基聚合物以及聚乙二醇等。
[0111]
作为上述载体、赋形剂和稀释剂，可以举出乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。
[0112]
作为上述溶剂和增溶剂，可以举出甘油、dmso、dma、n-甲基吡咯烷酮、乙醇、苯甲醇、异丙醇、各种分子量的聚乙二醇(peg300和peg400等)以及丙二醇等。
[0113]
作为上述表面活性剂，可以举出非离子型、阴离子型、阳离子型、两性离子型、聚合物性以及两性的表面活性剂。
[0114]
作为上述稳定剂，可以举出脂肪酸、脂肪醇、醇、长链脂肪酸酯、长链醚、脂肪酸的亲水性衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醚、聚乙烯醇、烃、疏水性聚合物、吸湿性聚合物以及酰胺类似物。
[0115]
另外，上述其他成分可以包含1种或2种以上的成分。
[0116]
此外，上述其他成分的量没有特别限定，在将治疗剂整体设为100质量％的情况下，可以为0质量％～99.999质量％、可以为0质量％～99.99质量％、可以为0质量％～99.9质量％、可以为5质量％～99.9质量％、可以为10质量％～99.9质量％、可以为20质量％～99.9质量％、可以为30质量％～99.9质量％、可以为40质量％～99.9质量％、可以为50质量％～99.9质量％、可以为60质量％～99.9质量％、可以为70质量％～99.9质量％、可以为80质量％～99.9质量％、也可以为90质量％～99.9质量％。
[0117]
t细胞淋巴瘤的治疗剂的给药类型没有特别限定，可以举出口服剂、非口服剂以及
涂布剂等。
[0118]
作为可应用上述治疗剂的癌，可以举出例如蕈样肉芽肿病、塞泽里综合征、成人t细胞白血病淋巴瘤、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴增生性疾病(例如，间变性大细胞淋巴瘤)、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤等。
[0119]
[6.其他]
[0120]
本发明也可以如下构成：
[0121]
[1]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法包括对采自被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0122]
[2]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的指标的检测方法中，上述对乙酰化微管蛋白进行检测的步骤是通过使用抗乙酰化微管蛋白抗体的免疫学方法或质谱法对乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0123]
[3]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的检查试剂盒具备抗乙酰化微管蛋白抗体。
[0124]
[4]本发明的一个方式的检测方法是用于评价药剂给药后的被测体中的t细胞淋巴瘤的抑制效果的指标的检测方法，其中，包括对采自药剂给药后的被测体的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0125]
[5]本发明的一个方式的评价方法是评价被测试样是否是对t细胞淋巴瘤具有抑制作用的物质的评价方法，其中，包括：使被测试样与采自罹患t细胞淋巴瘤的被测体的t细胞接触的步骤；和对上述接触了被测试样的t细胞中的乙酰化微管蛋白进行检测的步骤。
[0126]
[6]本发明的一个方式的t细胞淋巴瘤的治疗剂含有抑制乙酰化微管蛋白的凝集的试剂和/或抑制微管蛋白的乙酰化的试剂作为有效成分。
[0127]
本发明也可以如下构成：
[0128]
《1》一种t细胞淋巴瘤的治疗方法，其具有下述步骤：将含有抑制乙酰化微管蛋白的凝集的试剂和/或抑制微管蛋白的乙酰化的试剂作为有效成分的t细胞淋巴瘤的治疗剂给药至被测体(例如，人或非人动物)。
[0129]
《2》抑制乙酰化微管蛋白的凝集的试剂和/或抑制微管蛋白的乙酰化的试剂在制造t细胞淋巴瘤的治疗剂中的用途。
[0130]
实施例
[0131]
下面，对本发明的一个实施例进行说明。需要说明的是，本发明不限定于下述实施例的记载，可以在本发明的范围内进行各种变更。
[0132]
[表达方式分析]
[0133]
(采集、固定)
[0134]
采集来自罹患t细胞淋巴瘤的被测体(患者)的病变部的皮肤、以及来自正常部的皮肤，制成石蜡包埋样品，利用二甲苯进行脱蜡。接着，将该脱蜡后的样品分别在100％乙醇、95％乙醇和纯净水中各浸渍10分钟，缓慢地加水。
[0135]
(抗原活化、透过处理)
[0136]
之后，将加水后的样品在1mm edta(乙二胺四乙酸)水溶液中煮沸15分钟，使抗原活化。接着，将该样品在封闭/透过处理剂中(包含含有10％血清和0.1w/w％聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯的pbs(磷酸盐缓冲盐水)溶液的试剂)孵育30分钟，由此对该样品进行封闭和透过处理。
[0137]
(免疫染色)
[0138]
该样品中，为了分别对乙酰化微管蛋白、胰岛蛋白(langerin)、ccr4以及cd4进行检测，使用下述一次抗体。
[0139]
·
抗乙酰化微管蛋白抗体[sigma-aldrich公司制造、商品名：单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体6-11b-1克隆、产品编号：t6793]、
[0140]
·
抗胰岛蛋白抗体[abcam公司制造、商品名：抗胰岛蛋白[epr15863]抗体、商品目录编号：ab192027]、
[0141]
·
抗ccr4抗体[abcam公司制造、商品名：抗ccr4抗体、商品目录编号：ab1669]、
[0142]
·
抗cd4抗体[proteintech公司制造、商品名：cd4多克隆抗体、商品目录编号：19068-1-ap]。
[0143]
使这些抗体与样品在4℃下反应一晩。另外，这些抗体的使用浓度和反应方法依照各自的操作规程进行。反应后，使用清洗液a[含有0.1w/w％聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯的pbs(磷酸盐缓冲盐水)溶液]对样品进行清洗。
[0144]
为了检测上述一次抗体，使用下述二次抗体。
[0145]
·
荧光色素标记抗兔igg抗体[abcam公司制造、商品名：山羊抗兔igg h&l(荧光色素：alexa fluor(注册商标)594)、商品目录编号：ab150080]、
[0146]
·
荧光色素标记抗山羊igg抗体[abcam公司制造、商品名：驴抗山羊igg h&l(荧光色素：alexa fluor(注册商标)594)、商品目录编号：ab150132]、
[0147]
·
荧光色素标记抗小鼠igg抗体[abcam公司制造、商品名：山羊抗小鼠igg h&l(荧光色素：alexa fluor(注册商标)488、商品目录编号：ab150113)]。
[0148]
使这些抗体与样品在4℃下反应一晩。另外，这些抗体的使用浓度和反应方法依照各自的操作规程进行。
[0149]
(核染色)
[0150]
接着，使用下述核染色剂对核进行染色。
[0151]
·
核染色剂hoechst 33342[thermo fisher公司制造、商品名：hoechst 33342、三盐酸化物、三水合物10mg/ml水溶液、产品编号：h3570]。
[0152]
使该核染色剂与样品在4℃下反应一晩。另外，使用浓度和反应依照该核染色剂的操作规程进行。
[0153]
(封入)
[0154]
利用上述清洗液a对所得到的试样分别进行清洗后，使用下述防褪色用封入剂将其封入，得到显微镜观察用的试样。
[0155]
·
防褪色用封入剂[thermo fisher scientific co.,ltd.制造、商品名：prolong(注册商标)gold防褪色用封入剂、产品编号：p36934]
[0156]
(显微镜观察)
[0157]
使用共聚焦显微镜[奥林巴斯株式会社制造、产品编号：fv1200]，对各试样中包含的朗格汉斯细胞、ccr4阳性细胞以及cd4阳性细胞进行检测，分析乙酰化微管蛋白阳性细胞中的细胞表面标志物的表达方式。在显微镜观察中，为了记录各荧光，一边切换荧光滤光器一边进行拍摄、图像化。将其结果示于图1。
[0158]
[结果]
[0159]
图1中，(a)是对朗格汉斯细胞标志物与乙酰化微管蛋白(ac-tub)的表达方式进行了显微镜观察的图像，(b)是对ccr4细胞标志物与乙酰化微管蛋白(ac-tub)的表达方式进行了显微镜观察的图像，(c)是对cd4细胞标志物与乙酰化微管蛋白(ac-tub)的表达方式进行了显微镜观察的图像，(d)是对cd8细胞标志物与乙酰化微管蛋白(ac-tub)的表达方式进行了显微镜观察的图像。
[0160]
如图1(a)所示，在作为树突细胞之一的朗格汉斯细胞中未观察到表达乙酰化微管蛋白的细胞。
[0161]
如图1(c)和(d)所示，在许多恶性程度低的cd4

t细胞和cd8

t细胞中观察到了乙酰化微管蛋白的表达。此外，如图1(b)所示，在恶性程度高的ccr4

t细胞中，在近似100％的细胞中观察到了乙酰化微管蛋白的表达。由于在恶性程度低的cd4

t细胞和cd8

t细胞与恶性程度高的ccr4

t细胞两者中观察到了乙酰化微管蛋白的表达，因此可知，若以乙酰化微管蛋白为指标，不仅能够诊断晚期的恶性程度高的t细胞淋巴瘤，还能够诊断早期的恶性程度低的t细胞淋巴瘤。
[0162]
工业实用性
[0163]
本发明能够广泛用于医疗领域中，特别是能够适合用于t细胞淋巴瘤的指标的检测方法、检查试剂盒以及治疗等中。