一种TSLP相关病症治疗剂的开发和应用的制作方法

一种tslp相关病症治疗剂的开发和应用
技术领域
1.本公开涉及一种识别tslp蛋白的抗体及其制造方法和应用。


背景技术：

2.胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，tslp)是一种白细胞介素-7家族的细胞因子，主要由位于皮肤、肠道或肺部的上皮细胞和角质细胞产生，参与保持粘膜免疫系统的稳定。上皮组织受过敏原或病原体刺激或破坏后，树突状细胞向原始cd4 t细胞呈递抗原，同时释放上皮细胞因子、tslp和il-33。这些重要的共刺激细胞因子导致过敏原特异性th2细胞的发育，然后产生细胞因子白细胞介素il-4、il-5和il-13。这组th2衍生的细胞因子在过敏性疾病的病理发生中起着关键作用。
3.tslp是一种多功能细胞因子，可通过多种免疫细胞表面的tslpr/il-7rα受体发挥生物学功能，包括dc细胞、cd4和cd8 t细胞、b细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞和nkt细胞等(ziegler sf,2013)。tslp刺激未成熟树突细胞(idcs)活化，增加抗原递呈，并产生il-8(interleukin 8或又称为chemokine(c-x-c motif)ligand 8(cxcl8))、嗜酸性粒细胞趋化因子-2(eotaxin2或又称为chemokine(c-c motif)ligand 24(ccl24))、tarc(thymus and activation-regulated chemokine或又称为chemokine(c-c motif)ligand 17(ccl17))和mdc(macrophage-derived chemokine或又称为chemokine(c-c motif)22(ccl22))，吸引嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、th2细胞聚集；tslp可促使初始t细胞向th2细胞分化，这一过程依赖于tslp诱导dc细胞表达ox40l；tslp可诱导肥大细胞增殖，延长嗜酸性粒细胞的生存周期，以及炎性细胞因子和趋化因子的特异性释放；tslp还可刺激另外一群重要的黏膜免疫细胞——第2组先天性淋巴细胞(group 2innate lymphoid cells,ilc2)，分泌th2细胞因子il-4、il5和il-13，并在体内促进皮肤炎症。平滑肌细胞受tslp刺激也分泌产生il-8和eotaxin。tslp还被证明能提高多种先天免疫细胞(包括ilc2、肥大细胞、自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞)的细胞因子产量，并促进嗜碱性细胞亚群的发育和功能。因此，tslp可能是炎症级联反应的启动因子之一，抑制tslp可以从炎症发生的早期进行干预，阻止免疫细胞释放促炎细胞因子，从而比单独抑制il-4、il-5和il-13更为有效。
4.tslp通过jak/stat(jak kinase-signal transducer and activator of transcription)途径转导信号。tslp结合到细胞膜上的tslpr后，再与il-7rα结合，形成稳定的tslp-tslpr-il7ra受体复合物，复合物中tslpr受体胞内段招募和活化jak2，与il7rα招募的jak1共同作用，活化下游信号分子。研究显示，在人外周血来源的cd11c dc细胞中，tslp可活化stat1、stat3、stat4、stat5和stat6等多个stat信号分子，其中stat5活化信号是促进th2细胞分化和分泌th2因子的关键。另外，tslp刺激jak/stat5信号通路活化，可使ilc2细胞对糖皮质激素的抑制作用无反应，提示抑制tslp可能有助于恢复患者对糖皮质激素的敏感。
5.tslp与ii型炎症疾病的发生密切相关。研究显示，tslp在特应性皮炎患者的受损皮肤中大量表达，而在非受损皮肤中检测不到。在哮喘和慢阻肺患者(copd)的肺上皮和粘
膜下层中也检测到含有大量的tslp mrna阳性细胞，这些患者的肺泡灌洗样本中tslp浓度高于健康人对照组。哮喘患者的tslp表达水平与th2细胞因子和趋化因子表达直接相关，而与患者保留的肺功能状态负相关。在过敏性鼻炎患者的活检中，发现tslp在鼻上皮中的表达增加，并且与上皮相关组织中的th2细胞因子产生和嗜酸性粒细胞浸润相关。
6.tslp和tslpr的基因多态性被认为和嗜酸性食管炎(eosinophilic esophagitis，eoe)的发病有关。在eoe患者的食道样本中，检测到tslp高表达和嗜碱性粒细胞(lin-,cd49b ,fcεri ,c-kit-,2d7 )比例升高。有意思的是，小鼠eoe模型依赖于tslp和嗜碱性粒细胞，而不依赖于ige。使用tslp中和抗体，或清除嗜碱性粒细胞，均可有效减轻eoe症状，提示抑制tslp-嗜碱性粒细胞，而不是ige，可能是治疗eoe的有效途径。
7.另外，有研究显示，tslp可能促进th1/th17相关自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和多发性硬化症。在类风湿性关节炎患者关节中，tslp及tslpr表达细胞增加。在蛋白多糖诱导的类风湿性关节炎小鼠模型中，tslpr缺陷小鼠的il-17、il-1β和il-6水平降低，infγ和il-10增高，疾病症状减轻。表明tslp及其受体可能成为类风湿性关节炎的新治疗靶点。


技术实现要素：

8.本发明人以重组tslp蛋白、基因枪或其组合形式进行免疫小鼠，得到了多株识别人及食蟹猴tslp重组蛋白的高亲和力抗体。本公开抗体具有很高的亲和力，其能有效阻断tslp与其受体tslpr的结合，并能阻断tslp诱导的报告基因细胞的stat5信号转导，同时能阻断tslp诱导的细胞增殖，阻断效率强于同类其他抗体，从而可以用于过敏性炎症疾病的诊断和治疗。
9.在一方面，本公开提供了结合tslp蛋白的抗体或其抗原结合部分。
10.在一方面，本公开提供了编码如前述方面的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。
11.在一方面，本公开提供了含有前述方面的核酸分子的载体。
12.在一方面，本公开提供了含有前述方面的载体的细胞。
13.根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。
14.在一方面，本公开提供了包含如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分或其编码核酸和药学上可接受的载体的药物组合物或试剂盒。
15.在一方面，本公开提供了治疗tslp相关病症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞和/或药物组合物。
16.前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体和/或细胞或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中tslp相关病症的药物或试剂盒中的用途。
17.所述抗体可高亲和性地结合人tslp和/或食蟹猴tslp，可阻断tslp与tslpr的结合，可抑制tslp刺激信号通过stat5通路进行的转导。
附图说明
18.图1、原核重组表达的tslp蛋白
19.图2、hek293细胞重组表达的tslpr蛋白
20.图3、elisa检测tslp重组蛋白结合受体tslpr
21.图4、ba/f3-htslpr细胞facs检测
22.图5、ba/f3-htslpr-il7rα细胞增殖检测
23.图6、ba/f3-htslpr-il7rα-stat5、luc细胞报告基因检测
24.图7、嵌合抗体的elisa结合检测
25.图8、嵌合抗体的elisa阻断检测
26.图9、嵌合抗体细胞水平的阻断
27.图10、嵌合抗体对细胞增殖的抑制
28.图11、嵌合抗体对报告基因表达的抑制
29.图12、人源化抗体与人及食蟹猴tslp的elisa结合检测
30.图13、人源化抗体的elisa阻断检测
31.图14、人源化抗体细胞水平的阻断
32.图15、人源化抗体对细胞增殖的抑制
33.图16、人源化抗体对报告基因表达的抑制
具体实施方式
34.i.定义
35.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
36.在一个方面，本文提供的是特异性结合tslp的抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段。在具体的方面，本文提供的是特异性结合tslp的单克隆抗tslp抗体，其中所述抗tslp抗体包括亲本抗体的变体。在具体的方面，本文提供的是特异性结合tslp(例如，人tslp)的抗体。在特定的方面，本文提供的是包含一个或更多个氨基酸残基中的修饰的抗tslp抗体(例如，重链可变区的框架区中5-13个氨基酸取代)，与没有所述修饰的亲本抗体相比，其保持与抗原的亲和力。
37.如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
38.就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为表现出与参照多肽序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为表现出与参照核酸序列至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列。
39.序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性(参见，例如：computational molecular biology,
lesk,a.m.,ed.,oxford university pres,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；and sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(carrillo,h.&lipman,d.,siam j applied math 48:1073(1988))。
[0040]“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。
[0041]
就抗体的可变结构域而言，术语“可变”系指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于针对其特异靶的特定抗体的特异识别和结合。但是，可变性在抗体的整个可变结构域内不是均匀分布的。可变性集中在被称为互补决定区域(cdrs；即cdr1、cdr2和cdr3)或超变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变结构域内。可变结构域内保守程度更高的部分被称为构架(fr)区或构架序列。天然重链和轻链的每个可变结构域均包括四个fr区，其主要采用β-折叠构型，它们籍三个cdrs连接起来，cdrs形成环，所述环连接β-折叠结构并在某些情形下形成部分的β-折叠结构。每条链的cdrs通常被fr区在邻近连接起来，并且借助于来自其它链的cdr，有助于抗体靶结合位点(表位或决定簇)的形成(参看kabat等人sequences of proteins of immunological interest,nationalinstitute of health,bethesda,md(1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依据kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个cdr可具有特异结合关联表位的能力。
[0042]
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，methods in molecular biology，vol 207:recombinant antibodies for cancer therapy methods and protocols(2003)；chapter 1；p 3-25,kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，
其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10
7-108m-1的ka)抗原的抗体。“功能片段”或“抗tslp抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段
″
含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等等。“fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(v
h-v
l
二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdrs相互作用，以确定v
h-v
l
二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个cdrs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的cdrs的fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。
[0043]
如本文中所用，术语“双特异性”(bispecific antibody，bsab)指抗体和/或抗原结合分子能够特异性结合两种不同的抗原性决定簇，通常，双特异性抗体和/或抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗体和/或抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
[0044]
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(smith et al.(2004)j.clin.pathol.57,912-917；和nelson et al.,j clin pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化b细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如ebv的病毒感染b细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
[0045]
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，harlow&lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
[0046]
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如vh-ch1-ch2-ch3或vh-ch1-ch2-ch3-ch4)和两条全长轻链(vl-cl)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌b细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
[0047]
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
[0048]“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(cdr)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的cdr残基置换。
[0049]
此外，在人源化中，还可能对vh和/或vl的cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如pcr介导的突变引
入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，cdr内的突变通常不超过一个或两个。因此，本公开所述人源化抗体还涵盖cdr内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
[0050]
如本文所用，术语“cdr”指互补决定区(complementarity-determining region)，已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个cdr。cdr也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中，在cdr的一级结构中具有非常高的变异性位点。本说明书中，重链的cdr由来自重链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示，轻链的cdr由来自轻链的氨基端序列的氨基端的cdr1、cdr2、cdr3表示。这些位点在三级结构中彼此临近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。
[0051]
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
[0052]
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1
×
107m-1
或1x108m-1
或更大的亲和常数ka(或者1
×
10-7
m或1
×
10-8
m或更低的解离常数(kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(spr)(rich and myszka(2000)curr.opin.biotechnol 11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，paul,ed.,fundamental immunology,2nd ed.,raven press,new york,pages 332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性spr和itc方法的美国专利第7，229，619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，biacore 2000,biacore ab,upsala,sweden and ge healthcare life sciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)。
[0053]
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括dna分子及rna分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cdna。
[0054]
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cdna分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
[0055]
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
[0056]
亦提供本文所述序列表中所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编
码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。例如，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及pcr介导的诱变)将修饰引入本文所述的序列表中。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域中已有定义的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗tslp抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见brummell et al.,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi et al.,protein eng.12(10):879-884(1999)；burks et al.,proc.natl.acad.sci.usa 94:412-417(1997))。
[0057]
作为另一选择，在另一实施方案中，可通过例如饱和诱变沿抗tslp抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变，且可针对改良的结合活性筛选所得经修饰抗tslp抗体。
[0058]
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过elisa定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，lowry蛋白测定以及bradford蛋白测定。
[0059]
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于cho细胞、各种cos细胞、hela细胞、hek细胞例如hek 293细胞。
[0060]
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
[0061]
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
[0062]
如本文所用，“表达载体”包括能够表达dna的载体，所述dna与诸如启动子区的能够影响这类dna片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒dna，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组dna或rna构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆dna的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真
id no:23-25的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0074]
(3)分别包含seq id no:28-30的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:33-35的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0075]
(4)分别包含seq id no:38-40的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:43-45的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0076]
(5)分别包含seq id no:48-50的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:53-55的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0077]
(6)分别包含seq id no:58-60的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:63-65的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0078]
(7)分别包含seq id no:68-70的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:73-75的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0079]
(8)分别包含seq id no:78-80的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0080]
(9)分别包含seq id no:83-85的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0081]
(10)分别包含seq id no:88-90的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0082]
(11)分别包含seq id no:93-95的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0083]
(12)分别包含seq id no:98-100的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0084]
(13)分别包含seq id no:103-105的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0085]
(14)分别包含seq id no:108-110的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0086]
(15)分别包含seq id no:113-115的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0087]
(16)分别包含seq id no:118-120的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0088]
(17)分别包含seq id no:123-125的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0089]
(18)分别包含seq id no:128-130的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0090]
(19)分别包含seq id no:133-135的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0091]
(20)分别包含seq id no:138-140的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0092]
(21)分别包含seq id no:143-145的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0093]
(22)分别包含seq id no:148-150的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0094]
(23)分别包含seq id no:153-155的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0095]
(24)分别包含seq id no:158-160的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0096]
(25)分别包含seq id no:163-165的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:168-170的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0097]
(26)分别包含seq id no:153-155的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0098]
(27)分别包含seq id no:158-160的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0099]
(28)分别包含seq id no:163-165的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0100]
(29)分别包含seq id no:78-80的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0101]
(30)分别包含seq id no:83-85的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0102]
(31)分别包含seq id no:98-100的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0103]
(32)分别包含seq id no:103-105的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0104]
(33)分别包含seq id no:123-125的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列；
[0105]
(34)分别包含seq id no:128-130的重链cdr1、cdr2及cdr3序列，和/或分别包含seq id no:173-175的轻链cdr1、cdr2及cdr3序列。
[0106]
在一方面，本公开涉及根据前一方面的抗体或其抗原结合部分，其包含选自氨基酸序列seq id no:7、17、27、37、47、57、67、77、82、87、92、97、102、107、112、117、122、127、132、137、142、147、152、157、162或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列seq id no:12、22、32、42、52、62、72、167、172或其任何变体的轻链可变区。
[0107]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:7或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:12或其任何变体的轻链可变区。
[0108]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:17或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:22或其任何变体的轻链可变区。
[0109]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:27或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:32或其任何变体的轻链可变区。
[0110]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:37或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:42或其任何变体的轻链可变区。
[0111]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:47或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:52或其任何变体的轻链可变区。
[0112]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:57或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:62或其任何变体的轻链可变区。
[0113]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:67或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:72或其任何变体的轻链可变区。
[0114]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:77或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0115]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:82或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0116]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:87或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0117]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:92或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0118]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:97或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0119]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:102或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0120]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:107或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0121]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:112或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0122]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:117或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0123]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:122或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0124]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:127或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0125]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:132或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0126]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:137或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0127]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:142或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0128]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:147或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0129]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:152或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0130]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:157或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0131]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:162或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:167或其任何变体的轻链可变区。
[0132]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:152或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0133]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:157或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0134]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:162或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0135]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:77或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0136]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:82或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0137]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:97或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0138]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:102或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0139]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:122或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0140]
在一方面，本公开涉及一种结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其包含氨基酸序列seq id no:127或其任何变体的重链可变区，和氨基酸序列seq id no:172或其任何变体的轻链可变区。
[0141]
在一方面，本公开提供了编码根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含选自seq id no:11、21、31、41、51、61、71、81、86、91、96、101、106、111、116、121、126、131、136、141、146、151、156、161、166或其任何变体的抗体重链核酸序列，和/或选自seq id no:16、26、36、46、56、66、76、171、176或其任何变体的抗体轻链核酸序列。
[0142]
在一方面，本公开涉及结合人tslp的抗体或其抗原结合部分，其与前述任一方面的抗体或其抗原结合部分具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
[0143]
在一方面，本公开涉及编码如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，或与其具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸分子。
[0144]
在一方面，本公开提供了含有如前述任一方面的核酸的载体。
[0145]
在一方面，本公开提供了含有如前述任一方面的载体的细胞。
[0146]
在一方面，本公开提供了包含如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分或其编码核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0147]
在一方面，本公开提供了治疗tslp相关病症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物。
[0148]
在一方面，本公开提供了前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中tslp相关病症的药物中的用途。
[0149]
根据前述任一方面，任选地，所述tslp相关病症是tslp相关炎性病症以及自身免疫性疾病。任选地，所述抗体偶联其他药物，例如带标记或具有细胞毒性的缀合物。
[0150]
在一方面，本公开还包括试剂盒，例如所述试剂盒包括本公开的抗体、其片段、同源物、其衍生物等，例如带标记或具有细胞毒性的缀合物，以及抗体使用说明书、杀死特定
类型细胞的缀合物等等。该说明书可包括在体外、体内或离体使用抗体、缀合物等的指导。抗体可以是液体形式或固体，通常是冻干的。该试剂盒可包含其它适宜的试剂，如缓冲液、重构溶液以及为了预定用途的其它必要成分。考虑了以预定量包装好的试剂组合与用于其用途的说明书，所述用途例如用于治疗用途或用于进行诊断测定。当抗体是带标记的时，例如用酶标记的，那么该试剂盒可包括底物和酶所需的辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。此外，其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等也可包括在内。多种试剂的相对量可以改变而提供试剂溶液的浓缩物，这就提供了用户灵活性、节省空间、节省试剂等。这些试剂也可以干粉形式提供，通常是冻干形式，包括赋形剂，它在溶解时可提供具有适当浓度的试剂溶液。
[0151]
在一方面，本公开提供了前述任一方面的抗体或其功能片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物和/或试剂盒在制备用于制备抑制tslp与tslpr结合的试剂中的用途。
[0152]
此外，本公开的抗体还可用于免疫测定、纯化方法以及其它用到免疫球蛋白或其片段的方法。此类用途在本领域为人所熟知。
[0153]
相应地，本公开还提供包含本公开的抗tslp的抗体或其片段的组合物，所述抗体方便地和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合，这是本领域的常规做法。
[0154]
本公开所使用的术语“药物组合物”系指多种制备物的制剂。含有治疗有效量的多价抗体的制剂为无菌液体溶液、液体悬浮剂或冻干形式，任选地包含稳定剂或赋形剂。
[0155]
本公开的抗体可以作为单独施用的组合物使用，或可与其它活性剂联合使用。
[0156]
应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的药学上可接受的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化学工作者已知的药典中：remington's pharmaceutical sciences(第15版，mack publishing company，easton，pa.(1975))，特别是其中blaug、seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如lipofectin
tm
)、dna缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本公开的治疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药途径。
[0157]
在一个实施方案中，可将所述抗体用作治疗剂。此类试剂将通常用于治疗、缓解和/或预防受试者的与异常tslp表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常tslp表达、活性和/或信号传导相关的疾病或障碍，例如tslp相关病症的人患者来实施治疗方案。将抗体制剂，优选对其靶抗原有高特异性和高亲和性的抗体制剂施用给受试者并且将通常因其与靶标结合而产生效应。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如tslp)的表达、活性和/或信号传导功能。施用的抗体可消除或抑制或妨碍靶标(例如tslp)与其所天然结合的内源性的配体结合。例如，抗体与靶标结合并调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和/或以其它方式妨碍tslp表达、活性和/或信号传导。在一些实施方案中，为治疗与异常tslp表达相关的疾病或障碍，可将具有重链和轻链cdr的抗体施用给受试者。
[0158]
作为非限制性示例，与异常tslp表达、活性和/或信号传导相关的tslp相关病症包括tslp相关炎性病症以及自身免疫性疾病。tslp相关炎性病症包括过敏性炎症、哮喘、慢性
pharmacy第19版(alfonso r.gennaro等人编辑)mack pub.co.，easton，pa.:1995；drug absorption enhancement:concepts，possibilities，limitations，and trends，harwood academic publishers，langhorne，pa.，1994；以及peptide and protein drug delivery(advances in parenteral sciences，第4卷)，1991，m.dekker，new york。
[0163]
此类组合物通常包含抗体和药学上可接受的载体。当使用抗体片段时，与靶蛋白结合结构域特异性结合的最小抑制片段可为优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组dna技术产生(参见例如marasco等人，proc.natl.acad.sci.usa，90:7889-7893(1993))。
[0164]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适的药学上可接受的载体描述于最新版的remington's pharmaceutical sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
[0165]
将所述实施方案的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。给药途径的示例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部的)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：注射用无菌稀释剂例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐、以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。ph可用酸或碱进行调节，例如盐酸或氢氧化钠。可将肠胃外制剂包装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制多剂量小瓶内。
[0166]
适于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的药学上可接受的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，parsippany，n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当为流动性达到易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须能防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。例如通过利用涂层例如卵磷脂，在分散体情况下维持所需颗粒尺寸，以及利用表面活性剂，可以保持适宜的流动性。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨醇)、氯化钠。注射用组合物的延长吸收可通过在所述组合物中包含延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
[0167]
根据需要，可以通过将抗体以所需量掺入具有上文所列成分中的一种或组合(按需要)的合适溶剂中来制备无菌注射溶液，然后过滤消毒。一般来讲，通过将抗体掺入含有碱性分散介质和上文所列那些中的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是获得粉末的真空干燥和冷冻干燥，该粉末包含
活性成分和任何另外的期望成分，它们来自前述的这些成分的无菌过滤溶液。
[0168]
对于吸入给药，从包含合适推进剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气溶胶喷雾形式递送化合物。
[0169]
还可以通过经粘膜或透皮方式全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域是通常所知的，并且包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用喷鼻剂或栓剂来实现。对于透皮给药，可将一种或多种所述抗体配制成如本领域通常所知的膏剂、软膏、凝胶、或霜膏。
[0170]
还可将化合物以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯)或滞留性灌肠剂形式进行制备以用于经直肠递送。
[0171]
在一个实施方案中，所述抗体可用防止其不被身体迅速消除的载体制备，例如缓释/控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送体系。可使用可生物降解、可生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0172]
尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用，剂量单位形式是指用于待治疗的受试者，适合作为单位剂量的物理上可分离的单位；每个单位含有经计算与所需药物载体结合产生期望治疗效果的预定量的一种或多种所述抗体。所述实施方案的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：抗体的独特特征和待实现的具体治疗效果，和用于治疗个体的此类抗体的调配领域中固有的局限性。
[0173]
所述药物组合物可与给药说明书一起放于容器、包装、或分配器中。
[0174]
本文所述制剂还可根据要治疗的具体情况而包含多于一种所述抗体，优选具有互补活性但对彼此无负面影响的那些。另选地或除此之外，组合物可例如包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒素试剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当地联合存在。例如，可以在试剂盒中联合存在，也可以在使用中联合存在。
[0175]
在一个实施方案中，一种或多种所述抗体可在联合治疗中施用，即与其它试剂例如治疗剂(其可用于治疗病理学病症或障碍，例如各种形式的癌症、自身免疫性障碍和炎性疾病)联合。术语“联合”在本文中是指将试剂基本上同步地，同时地或顺次地给予。如果顺次给予，则在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种仍优选在治疗位点处以有效浓度被检测到。在一种情况下，“联合”也可以是在试剂盒中同时包含本公开的抗体和其他治疗剂。
[0176]
例如，联合治疗可包含本文所述一种或多种抗体与一种或多种附加治疗剂(例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂，如下更详述的)共同配制和/或共同施用。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，因而避免了与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
[0177]
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
[0178]
实施例
[0179]
实施例1、tslp及tslpr重组蛋白的制备
[0180]
合成人tslp(uniprot：q969d9，seq id no：1)及食蟹猴tslp(uniprot：a0a2k5txv0，seq id no：2)的cdna，将序列克隆到真核表达载体pcmv3(购自北京sinobiological，货号cg90911-ut)，n端插入信号肽mdmrvpaqllgllllwlrgars，同时将含6个组氨酸的标签融合表达在tslp羧基端，获得psect-htslp-chis和psect-cytslp-chis质粒，并以此质粒转染hek293.6e细胞(atcc crl-1573)，收集细胞上清液，但通过镍柱亲和层析未得到相应长度的重组蛋白。继而将tslp全长片段克隆到原核表达质粒pet-30a中，以此质粒转化bl21 e.coli.，诱导表达后发现重组蛋白表达于包涵体。将包涵体蛋白进行重折叠，纯化得到人tslp及食蟹猴tslp重组蛋白。结果如图1所示，纯化得到人tslp及食蟹猴tslp重组蛋白。
[0181]
对人tslpr的cdna(uniprot：q9hc73，seq id no：3，购自北京sinobiological，货号hg18720-ut)进行pcr扩增，获得编码人tslpr胞外域(gln23-lys231)的基因片段，将该基因片段克隆到真核表达载体pcmv3的启动子下游，同时c端融合表达人igg1 fc(knob)片段，得到phc1-tslpr-hfc-knob质粒。同时构建只含人igg1 fc(hole)片段的质粒phc1-hfc-hole，然后将该真核表达质粒与phc1-tslpr-hfc-knob质粒混合，共转染真核细胞hek293.6e，得到人tslpr-fc融合蛋白。同样，对合成食蟹猴tslpr的cdna(uniprot：g8f663，seq id no：4)进行pcr扩增，获得编码食蟹猴tslpr胞外域(gln23-lys231)的基因片段，将该基因片段克隆到含人igg1 fc(knob)片段的真核表达质粒中，使该食蟹猴tslpr胞外域与人igg1 fc(knob)n端融合，然后将该真核表达质粒与只含人igg1 fc(hole)片段的质粒混合，共转染真核细胞hek293.6e，得到食蟹猴tslpr-fc融合蛋白。质粒转染hek293.6e细胞后，培养5-7天，收集细胞上清液，通过protein a亲和层析纯化得到人tslpr(seq id no：5)及食蟹猴tslpr(seq id no：6)胞外域重组蛋白，结果如图2所示。
[0182]
用elisa检测人tslp重组蛋白与人tslpr胞外域重组蛋白的结合，结果显示，其ec
50
＝0.11nm，这表明重组人tslp以高亲和力与人tslpr结合(图3)。
[0183]
实施例2、tslpr稳转细胞构建
[0184]
1)ba/f3-htslpr稳转细胞株的构建
[0185]
ba/f3细胞维持在含有10％胎牛血清、50μm 2-巯基乙醇、2mm l-谷氨酰胺、50μg/ml青霉素-链霉素和10ng/ml小鼠il-3的rpmi-1640培养基中。将表达人tslpr的慢病毒表达载体(广州复能基因有限公司，ex-w0156-lv105-b)，通过lenti-pac hiv慢病毒包装试剂盒(广州复能基因有限公司)包装病毒，并转染ba/f3细胞，加入嘌呤霉素进行抗性筛选得到能够稳定表达人tslpr的细胞株ba/f3-htslpr。图4显示，通过检测生物素化人tslp蛋白与细胞表面tslpr的结合，确认所构建细胞表达人tslpr，且其ec
50
＝0.22nm。
[0186]
2)ba/f3-htslpr-il7rα稳转细胞株的构建
[0187]
il-7rα参与tslp受体复合物的信号传递，当tslp结合tslpr后，通过与il-7rα形成异源二聚体受体复合物，il-7rα胞内段的jak1和tslpr胞内段的jak2发生磷酸化，激活下游信号分子，从而向细胞内部传导活化信号。将ires(genbank km077140.1,99-745)和人il-7rα基因克隆到表达人tslpr的慢病毒表达载体，得到plenti-cmv-tslpr-ires-il7rα-puro双基因共表达质粒，转染ba/f3细胞，构建具有完整人tslp信号转导通路的稳转细胞。
[0188]
ba/f3细胞维持在包含10％胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、50μg/ml青霉素-链霉素和
2ng/ml小鼠il-3的rpmi-1640培养基中。使用lenti-pac hiv慢病毒包装试剂盒，将人tslpr和il7rα双基因共表达质粒包装成慢病毒，以含有重组病毒的培养上清转导ba/f3细胞，加入嘌呤霉素进行抗性筛选，得到能够稳定表达人tslpr和il-7rα的细胞株ba/f3-htslpr-il7rα。细胞增殖活性检测显示，构建的ba/f3-htslpr-il7rα细胞株对人tslp有剂量依赖的增殖反应，且其ec50＝0.22nm(图5)。
[0189]
3)ba/f3-htslpr-il7rα-stat5 luc报告基因细胞株的构建
[0190]
在ba/f3-htslpr-il7rα稳转细胞株中，转入stat5-luc报告基因，筛选stat5荧光素酶报告基因细胞系。首先，合成含5个stat5应答元件(agttctgagaaaagt)的核苷酸序列，通过限制性内切酶kpni、hindiii克隆到pgl4.22-luc2p(promega,e6761)，同时将hygro抗性基因克隆到载体中并替换puro抗性基因，得到pgl4.22-luc2p stat5 re-hygro。其次，将10μg pgl4.22-luc2p stat5 re-hygro质粒与5
×
106ba/f3-htslpr-il7rα稳转细胞混合后进行电转染，电压设定为300v，电容为950μf；转染48-72小时后添加200μg/ml潮霉素b溶液，每隔3-5天更换筛选培养基。加压筛选一段时间后，稳转细胞形成克隆，有限稀释得到的单克隆株经不同浓度的tslp刺激6小时后，可检测荧光信号。图6显示，随着tslp浓度增高荧光信号逐渐增强，表明tslp能够激活稳转细胞ba/f3-htslpr-il7rα-stat5 luc的stat5信号通路，且该稳转细胞ba/f3-htslpr-il7rα-stat5 luc的ec50＝0.22nm。
[0191]
实施例3、动物免疫
[0192]
选择6周龄雌性balb/c小鼠进行免疫，每只小鼠每次免疫50μg抗原，抗原用人和食蟹猴tslp交替进行免疫，抗原与弗氏佐剂等体积混合后进行皮下免疫，每两周免疫一次。四次免疫后，尾部取血，分别用elisa检测小鼠血清的滴度，以及血清对tslp与tslpr结合的抑制作用。或者初次免疫后，每隔一周使用基因枪进行加强免疫，以人tslp表达质粒混合金粉，压力400psi，在小鼠腹部裸露皮肤进行轰击，共免疫九次。
[0193]
实施例4、抗体筛选
[0194]
1)fab噬菌体库
[0195]
取实施例3的免疫动物，在最后一次免疫三周后进行冲击免疫，用10μg/100μl/只人tslp重组蛋白尾静脉注射。四天后，取小鼠淋巴结及脾细胞，采用trnzol裂解法提取细胞的rna，然后逆转录合成单链cdna，以此为模板扩增抗体的可变区序列。在fab抗体片段噬菌体展示平台，构建tslp免疫文库，库容量》5
×
109，随机选择96个单克隆诱导表达，western blot显示轻、重链表达率均高于95％，测序显示序列多样性良好。在免疫管(maxisorp immunotube)包被人tslp重组蛋白或食蟹猴tslp重组蛋白，对tslp抗体库进行筛选。经过2轮筛选，得到多个能特异性识别tslp，并高效阻断tslp-tslpr结合的阳性克隆。在tg1感受态细胞中表达单克隆抗体fab，再次验证对人和食蟹猴tslp的结合和tslp/tslpr的阻断，得到6个具有高亲和力，可以同时结合人与食蟹猴，并且高效阻断tslp结合tslpr的克隆(结果如表1)。
[0196]
表1 elisa筛选fab噬菌体库
[0197][0198]
2)小鼠杂交瘤
[0199]
用10μg/100μl/只人tslp重组蛋白尾静脉注射进行冲击免疫，四天后取小鼠淋巴结及脾脏，在dmem中研磨后得到b细胞悬浮液，取适量的b细胞悬浮液和sp2/0混合后，用电融合仪进行细胞融合。将融合后的细胞在含有hat的dmem完全培养基中置于5％co2，37℃条件下培养。
[0200]
3)杂交瘤的筛选
[0201]
酶联免疫吸附实验(elisa)筛选与人tslp的结合
[0202]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的人tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl杂交瘤细胞上清或噬菌体上清，室温孵育60分钟；用pbst(pbs 0.05％tween-20)和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。
[0203]
杂交瘤细胞elisa筛选与食蟹猴tslp的结合
[0204]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的食蟹猴tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl杂交瘤细胞上清或噬菌体上清，室温孵育60分钟；用pbst和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。
[0205]
elisa筛选人tslp与人tslpr的阻断
[0206]
在96孔酶标板上包被1μg/ml人tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将杂交瘤细胞上清或噬菌体上清与60ng/ml生物素化人tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分钟。用pbs洗三次96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(sa-hrp)，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。
[0207]
elisa筛选食蟹猴tslp与食蟹猴tslpr的阻断
[0208]
在96孔酶标板上包被1μg/ml食蟹猴tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将杂交瘤细胞上清或噬菌体上清与60ng/ml生物素化食蟹猴tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分
钟。用pbs洗三次96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl sa-hrp，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。
[0209]
细胞水平的阻断
[0210]
将ba/f3-htslpr细胞加入96孔u型板，5
×
104/孔。将抗体与生物素化人tslp蛋白4℃孵育30分钟后加入细胞中，4℃孵育1小时，加入链霉亲和素偶联藻红蛋白荧光素(sa-pe)后4℃孵育45分钟，通过流式细胞仪检测抗体在细胞水平的阻断效果。
[0211]
经elisa筛选与人tslp结合的杂交瘤共712个克隆，其中，在elisa和细胞水平试验中，均能阻断人tslp与人tslpr结合的杂交瘤共52个克隆，与食蟹猴tslp结合并阻断食蟹猴tslp与食蟹猴tslpr结合有6个阳性克隆(结果如表2)。
[0212]
表2 elisa筛选杂交瘤上清
[0213]
[0214]
表2中，nd:未检测。
[0215]
实施例5、抗体序列的获得
[0216]
根据杂交瘤筛选的结果，将阳性单克隆细胞1000rpm离心，收集细胞，并以trizol提取总rna，以此为模板，合成第一链cdna后，以第一链cdna为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的可变区dna序列。在50μl反应体系中，分别加入cdna 1μl，10
×
pcr缓冲液5μl，正向及反向引物各1μl，dntp 1μl，25mmol mgcl
2 1μl，h2o 39μl，taq酶1μl，95℃预变性10分钟，进入温度循环，进行pcr扩增。反应条件为94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸15秒，共30个循环，然后72℃保温10分钟。根据噬菌体筛选的结果，扩增阳性克隆的可变区序列。经测序后，得到的候选阳性克隆重链和轻链可变区序列分别为：
[0217]
克隆:71g4 seq id nos:7-16
[0218]
重链vh
[0219][0220]
核酸序列
[0221][0222]
轻链vk
[0223][0224]
核酸序列
[0225][0226]
克隆:79d6 seq id nos:17-26
[0227]
重链vh
[0228][0229]
核酸序列
[0230][0231]
轻链vk
[0232][0233]
核酸序列
[0234][0235]
克隆:76a8 seq id nos:27-36
[0236]
重链vh
[0237][0238]
核酸序列
[0239][0240]
轻链vk
[0241][0242]
核酸序列
[0243][0244]
克隆:80d12 seq id nos:37-46
[0245]
重链vh
[0246][0247]
核酸序列
[0248][0249]
轻链vk
[0250][0251]
核酸序列
[0252][0253]
克隆:80e11 seq id nos:47-56
[0254]
重链vh
[0255][0256]
核酸序列
[0257][0258]
轻链vk
[0259][0260]
核酸序列
[0261][0262]
克隆:80b12 seq id nos:57-66
[0263]
重链vh
[0264][0265]
核酸序列
[0266][0267]
轻链vk
[0268][0269]
核酸序列
[0270][0271]
克隆:39g5-h8 seq id nos:67-76
[0272]
重链vh
[0273][0274]
核酸序列
[0275]
[0276]
轻链vk
[0277][0278]
核酸序列
[0279][0280]
实施例6、抗tslp嵌合抗体的表达
[0281]
将实施例5中获得的重链和轻链可变区序列片段pcr扩增，将重链可变区克隆入含有人重链恒定区的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的igg1重链。类似地，将轻链可变区克隆入含有人轻链恒定区的载体，以在哺乳动物细胞中表达完整的kappa轻链。经测序正确后转染入hek293.6e哺乳动物细胞中，igg1经表达分泌入培养基中，合并收集上清，过滤后纯化。采用protein a层析纯化igg，将洗脱蛋白超滤浓缩，通过分光光度法测定igg的浓度，采用sds-page分析igg的纯度。获得39g5-h8、71g4、79d6、80b12、80d12以及80e11嵌合抗体。
[0282]
实施例7、嵌合抗体的亲和力测定
[0283]
1)抗体与人tslp的结合
[0284]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的人tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl抗tslp抗体，室温孵育60分钟；用pbst和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图7-a及表3显示，实施例6获得的各嵌合抗体均能与人tslp结合。
[0285]
2)抗体与食蟹猴tslp的结合
[0286]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的食蟹猴tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl抗tslp抗体，室温孵育60分钟；用pbst和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图7-b及表3显示，实施例6获得的各嵌合抗体均能与食蟹猴tslp结合。
[0287]
表3嵌合抗体的elisa检测
[0288][0289]
3)biacore亲和力测定
[0290]
使用biacore t200系统，测量抗tslp抗体对人tslp的动力学结合活性。将2μg/ml的抗tslp抗体固定到传感器芯片protein a上，用1
×
hbs-ep缓冲液作为运行缓冲液，流速为10μl/分钟，运行40秒。将0-21.7nm的不同浓度的人tslp以30μl/分钟的流速注射到固定化的抗tslp抗体表面上。在每个注射循环后，用再生缓冲液10mm甘氨酸(ph2.0)以30μl/分钟的流速再生protein a芯片表面。
[0291]
将所得的数据与langmuir 1:1kinetic理论模型拟合，分析结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)及平衡解离常数kd(biaevaluation软件)。表4显示，各嵌合抗体均高亲和力结合人tslp。
[0292]
表4嵌合抗体的亲和力
[0293][0294]
实施例8、elisa水平的阻断
[0295]
1)抗体对人tslp和人tslpr结合的阻断
[0296]
在96孔酶标板上包被1μg/ml人tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将抗tslp抗体与60ng/ml生物素化人tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分钟。用pbs洗三次96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl sa-hrp，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图8-a及表3显示，各嵌合抗体均能阻断人tslp和人tslpr的结合。
[0297]
2)抗体对食蟹猴tslp和食蟹猴tslpr结合的阻断
[0298]
在96孔酶标板上包被1μg/ml食蟹猴tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将抗tslp抗体与60ng/ml生物素化食蟹猴tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分钟。用pbs洗三次
96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl sa-hrp，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图8-b及表3显示，各嵌合抗体均能阻断食蟹猴tslp和食蟹猴tslpr的结合。
[0299]
实施例9、细胞水平的阻断
[0300]
取ba/f3-htslpr-il7rα细胞，pbs洗3次，300g离心3分钟，加入3％bsa/pbs封闭30分钟。细胞重悬后加入96孔u型板，5
×
104/孔。将抗体与60ng/ml的生物素化人tslp蛋白室温孵育10分钟后加入细胞中，4℃孵育45分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，加入sa-pe后4℃孵育45分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，加入pi染料4℃孵育10分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，pbs重悬细胞，通过流式细胞仪检测抗体在细胞水平的阻断效果。图9显示，各嵌合抗体均能阻断tslp与细胞表面tslpr的结合。
[0301]
实施例10、嵌合抗体对tslp刺激ba/f3-htslpr-il7rα细胞增殖的抑制
[0302]
tslp抗体对tslp诱导的ba/f3-htslpr-il7rα细胞增殖抑制试验在rpmi-1640，10％胎牛血清中进行。
[0303]
提前一天将ba/f3-htslpr-il7rα细胞加入96孔细胞培养板中，浓度为2
×
104个/孔。将稀释后的60μl抗tslp抗体与60μl 5ng/ml人tslp在室温下预孵育15分钟。将预孵育后的抗体-细胞因子加入细胞培养板中100μl/孔。将96孔板在5％co2，37℃培养箱中培养72小时。在培养时间结束后，每孔加入celltiter-glo反应10分钟。在黑色96孔板中读取发光值。结果如图10及表5显示，各抗体均能抑制细胞的增殖，其中71g4抑制明显。
[0304]
表5嵌合抗体对细胞增殖的抑制ic50
[0305][0306][0307]
实施例11、嵌合抗体对tslp活化stat5信号的抑制
[0308]
将ba/f3-htslpr-il7rα-stat5 luc细胞饥饿过夜，次日按5
×
104/孔铺96孔板，50μl/孔；将人tslp稀释提前于37℃孵育30分钟；吸取50μl配体/抗体混合液至细胞板混匀，37℃孵育6小时；加入荧光检测试剂100μl；用酶标仪读取各孔的发光值。结果如图11及表6显示，各抗体均能抑制报告基因的表达，其中71g4抑制最明显。
[0309]
表6嵌合抗体对stat5报告基因的抑制ic50
[0310] ic50(nm)76a89.7879d69.6171g41.67
80b125.7980e1113.5780d123.8439g53.33
[0311]
实施例12、抗体人源化
[0312]
tslp抗体39g5、71g4、76a8、79d6、80b12、80d12和80e11来源于相同或相近的小鼠胚系基因，选择中和活性最强的鼠抗体39g5和71g4进行可变区序列人源化改造。
[0313]
首先将鼠抗体39g5序列与人抗体胚系序列进行比对，找出同源性好、维持抗体结构核心(upper hydrophobic core)的关键氨基酸序列完全相同、同时在人体出现频率高的人胚系轻链基因vk_1_39、igkj1*01和人胚系重链基因vh-1-69、ighj4*01，进行鼠抗体cdr移植；鼠抗71g4轻重链来源均与39g5相同，cdr3仅有1或2个氨基酸为相同类型的不同氨基酸残基，因此，将71g4重链的cdr1和cdr2分别置换到人源化39g5重链中，同时，分别以71g4人源化轻链或39g5人源化轻链，与39g5人源化重链进行配对表达，对围绕核心结合位点的区域进行优化，以改善亲和力以及分子表面电荷分布。随后同时利用计算机进行同源建模，分析cdr区及其周边的框架氨基酸序列、分子表面电荷、疏水区域分布，确定得到不同的重链衍生物和轻链衍生物，获得27个tslp抗体的人源化变体：ab1、ab2、ab3、ab4、ab5、ab6、ab7、ab8、ab9、ab10、ab11、ab12、ab13、ab14、ab15、ab16、ab17、ab18、ab19、ab20、ab21、ab22、ab23、ab24、ab25、ab26和ab27。上述27个人源化变体的重链和轻链见表7。
[0314]
表7 tslp抗体的人源化设计
[0315]
[0316][0317]
将轻、重链衍生物分别进行全序列合成后，克隆到含有抗体kappa链恒定区ckappa或人igg1恒定区ch1-ch3的载体。轻、重链衍生物质粒进行组合配对后，转染hek293.6e细胞，表达5-6天，收取上清进行protein a柱纯化。
[0318]
人源化抗体重链/轻链可变区序列如下：
[0319]
h39g5vh v1：seq id nos:77-81
[0320][0321]
核酸序列
[0322][0323]
h39g5vh v2：seq id nos:82-86
[0324][0325]
核酸序列
[0326][0327]
h39g5vh v3：seq id nos:87-91
[0328]
[0329]
核酸序列
[0330][0331]
h39g5vh v4：seq id nos:92-96
[0332][0333]
核酸序列
[0334][0335]
h39g5vh v5：seq id nos:97-101
[0336][0337]
核酸序列
[0338][0339]
h39g5vh v6：seq id nos:102-106
[0340][0341]
核酸序列
[0342]
[0343]
h39g5vh v7：seq id nos:107-111
[0344][0345]
核酸序列
[0346][0347]
h39g5vh v8：seq id nos:112-116
[0348][0349]
核酸序列
[0350][0351]
h39g5vh v9：seq id nos:117-121
[0352][0353]
核酸序列
[0354][0355]
h39g5vh v10：seq id nos:122-126
[0356][0357]
核酸序列
[0358][0359]
h39g5vh v11：seq id nos:127-131
[0360][0361]
核酸序列
[0362][0363]
h39g5vh v12：seq id nos:132-136
[0364][0365]
核酸序列
[0366][0367]
h39g5vh v13：seq id nos:137-141
[0368][0369]
核酸序列
[0370][0371]
h39g5vh v14：seq id nos:142-146
[0372][0373]
核酸序列
[0374][0375]
h39g5vh v15：seq id nos:147-151
[0376][0377]
核酸序列
[0378][0379]
h71g4vh v1：seq id nos:152-156
[0380][0381]
核酸序列
[0382][0383]
h71g4vh v2：seq id nos:157-161
[0384][0385]
核酸序列
[0386][0387]
h71g4vh v3：seq id nos:162-166
[0388][0389]
核酸序列
[0390][0391]
h39g5vk v1：seq id nos:167-171
[0392][0393]
核酸序列
[0394][0395]
h71g4vk v1：seq id nos:172-176
[0396][0397]
核酸序列
[0398][0399]
实施例13、人源化抗体的亲和力测定
[0400]
1)人源化抗体与人tslp的结合
[0401]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的人tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl抗tslp抗体，室温孵育60分钟；用pbst和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图12-a、c、e及表8显示，实施例12获得的各人源化抗体均与人tslp结合，其中ab20结合最强。
[0402]
2)人源化抗体与食蟹猴tslp的结合
[0403]
在96孔酶标板上包被1μg/ml的食蟹猴tslp重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。pbs洗一次后每孔加入100μl抗tslp抗体，室温孵育60分钟；用pbst和pbs各洗3遍后，每孔加入100μl hrp标记的抗人igg fc二抗，室温孵育60分钟。用pbst和pbs各洗三遍后，每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图12-b、d、f及表8显示，除ab14和ab15外，其余抗体均与食蟹猴tslp结合，其中ab20结合最强。
[0404]
表8 elisa检测人源化抗体与人及食蟹猴tslp的结合力
[0405][0406][0407]
3)biacore亲和力测定
[0408]
使用biacore t200系统，通过表面等离子体共振(spr)，测量抗tslp抗体对人和食
蟹猴tslp的动力学结合活性。将大约100ru的抗tslp抗体固定到传感器芯片protein a上，用1
×
hbs-ep缓冲液作为运行缓冲液，流速为10μl/分钟。将0-21.7nm的不同浓度的人或食蟹猴tslp以30μl/分钟的流速注射到固定化的抗tslp抗体表面上。在每个注射循环后，用再生缓冲液10mm甘氨酸(ph2.0)以30μl/分钟的流速再生protein a芯片表面。用biaevaluation软件，将所得的数据与langmuir 1:1kinetics理论模型拟合，分析结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)及平衡解离常数kd。
[0409]
表9显示，各抗体与人和食蟹猴tslp亲和力均较强，其中抗体ab22、ab23、ab24和ab26亲和力较高，结合人tslp的亲和力分别为0.06pm、0.08pm、0.02pm和2pm，结合食蟹猴tslp的亲和力分别为0.04pm、0.007pm、0.18pm和0.31pm。
[0410]
表9人源化抗体的亲和力
[0411][0412]
实施例14、elisa水平的阻断
[0413]
1)人源化抗体对人tslp和人tslpr结合的阻断
[0414]
在96孔酶标板上包被1μg/ml人tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将抗tslp抗体与60ng/ml生物素化人tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分钟。用pbs洗三次96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl sa-hrp，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图13-a、c、e及表10显示，人源化抗体ab1、ab2、ab3、ab4、ab5、ab8、ab10、ab13、ab19、ab20、ab21、ab22、ab23、ab24、ab25、ab26均能阻断人tslp与tslpr的结合。
[0415]
2)人源化抗体对食蟹猴tslp和食蟹猴tslpr结合的阻断
[0416]
在96孔酶标板上包被1μg/ml食蟹猴tslpr重组蛋白，包被液为碳酸盐缓冲液，4℃过夜。用pbs洗三次，每孔加入200μl含有2％脱脂牛奶的pbs封闭1小时。将抗tslp抗体与60ng/ml生物素化食蟹猴tslp蛋白在已封闭的u型96孔板中室温孵育30分钟。用pbs洗三次96孔酶标板，每孔加入100μl已孵育好的混合物，室温孵育1小时。分别用pbst和pbs洗三次后，每孔加入100μl sa-hrp，室温避光孵育30分钟。分别用pbst和pbs洗三次后每孔加入100μl tmb底物37℃显色10分钟后，以每孔50μl 2m硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。图13-b、d、f及表10显示，人源化抗体ab1、ab2、ab3、ab4、ab5、ab8、ab10、ab13、ab19、ab20、ab21、ab22、ab23、ab24、ab25、ab26均能阻断食蟹猴tslp与tslpr的结合。
[0417]
表10人源化抗体对tslp和tslpr结合的阻断
[0418][0419][0420]
实施例15、facs检测人源化抗体对tslp和tslpr结合的阻断
[0421]
取ba/f3-htslpr-il7rα细胞，pbs洗3次，300g离心3分钟，加入3％bsa/pbs封闭30分钟。细胞重悬后加入96孔u型板，5
×
104/孔。将抗体与60ng/ml的生物素化人tslp蛋白室温孵育10分钟后加入细胞中，4℃孵育45分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，加入sa-pe后4℃孵育45分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，加入pi染料4℃孵育10分钟，用0.5％bsa/pbs洗2次，pbs重悬细胞，通过流式细胞仪检测抗体在细胞水平的阻断效果。图14及表11显示，人源化抗体ab19、ab20、ab21、ab22、ab23、ab24、ab25、ab26均能阻断tslp与细胞表面tslpr的结合，且各抗体无明显差异。
[0422]
表11人源化抗体对细胞上tslpr与tslp结合的阻断
[0423]
人源化抗体重链/轻链细胞阻断ic50(nm)ab19h71g4vhv1/h71g4vkv10.45ab20h71g4vhv2/h71g4vkv10.33ab21h71g4vhv3/h71g4vkv10.36ab22h39g5vhv1/h71g4vkv10.39ab23h39g5vhv2/h71g4vkv10.33ab24h39g5vhv5/h71g4vkv10.36ab25h39g5vhv6/h71g4vkv10.35ab26h39g5vhv10/h71g4vkv10.39鼠抗71g4mab71g40.27鼠抗39g5mab39g50.36
同型对照klh higg1-[0424]
实施例16、人源化抗体对tslp刺激ba/f3-htslpr-il7rα细胞增殖的抑制
[0425]
通过应用短期增殖生物测定法(其利用表达重组人tslpr的细胞)，评估不同的抗tslp抗体在生物学上中和人tslp的能力。
[0426]
提前一天将细胞加入96孔细胞培养板中，浓度为2
×
104个/孔。将稀释后的60μl抗tslp抗体与60μl 5ng/ml人tslp在室温下预孵育15分钟。将预孵育后的抗体-细胞因子加入细胞培养板中100μl/孔。将96孔板在5％co2，37℃培养箱中培养72小时。在培养时间结束后，每孔加入celltiter-glo反应10分钟。在黑色96孔板中读取发光值。
[0427]
图15及表12结果显示，人源化抗体ab22、ab23、ab24和ab26四个抗体能明显抑制tslp刺激ba/f3-htslpr-il7rα细胞的增殖(ic50≈2.20nm、1.10nm、1.04nm和1.50nm)。同时与同类抗体a5(参考专利us10287348b2)比较，ab22、ab23、ab24和ab26抑制效果均优于a5(测定ic50＝16.55)。
[0428]
表12人源化抗体对细胞增殖的抑制
[0429][0430][0431]
实施例17、报告基因法检测人源化抗体对tslp通过stat5通路传导信号的阻断
[0432]
将ba/f3-htslpr-il7rα-stat5 luc细胞饥饿过夜，次日按5
×
104/孔铺96孔板，50μl/孔；将人tslp稀释提前于37℃孵育30分钟；吸取50μl配体/抗体混合液至细胞板混匀，37℃孵育6小时；加入荧光检测试剂100μl；用酶标仪读取各孔的发光值。
[0433]
图16及表13结果显示，人源化抗体ab22、ab23、ab24和ab26四个抗体能明显抑制tslp刺激信号通过stat5通路进行转导(ic50＝0.17nm、0.17nm、0.15nm和0.18nm)，且抑制效果优于a5(测定ic50＝1.93nm，参考kenneth v,2017报道ic50＝1.4nm)。
[0434]
表13人源化抗体对tslp诱导stat5信号通路活化的抑制ic50
[0435]
人源化抗体重链/轻链stat5信号抑制ic50(nm)ab22h39g5vhv1/h71g4vkv10.17ab23h39g5vhv2/h71g4vkv10.17ab24h39g5vhv5/h71g4vkv10.15ab26h39g5vhv10/h71g4vkv10.18
鼠抗71g4mab71g41.14鼠抗39g5mab39g54.92a5h5/l51.93同型对照klh higg1-[0436]
在不偏离本技术公开的实质和范围的情况下，可对本技术公开的各实施方案进行多种改变和使用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。