肿瘤特异性密蛋白18.2抗体的制作方法

肿瘤特异性密蛋白18.2抗体1.发明背景2.紧密连接是连接相邻的上皮或内皮细胞以形成屏障，阻止分子在细胞之间通过，并有助于维持细胞和组织的极性的多蛋白复合物。紧密连接由三大组跨膜蛋白组成：密蛋白和闭合蛋白、细胞质斑块蛋白和带蛋白。它们还含有细胞骨架蛋白和信号传导蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白ii和pkcζ。这些蛋白质相互作用以维持紧密连接结构(yu和turner2008)。3.密蛋白形成23种蛋白质的家族(hewitt,agarwal和morin2006)。密蛋白18是由cldn18基因编码的人类蛋白质，可在上皮细胞中形成紧密连接股。人cldn18可以在两个可变第一外显子的情况下可变剪接，产生两种蛋白质同种型(isoform)cldn18.1(或密蛋白18.1)和cldn18.2(或密蛋白18.2)。cldn18.2在wo2000/015659中首次公开为zsig28蛋白。这两种同种型的不同之处在于涵盖第一细胞外环的n端69个氨基酸。第一胞外域的跨度从氨基酸28到氨基酸80。在此范围内，cldn18.1和cldn18.2之间存在8个氨基酸差异。这两种不同的同种型在不同的组织中表达，cldn18.1主要在肺组织中表达，而cldn18.2显示出胃特异性(niimi等人2001)。cldn18.2在正常胃中的表达限于胃上皮的分化的短寿命细胞。cldn18.2的表达已在各种肿瘤组织中得到进一步鉴定。例如，已发现cldn18.2在胰腺、食管、卵巢和肺部的肿瘤中表达，与不同的组织学亚型相关(sahin等人2008)。人cldn18.2蛋白的氨基酸序列可来源于ncbi参考序列：np_001002026.1。该序列也公开为seqidno:133。4.鉴于cldn18.2在正常组织中的受限表达模式以及其在人类癌症中的异位表达，其是上皮肿瘤抗体治疗的有吸引力的癌症靶标。已经对这种抗体疗法进行了许多研究。wo2004/047863鉴定了cldn18的剪接变体并筛选了针对源自cldn18.2的不同肽的抗体：肽dqwstqdlyn(seqidno:57)，cldn18.2的n端胞外，与糖基化无关；肽nnpvtavfnyq(seqidno:58)，cldn18.2的n端胞外，大体上未糖基化；和肽stqdlynnpvtavf(seqidno:59)，cldn18.2的n端胞外域，未糖基化。其还公开了用在cldn18.1和cldn18.2同种型共同的c端胞外域中的泛cldn18肽tnfwmstanmytg(seqidno:60)筛选的多克隆兔抗体。wo2005/113587公开了针对由肽序列定义的cldn18.2特定表位的抗体：almivgivlgaigllv(seqidno:61)和rigsmedsakanmtltsgimfivs(seqidno:62)。wo2007/059997公开了通过用肽metdtlllwvlllwvpgstgdaaqparrarrtklgtelgstpvwwnsadgrmdqwstqdlynnpvtavfnyqglwrscvressgftecrgyftllglpamlqavraaiqhsggrsrrartkthlrrgse(seqidno:63)免疫获得的cldn18.2特异性单克隆抗体，包括具有n-端和c-端延伸的cldn18.2的第一胞外域。通过这种免疫获得的抗体通过补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)介导细胞杀伤。抗体imab362，也称为claudiximab或zolbetuximab，公开于wo2007/059997和wo2016/165762。imab362是源自鼠单克隆抗体的igg1抗体，并且已经被嵌合以展示人igg1恒定区供临床使用。wo2008/145338还公开了与第一胞外域内的重叠肽(mdqwstqdlynnpvt(seqidno:64)、lynnpvtavfnyqgl(seqidno:65)、vfnyqglwrscvres(seqidno:66)、qglwrscvressgft(seqidno:67)和rscvressgftecrg(seqidno:68))结合的抗体。为了产生靶向cldn18.2的c-端部分的抗体以用于检测癌症组织切片的细胞中的cldn18.2表达的诊断目的，wo2013/167259公开了与cldn18.2的c-端表位结合的抗体。这两个表位的序列是tedevqsypskhdyv(seqidno:69)和evqsypskhdyv(seqidno:70)。wo2013/174509提出了抗cldn18.2抗体与稳定γδt细胞的药剂或与稳定或增加cldn18.2表达的药剂的组合。抗体可以与治疗部分如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性同位素缀合。wo2014/075788公开了使用结合cldn18.2和cd3的双特异性抗体治疗癌症疾病的方法。wo2014/127906公开了稳定或增加cldn18.2表达的组合剂。wo2016/166122公开了抗cldn18.2单克隆抗体，该抗体可在cldn18.2结合后高效内化，因此适用于抗体-药物缀合物(adc)开发。此外，还公开了分别使用可切割的spdb或缬氨酸-瓜氨酸接头将此类抗体与药物dm4和mmae缀合。然而，尽管专利申请中公开了所有抗体，但目前只有wo2007/059997和wo2016/165762中公开的嵌合imab362在临床试验中得到测试。除了这些抗体和adc，wo2018/006882还公开了基于抗cldn18.2单克隆抗体的嵌合抗原受体(car)。wo2018/006882的抗体已经人源化，其序列在与jiang等人2018(jiang等人2018)相关的补充材料部分中公开。基于人源化抗体的cart细胞目前正在晚期胃腺癌和胰腺癌患者的i期临床试验(clinicaltrials.gov标识符：nct03159819)中进行测试。cn109762067公开了介导通过cdc和adcc的细胞杀伤的其他抗cldn18.2单克隆抗体。wo2019/173420公开了具有adcc活性的抗cldn18.2人源化单克隆抗体。wo2019/175617公开了相较于imab362结合不同的表位的抗cldn18.2单克隆抗体。wo2019/219089公开了结合cldn18.2突变体的单克隆抗体。5.已描述cldn18.2以不同的构象存在并含有潜在的细胞外n-糖基化位点(参见wo2007/059997第3页，第一段)，这可能导致正常细胞和肿瘤细胞之间潜在不同的拓扑结构/差异糖基化(参见wo2007/059997第4页，第二段)。然而，报道的抗体无一优先靶向肿瘤细胞上表达的cldn18.2。由于cldn18.2不仅在肿瘤中表达，而且在健康组织即在胃组织中表达(sahin等人2008)，显然有益的是具有仅靶向肿瘤中表达的cldn18.2的抗体，以避免经常与治疗性抗体对健康器官/组织的中靶作用相关的安全问题和副作用(hansel等人2010)，特别是如针对imab362报道(sahin等人2018；tureci等人2019)。6.除了以高亲和力与靶标结合外，治疗性抗体还应在开发、生产、储存和临床应用(体内)期间保持其期望特性。翻译后修饰(ptm)可能会损害抗体的稳定性(lu等人2019；gervais2016)。由于不受控制的ptm可能导致抗体的功效、活性、效力或稳定性低于期望，因此在开发治疗性抗体期间设计具有最小可能ptm的抗体非常重要。ptm还可以对生物仿制药的监管接受、技术转让或工艺和开发产生深远的影响。主要的修饰是氧化、脱酰胺和异构化。此外，imab362是仍具有延伸的小鼠序列的嵌合抗体，所述小鼠序列可能会导致某些患者产生抗药抗体，其例如在重复应用后可能会导致治疗效果下降。7.因此，需要改进的对cldn18.2特异性的抗体，用于治疗肿瘤患者。8.定义[0009]“抗体”，也称为“免疫球蛋白”(ig)，通常包含四条多肽链—两条重(h)链和两条轻(l)链，因此是多聚体蛋白质，或包含其等效的ig同源物(例如，仅包含重链的骆驼科抗体，单结构域抗体(sdab)或纳米抗体，其可以衍生自重链或轻链)。术语“抗体”包括基于抗体的结合蛋白、保留靶标结合能力的修饰抗体形式。术语“抗体”还包括保留ig分子的基本表位结合特征的全长功能突变体、变体或衍生物(包括但不限于鼠的、嵌合的、人源化的和完全人的抗体)，并且包括双重特异性、双特异性、多特异性和双可变结构域ig。ig分子可以是任何类别(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)或亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)和同种异型。ig分子也可以发生突变，例如增强或降低对fcγ受体或新生fc受体(fcrn)的亲和力。[0010]如本文所用，“抗体片段”涉及非全长的并表现出靶标结合的包含衍生自抗体的至少一条多肽链的分子。抗体片段能够与其相应的全长抗体结合相同的表位或靶标。抗体片段包括但不限于单独或任意组合的(i)fab片段，其是由可变轻(vl)结构域、可变重(vh)结构域、恒定轻(cl)结构域和恒定重1(ch1)结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，其是包含两个在铰链区通过二硫键连接的fab片段的二价片段(f(ab')2片段的还原产生具有游离巯基的两个fab'片段)；(iii)fab(fa)片段的重链部分，其由vh和ch1结构域组成；(iv)可变片段(fv)片段，其由抗体单臂的vl和vh结构域组成；(v)结构域抗体(dab)片段，其包含单个可变结构域；(vi)分离的互补决定区(cdr)；(vii)单链fv片段(scfv)；(viii)双抗体，其为二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短而无法使同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点；(ix)线性抗体，其包含一对串联的fv片段(vh-ch1-vh-ch1)，与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(x)双重可变结构域免疫球蛋白；(xi)免疫球蛋白重链和/或轻链的其他非全长部分，或其突变体、变体或衍生物。[0011]如本文所用，“基于抗体的结合蛋白”可代表在其他非免疫球蛋白或非抗体衍生组分的情况下含有至少一个抗体衍生的vh、vl或ch免疫球蛋白结构域的任何蛋白质。此类基于抗体的蛋白质包括但不限于(i)结合蛋白的fc融合蛋白，包括具有全部或部分免疫球蛋白ch结构域的受体或受体组分，(ii)结合蛋白，其中vh和/或vl结构域与替代分子支架偶联，或(iii)分子，其中免疫球蛋白vh和/或vl和/或ch结构域以天然存在的抗体或抗体片段中通常找不到的方式组合和/或组装。[0012]如本文所用，术语“修饰的抗体形式”涵盖抗体-药物缀合物(adc)、聚环氧烷修饰的scfv、单抗体、双抗体、骆驼科抗体、结构域抗体、双特异性或三特异性抗体、iga、或由j链和分泌组分连接的两种igg结构、鲨鱼抗体、新大陆灵长类动物框架和非新大陆灵长类动物cdr、去除铰链区的igg4抗体、具有工程改造进入ch3结构域中的两个额外结合位点的igg、具有改变的fc区以增强或降低对fcγ受体的亲和力的抗体、包含ch3、vl和vh的二聚化构建体等。[0013]kabat编号方案(martin和allemn2014)已经应用于公开的抗体。[0014]在本说明书和权利要求书中使用术语“包含”时，其不排除其他元素。出于本发明的目的，认为术语“由……组成”是术语“包含……”的优选实施方案。如果在下文中将组限定为包括至少一定数量的实施方案，这也应理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。[0015]除非另有明确说明，涉及单数名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一”、“一个”或“该”，包括该名词的复数形式。[0016]技术术语按其常识使用。如果将特定含义传达给某些术语，则将在以下使用该术语的上下文中给出术语的定义。[0017]发明详述[0018]本发明人惊奇地鉴定出如以下实施方案中进一步描述的新型抗cldn18.2抗体，其展现出相较于表达cldn18.2的健康胃细胞对表达cldn18.2的肿瘤细胞的结合增加和/或具有改进的稳定性和/或在保留其改进的特性的情况下人源化。[0019]因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其中该抗体或其片段展现出相较于表达cldn18.2的健康组织对表达cldn18.2的肿瘤组织的结合增加。在一个实施方案中，用于比较的健康细胞或组织是健康胃细胞或健康胃组织。[0020]分别如实施例4和5中所示，本文提供的抗体或其片段对肿瘤组织的结合增加可以通过生物分析方法如流式细胞术(fc)或免疫组织化学(ihc)来显示。可以通过将表达cldn18.2的a549细胞皮下注射到balb/c小鼠中来生成表达cldn18.2的肿瘤。表达cldn18.2的a549细胞可以如实施例4中所示生成，并且可以在2019年12月6日保藏在dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbhinhoffenstr.7b38124braunschweigde的保藏号dsmacc3360下获得。健康组织(例如健康胃组织)也可以来源于携带肿瘤的小鼠。因此可以在肿瘤组织和从同一动物获得的健康组织上显示相较于健康组织对肿瘤组织的结合增加。[0021]相较于在健康组织中表达的cldn18.2，对在肿瘤组织中表达的cldn18.2的结合增加可能是由于翻译后修饰，如cldn18.2的差异糖基化或cldn18.2的错误折叠。[0022]流式细胞术(fc)可用作测试抗体结合的生物分析方法。cldn18.2阳性细胞的百分比可以例如通过特异性抗cldn18.2抗体的fc测量。另一种可能的结合读数可以例如是肿瘤细胞样品中cldn18.2阳性细胞的百分比相对于从健康组织(如健康胃组织)获得的细胞样品中cldn18.2阳性细胞的百分比的比率。与健康细胞(如健康胃细胞)相比，抗体对由表达cldn18.2的a549细胞生成的表达cldn18.2的肿瘤细胞的结合增加，可以通过》2、》5、≥10、优选地≥15、以及更优选地≥20的比率显示。[0023]与健康细胞(如健康胃细胞)相比，抗体对由表达cldn18.2的a549细胞生成的表达cldn18.2的肿瘤细胞的结合增加，也可以通过显示相较于健康细胞(如健康胃细胞)，抗体结合至少2倍更多、至少5倍更多、至少10倍更多、优选地至少15倍更多、优选地至少20倍更多的肿瘤细胞来描述。[0024]免疫组织化学(ihc)可用作测试抗体结合的生物分析方法。优选地，用于ihc的组织样品应在切除后速冻，一旦解冻，就如例如实施例5所示固定在丙酮中。由于cldn18.2是健康组织中的紧密连接蛋白，因此阳性cldn18.2染色应导致在健康组织和/或肿瘤组织中的细胞-细胞界面处膜染色占主导的显现。因此，阴性cldn18.2染色或弱染色应导致膜染色的缺乏。[0025]在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，当通过对过表达cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术(fc)滴定进行测量时，其以高于0.4μg/ml、高于0.5μg/ml、优选地高于0.6μg/ml、但不高于1μg/ml的半数最大有效浓度(ec50)值结合cldn18.2。可以如实施例3中所述生成过表达cldn18.2的hek293t细胞。当通过对过表达cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术(fc)滴定进行测量时，本发明的抗体的ec50值可以是0.4至1μg/ml、0.5至1μg/ml或优选地0.6至1μg/ml。[0026]或者，当通过对过表达cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术进行测量时，本发明抗体的ec50值可以与imab362的ec50值进行比较，其中本发明抗体的ec50值比imab362的ec50值至少高1.1倍、至少高1.2倍、优选地至少高1.5倍、更优选地至少高2倍、甚至更优选地至少高2.5倍，但比imab362的ec50值高不超过5倍。当通过对过表达cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术测量时，本发明抗体的ec50值可以比imab362的ec50值高1.1倍至高2.5倍、高1.2倍至高2.5倍、优选地高1.5倍至高2.5倍、或更优选地高2倍至高2.5倍。[0027]在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，当通过对pa-tu-8988s-high细胞的流式细胞术滴定进行测量时，其以高于0.6μg/ml、高于1μg/ml、优选地高于1.5μg/ml、更优选地高于2μg/ml但不高于3mg/ml的ec50值结合cldn18.2。可以如实施例2中所述生成pa-tu-8988s-high细胞。当通过对pa-tu-8988s-high细胞的流式细胞术滴定进行测量时，本发明抗体的ec50值可以是0.6至3μg/ml、1至3mg/ml、优选地1.5至3μg/ml、或更优选地2至3μg/ml。[0028]或者，当通过对pa-tu-8988s-high细胞的流式细胞术进行测量时，本发明抗体的ec50值可以与imab362的ec50值进行比较，其中本发明抗体的ec50值比imab362的ec50值至少高1.5倍、至少高2倍、优选地至少高3倍、更优选至少高4倍，但高不超过5倍。当通过流式细胞术对pa-tu-8988s-high细胞进行测量时，本发明抗体的ec50值可以比imab362的ec50值高1.5倍至高5倍、高2倍至高5倍、高3倍至高5倍、或高4倍至高5倍。[0029]在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，当通过对过表达cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术进行测量时，其以imab362的maxmfi值的 /-40％内的maxmfi值结合cldn18.2。本发明还提供了抗体或其片段，当通过对pa-tu-8988s-high细胞的流式细胞术进行测量时，其以等于imab362的maxmfi值或比imab362的maxmfi值高至多2倍的maxmfi值结合cldn18.2。[0030]相较于表达cldn18.2的健康组织对表达cldn18.2的肿瘤组织的结合增加的抗体或其功能片段可以相较于不能区分表达cldn18.2的健康组织与表达cldn18.2的肿瘤组织的抗体具有治疗优势。肿瘤特异性抗体可以不导致通常与治疗性抗体在健康器官/组织中的中靶作用有关的安全问题和副作用(hansel等人2010)。例如对于imab362，已经报道了这种不想要的效应(sahin等人2018；tureci等人2019)。[0031]本发明还提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含分别为seqidno:21、seqidno:22和seqidno:23的重链互补决定区(hcdr)hcdr1、hcdr2和hcdr3序列以及分别为seqidno:24、seqidno:25和seqidno:26的轻链cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0032]本发明还提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含seqidno:23的重链hcdr3序列和seqidno:26的轻链lcdr3序列。[0033]相应的共有序列可以在表1中找到。应当理解，基于源自共有序列的cdr的任意组合并结合cldn18.2的任何抗体或其片段是本发明的一部分。[0034]表1:分离的抗体cdr共有序列[0035][0036][0037]抗体结合或结合亲和力通常用平衡结合或解离常数(分别为ka或kd)表示，它们又是解离和结合速率常数(分别为koff和kon)的倒数比。因此，只要速率常数的比率保持不变，等效的亲和力可对应于不同的速率常数。结合亲和力和/或速率常数可以使用本领域熟知的或本文描述的技术来确定，如elisa、流式细胞术滴定、等温滴定量热法(itc)、biacore(spr)、生物层干扰量度法(biolayerinferometry)或荧光偏振。在一些情况下，由于抗原的性质，抗体的ka或kd可能难以测量。对于如密蛋白的整合膜蛋白而言，尤其如此(hashimoto等人2018)。在这种情况下，整合膜蛋白可以表达为蛋白脂质体或脂质颗粒。此类脂质颗粒可固定在塑料上并用于elisa测定以确定抗体与固定抗原的结合亲和力。因此，可以计算每个测试抗体或其功能片段的半数最大有效浓度(ec50)值，代替ka或kd值，反映其与抗原的结合亲和力(或结合强度)。下面的实施例2和图1举例说明了具有包含在表1的共有序列中的cdr的抗体的elisa测定结合亲和力曲线。ec50值和最大结合值可用于定量抗体与cldn18.2的结合。下面的实施例3涉及通过对表达cldn18.2的细胞的流式细胞术，计算具有包含在表1的共有序列中的cdr的抗体的ec50值。[0038]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含分别为seqidno:21、seqidno:126和seqidno:23的重链cdrhcdr1、hcdr2和hcr3序列以及分别为seqidno:24、seqidno:25和seqidno:26的轻链cdrlcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0039]在一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含：[0040]a.分别为seqidno:1、seqidno:15和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0041]b.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0042]c.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:17、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0043]d.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:18、seqidno:19和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0044]e.分别为seqidno:12、seqidno:15和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0045]f.分别为seqidno:1、seqidno:20和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0046]g.分别为seqidno:1、seqidno:20和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:18、seqidno:19和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0047]h.分别为seqidno:12、seqidno:20和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或[0048]i.分别为seqidno:12、seqidno:20和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:17、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0049]在又一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含：[0050]a.分别为seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0051]b.分别为seqidno:1、seqidno:7和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或[0052]c.分别为seqidno:12、seqidno:2和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:13、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0053]在又一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含：[0054]a.seqidno:27的vh序列和seqidno:28的vl序列；[0055]b.seqidno:29的vh序列和seqidno:30的vl序列；[0056]c.seqidno:31的vh序列和seqidno:32的vl序列。[0057]在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含：[0058]a.seqidno:33的vh序列；[0059]b.seqidno:34的vh序列；[0060]c.seqidno:35的vh序列；[0061]d.seqidno:36的vh序列；或[0062]e.seqidno:37的vh序列；[0063]和[0064]f.seqidno:38的vl序列；[0065]g.seqidno:39的vl序列；[0066]h.seqidno:40的vl序列；或[0067]i.seqidno:41的vl序列。[0068]在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含：[0069]a.seqidno:33的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0070]b.seqidno:34的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0071]c.seqidno:34的vh序列和seqidno:39的vl序列；[0072]d.seqidno:34的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0073]e.seqidno:35的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0074]f.seqidno:36的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0075]g.seqidno:36的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0076]h.seqidno:37的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0077]i.seqidno:37的vh序列和seqidno:38的vl序列；或[0078]j.seqidno:37的vh序列和seqidno:39的vl序列。[0079]在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其包含：[0080]a.seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0081]b.seqidno:47的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0082]c.seqidno:47的重链序列和seqidno:52的轻链序列；[0083]d.seqidno:47的重链序列和seqidno:53的轻链序列；[0084]e.seqidno:48的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0085]f.seqidno:47的重链序列和seqidno:54的轻链序列；[0086]g.seqidno:49的重链序列和seqidno:53的轻链序列；[0087]h.seqidno:50的重链序列和seqidno:54的轻链序列；[0088]i.seqidno:50的重链序列和seqidno:51的轻链序列；或[0089]j.seqidno:50的重链序列和seqidno:52的轻链序列。[0090]所公开的抗体的恒定轻链区cl和恒定重链区ch1和fc区可以分别具有seqidno:127和seqidno:128的氨基酸序列。[0091]在优选的实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列。[0092]在进一步优选的实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其由seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列组成。[0093]本发明还涉及具有与本发明抗体的氨基酸序列有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列的抗体，相较于表达cldn18.2的健康胃细胞，其表现出对表达cldn18.2的肿瘤细胞的结合增加。[0094]在一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其具有与包含以下的抗体有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列:[0095]a.seqidno:27的vh序列和seqidno:28的vl序列；[0096]b.seqidno:29的vh序列和seqidno:30的vl序列；[0097]c.seqidno:31的vh序列和seqidno:32的vl序列。[0098]在进一步的实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其具有与包含以下的抗体有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列:[0099]a.seqidno:33的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0100]b.seqidno:34的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0101]c.seqidno:34的vh序列和seqidno:39的vl序列；[0102]d.seqidno:34的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0103]e.seqidno:35的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0104]f.seqidno:36的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0105]g.seqidno:36的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0106]h.seqidno:37的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0107]i.seqidno:37的vh序列和seqidno:38的vl序列；或[0108]j.seqidno:37的vh序列和seqidno:39的vl序列。[0109]在又一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体，其具有与由seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列组成的抗体有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少98％同一性的氨基酸序列。[0110]在另一个实施方案中，抗体(或存在的抗体片段)的fc结构域可以包含修饰或突变，如下表2中列出的修饰或突变。可以引入此类修饰或突变来调节抗体的fc结构域的效应器活性。抗体的修饰还可以包括添加到抗体hc链和/或lc链的c端的肽标签。此类标签可以用于例如蛋白质纯化或蛋白质缀合。[0111]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2抗体或其片段，该抗体是iga1、iga2、igd、ige、igg1、igg2、igg3、igg4、合成igg、igm、f(ab)2、fv、scfv、iggach2、f(ab')2、scfvch3、fab、vl、vh、scfv4、scfv3、scfv2、dsfv、fv、scfv-fc、(scfv)2、非消耗性(non-depleting)igg、双抗体、二价抗体或其fc工程化版本。在优选的实施方案中，抗体是igg1类型的抗体。免疫球蛋白的fc区与多种fcγ受体(fcγr)和补体蛋白(例如，c1q)相互作用，并介导免疫效应器功能，如通过抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)或补体依赖性细胞毒性(cdc)消除靶细胞。对于治疗方法，增强或沉默相关效应器功能可能是有益的。免疫球蛋白的类型(iga、igd、ige、igg、igm)可以根据与fc结构域相关的抗体的期望效应器功能来选择。也可以使用合成免疫球蛋白，如具有igg2氨基酸118至260和igg4氨基酸261至447的免疫球蛋白或具有来自igg4的点突变(例如，h268q/v309l/a30s/p331s)的igg2变体。此类合成免疫球蛋白降低了抗体的效应器功能。fc工程化免疫球蛋白也可以用于调节抗体效应器功能。表2显示了此类fc工程化的实例。在具有改变的岩藻糖基化的生产细胞系中的表达也可以影响fcγr结合。[0112]表2：调节抗体效应器功能的修饰的实例。除非另有说明，否则突变位于igg1亚类上(wang,mathieu和brezski2018)。[0113][0114][0115]也可以调节抗体的半衰期。fc结构域在抗体的稳定性和血清半衰期中起着核心作用。对于治疗方法，抗体半衰期可通过使用缺少fc结构域或具有截短fc结构域的抗体片段来缩短，如f(ab)2、fv、scfv、iggach2、f(ab')2、scfvch3、fab、vl、vh、scfv4、scfv3、scfv2、dsfv、fv、scfv-fc或(scfv)2。抗体也可以是双抗体或二价抗体的形式。双抗体或二价抗体可用于增加对靶标的亲和力，从而允许较低剂量。缺少fc结构域或具有截短fc结构域的功能片段也可用于开发其他治疗方法，如嵌合抗原受体t细胞(cart细胞)或双特异性t细胞接合剂(bite)。在car构建体中，一个vh结构域和一个vl结构域通常通过短肽接头连接以形成单链可变片段(scfv)，并且scfv片段进一步连接到跨膜结构域和胞质内t细胞免疫受体的基于酪氨酸的激活基序(来自例如cd3ζ)和共刺激分子的其他结构域(来自例如cd28、4-1bb(cd127)或ox40)(chang和chen2017)。scfv片段中使用的vh和vl结构域可以是表3中列出的抗体。bite通常由两种不同抗体的两个scfv的融合物组成。一个scfv结构域可以是表3中列出的结合cldn18.2的分离的抗体，而另一个scfv结构域来自结合例如cd3、cd16、nkg2d、nkp46、cd2、cd28或cd25的抗体。可在diegoellerman(2019)的综述中找到用于t细胞重定向的bite抗体形式和其他双特异性抗体形式的充分指导。[0116]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，该抗体具有seqidno:127的恒定轻链区(cl)和优选地具有降低的fcγr结合的seqidno:129的恒定重链区ch1以及fc区，其在恒定重链区ch2中具有l234a/l235a突变。更优选地，本发明提供了抗体，该抗体具有seqidno:130的恒定重链区ch1和fc区，其在恒定重链区ch1和fc区中具有l234a/l235a/p329g突变，具有甚至进一步降低的fcγr结合。[0117]在另一个优选的实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含seqidno:33的vh序列、seqidno:38的vl序列、seqidno:127的恒定轻链区(cl)以及具有l234a/l235a的seqidno:129的恒定重链区ch1和fc区。[0118]在另一个优选的实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段，其由seqidno:33的vh序列、seqidno:38的vl序列、seqidno:127的恒定轻链区(cl)以及具有l234a/l235a的seqidno:129的恒定重链区ch1和fc区组成。[0119]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其中该抗体或其片段是人源化的。单克隆抗体的人源化是完善建立的。handbookoftherapeuticantibodies,第二版提供了单克隆抗体的人源化(saldanha2014)、用于分析此类抗体的生物信息学工具(martin和allemn2014)以及治疗性抗体的开发和制备(jacobi等人2014)的充分信息。[0120]在另一个实施方案中，抗体或其片段是结合cldn18.2的分离的抗体或分离的片段。[0121]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，其中该抗体或其片段不结合cldn18.1。因此，抗体不表现出与cldn18.1的交叉反应性或交叉结合。抗体与靶蛋白的结合可以通过对表达靶蛋白的细胞的流式细胞术进行测试。测试抗体与其靶蛋白的特异性结合可以在直方图上可视化。此图在抗体特异性结合表达的靶蛋白时产生具有高荧光信号的峰，而在抗体不结合或仅非常弱地结合表达的靶蛋白时产生具有低荧光信号的峰。结合程度也可以用条形图表示，显示通过流式细胞术测量的最大平均荧光强度(maxmfi)，高maxmfi反映强结合，低/无maxmfi反映无结合或非常弱的结合。比较同一实验设置中不同抗体的maxmfi值也可以表明抗体与靶标的亲和力，较高的maxmfi表示较低的解离率(offrate)和较高的亲和力。在实施例3以及图4和图5中可以找到此结合测定的实例。[0122]在另一个实施方案中，本发明提供了结合cldn18.2的抗体或其片段，该抗体与另一个部分结合。抗体或其片段与另一部分的结合可以是共价的或非共价的。该部分可以包括放射性同位素、荧光标签、组织学标志物、细胞毒素或细胞因子。该部分与抗体的共价结合可以通过本领域中已知的接头促进。[0123]在又一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的肿瘤特异性抗体或其片段，其中该抗体对翻译后脱酰胺化的易感性低于imab362。在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的肿瘤特异性抗体或其片段，其中该抗体不经历翻译后脱酰胺化。翻译后修饰(ptm)是抗体开发以及抗体生产和储存中的重要问题。不受控制的ptm可能导致抗体具有较低的功效、活性、效力或稳定性。ptm可以是n-糖基化、赖氨酸糖基化和生物加工过程中来自细胞培养基的其他半胱氨酸、谷胱甘肽或其他含巯基的化合物加帽的半胱氨酸、或者由于通过共价二硫键连接的半胱氨酸形成二聚体和更高级的寡聚体。在ptm中，天冬酰胺(asn,n)残基的脱酰胺化、天冬氨酸盐(天冬氨酸,asp,d)残基的异构化和琥珀酰亚胺中间体的形成是在生产、储存期间或施用后体内的治疗性抗体的最常见的修饰反应。asn的脱酰胺化和asp的异构化取决于序列倾向、结构环境和储存条件，特别是溶液ph值和储存温度。这些修饰可能导致功能或生物活性降低或甚至丧失，特别是在受影响的残基参与靶标结合的情况下。asn和asp残基面临修饰的风险，特别是当它们位于结构柔性的区域(如cdr环)中时，以及满足某些其他结构的先决条件时，而已观察到框架区对修饰具有可比较的抗性。除了asn和asp残基的结构位置外，还鉴定了asn脱酰胺和asp异构化的典型基序。这些典型基序分别为ng、ns、nn、nt、nh、以及dg、ds、dd、dt和dh(lu等人2019)。在计算机分析中，公开的抗体在vl结构域的cdr2的最后一个氨基酸和hc的ch2和ch3区(vl-cdr2(在位置62)、ch2(在位置282)、ch3(在位置403))中呈现dgasp异构化基序。[0124]asp的异构化可以通过将抗体置于低ph(即ph5.5)和加热(即40℃)两周来测试，而抗体的asn脱酰胺化可以通过将抗体置于高ph(即ph8.0)和加热(即40℃)一周，模拟生产和储存条件来测试。[0125]发明人现已表明，尽管在这些苛刻条件下，所公开的抗体在它们的cdr中含有asn和asp，并且带有asp-gly(dg)asp-异构化基序，但是令人惊讶地它们没有asn脱酰胺化(参见表6)和asp异构化(参见表7)并且它们与cldn18.2的结合亲和力不受影响。另一方面，imab362在这种条件下显示出asn脱酰胺化，诱导结合亲和力丧失(如表6和图10所示)。因此，本发明提供了结合cldn18.2的分离的抗体或其片段，并且在生产、储存和临床应用(体内)期间与imab362相比不易受ptm影响，并且保证在生产、储存和临床应用(体内)期间维持的与cldn18.2的结合亲和力。[0126]本发明还提供了与本文所述抗体结合相同表位的抗体。在一个实施方案中，该抗体与包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体结合相同的表位。[0127]本发明进一步提供与本文所述抗体竞争结合的抗体。在一个实施方案中，该抗体与包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体竞争结合。[0128]本发明进一步提供竞争性抑制本文所述抗体与密蛋白18.2结合的抗体。在一个实施方案中，该抗体竞争性地抑制包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体与密蛋白18.2的结合。[0129]检测抗体与相同抗原的结合的合适方法包括定位抗原-抗体相互作用的方法。此方法已描述于abbott2014(abbott,damschroder和lowe2014)。检测竞争的合适方法包括通过表位分箱(binning)进行的竞争性测定，如abdiche2009(abdiche等人2009)中所述。检测竞争性抑制的合适方法包括elisa测定。[0130]根据一个实施方案，本发明提供了编码结合cldn18.2的分离的肿瘤特异性抗体或其功能片段的核酸序列。核酸序列可以编码单独的cdr、编码vh和vl区、或编码抗体的整个重链和轻链。这些核酸序列可以在表3中找到。核酸序列还可以编码f(ab)2、fv、scfv、iggach2、f(ab')2、scfvch3、fab、vl、vh、scfv4、scfv3、scfv2、dsfv、fv、scfv-fc、(scfv)2、非消耗性igg、双抗体、二价抗体或其fc工程化版本。编码的免疫球蛋白可以是iga1、iga2、igd、ige、igg1、idg2、igg3、igg4、合成igg、igm或其突变和fc工程化版本。[0131]在又一个实施方案中，核酸序列还可以编码结合cldn18.2的car构建体。在chang和chen(2017)或june和sadelain(2018)中可以找到关于构建cart细胞的充分指导。在一个实施方案中，本发明提供了t细胞，该t细胞经过基因工程改造以产生人工t细胞受体，例如嵌合抗原受体(car)，其中人工t细胞受体包含本发明的结合cldn18.2的抗体或其功能片段。[0132]在又一个实施方案中，本发明提供特异性结合cldn18.2的基于肿瘤特异性抗体的结合蛋白。此类结合蛋白可以至少包含公开的抗体的cldn18.2结合结构域和另一个与抗体无关的蛋白质结构域。本发明还提供了结合cldn18.2的修饰抗体形式。[0133]本发明还提供了表达载体，其包含本发明的核酸或由于密码子简并性而导致的简并核酸。表达载体可以是用于在哺乳动物细胞、细菌、真菌或昆虫细胞中表达蛋白质的表达载体，并且选择用于携带包含编码抗体或其功能片段的核酸的表达载体的宿主细胞类型。在green和sambrook(green和sambrook2012)中可以找到构建此类载体的充分指导。[0134]在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是哺乳动物细胞或细胞系、细菌细胞、真菌细胞或昆虫细胞。[0135]在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段、编码该抗体或其片段的核酸、包含该核酸的载体或包含该核酸或该载体的宿主细胞，用于治疗患有肿瘤疾病的受试者。[0136]在另一个实施方案中，本发明涉及结合cldn18.2的抗体或其片段、编码该抗体或其片段的核酸、包含该核酸的载体或包含该核酸或该载体的宿主细胞，用于治疗有形成赘生性疾病风险的受试者，和/或用于治疗被诊断患有赘生性疾病的受试者。[0137]所公开的抗体或其片段可用作单一疗法。在一个优选的实施方案中，所公开的抗体或其片段与肿瘤疾病的既定护理标准结合使用。[0138]肿瘤疾病可以是选自胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌和肺癌中的至少一种疾病。据了解，待治疗的赘生性疾病表达cldn18.2。[0139]在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人。[0140]本发明的另一个实施方案提供了使用结合cldn18.2的抗体或其功能片段治疗赘生性疾病的方法，所述赘生性疾病包括胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌或肺癌，其中该方法包括向有需要的受试者提供施用药学有效量的抗体或其功能片段。治疗方法可以是单一疗法或优选地与肿瘤疾病的既定护理标准的联合疗法。[0141]人cldn18.2蛋白的氨基酸序列可来源于ncbi参考序列：np_001002026.1。该序列也公开为seqidno:133。附图说明[0142]图1：通过elisa评估如指定的所选嵌合和人源化抗cldn18.2抗体与含有cldn18.2的脂质颗粒或空脂质颗粒的结合。a.嵌合抗体ccl1-1、ccl1-2、ccl1-3、imab362和仅二抗；b.人源化抗体hcl1a至hcl1j、嵌合ccl1-1、imab362和仅二抗。所有新生成的抗体都结合脂质体cldn18.2。[0143]图2：针对cldn18.2表达水平对pa-tu-8988s细胞进行分选。a.用imab362染色的pa-tu-9888s的fc谱。b.通过facs针对高表达cldn18.2分选的pa-tu-8988s细胞的fc谱。[0144]图3：生成过表达hucldn18.2的hek293t细胞。用编码hucldn18.2以稳定表达cldn18.2或编码hucldn18.1以稳定表达cldn18.1的质粒转染不内源性表达cldn18.2的hek293t细胞。在用imab362和泛cldn18.1抗体或仅抗人igg二抗染色后，通过fc分析表达。a.未转染的hek293t细胞的fc谱。b.稳定表达cldn18.1的转染hek293t细胞的fc谱。c.稳定表达cldn18.2的转染hek293t细胞的fc谱。[0145]图4：嵌合ccl1-1、ccl1-2和ccl1-3抗体与过表达cldn18.1或cldn18.2的前b细胞l11细胞的流式细胞术结合测定。嵌合抗体结合cldn18.2而不结合cldn18.1。imab362用作阳性结合对照。[0146]图5：人源化hcl1a至hcl1j抗体对过表达cldn18.1或cldn18.2的hek293t细胞的流式细胞术结合测定。人源化抗体结合cldn18.2而不结合cldn18.1。imab362和ccl1-1用作阳性结合对照。[0147]图6：过表达cldn18.2的a549细胞的facs表达谱。用编码cldn18.2的质粒稳定转染不表达内源性cldn18.2的a549细胞，并使用imab362通过facs分析cldn18.2的表达。[0148]图7：流式细胞术活细胞染色。该图表示由cldn18.2抗体(ccl1-1、hcl1a、hcl1b、hcl1c、hcl1f和imab362)结合的分离的单细胞的百分比。单细胞从注射的过表达cldn18.2的a549细胞引起的表达cldn18.2的小鼠肿瘤中分离(实心条)或从表达cldn18.2的小鼠健康胃中分离(空心条)。[0149]图8：冷冻胃组织染色。表达cldn18.2的小鼠健康胃组织的冷冻组织切片已用hcl1a(a)、hcl1b(b)、hcl1c(c)、hcl1f(d)或imab362(e)抗体染色。图片是代表性的ihc图像。[0150]图9：从注射的过表达cldn18.2的a549细胞引起的冷冻肿瘤组织的染色。表达cldn18.2的小鼠肿瘤的冷冻组织切片已用hcl1a(a)、hcl1f(b)、imab362(c)或abcam34h14l15泛cldn18抗体染色。图片是代表性的ihc图像。[0151]图10：脱酰胺化对imab362结合活性的影响。脱酰胺化后imab362对cldn18.2的亲和力降低。实施例[0152]实施例1：嵌合和人源化抗体的生成[0153]生成单克隆抗体的技术已经是完善建立的。handbookoftherapeuticantibodies,第二版(2014)提供了有关这些技术的充分信息，如通过免疫小鼠或大鼠产生单克隆抗体(moldenhauer2014)、单克隆抗体的人源化(saldanha2014)、用于分析抗体的生物信息学工具(martin和allemn2014)或治疗性抗体的开发和制备(jacobi等人2014)。简而言之，通过用编码人cldn18.2cdna(hucldn18.2)(ncbi参考序列：nm_001002026.3)的质粒对大鼠进行dna免疫，生成针对cldn18.2的单克隆抗体。通过流式细胞术(fc分析)和elisa分析大鼠免疫血清对hucldn18.2的特异性反应性。随后从免疫大鼠分离的淋巴细胞中生成杂交瘤克隆以获得嵌合抗体。三个克隆被鉴定为cldn18.2特异性，从而产生了具有相似的cdr的名为ccl1-1、ccl1-2和ccl1-3的嵌合抗体(参见表3)。随后，将ccl1-1、ccl1-2和ccl1-3人源化，产生了10个人源化克隆，分别命名为hcl1a、hcl1b0、hcl1c、hcl1d、hcl1e、hcl1f、hcl1g、hcl1h、hcl1i和hcl1j抗体(参见表3)。[0154]作为对照，使用wo2013/174509中公布的重链(seqidno:55)和轻链(seqidno:56)的序列合成imab362抗体，命名为单克隆抗体182-d1106-362，保藏号dsmacc2810，于2006年10月26日保藏在dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbhinhoffenstr.7b38124braunschweigde。[0155]表3：抗体核酸和氨基酸序列[0156][0157][0158][0159][0160][0161][0162][0163][0164][0165][0166][0167][0168][0169]进一步修饰实施例2至5中描述的抗体以在hc的c端含有rlpqtgg标签(seqidno:131)和/或在lc的c端含有ggggslpqtgg标签(seqidno:132)。在这种情况下，hc上的c端赖氨酸(k)被标签的arg(r)取代。标签的添加没有改变抗体对cldn18.2的亲和力和特异性。[0170]实施例2：elisa测定和fc滴定以确认嵌合和人源化抗体变体对cldn18.2的结合[0171]嵌合抗体和人源化抗体(hcl)对cldn18.2的结合亲和力在elisa测定中进行了测试，其中带有cldn18.2的脂质颗粒作为抗原来源。cldn18.2-脂质颗粒和空脂质颗粒(没有结合的抗原，作为阴性对照)用于以10u/ml的最终浓度包被96孔板。用pbs/0.05％tween-20(pbs-t)洗涤并在37℃下用pbs-t/3％bsa封闭至少1小时后，起始浓度为2μg/ml的测试抗体的1:3连续稀释液添加到包被的孔中并在37℃下孵育至少1小时。通过结合hrp-山羊抗人二抗，以sigmafasttmopd作为过氧化物酶底物进行显影，通过加入2mh2so4终止反应，然后在elisa读板器上读取490nm处的od，揭示了结合抗体的存在。代表性结合曲线显示于图1。本发明的所有测试抗体特异性结合含有cldn18.2的脂质颗粒。有趣的是，与亲本嵌合ccl1-1抗体相比，嵌合抗体的人源化并未导致亲和力降低，如可以预期，并且对于10种抗体中的6种，甚至增加了其亲和力。[0172]嵌合抗体和人源化抗体对cldn18.2的结合也通过使用过表达cldn18.2的pa-tu-8988s细胞(creativebioarray，目录号csc-c0326)和hek293t(atcc，crl-3216tm)细胞的fc滴定来测试。fc滴定允许测量测试抗体的半数最大有效浓度(ec50)。通过facs选择表达高水平cldn18.2的pa-tu-8988s细胞。本文中，这些细胞被命名为pa-tu-8988s-high细胞。基于imab362的facs染色，pa-tu-8988s细胞群表达不同水平的cldn18.2，具有高水平和中等水平的表达(参见图2a)。为了具有更同质的细胞群，细胞通过facs分选以仅选择具有较高cldn18.2表达的细胞。简而言之，将悬浮在facs缓冲液(pbs，2％fcs)中的pa-tu-8988s细胞与2μg/ml的imab362在冰上孵育30分钟。在facs缓冲液中洗涤后，将细胞与pe标记的fcγ特异性igg山羊抗人二抗(ebioscience)在冰上孵育30分钟。洗涤后，将染色的细胞重悬于facs缓冲液中，通过facsariatm仪器进行分析和分选，将中等表达细胞与高表达细胞分离(图2b)。在分选后，将收集的pa-tu-8988s-high细胞重悬于生长培养基中，扩增，并将冷冻等分保存于液氮中。如实施例3所述生成过表达cldn18.2或cldn18.1的hek293t细胞，并通过流式细胞术分析cldn18.2的表达(图3)。[0173]为了量化抗体与cldn18.2的结合，将250x103个细胞/孔的过表达cldn18.2的hek293t细胞或pa-tu-8988-high细胞接种到96-孔板中的fc缓冲液(pbs/2％fbs)中并通过离心沉降。imab362和待测的hcl抗体以20μg/ml稀释，然后按1:4连续稀释并在4℃下与分配的细胞孵育30分钟。在用fc缓冲液洗涤后，将pe偶联的抗人igg二抗添加到细胞中，在4℃下再持续30分钟，然后用fc缓冲液进一步洗涤。然后将细胞重悬于100μlfc缓冲液中，并用facscaliburtm细胞分析仪(bdbiosciences，美国)进行测量。fc分析(参见图5和表4)表明，hcl抗体比imab362具有更高的ec50值，尽管其maxmfi值与imab362在相同的范围内。相似的maxmfi值可以指示imab362和hcl抗体的相似结合/解离速率。[0174]表4：在过表达cldn18.2的hek293t细胞系和pa-tu-8988s-high细胞系上测量的所有hcl和imab362抗体的最大mfi和ec50(μg/ml)。[0175][0176]实施例3：稳定表达hcldn18.1和hcldn18.2的前b细胞l11细胞和hek293t细胞的生成；嵌合抗体和人源化抗体的结合特异性的测试。[0177]前b细胞l11细胞系(waldmeier等人2016)和hek293t(atcccrl-3216tm)细胞系不内源性表达cldn18.1或cldn18.2。因此，为了测试抗体结合，将cldn18.1和cldn18.2在这些细胞系中重组过表达。通过用转座酶表达构建体(pcdna3.1-hy-mpb)，带有可转座的全长hucldn18.1(ppb-puro-hucldn18.1)或hucldn18.2(ppb-puro-hucldn18.2)以及嘌呤霉素抗性盒的构建体和携带egfp的构建体作为转染对照(pegfp-n3)(waldmeier等人2016)电穿孔共转染细胞。电穿孔后，细胞在37℃的加湿培养箱中在生长培养基中恢复两天，对于l11细胞在7.5％co2气氛的情况下，对于hek293t细胞在5％co2气氛的情况下。通过egfp表达的fc分析来验证转染。然后通过将1μg/ml嘌呤霉素添加到培养物中来选择表达cldn18.1或cldn18.2的细胞，并进一步扩增以允许生成在含有10％dmso的fcs中的冷冻原液。通过fc分析转染细胞中cldn18.1和cldn18.2的表达(参见图3)。简而言之，通过离心收集悬浮生长的经胰蛋白酶处理的hek293t细胞和l11细胞，重悬于pbs/2％fcs中，并使用imab362作为一抗在冰上以2μg/ml的浓度对cldn18.2染色30分钟，然后在pbs/2％fcs中洗涤，用抗人igg(fcγ特异性)pe山羊抗体(ebioscience)作为二抗在冰上染色30分钟。进一步洗涤后，使用facscaliburtm仪器分析重悬于冰冷fc缓冲液中的染色细胞(参见图4和图5)。未转染的亲本细胞不表达cldn18.2，用作阴性对照。使用识别cldn18.1和cldn18.2的专有泛cldn18抗体以类似方式分析cldn18.1的表达(参见图3)。任何可用于流式细胞术测量的泛cldn18抗体也适用，如origenetechnologies提供的抗体抗密蛋白-18/cldn18(c端)(目录号ap50944pu-n)、来自mybiosource的cldn18(c端)兔pab(目录号mbs8555451)或来自prosci的cldn18抗体(目录号63-847)。[0178]因此，使用稳定表达hucldn18.1和hucldn18.2的l11和hek293t细胞来测试嵌合抗体ccl1-1、ccl1-2、ccl1-3和人源化抗体对cldn18.2而非cldn18.1的结合特异性。使用2μg/ml的抗体将细胞在冰上染色30分钟，然后在pbs/2％fcs中洗涤后，用抗人igg(fcγ特异性)pe山羊抗体(ebioscience)作为二抗冰上染色30分钟。所有三种嵌合抗体(图4)和人源化抗体(图5)均结合l11或hek293t细胞表达的hucldn18.2，而不结合hucldn18.1。此外，人源化抗体与hucldn18.2结合的亲和力与imab362相似，并且亲和力至少与ccl1-1一样好(图5)。[0179]实施例4：通过对活体肿瘤组织和活体胃组织的流式细胞术测试人源化cldn18.2抗体结合活性[0180]a549(atccccl-185tm)细胞系不内源性表达cldn18.1或cldn18.2。为了测试抗体与cldn18.2的结合，在a549细胞中表达cldn18.2。通过用转座酶表达构建体(pcdna3.1-hy-mpb)(klose等人2017)，带有可转座的全长hucldn18.2(ppb-puro-hucldn18.1)以及嘌呤霉素表达盒的构建体和携带egfp的构建体作为转染对照(pegfp-n3)(waldmeier等人2016)电穿孔共转染a549细胞。电穿孔后，让细胞在37℃、5％co2气氛的加湿培养箱中的生长培养基中恢复两天。通过egfp表达的fc分析来验证转染。然后通过将1μg/ml嘌呤霉素添加到培养物中来选择表达cldn18.1或cldn18.2的细胞，并进一步扩增以允许生成在含有10％dmso的fcs中的冷冻原液。通过fc分析转染细胞中cldn18.2的表达。简而言之，通过离心收集胰蛋白酶处理的a549细胞，重悬于pbs/2％fcs中并使用imab362作为一抗在冰上以2μg/ml的浓度对cldn18.2染色30分钟，然后在pbs/2％fcs中洗涤后，用2.5μg/ml抗人igg(fcγ特异性)pe山羊抗体(ebioscience)作为二抗在冰上染色30分钟。进一步洗涤后，使用facscaliburtm仪器分析重悬于冰冷fc缓冲液中的染色细胞(参见图6)。未转染的亲本细胞不表达cldn18.2，用作阴性对照。这些细胞于2019年12月6日保藏于dsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbhinhoffenstr.7b38124braunschweigde，可在保藏号dsmacc3360下获得。[0181]将在100μl50％matrigel中表达cldn18.2的1x106a549细胞皮下植入两只balb/c小鼠，并在数周内监测肿瘤生长，直至肿瘤达到150-450mm3之间的期望大小。收集健康的胃组织和肿瘤组织用于fc分析。将收集的组织切成小块并用miltenyi肿瘤分离试剂盒(macsmiltenyibiotec,德国)消化。将组织块与解离缓冲液(根据制造商说明制备)在6孔板中37℃下在持续的轻柔震荡运动下孵育30分钟。将样品重悬并通过70μm细胞过滤器(corning，美国)过滤，然后用20mlfc缓冲液(pbs 2％fbs)洗涤。将细胞悬液离心(在4℃下400g5分钟)并弃去上清液。如果需要，将细胞悬液通过过滤器并反复离心，将沉淀物重悬于5ml红细胞裂解缓冲液(biolegend，美国)中，在冰上孵育4分钟。孵育后，加入25mlpbs，再次离心悬浮液(4℃下400g5分钟)。将沉淀物重悬于fc缓冲液中(基于沉淀0.5-3ml)。将相等数量的细胞转移到96孔板中并进一步处理用于fc分析。用pbs洗涤板中的细胞并离心(在4℃下400g2分钟)。将沉淀物重悬于50μl/孔的染色混合物中，该混合物由在pbs中稀释的所选抗体(4μg/ml的ccl1-1、hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f；2μg/ml的imab364)和af488标记的ae1/ae3泛细胞角蛋白抗体(thermofisherscientific,美国)组成，并在冰上孵育25分钟。孵育后，细胞在pbs中洗涤两次并离心(在4℃下400g2分钟)。将沉淀物重悬于50μl/孔的二次染色混合物(pbs pe标记的抗人抗体)(thermofisherscientific，美国)中，并在冰上孵育25分钟。孵育后，细胞在pbs中再次洗涤两次。将沉淀物重悬于100μl含有dapi的pbs中。将板保持在冰上直至fc分析。对于fc分析，通过前向散射和dapi染色将活细胞与死细胞分离。然后对活细胞进行门控以确定是否存在细胞角蛋白(af888阳性)和结合的cldn18.2抗体(pe阳性细胞)。fc分析结果可以参见图7和表5。结果是从两只小鼠获得的数据的平均值。[0182]所有测试的抗体(ccl1-1、hcl1a、hcl1b、hcl1c、hcl1f和imab364)结合相似百分比(约在20％和30％之间)的带有cldn18.2的肿瘤细胞。然而，令人惊讶的是，只有imab362与带有cldn18.2的健康胃细胞结合，而ccl1-1、hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f的结合几乎无法检测到，结合不到1％的健康胃细胞。源于注射的表达cldn18.2的a549细胞的肿瘤细胞与健康胃细胞中表达的cldn18.2之间的结合能力差异也表示为阳性肿瘤细胞％除以阳性胃细胞％的比率(参见表5中的最后一列)。对于imab362，该比率低于5，平均而言接近1，而对于测试的ccl1-1人源化克隆(hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f)，该比率高于15，平均而言高于30。[0183]表5：fc结合数据和所选抗体对健康胃细胞和肿瘤细胞的结合比率。[0184][0185][0186]因此，与健康胃细胞相比，ccl1-1和测试的ccl1-1人源化克隆(hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f)显示出与肿瘤细胞的结合增加，因此是肿瘤特异性cldn18.2抗体。相比之下，imab362无法区分带有cldn18.2的肿瘤细胞和带有cldn18.2的健康胃细胞。[0187]实施例5：通过在冷冻组织样品上的免疫组织化学(ihc)测试人源化cldn18.2抗体[0188]从皮下植入1x106个表达cldn18.2的a549细胞的balb/c小鼠获得的表达cldn18.2的新鲜胃和肿瘤组织样品在合适的组织模具中的oct中速冻。在-20℃下用低温恒温器切割5-15μm厚的组织切片，在室温(rt)下转移到显微镜载玻片上，随后保持冷冻直至ihc染色。染色前，将载玻片放回室温并在预冷的丙酮(-20℃)中固定10分钟。在室温下蒸发丙酮后，将载玻片在tbs中冲洗并处理以封闭非特异性染色位点：将载玻片在0.3％h2o2中室温孵育15分钟，然后用tbs洗涤并在过氧化物酶封闭溶液(agilent,美国)中室温下孵育60分钟。封闭后，对载玻片进行抗体染色处理：将载玻片与一抗(hcl1a、hcl1b、hcl1c、hcl1f、imab362和34h14l15泛cldn18抗体(abcam，美国))在室温下孵育120分钟，在tbs中洗涤，然后与hrp缀合的抗人抗体(或泛cldn18抗体的抗兔抗体)在室温下孵育30分钟。根据制造商的说明，通过用dab 底物chromogen系统(agilent，美国)处理载玻片，揭示与组织切片上的cldn18.2或泛cldn18结合的抗体。在随后的tbs洗涤后，载玻片在苏木精中复染，在dh2o中冲洗15分钟，在连续的95％和100％乙醇洗涤中脱水，然后在二甲苯中进一步清洁载玻片。最后，用盖玻片将载玻片安装在甘油封固剂(agilent，美国)中。健康小鼠胃组织和小鼠肿瘤组织染色的代表性显微镜图像可以分别在图8和图9中找到。[0189]图8显示了健康胃组织的代表性染色。在与hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f(分别为图a、b、c和d)共染色的组织中，仅可见细胞核的苏木精染色，而与imab362共染色的组织(图e)显示了膜cldn18.2dab染色。因此，与表达cldn18.2的健康胃组织结合的imab362相比，测试的ccl1-1的人源化克隆(hcl1a、hcl1b、hcl1c和hcl1f)不结合表达cldn18.2的健康胃组织。此外，图9显示了肿瘤组织的代表性染色，图a、b、c和d分别是用hcl1a、hcl1f、imab362和abcam34h14l15泛cldn18抗体染色的肿瘤组织的代表性图像。所有用测试抗体染色的肿瘤都显示出强烈的膜cldn18.2dab染色。与imab362或泛cldn18抗体类似，测试的ccl1-1的人源化克隆(hcl1a和hcl1f)结合表达cldn18.2的小鼠肿瘤组织。因此，相较于表达cldn18.2的健康胃组织，ccl1-1的人源化克隆表现出与表达cldn18.2的肿瘤组织的结合增加。[0190]实施例6：人源化抗体(hcl)变体和imab362的asn脱酰胺化和asp异构化倾向分析[0191]asn(n)残基的脱酰胺化和asp(d)残基的异构化作用可能发生在生物制药制备、储存或临床应用(体内)过程中。脱酰胺化和异构化可能导致蛋白质结构、功能、活性、稳定性和免疫原性的潜在变化。因此，必须将其最小化和控制，特别是在监管环境中。可以在计算机上分析asn脱酰胺化和asp异构化基序的存在。最常见的asn脱酰胺化基序是ng基序，而最常见的asp异构化基序是dg基序。[0192]这种计算机分析表明，所有的hcl抗体在vl的第二个cdr中都具有潜在的dgasp异构化基序，并且hcl抗体或imab362无一在其cdr中具有潜在的ng脱酰胺化基序。为了验证计算机的预测，对hcl抗体和imab362在高ph或低ph和热条件下进行应激，以加速制备过程和长期储存期间可能发生的修饰。简而言之，用amicon离心过滤器将抗体样品缓冲液交换为20mm磷酸钠缓冲液ph8.0用于asn脱酰胺化应激测试，或20mm柠檬酸盐缓冲液、ph5.5用于asp异构化应激测试，并将样品稀释至终浓度为3.0mg/ml。将30μl样品在具有加热防冷凝盖的加热块中于40℃下孵育1周(asn-脱酰胺化)或2周(asp-异构化)。应激处理和无应激处理的样品储存于-80℃。通过强阳离子交换(scx)色谱分析样品的asn脱酰胺化和asp异构化。在scx色谱图中，asn的脱酰胺化导致主峰之前的峰面积(bm)增加，而在scx色谱图中，asp异构化导致主峰之后的峰面积(am)增加(du等人2012)。scx色谱在mabpacscx-10柱(thermofisherscientific,basel,瑞士)上运行，缓冲液a为ph4.0，缓冲液b为ph11.0。流速为0.5ml/min，ph梯度为30-80％缓冲液b。将20μl缓冲液a中的10μg样品进样到柱中。通过280nm处的蛋白质吸光度进行样品检测。hcl抗体仅显示bm增加约27.9-32.2％(参见表6)，这评定为不重要的。然而，imab362显示bm显著增加40.9％(参见表6)，即使该抗体在可变结构域中没有ng基序。与本发明的抗cldn18.2单克隆抗体相比，imab362在hccdr3(氨基酸103-104)(seqidno:55)和lccdr1(氨基酸31-32)(seqidno:56)位置具有两个ns基序。ns基序是脱酰胺化的第二最可能的基序。[0193]表6：mab的脱酰胺化应激测试，强阳离子交换(scx)色谱[0194][0195]asn-脱酰胺化应激测试对hcl1a、hcl1i和imab362与cldn18.2的结合亲和力的影响在elisa测定中进行了测试，其中带有cldn18.2的脂质颗粒作为抗原来源。cldn18.2脂质颗粒和空脂质颗粒(无抗原)用于在100mm碳酸钠，ph9.6中以10u/ml的终浓度包被96孔板。用pbs/0.05％tween-20(pbs-t)洗涤并在37℃下用pbs-t/3％bsa封闭至少1小时后，添加起始浓度2μg/ml的hcl抗体的1:3连续稀释液并在37℃下孵育至少1小时。通过结合hrp-山羊抗人二抗，以sigma-fastopd作为过氧化物酶底物显色，通过添加2mh2so4终止反应，并在elisa读板器上以od-490进行读数，揭示了结合抗体的存在。脱酰胺化应激测试后imab362ec50值高出1.8倍(无应激处理参考：ec50为51.5ng/ml，应激处理：ec50为95.09ng/ml)(参见图10)。这可能与脱酰胺化应激测试后scx中40.9％的bm增加有关(参见表6)。确认scxasn脱酰胺化结果，在对hcl1a和hcl1i进行脱酰胺化应激测试后，未观察到抗原结合的显著差异(参见表6)。因此，脱酰胺化应激测试表明，与imab362相比，hcl抗体更不易于脱酰胺化和潜在的降低的靶结合，并且可以预见在制备、储存和临床应用(体内)期间更稳定，从而产生更均匀和活性的抗体/产品。[0196]尽管所有hcl抗体在vl的第2个cdr和hc的ch2和ch3结构域中具有潜在的dgasp异构化基序(vl-cdr2(位置62)、ch2(位置282)、ch3(位置403))，asp异构化应激测试没有显示asp异构化(参见表7)，这与du等人(du等人2012)的预测相反。无应激处理的样品(imab362除外)的am值已经明显较高。这可能是由于重链的赖氨酸剪切(clipping)变体。imab362是无应激处理样品中唯一没有高am的抗体。imab362是唯一测试的不含c端lys的抗cldn18.2抗体，这意味着对于hcl抗体，c端lys剪切是无应激处理和应激处理样品中am增加的最可能原因。[0197]表7：mab的asp异构化应激测试，强阳离子交换(scx)色谱[0198][0199][0200]本发明也通过以下实施方案来描述：[0201]1.结合cldn18.2的抗体或其片段，其中该抗体或其片段展现出与表达cldn18.2的健康组织相比对表达cldn18.2的肿瘤组织的结合增加。[0202]2.结合cldn18.2的抗体或其片段，其包含分别为seqidno:21、seqidno:22和seqidno:23的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，分别为seqidno:24、seqidno:25和seqidno:26的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0203]3.实施方案1或2的抗体或其片段，其包含：[0204]a.分别为seqidno:1、seqidno:15和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0205]b.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0206]c.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:17、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0207]d.分别为seqidno:1、seqidno:16和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:18、seqidno:19和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0208]e.分别为seqidno:12、seqidno:15和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0209]f.分别为seqidno:1、seqidno:20和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0210]g.分别为seqidno:1、seqidno:20和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:18、seqidno:19和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0211]h.分别为seqidno:12、seqidno:20和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或[0212]i.分别为seqidno:12、seqidno:20和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:17、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0213]4.实施方案1或2的抗体或其片段，其包含：[0214]a.分别为seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；[0215]b.分别为seqidno:1、seqidno:7和seqidno:8的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或[0216]c.分别为seqidno:12、seqidno:2和seqidno:3的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列，以及分别为seqidno:13、seqidno:14和seqidno:11的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。[0217]5.实施方案1或2的抗体或其片段，其包含：[0218]a.seqidno:27的vh序列和seqidno:28的vl序列；[0219]b.seqidno:29的vh序列和seqidno:30的vl序列；或[0220]c.seqidno:31的vh序列和seqidno:32的vl序列。[0221]6.实施方案1-3中任一项的抗体或其片段，其包含：[0222]a.与seqidno:33的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vh序列；[0223]b.与seqidno:34的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vh序列；[0224]c.与seqidno:35的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vh序列；[0225]d.与seqidno:36的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vh序列；或[0226]e.与seqidno:37的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vh序列；[0227]和[0228]f.与seqidno:38的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vl序列；[0229]g.与seqidno:39的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vl序列；[0230]h.与seqidno:40的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vl序列；或[0231]i.与seqidno:41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的vl序列。[0232]7.实施方案1或2的抗体或其片段，其包含：[0233]a.seqidno:33的vh序列；[0234]b.seqidno:34的vh序列；[0235]c.seqidno:35的vh序列；[0236]d.seqidno:36的vh序列；或[0237]e.seqidno:37的vh序列；[0238]和[0239]f.seqidno:38的vl序列；[0240]g.seqidno:39的vl序列；[0241]h.seqidno:40的vl序列；或[0242]i.seqidno:41的vl序列。[0243]8.实施方案1或2的抗体或其片段，其包含：[0244]a.seqidno:33的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0245]b.seqidno:34的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0246]c.seqidno:34的vh序列和seqidno:39的vl序列；[0247]d.seqidno:34的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0248]e.seqidno:35的vh序列和seqidno:38的vl序列；[0249]f.seqidno:36的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0250]g.seqidno:36的vh序列和seqidno:40的vl序列；[0251]h.seqidno:37的vh序列和seqidno:41的vl序列；[0252]i.seqidno:37的vh序列和seqidno:38的vl序列；或[0253]j.seqidno:37的vh序列和seqidno:39的vl序列。[0254]9.实施方案1-3中任一项的抗体，其包含：[0255]a.与seqidno:46的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:51的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0256]b.与seqidno:47的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:51的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0257]c.与seqidno:47的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:52的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0258]d.与seqidno:47的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:53的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0259]e.与seqidno:48的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:51的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0260]f.与seqidno:47的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:54的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0261]g.与seqidno:49的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:53的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0262]h.与seqidno:50的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:54的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0263]i.与seqidno:50的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:51的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列；[0264]j.与seqidno:50的重链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的重链序列，以及与seqidno:52的轻链序列的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的轻链序列，[0265]或其具有工程化fc结构域的版本。[0266]10.实施方案1或2的抗体，其包含：[0267]a.seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0268]b.seqidno:47的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0269]c.seqidno:47的重链序列和seqidno:52的轻链序列；[0270]d.seqidno:47的重链序列和seqidno:53的轻链序列；[0271]e.seqidno:48的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0272]f.seqidno:47的重链序列和seqidno:54的轻链序列；[0273]g.seqidno:49的重链序列和seqidno:53的轻链序列；[0274]h.seqidno:50的重链序列和seqidno:54的轻链序列；[0275]i.seqidno:50的重链序列和seqidno:51的轻链序列；[0276]j.seqidno:50的重链序列和seqidno:52的轻链序列，或其具有工程化fc结构域的版本。[0277]11.实施方案1至10中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段是iga1、iga2、igd、ige、igg1、igg2、igg3、igg4、合成igg、igm、f(ab)2、fv、scfv、iggach2、f(ab')2、scfvch3、fab、vl、vh、scfv4、scfv3、scfv2、dsfv、fv、scfv-fc、(scfv)2、非消耗性igg、双抗体、二价抗体或其fc工程化版本。[0278]12.实施方案1至11中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段是人源化的。[0279]13.实施方案1至12中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段不结合cldn18.1。[0280]14.实施方案1至13中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段对翻译后脱酰胺化的敏感性低于imab362。[0281]15.实施方案1至14中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段在流式细胞术测量期间相较于表达cldn18.2的健康组织细胞标记多至少2倍、多至少5倍、多至少10倍或多至少20倍的表达cldn18.2的肿瘤细胞。[0282]16.实施方案1至14中任一项的抗体或其片段，其中相较于表达cldn18.2的健康组织细胞对表达cldn18.2的肿瘤细胞的结合增加通过流式细胞术或通过免疫组织化学测量。[0283]17.实施方案1至16中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段以相较于imab362结合在hek293t细胞或pa-tu-8988-high中表达的cldn18.2的ec50值高至少1.1倍、高至少1.2倍、高至少1.5倍、高至少2倍或高至少2.5倍但高不超过3倍的ec50值结合在hek293t细胞或pa-tu-8988-high细胞中表达的cldn18.2。[0284]18.实施方案17的抗体或其片段，其中结合通过流式细胞术(fc)滴定测量。[0285]19.实施方案1至18中任一项的抗体或其片段，其中抗体或其片段是分离的。[0286]20.编码实施方案1至19中任一项的抗体或其片段的核酸。[0287]21.包含实施方案20的核酸的载体。[0288]22.包含实施方案20的核酸或实施方案21的载体的宿主细胞。[0289]23.实施方案1至19中任一项的抗体或其片段、实施方案20的核酸、实施方案21的载体或实施方案22的宿主细胞，用于治疗如下受试者：[0290]a.患有赘生性疾病，[0291]b.有风险形成赘生性疾病，和/或[0292]c.被诊断为赘生性疾病。[0293]24.用于实施方案23的抗体或其片段，其中赘生性疾病选自胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌和肺癌。[0294]25.结合cldn18.2的抗体或其片段，其中抗体或其片段[0295](i)与包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体结合相同的表位；[0296](ii)与包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体竞争结合；和/或[0297](iii)竞争性抑制包含seqidno:46的重链序列和seqidno:51的轻链序列的抗体与cldn18.2的结合。[0298]序列[0299]seqidno:1dyamh[0300]seqidno:2wintytgkptyaddfkg[0301]seqidno:3avfygytmda[0302]seqidno:4rasediysnla[0303]seqidno:5svkrlqd[0304]seqidno:6lqgsnfplt[0305]seqidno:7winaytgkptyaddfkg[0306]seqidno:8avyygytmda[0307]seqidno:9rtsediysnfa[0308]seqidno:10svnrlqd[0309]seqidno:11lqgskfplt[0310]seqidno:12dyamy[0311]seqidno:13rtsediysnla[0312]seqidno:14aikrlqd[0313]seqidno:15wintytgkptyaqkfqg[0314]seqidno:16wintytgkptysqkfqg[0315]seqidno:17rtsediysnla[0316]seqidno:18rtsediysnfa[0317]seqidno:19svnrlqd[0318]seqidno:20winaytgkptyaqkfqg[0319]seqidno:21dyamx[0320]第5位的x是h或y[0321]seqidno:22winxytgkptyxxxfxg[0322]第4位的x是t或a；[0323]第12位的x是a或s；[0324]第13位的x是d或q；[0325]第14位的x是d或k；[0326]第16位的x是k或q[0327]seqidno:23avxygytmda[0328]第3位的x是f或y[0329]seqidno:24rxsediysnxa[0330]第2位的x是a或t；[0331]第10位的x是l或f[0332]seqidno:25xxxrlqd[0333]第1位的x是s或a；[0334]第2位的x是v或i；[0335]第3位的x是k或n[0336]seqidno:26lqgsxfplt[0337]第5位的x是k或n[0338]seqidno:27ccl1-1hc可变区[0339]qiqlvqsgpelkkpgesvkisckasgytftdyamhwvkqapgkglkwmgwintytgkptyaddfkgrfvfsleasastanlqisnlknedtatyfcaravfygytmdawgqgtsvtvss[0340]seqidno:28ccl1-1lc可变区[0341]diqmtqspaslsaslgetisiacrasediysnlawyqqksgkspqllifsvkrlqdgvpsrfsgsgsgtqyslkisgmqpedegdyfclqgsnfpltfgsgtkleik[0342]seqidno:29ccl1-2hc可变区[0343]qiqlvqsgpelkkpgesvkiscktsgytftdyamhwvkqgpgkgmkwmgwinaytgkptyaddfkgrfvlsleasastanlqisnlknedtatyfcaravyygytmdawgqgtsvivss[0344]seqidno:30ccl1-2lc可变区[0345]diqmtqspaslsaslgetisiecrtsediysnfawfqqksgkspqlliysvnrlqdgvpsrfsgsgsgtqyslkisgmqpedegdyfclqgskfpltfgsgtkleik[0346]seqidno:31ccl1-3hc可变区[0347]qiqlvqsgpelkkpgesvkisckasgytftdyamywvkqvpgkglrwmgwintytgkptyaddfkgrfvfsleasastanlqisnlknedtatyfcaravfygytmdawgqgtsvtvss[0348]seqidno:32ccl1-3lc可变区[0349]diqmtqspaslsaslgetisiacrtsediysnlawyqqksgkspqllifaikrlqdgvpsrfsgsgsgtqyslkisgmqpedegdyfclqgskfpltfgsgtkleik[0350]seqidno:33hcl1ahc可变区[0351]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwintytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvss[0352]seqidno:34hcl1b,c和dhc可变区[0353]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwintytgkptysqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvss[0354]seqidno:35hcl1ehc可变区[0355]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamywvrqapgqrlewmgwintytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvss[0356]seqidno:36hcl1f和ghc可变区[0357]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwinaytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvss[0358]seqidno:37hcl1h,i和jhc可变区[0359]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamywvrqapgqrlewmgwinaytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravyygytmdawgqgtlvtvss[0360]seqidno:38hcl1a,b,e和ilc可变区[0361]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasediysnlawyqqkpgkapkllifsvkrlqdgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqgsnfpltfgqgtkveik[0362]seqidno:39hcl1c和jlc可变区[0363]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsediysnlawyqqkpgkapkllifaikrlqdgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqgskfpltfgqgtkveik[0364]seqidno:40hcl1d和glc可变区[0365]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsediysnfawyqqkpgkapklliysvnrlqdgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqgskfpltfgqgtkveik[0366]seqidno:41hcl1f和hlc可变区[0367]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasediysnlawyqqkpgkapklliysvkrlqdgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqgsnfpltfgqgtkveik[0368]seqidno:42hcl3a,b和chc可变区[0369]qvqlqesgpglvkpsetlsltcavsgysvssnyrwhwirqppgkglewigyiniagstnynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycarnpsitramdawgqgtlvtvss[0370]seqidno:43hcl3alc可变区[0371]diqmtqspsslsasvgdrvtitckssqnifknlewyqqkpgkapklliyytnnlqtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycyqynsgpftfgqgtkveik[0372]seqidno:44hcl3blc可变区[0373]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqnifknlewyqqkpgkapklliyytnnlqtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycyqynsgpftfgqgtkveik[0374]seqidno:45hcl3clc可变区[0375]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqnifknlewyqqkpgkapklliyytnnlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycyqynsgpftfgqgtkveik[0376]seqidno:46hcl1ahc全长[0377]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwintytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0378]seqidno:47hcl1b,c和dhc全长[0379]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwintytgkptysqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0380]seqidno:48hcl1ehc全长[0381]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamywvrqapgqrlewmgwintytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0382]seqidno:49hcl1f和ghc全长[0383]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamhwvrqapgqrlewmgwinaytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravfygytmdawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0384]seqidno:50hcl1h,i和jhc全长[0385]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyamywvrqapgqrlewmgwinaytgkptyaqkfqgrvtitrdtsastaymelsslrsedtavyycaravyygytmdawgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp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