一种与绵羊奶体细胞数相关的SNP分子标记及应用

一种与绵羊奶体细胞数相关的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及一种与绵羊奶体细胞数相关的snp分子标记及其应用，属于绵羊snp分子标记技术领域。


背景技术：

2.奶样中的体细胞由白细胞和少量上皮细胞所组成，体细胞主要来源于机体免疫系统，其在奶中发挥着吞噬异物、排除感染和修复组织等功能作用。乳房中体细胞是始终存在的，数量变化范围也较大。当绵羊乳房受到病菌等感染时，奶样中的体细胞会大大增加；而炎症减轻后，其体细胞数也将逐渐减少。因此，绵羊奶中的体细胞数是反映绵羊乳房健康状况和判断其乳房炎轻重的重要手段，同时也和绵羊奶的质量有关。在奶牛中，研究者们通常认为体细胞数超过500k/ml时，则判断个体可能感染了乳房炎。
3.影响奶样中体细胞数变化的因素有很多，包括年龄、泌乳期、体型、挤奶时间、季节、营养水平和遗传因素等。在奶牛中，已报道了信号通路及一些关键基因的多态性与其体细胞数性状存在密切的关联，如细胞内jak-stat信号转到通路参与了细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节等许多重要生物学过程，介导着乳房中的免疫反应；其中stat5b和jak2等基因的多态性（snp变异）与牛奶中的体细胞数存在显著相关关系。
4.目前，尚没有发现与绵羊奶体细胞数性状紧密相关的snp位点。


技术实现要素：

5.本发明公开了一种与绵羊奶体细胞数相关的snp分子标记及其应用，通过本发明公开的特异性引物，所检测的snp位点突变信息可以用于绵羊低体细胞数（低乳房炎患病率）性状的分子标记辅助选育工作。
6.为实现绵羊奶体细胞数的分子鉴定和未来的分子标记辅助选择低体细胞数（低乳房炎患病率）绵羊品种，本发明采用如下技术方案。
7.一种与绵羊产奶量相关的snp分子标记，其特征在于它位于第11号染色体第42139093处；其snp分子标记的多态性为a/g；所述snp位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为ars-ui_ramb_v2.0，2020年11月。其中所述的snp分子标记的特异性引物，其特征在于，上游引物序列如seq id no: 1所示，下游引物序列如seq id no: 2所示；seq id no: 1aagtccctgctcaagaacgaseq id no: 2gagcctgtcagtgtggatca。
8.本发明进一步公开了所述的snp分子标记在预测绵羊奶体细胞数中的应用。其应用可用于绵羊奶体细胞数性状的早期选育。实验结果显示绵羊第11号染色体第42139093处snp分子标记存在a/g突变，且与绵羊奶体细胞数性状显著相关。同时本发明也公开了预测绵羊奶体细胞数中的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）颈静脉抽取目标绵羊的抗凝血（绵羊的dna从其颈静脉抗凝血中提取），并用于dna提取；
（2）以提取的dna为模板，利用snp分子标记的特异性引物进行pcr扩增，pcr扩增的退火温度为60℃，并获得目标pcr产物；（3）对步骤（2）中的pcr产物进行sanger测序，分析其基因型（aa、ag、gg）；（4）结果判断：根据基因型不同判断绵羊的奶样体细胞数，以预测其患乳房炎的风险：第11号染色体第42139093处基因型为aa时，代表该绵羊的奶样体细胞数性状表型较高，预示着其患乳房炎的风险较高；第11号染色体第42139093处基因型为ag时，代表该绵羊的奶样体细胞数性状表型较低，预示着其患乳房炎的风险较低；第11号染色体第42139093处基因型为gg时，代表该绵羊的奶样体细胞数性状表型较低，预示着其患乳房炎的风险较低；本发明还公开了所述的snp分子标记在选育低体细胞数（低乳房炎患病率）绵羊中的应用。其方法为：不断选择保留羊群中第11号染色体第42139093处snp分子标记为g的基因后代，不断淘汰羊群中第11号染色体第42139093处snp分子标记为a的基因后代。
9.本发明主要解决了绵羊奶样体细胞数选育的分子标记辅助选择问题，重点考察了绵羊奶体细胞数性状与本发明所提供的分子标记的关联关系，主要的难点在于筛选绵羊第11号染色体第42139093处的a》g突变信息。
10.本发明公开的一种与绵羊奶体细胞数相关的snp分子标记及其应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：本发明所提供的snp分子标记，不受绵羊年龄和性别的限制，可用于绵羊奶样体细胞数性状的早期选育。针对刚出生的小母羊收集血液样本后，经基因分型后即可预测其成年后奶样中体细胞数的高低；针对刚出生的小公羊收集血液样本后，经基因分型后即可知道其是否携带奶体细胞数低（低乳房炎患病率）的遗传特性，以指导其配种并预测其后代母羊的奶样体细胞数的情况。
附图说明
11.图1为pcr产物凝胶电泳图；图2为绵羊第11号染色体第42139093处snp分子标记分型图；图3为绵羊奶体细胞数与目标snp关联分析柱形图。
具体实施方式
12.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
13.实施例11.以71只湖羊母羊为试验对象，在其产羔后第7天，每隔7天进行挤奶，直至第56天最后一次挤奶，并结束测定。
14.2. snp分子标记的特异性引物，其上游引物序列如seq no.1所示，下游引物序列
如seq no.2所示。
15.seq no.1：5
’‑
aagtccctgctcaagaacga-3’seq no.2：5
’‑
gagcctgtcagtgtggatca-3’3. 采集绵羊颈静脉抗凝血2ml，利用酚仿法提取目标个体dna；4. 以提取的dna为模板，利用步骤2中的snp分子标记的特异性引物进行pcr扩增，扩增程序为：95℃、5min，33
×
[95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s]，72℃、8min，4℃保存；最终获得的pcr产物在1%琼脂糖中进行电泳，电泳结果如图1所示；5. 对步骤4中的pcr产物进行sanger测序，利用chromaspro软件对测序结果进行分析；根据测序峰图可将该snp位点基因型判定为aa、ag和gg型，如图2所示；6. 统计湖羊7-56天的奶样体细胞数结果（平均数
±
标准误），可知：第11号染色体第42139093处基因型为gg时，其湖羊的7-56天平均奶体细胞数为363.45
±
86.21k/ml；第11号染色体第42139093处基因型为ag时，其湖羊的7-56天平均奶体细胞数为429.54
±
74.39k/ml；第11号染色体第42139093处基因型为aa时，其湖羊的7-56天平均奶体细胞数为913.63
±
440.98k/ml。
[0016]
经过spss单因素方差统计分析后，发现gg型和ag型湖羊7-56天平均奶体细胞数显著低于aa型湖羊（p《0.05）（图3）。
[0017]
根据7-56天湖羊奶体细胞数和基因型相关性分析结果，可在刚出生的湖羊中通过采血、提取dna后，经本专利基因分型即可判断其未来绵羊奶的体细胞情况，并预测该羊患乳房炎的风险。为了选育奶体细胞数低（低乳房炎患病率）的绵羊群体，应不断选择保留羊群中第11号染色体第42139093处snp分子标记为g的基因后代，不断淘汰羊群中第11号染色体第42139093处snp分子标记为a的基因后代。