包含接枝到阳离子聚合物上的三唑化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用的制作方法

包含接枝到阳离子聚合物上的三唑化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用
1.本发明涉及包含接枝到阳离子聚合物上的杂环化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用，所述杂环化合物尤其是三唑衍生物。本发明涉及一种适用于将核酸分子转染到细胞、优选真核细胞中的组合物，所述组合物包含(i)至少一种通式(i)的化合物、优选至少一种通式(iii)的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或混合物，或其可接受的盐，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基，其中y1、y2、y3、z1、z2、z3、x1、x2、r3、p

、r和v如本说明书中所定义。本发明还涉及所述组合物的用途，并且涉及一种用于活细胞的体外或离体转染的方法。
2.基因转移是将外源基因的拷贝引入到活细胞中以便诱导基因产物的合成的过程。转染是利用非病毒方法的手段有意地和人工地将核酸(dna或rna)引入到真核细胞中的过程。转染对现代生物学和医学的发展至关重要，并且提供了许多关于基因功能和调控的知识。
3.根据本发明的转染可以在包括哺乳动物细胞和昆虫细胞的各种细胞中实现，可以在原代细胞、细胞系、稳定细胞或肿瘤细胞中实现。通过提供在细胞中表达新的外源蛋白或者过度表达或沉默天然存在的蛋白质的可能性，转染是用于体外基因组研究的有力工具。
4.根据本发明的转染可以通过离体或体内方案应用于疗法。使用非病毒载体的基于核酸的疗法可以靶向不同组织/器官或肿瘤中的不同疾病、遗传疾病、免疫性疾病、癌症或病毒感染。细胞靶向通过不同的机制来实现，并且取决于转染试剂的性质和特性、方法或方案组成或配制以及给药途径(kaestner等人，2015)。
5.在生物生产中，根据本发明的转染可以用于生成过量产生重组蛋白、肽或抗体的稳定细胞克隆。最近，允许瞬时基因表达(tge)的转染正成为一种有价值的方法，其用于快速产生中等水平的重组蛋白或抗体，所述重组蛋白或抗体可用于研究和过程开发阶段。瞬时基因表达过程有利地用于产生重组病毒，如腺相关病毒(aav)、慢病毒(lv)或腺病毒(merten等人，2016；van der loo和wright，2015)。此类过程由转染许多表达载体(质粒)组成，所述表达载体(质粒)在细胞中表达产生病毒所必需的不同组分，这些组分包括衣壳蛋白、辅助蛋白、囊膜蛋白、病毒聚合酶或调节剂、或病毒基因组。高产细胞用于病毒产生，如hek293和衍生物细胞、hela、bhk-21、a549或昆虫细胞。转染可以在高细胞密度的粘附或悬浮适应细胞中实现，这些细胞在含有血清的培养基中培养，或者在无蛋白质、化学限定或完全合成的培养基中培养。
6.转染是一种将诱导基因组修饰、工程化改造或编辑所必需的不同组分(如锌指核酸酶、cre/lox蛋白或crispr cas-9蛋白)引入细胞中的方法。
7.dna转染使用质粒dna，其触发由蛋白质或肽和/或核酸(如信使rna、长rna、微rna、短发夹rna、短干扰rna等)的启动子驱动的基因表达。
8.在大多数情况下，质粒dna已被用于转染目的，因为其具有固有的稳定性，并且能够整合到宿主基因组中以产生稳定的基因表达，或者能够以游离型形式保留在细胞核中以提供瞬时基因表达。然而，当与实验室常规使用的标准转化细胞系相比时，一些被命名为
氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-chol))代替。自这些开创性的工作以来，许多阳离子脂质的设计目标是生成具有提高的转染效率的新型阳离子脂质试剂。这些试剂中的许多种是市售的，并且最近的试剂代表可在市场上获得的最先进的阳离子脂质试剂。然而，仍然观察到局限性，因为转染并非在所有细胞类型中都有效，并且细胞毒性仍然是阳离子脂质系统的主要关注点。
13.阳离子聚合物代表第二大类转染试剂，其优势在于在其主链中提供大密度的带电氨基基团。在生理ph下具有正电荷的阳离子聚合物能够将dna复合成颗粒或聚集体，启动细胞结合并通过内吞作用触发细胞内化。聚赖氨酸(pll)是第一种使用的聚合物，但表现出非常有限的转染效率(wu和wu，1987，zenke等人，1990)。当添加如弱碱(如氯喹(erbacher等人，1996))或融合肽(如流感肽(planck等人，1994))等添加剂以便分别缓冲不稳定核内体的酸性ph并诱导细胞质中更多dna释放时，其效率可以提高。behr等人已证明，聚乙烯亚胺(pei)是一种在转染中比pll更有效的聚合物(boussif等人，1995)。pei具有高密度的氨基基团，并且在生理ph下没有完全质子化。与pei复合的dna被内吞后，聚合物具有缓冲能力，其诱导“质子海绵”活性，导致囊泡肿胀和核内体溶解，最终在细胞质中释放dna，而无需添加剂的帮助(boussif等人，1995；sonawane等人，2003)。支化和线性pei在转染中都是有效的，但当与支化形式相比时，线性拓扑被证明为更有效(itaka等人，2004)，不受血清的存在的抑制，毒性更小。二十年以来，开发了许多策略，以提高pei的转染效率、减少其毒性或提出可生物降解的pei基聚合物的替代方案。
14.许多工作集中在通过将组氨酰基或苄基残基(us8658150，chandrashekhar等人，2012)接枝到聚合物上来优化pei的固有质子海绵核内体溶解活性。探索了其他修饰，如添加亲水性基团(ep2070970)以增加dna/pei复合物的溶解度并减少细胞毒性。将疏水性官能团添加到pei中，以使用n-酰基基团增加聚合物的生物可降解性(ep0262641)，或者以生成脂质聚合物(us20090022746，wo2006/041617)。在各种细胞系中观察到更高的基因转染效率。然而，“难以转染”细胞中的效率仍然是非常有限的。
15.描述了用于dna转染的其他阳离子聚合物，如壳聚糖(erbacher等人，1998)、聚酰胺胺(pamam)树枝状聚合物(tomalia等人，1985，haensler和szoka，2003)、降解或破裂的树枝状聚合物(tang等人，1996)、结构上柔性的树枝状聚合物(liu等人，2011)、聚酰胺酯类(little等人，2004)、聚(α[4-氨基丁基]-l-乙醇酸)(akinc等人，2003)、阳离子环糊精两亲分子(cryan等人，2004)、聚(n-甲基乙烯胺)(dr
é
an等人，2018)、聚(2-n-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯(pdmaema)、聚烯丙基胺(boussif等人，1999)、聚鸟氨酸(dong等人，1993)、聚精氨酸(alhakamy等人，2013)、聚组氨酸(putman等人，2003)和细胞穿膜肽(cpp)(gupta,2005)。
[0016]
据报道，阳离子聚合物(如pei)能够转染有丝分裂后细胞(brunner等人)。然而，在不存在有丝分裂和随后的核膜破裂的情况下，已证明，质粒dna由于其大尺寸》1kbp而不能通过核孔复合物进入细胞核(lukacs等人，2000)。一旦从核内体中释放出来，dna仍然与一些阳离子聚合物缔合，这有助于保护其免受核酸酶降解(lechardeur等人，1999)。已知dna能够与存在于细胞质中的蛋白质、特别是动力蛋白相互作用，从而允许基于微管的向细胞核的运动或允许具有nls信号的转录因子的结合，这可能通过输入蛋白通路将dna引导到核孔复合物(bai等人，2017)。
[0017]
阳离子聚合物代表一类适用于基因疗法方案的体内应用的递送试剂，其中dna/阳离子聚合物复合物通过不同的给药途径直接注射，如静脉内、腹膜内、皮内、肿瘤内或脑内注射。用可接受的赋形剂和/或缓冲剂配制的阳离子聚合物适用于体内基因转移。特别地，据报道，pei是一种用于体内应用的有效聚合物(boussif等人，1995)。
[0018]
由于其特殊的结构特征和富电子环境，杂环化合物如吡唑、咪唑或三唑衍生物(尤其是三唑衍生物)表现出广谱的生物活性。三唑类衍生物可能具有影响核内体ph值的特性。另外，三唑可能有助于与核酸形成氢键。向三唑中添加环烷基或芳基部分可以提供补充的疏水相互作用，如与核碱基的π-π堆积。总之，这些特性可以微调与核酸的相互作用，并为开发新的dna载体提供可能性。
[0019]
本发明人提供了一种通过使用芳香性杂环化合物、尤其是三唑衍生物来改进转染试剂的方式，以微调对核酸分子(例如dna)的亲和力和与其的结合，优化酸性条件下的缓冲能力和/或增加细胞核中的扩散、结合和摄取。
[0020]
因此，本发明的目的是提供更有效的转染组合物或提供用于将核酸分子转染到细胞中的制剂。
[0021]
本发明的另一目的是提供一种用于使用所述组合物或包含此种组合物的制剂转染核酸分子以给药到细胞中的方法。
[0022]
本发明人对取代的杂环化合物(尤其是咪唑、三唑、吡唑衍生物)进行了基于结构的筛选，以通过阳离子聚合物提高转染效率。将此类取代的杂环化合物接枝到各种分子量的阳离子聚合物、尤其是聚乙烯亚胺(pei)聚合物上，以便微调缀合物。提出了许多变化，以便定义促进核酸分子(例如dna)转染的最佳结构。已开发表现出疏水特性的杂环，并且可能代表细胞质蛋白的结合基序，从而潜在地促进核输入。
[0023]
本发明涉及一种适用于将核酸分子转染到细胞、优选真核细胞中的组合物，所述组合物包含(i)至少一种通式(i)的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或混合物，或其可接受的盐，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基：
[0024][0025]
其中：
[0026]-y1、y2和y3可以相同或不同，代表c或n，条件是y1、y2和y3中的至少两个是n，并且进一步的条件是y1、y2和y3中的至少一个但不超过两个分别被z1、z2和z3取代；
[0027]-z1代表h、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z1不存在；
[0028]-z2代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、c
5-c
10
杂芳基、卤素、
oh、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基胺、c
1-c
12
烷氧基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
1-c
12
烷氧基、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z2不存在；
[0029]-z3代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、c
5-c
10
杂芳基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、c
2-c
18
亚烷基、oh、胍、卤素、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z3不存在；
[0030]-x1和x2可以相同或不同，代表co或ch2；
[0031]-r3代表(ch2)m、(ch2)
m-chch
3-(ch2)
n-、(ch2)
m-c(ch3)
2-(ch2)
n-、(ch2)
m-o-(ch2)
n-、(ch2)
m-s-(ch2)
n-、(ch2)
m-ch
2-o-，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，并且n代表1至3的整数；
[0032]-p

代表接枝阳离子聚合物，其是包含仲胺、叔胺、伯胺和仲胺的混合物、伯胺和叔胺的混合物、仲胺和叔胺的混合物、或者伯胺、仲胺和叔胺的混合物的多胺；
[0033]-r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂芳基、c
5-c
10
杂环基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；
[0034]
条件是：
[0035]-z1、z2、z3、r或v中仅有一个代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

。
[0036]
在本发明的优选实施方案中，适用于将核酸分子转染到细胞、优选真核细胞中的组合物包含(i)至少一种通式(iii)的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或混合物，或其可接受的盐，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基：
[0037][0038]
其中：
[0039]-z1代表h、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z1不存在；
[0040]-z2代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、c
5-c
10
杂芳基、卤素、oh、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基胺、c
1-c
12
烷氧基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
1-c
12
烷氧基、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z2不存在；
[0041]-z3代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、c
5-c
10
杂芳基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、c
2-c
18
亚
烷基、oh、胍、卤素、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；或z3不存在；
[0042]-x1和x2可以相同或不同，代表co或ch2；
[0043]-r3代表(ch2)m、(ch2)
m-chch
3-(ch2)
n-、(ch2)
m-c(ch3)
2-(ch2)
n-、(ch2)
m-o-(ch2)
n-、(ch2)
m-s-(ch2)
n-、(ch2)
m-ch
2-o-，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，并且n代表1至3的整数；
[0044]-p

代表接枝阳离子聚合物，其是包含仲胺、叔胺、伯胺和仲胺的混合物、伯胺和叔胺的混合物、仲胺和叔胺的混合物、或者伯胺、仲胺和叔胺的混合物的多胺；
[0045]-r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂环基、c
5-c
10
杂芳基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

；
[0046]
条件是：
[0047]-z1、z2或z3中的至少一个存在，优选地z1或z3存在；并且
[0048]-z1、z2、z3、r或v中仅有一个代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

。
[0049]
在上述组合物的具体实施方案中，z1、z2或z3中仅有一个存在，优选地z1或z3存在。
[0050]
如本文所定义，术语“互变异构体”是指仅在氢原子和电子的位置上不同的结构异构体。互变异构体的实例包括但不限于酮-烯醇、烯胺-亚胺、酰胺-亚胺酸、内酰胺-内羟亚胺(lactim)、亚硝基-肟、烯酮-炔醇、氨基酸或亚磷酸酯-膦酸酯。
[0051]
如本文所定义，术语“内消旋体”或“内消旋化合物”是指具有两个或更多个手性中心但不具有旋光活性的立体异构体。
[0052]
如本文所定义，术语“外消旋体”或“外消旋混合物”是指两种对映体的等比例混合物。
[0053]
如本文所定义，术语“对映异构体”是指为镜像的立体异构体，即镜像异构体。
[0054]
如本文所定义，术语“非对映异构体”指具有多于一个手性中心的化合物的异构体，它们不是彼此的镜像。
[0055]
如本文所定义，术语“可接受的赋形剂”是指药学上可接受的载剂，其是生理上可接受的任何物质或物质的组合，即适于在与宿主(特别是人)接触的组合物中使用，并且因此无毒。其可以是指任何常规类型的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或配制助剂。合适的可接受的赋形剂的实例包括但不限于葡萄糖、半乳糖、乳糖、右旋糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇或普朗尼克酸(pluronic acid)。
[0056]
如本文所定义，术语“缓冲剂”是指调整、维持或控制溶液ph的制剂。缓冲剂可以是可能会包含缓冲溶液的弱酸或弱碱。合适的缓冲剂的实例包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、碳酸氢钙、柠檬酸钙、柠檬酸钠、氢氧化镁、碳酸氢镁、乙酸钾、tris乙酸盐、乙酸钠、磷酸二氢钾、碳酸钾、碳酸氢钾、柠檬酸钾或氧化镁。
[0057]
如本文所定义，术语“细胞培养基”或“转染培养基”是指含有血清的培养基、合成培养基、无动物组分培养基或化学限定培养基，尤其是用于维持细胞存活、或用于生长、用于分化或用于扩展细胞、或用于增强转染的培养基。
[0058]
如本文所定义，术语“c
1-c
18
烷基”代表包含1至18个碳原子的直链或支链烃链的任何一价基团。术语“c
1-c6烷基”代表具有1至6个碳原子的烷基。合适的c
1-c
18
烷基基团的实例包括但不限于c
1-c4烷基基团(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、c
6-c8烷基基团(如正己基、正庚基或正辛基以及正戊基、2-乙基己基)、3,5,5-三甲基己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基或正十八烷基。
[0059]
如本文所定义，术语“c
1-c
12
烷氧基”代表具有式-or’的基团，其中r’是c
1-c
12
烷基。合适的c
1-c
12
烷氧基基团的实例包括但不限于c
1-c6烷氧基，如甲氧基(
–
och3)、乙氧基(
–
och2ch3)、叔丁氧基(
–
oc(ch3)3)或
–
o(ch2)5ch3。
[0060]
如本文所定义，术语“c
6-c
18
芳基”代表包含6至18个碳原子的芳香烃的任何一价基团。合适的c
6-c
18
芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基或菲基。
[0061]
如本文所定义，术语“c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基”代表与如本文所定义的烷基基团结合的如本文所定义的芳基基团。合适的c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基基团的实例包括但不限于苄基、苯基乙基(或苯乙基)、苯基丙基、苯基丁基、苯基戊基、苯基己基、萘基甲基、萘基乙基、萘基丙基、萘基丁基、萘基戊基、萘基己基、蒽基甲基、蒽基乙基、蒽基丙基、蒽基丁基、蒽基戊基、蒽基己基、菲基甲基、菲基乙基、菲基丙基、菲基丁基、菲基戊基或菲基己基。
[0062]
如本文所定义，术语“c
2-c
18
杂烷基”代表被一个或多个杂原子(如o、n或s)取代的如本文所定义的烷基基团。
[0063]
如本文所定义，术语“c
5-c
10
杂芳基”代表包含1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的单环或双环5至10元芳香族基团的任何一价基团。合适的c
5-c
10
杂芳基的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、噁唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1-苯并呋喃基、1-苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、1,2-苯并异噁唑基、2,1-苯并异噁唑基、1,2-苯并异噻唑基、2,1-苯并异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并三唑基、吡啶基、吡啶鎓基(pyridinium)、喹啉基、喹啉鎓基(quinolinium)、异喹啉基、异喹啉鎓基(isoquinolinium)、哒嗪基、噌啉基、酞嗪基、嘧啶基、喹唑啉基、吡嗪基或喹喔啉基。
[0064]
如本文所定义，术语“c
1-c
18
烷基胺”代表包含1至18个碳原子的直链或支链烃链的任何一价基团，其中与碳原子键合的氢原子中的一个被氨基基团代替。合适的c
1-c
18
烷基胺的实例包括但不限于-(ch2)
n-nh2(其中n代表1至18的整数)、-ch2nhch3、-ch2ch(ch3)-nh2或-(ch2)nn(ch3)2，其中n代表1至6的整数。
[0065]
如本文所定义，术语“c
1-c
18
烷基-c
1-c
12
烷氧基”代表与如本文所定义的烷氧基基团结合的如本文所定义的烷基基团。
[0066]
如本文所定义，术语“c
2-c
18
亚烷基”是指通过从同一碳原子去除两个氢原子而衍生自烷烃的二价基团，自由价是双键(＝cr2)的一部分。合适的c
2-c
18
亚烷基的实例包括但不限于＝ch2、＝ch(ch2ch3)或＝c(ch3)2。
[0067]
如本文所定义，术语“卤素”代表f、cl、br或i的原子。
[0068]
如本文所定义，术语“c
1-c
24
酯”代表具有式
–
c(o)or”的基团，其中r”是c
1-c
24
烷基，尤其是如本文所定义的c
1-c
18
烷基。
[0069]
如本文所定义，术语“c
5-c
10
杂环基”是指含有一个或多个杂原子(如o、n或s)的单环或双环5至10元环的任何一价基团。合适的杂环基的实例包括但不限于哌啶基、哌嗪基、
四氢吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基或氮杂环庚烷基(azepanyl)。
[0070]
除非另有提及，否则上文定义的基团和自由基可以未被取代或者被一个或多个取代基(例如卤素、烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基羰基、烷酰基、芳酰基、甲酰基、腈、硝基、酰胺基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳硫基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基和二芳基氨基)取代。
[0071]
在本发明的具体实施方案中，组合物进一步包含至少一种待转染到细胞中的核酸分子。优选地所述核酸分子选自：脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、dna/rna杂合体、短干扰rna(sirna)、微rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、信使rna(mrna)、crispr指导rna，以及编码所述核酸分子的表达载体，尤其是编码所述核酸分子的质粒，或表达所述核酸分子(如sirna、微rna、shrna、crispr指导rna)的质粒。优选地所述核酸分子是dna。
[0072]
当将不同的核酸提供在本发明的组合物中时，这些核酸可以是所有的dna分子或所有的rna分子，或者可以是dna和rna分子的混合物或包含dna和rna链的缔合的分子。
[0073]
所述核酸分子可以是单链或双链的，并且可以含有经修饰或未经修饰的碱基。
[0074]
术语“多核苷酸”、“核酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换地使用以指定这些核酸分子。
[0075]
根据本文提供的公开内容，本发明的组合物可以用作核酸分子与至少一种通式(i)的化合物(包括本文公开的其任何具体实施方案)、优选至少一种通式(iii)的化合物和可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基的制剂。或者，它可以用作细胞培养物或用作扩展细胞(expanded cells)，其中在作为培养物和/或扩展细胞来提供之前，分离的细胞已经用所述制剂进行了处理以用于转染。换句话说，作为实施方案，本发明的组合物涵盖细胞或细胞培养物或扩展细胞，其中所述制剂已经通过根据本发明的转染而引入。尤其是，细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。细胞可以是分裂细胞或非分裂细胞。
[0076]
在本发明的具体实施方案中，本发明的组合物包含1至5种、优选至少两种不同的通式(i)、优选通式(iii)的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或混合物，或其可接受的盐。
[0077]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)的化合物是这样的化合物，其中：(i)y1和y3代表n，y2代表c；或(ii)y1和y2代表n，y3代表c；或(iii)y2和y3代表n，y1代表c；或(iv)y1、y2和y3代表n。当(iv)y1、y2和y3代表n时，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)的化合物对应于通式(iii)的化合物。
[0078]
通式(iii)的化合物的结构是对称的，使得r和v可以互换，z1和z3可以互换。因此，涉及r的定义也适用于v，并且涉及z1的定义也适用于z3。
[0079]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：(i)z1代表h；或(ii)z1代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z1代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2。
[0080]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：(i)z2代表h、c
1-c
12
烷氧基，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基；更优选地z2代表h、ch3、cf3或
och3；甚至更优选地z2代表ch3；或(ii)z2代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z2代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2。
[0081]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：(i)z3代表h，直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基，或者直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基；或(ii)z3代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z3代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2。
[0082]
在本发明的优选实施方案中，如果(i)z1代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z1代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，则(ii)z2代表h、c
1-c
12
烷氧基，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基；更优选地z2代表h、ch3、cf3或och3；和/或(iii)z3代表h，直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基，或者直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基；和/或(iv)r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂环基、c
5-c
10
杂芳基、或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基。
[0083]
在本发明的另一优选实施方案中，如果(i)z2代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z2代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，则(ii)z1代表h；和/或(iii)z3代表h，直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基，或者直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基；和/或(iv)r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂环基、c
5-c
10
杂芳基、或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基。
[0084]
在本发明的另一优选实施方案中，如果(i)z3代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z3代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，则(ii)z1代表h；和/或(iii)z2代表h、c
1-c
12
烷氧基，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基；更优选地z2代表h、ch3、cf3或och3；和/或(iv)r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂环基、c
5-c
10
杂芳基、或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基。
[0085]
在本发明的优选实施方案中，如果(i)r或v代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z3代
表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，则(ii)z1代表h；和/或(iii)z2代表h、c
1-c
12
烷氧基，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基；和/或(iv)z3代表h，直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基，或者直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基。
[0086]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：(i)z1、z2或z3中仅有一个代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z1、z2或z3中仅有一个代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2；和/或(ii)z1代表h；和/或(iii)z2代表h、c
1-c
12
烷氧基，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基；更优选地z2代表h、ch3、cf3或och3；和/或(iv)z3代表h，或者直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基。
[0087]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：
[0088]
如果(i)r或v代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如本文所定义；更优选地z3代表x
1-r
3-x
2-p

，其中x1代表ch2，x2代表co，并且r3代表(ch2)m，其中m代表1至3的整数，优选地m等于2，则
[0089]
(ii)z3存在，并且z3代表h，直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基，优选直链或支链饱和或不饱和c
1-c6烷基，或者直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基。
[0090]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如所定义的通式(i)、优选通式(iii)的化合物是这样的化合物，其中：接枝阳离子聚合物选自：线性或支化聚乙烯亚胺(pei)、pei树枝状聚合物、聚丙烯亚胺(ppi)、聚(酰胺基胺)(paa)和树枝状聚合物(pamam)、阳离子环糊精、聚烷基胺、聚羟基烷基胺、聚(丁烯亚胺)(pbi)、精胺、n-取代的聚烯丙基胺、n-取代的壳聚糖、n-取代的聚鸟氨酸、n-取代的聚赖氨酸(pll)、n-取代的聚乙烯胺、聚(β-氨基酯)、超支化聚(氨基酯)(h-pae)、网状化聚(氨基酯)(n-pae)、聚(4-羟基-1-脯氨酸酯)(php-酯)和聚-β-氨基酸。优选地，阳离子聚合物是线性或支化pei，更优选线性pei。
[0091]
接枝阳离子聚合物的接枝率可以为1至50％，优选5至30％，更优选地为20％。
[0092]
如本文所定义，术语“接枝率”是指通过侧链接枝在伯氨基或仲氨基基团上的单体的数目除以存在于原始阳离子聚合物中的总单体的数目。接枝率会取决于阳离子聚合物的分子量、接枝到聚合物上的侧链的化学反应性或获得的生物效应。所述接枝率可以通过本领域众所周知的测量方法(例如通过nmr)来确定。
[0093]
接枝阳离子聚合物的平均分子量(mw)可以为1kda至500kda，优选1kda至50kda，更优选5kda至50kda或者1kda至15kda。尤其是，接枝阳离子聚合物的平均分子量(mw)可以为6、8、10、15、22或30kda，优选6、8、10、15或30kda。
[0094]
接枝阳离子聚合物可以与反离子(如氯离子、磷酸根、柠檬酸根、乙酸根、丙酸根、碳酸根、琥珀酸根、磺酸根、硫酸根或羧酸根)缔合。
[0095]
在本发明的具体实施方案中，至少一种优选的如本文所定义的通式(i)、优选通式
(iii)的化合物是这样的化合物，其中：y1、y2、y3、z1、z2、z3、x1、x2、r3和p

如本文所定义；并且r或v代表h、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基或环烷基、c
6-c
18
芳基、直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基、直链或支链饱和或不饱和c
2-c
18
杂烷基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
24
酯、c
5-c
10
杂环基、c
5-c
10
杂芳基、直链或支链饱和或不饱和c
1-c
18
烷基-c
5-c
10
杂芳基、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

。
[0096]
优选地，r或v代表h、甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、仲丁基、环戊基、苯基、氟苯基、苄基、吡啶、2-吡啶、3-吡啶、氟苄基、经取代的吗啉基、经取代的哌嗪基、4-羟基苄基或4-羟基苯乙基；更优选地r或v代表甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、仲丁基、环戊基、苯基、苄基、氟苄基、4-羟基苯乙基、2-吡啶或3-吡啶。
[0097]
与z1、z2、z3、x1、x2、r3和p有关的式(iii)的化合物的最优选实施方案如本文对式(i)的化合物所定义。
[0098]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：z1、z2或z3中仅有一个(优选z1)代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如式(i)中、优选式(iii)中所定义。
[0099]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：r或v中仅有一个代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如式(i)中、优选式(iii)中所定义。
[0100]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：y1、y2和y3代表n。这些化合物对应于通式(iii)的化合物。
[0101]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是其这样的化合物，其中：z3代表直链或支链饱和或不饱和c
6-c
18
芳基-c
1-c
18
烷基，优选氟苄基或4-羟基苯乙基。
[0102]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：r代表h、甲基、丙基、异丙基、环丙基、苄基、氟苄基、吡啶、2-吡啶、3-吡啶、苯基、氟苯基、经取代的吗啉基或经取代的哌嗪基。
[0103]
在本发明的具体实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：v代表h、x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如式(i)中、优选式(iii)中所定义。
[0104]
在本发明的优选实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：(i)y1、y2和y3代表n；和/或(ii)v代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

，其中x1、x2、r3和p

如式(i)中所定义；和/或(iii)r代表h；和/或(iv)z3代表氟苄基或4-羟基苯乙基。
[0105]
在本发明的优选实施方案中，优选的化合物是这样的化合物，其中：(i)y1、y2和y3代表n；和/或(ii)z1代表x
1-r
3-x
2-p

、x
1-r
3-p

、x
1-x
2-p

、r
3-x
2-p

、x
1-p

、r
3-p

或x
2-p

，优选x
1-r
3-x
2-p

；和/或(iii)v代表h；和/或(iv)r代表苄基、氟苄基、吡啶、2-吡啶、3-吡啶、甲基、丙基、异丙基、环丙基、苯基、氟苯基、经取代的吗啉基或经取代的哌嗪基。
[0106]
根据本发明的具体实施方案，优选的化合物对应于如表1中所公开的化合物2.19至2.61，优选化合物2.19、2.22、2.23、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.55、2.56、2.57、2.58、2.59、2.60和2.61。
[0107]
表1.本发明的优选化合物的结构。
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114][0115]
在本发明的优选实施方案中，至少一种通式(iii)的化合物选自以下化合物：2.19、2.22、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.55、2.56、2.57、2.58、2.59、2.60和2.61，甚至更优选地是化合物2.22。
[0116]
至少一种通式(i)、优选通式(iii)的化合物可以根据本领域众所周知的各种方法来制备。
[0117]
本发明还涉及本发明的组合物，其用于细胞转化、细胞疗法或基因疗法的体内应用，所述细胞转化通过使用本发明的组合物摄取外源核酸来进行。细胞可以是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，特别是人细胞，尤其是原代细胞，可以是分裂细胞或非分裂细胞。
[0118]
本发明还涉及一种用于活细胞的体外或离体转染的方法，其包括将本发明的组合物引入细胞中。可以将所述活细胞提供或维持在含有血清的培养基、合成培养基、无动物组分培养基或化学限定培养基中。
[0119]
本发明还涉及本发明的组合物用于将至少一种核酸分子转染到细胞、细胞系或多个细胞中的体外或离体用途，所述细胞、细胞系或多个细胞优选为选自以下的细胞、细胞系或多个细胞：哺乳动物细胞、昆虫细胞、原代细胞、粘附细胞、悬浮细胞、分裂细胞(如干细胞)、非分裂细胞(如神经元细胞)和癌细胞，所述细胞、细胞系或多个细胞任选地被组织成球状体、类器官、2d或3d细胞培养物，或者作为纤维或基质培养物来提供，和/或在生物反应器内。
[0120]
如本文所定义，术语“粘附细胞”是指需要固体支持物以进行生长且因此具有贴壁依赖性的细胞。粘附细胞的实例包括但不限于mrc-5细胞、hela细胞、vero细胞、nih-3t3细胞、l293细胞、cho细胞、bhk-21细胞、mcf-7细胞、a549细胞、cos细胞、hek 293细胞、hep g2细胞、snn-be(2)细胞、bae-1细胞或sh-sy5y细胞。
[0121]
如本文所定义，术语“悬浮细胞”是指不需要固体支持物以进行生长且因此具有非贴壁依赖性的细胞。悬浮细胞的实例包括但不限于nso细胞、u937细胞、namalawa细胞、hl60细胞、wehi231细胞、yac 1细胞、jurkat细胞、thp-1细胞、k562细胞或u266b1细胞。
[0122]
如本文所定义，术语“球状体”是指培养中保持三维架构的球形异源细胞聚集体。
[0123]
如本文所定义，术语“类器官”是指由以与体内相似的方式自组织的器官特异性细胞类型的集合形成的三维结构。
[0124]
如本文所定义，术语“纤维或基质培养物”是指由不溶性弹性纤维或自组织成基质的细胞外蛋白构成的三维细胞培养支持物。
[0125]
所述转染可以是稳定的或瞬时的、标准的或反向的。
[0126]
如本文所公开，本发明的组合物可以包含多种不同的用于共转染的核酸，这些核酸尤其选自：多种质粒dna、质粒dna和寡核苷酸、质粒dna和mrna。
[0127]
所述至少一种待转染的核酸分子可以是编码蛋白质、蛋白质片段、肽或抗体或其功能性抗原结合区(尤其是其vh和/或vl链)的基因。所述蛋白质可以选自：报告蛋白、荧光蛋白、酶、结构蛋白、受体、跨膜蛋白、治疗性蛋白质、细胞因子、毒素、致癌蛋白、抗癌基因、促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白、聚合酶、转录因子和衣壳蛋白。
[0128]
本发明还涉及本发明的组合物用于基因组工程、用于细胞重编程(尤其是用于将分化细胞重编程为诱导多能干细胞(ipc))、用于分化细胞或用于基因编辑的体外或离体用途。此种用途可以在体外或离体细胞培养中进行，用于产生生物制剂、用于制备用于疗法目的的细胞、或用于研究细胞功能或行为，尤其是转染后的细胞扩展步骤，或者可以在体内进行，以在需要其的宿主中用于治疗性目的。
[0129]
本发明还涉及本发明的组合物在以下中的体外或离体用途：(i)产生生物制剂，尤其是编码重组蛋白、肽或抗体的生物制剂；或(ii)产生重组病毒，如腺相关病毒(aav)、慢病毒(lv)、腺病毒、溶瘤病毒或杆状病毒，所述组合物包含多种用于共转染的核酸分子，如多种质粒；或(iii)产生病毒性或病毒样颗粒，所述组合物包含多种用于共转染的核酸分子，如多种质粒。
[0130]
因此，本发明还涉及一种用于产生以下的方法：(i)生物制剂，尤其是编码重组蛋白、肽或抗体的生物制剂；或(ii)重组病毒，如腺相关病毒(aav)、慢病毒(lv)、腺病毒、溶瘤病毒或杆状病毒，其中本发明的组合物包含多种用于共转染的核酸分子；或(iii)病毒性或病毒样颗粒，其中本发明的组合物包含多种用于共转染的核酸分子。如本文所定义，术语“生物制剂”是指蛋白质或核酸或其组合、活体(如细胞或病毒)、细胞区室、类器官和组织。
[0131]
在用于产生aav的方法的优选实施方案中，所述组合物包含(i)至少一种选自化合物2.22、2.23、2.43、2.44、2.47、2.54、2.57、2.60和2.61的化合物，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基。
[0132]
在用于产生lv的方法的优选实施方案中，所述组合物包含(i)至少化合物2.22，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基。
[0133]
如本文所定义，术语“生物制剂”是指蛋白质或核酸或其组合、活体(如细胞或病毒)、细胞区室、类器官和组织。
[0134]
在本发明的具体实施方案中，本发明的所述组合物的体外或离体用途或所述方法用于产生重组病毒，所述组合物包含多种表达载体(如质粒载体)以在粘附或悬浮细胞(如hek293和衍生物细胞、hela、bhk-21、a549或昆虫细胞)中转染，其中所述载体(尤其是质粒)是表达用于病毒或病毒样产生的病毒结构序列和转移载体基因组并且任选地表达由所述转移载体基因组编码的所关注的分子的构建体。
[0135]
在本发明的具体实施方案中，所述重组病毒用于细胞疗法或基因疗法的体内用途。
[0136]
在本发明的具体实施方案中，本发明涉及本发明的组合物在产生重组病毒(如腺
相关病毒(aav)或慢病毒(lv))中的体外或离体用途，所述组合物包含(i)至少一种选自化合物2.22、2.23、2.42、2.43、2.44、2.46、2.47、2.54、2.57、2.60和2.61的化合物，以及(ii)可接受的赋形剂、缓冲剂、细胞培养基或转染培养基。优选地，包含化合物2.22的组合物用于产生lv；并且包含至少一种选自化合物2.22、2.23、2.43、2.44、2.47、2.54、2.57、2.60和2.61的化合物的组合物用于产生aav。
[0137]
除非另有说明，否则所有上述实施方案可以组合在一起。因此，在单独的实施方案的上下文中描述的特征可以在单一实施方案中组合。
[0138]
本发明的其他特征和优点将从随后的实施例中显而易见，并且还将在附图中进行说明。
附图说明
[0139]
图1.通式(i)的化合物的化学结构。
[0140]
图2.用实施例3的化合物转染caco-2、hep g2、mdck和mcf-10a后的gfp表达的百分比。比例1:3和1:4指示μg dna/μl化合物的比例。
[0141]
图3.从悬浮hek-293t细胞产生aav-2。表达gfp报告基因的aav-2载体是在悬浮生长于freestyle f17培养基中的hek-293t细胞中产生的。将细胞接种并培养3天，然后以比例1:2或1:3μgdna/μl试剂，用或各种化合物通过3种质粒(表达rep和cap的paav-rc2载体；表达adeno e2a、adeno e4和adeno va辅助因子的phelper载体；以及表达受cmv启动子控制的gfp的paav-gfp控制载体)转染。转染后72小时测定aav滴度(转导单位，tu/ml)。与以比例1:2和1:3的转染相比，结果被表达为相对aav-2转导单位/ml(tu/ml)。
[0142]
图4.从悬浮hek-293t细胞产生慢病毒颗粒。表达gfp报告基因的慢病毒是在悬浮生长于freestyle f17培养基中的hek-293t细胞中产生的。将细胞接种并培养3天，然后以比例1:2μg总dna/μl试剂，用或化合物2.22通过4种质粒转染。转染后72小时测定慢病毒滴度(转导单位，tu/ml)。
[0143]
图5.通式(iii)的化合物的化学结构。
[0144]
图6.用化合物2.22和2.53至2.61转染hep g2细胞后的gfp表达的百分比。比例1:3和1:4指示μg dna/μl化合物的比例。
[0145]
图7.用化合物2.22和2.53至2.61从悬浮hek-293t细胞产生aav-2。表达gfp报告基因的aav-2载体是在悬浮生长于freestyle f17培养基中的hek-293t细胞中产生的。将细胞接种并培养3天，然后以比例1:2μg dna/μl试剂，用或各种化合物通过3种质粒(表达rep和cap的paav-rc2载体；表达adeno e2a、adeno e4和adeno va辅助因子的phelper载体；以及表达受cmv启动子控制的gfp的paav-gfp控制载体)转染。转染后72小时测定aav滴度(转导单位，tu/ml)。结果被表达为相对aav-2转导单位/ml(tu/ml)。
[0146]
图8.转染的dna量和化合物2.22/μg dna的比例对从悬浮hek-293t细胞产生aav-2的影响。表达gfp报告基因的aav-2载体是在悬浮生长于freestyle f17培养基中的hek-293t细胞中产生的。将细胞接种并培养3天，然后以μg dna/μl试剂的不同比例(比例1:1.5至1:3)，用化合物2.22(在15mm氮浓度下配制)通过3种质粒(表达rep和cap的paav-rc2载体；表达adeno e2a、adeno e4和adeno va辅助因子的phelper载体；以及表达受cmv启动子控制的gfp的paav-gfp控制载体)转染。转染后72小时测定aav滴度(转导单位，tu/ml)。结果
被表达为相对aav-2转导单位/ml(tu/ml)。转染后72小时用台盼蓝(trypan blue)测定来确定细胞活力。
[0147]
图9.dna与化合物2.22复合的时间对从悬浮hek-293t细胞产生aav-2的影响。表达gfp报告基因的aav-2载体是在悬浮生长于freestyle f17培养基中的hek-293t细胞中产生的。将细胞接种并培养3天，然后以dna/μl试剂的比例1:2并以1μg dna/百万个细胞，用化合物2.22(在15mm氮浓度下配制)通过3种质粒(表达rep和cap的paav-rc2载体；表达adeno e2a、adeno e4和adeno va辅助因子的phelper载体；以及表达受cmv启动子控制的gfp的paav-gfp控制载体)转染。转染后72小时测定aav滴度(转导单位，tu/ml)。结果被表达为相对aav-2转导单位/ml(tu/ml)。
实施例
[0148]
实验部分
[0149]
材料和方法
[0150]
细胞培养
[0151]
在37℃下，在含5％co2的空气气氛中，将caco-2(htb-37
tm
)人结肠上皮细胞生长在补充有1％非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、2mm谷氨酰胺以及100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml链霉素(streptomycin)的含有20％fbs的dmem 4.5g/l葡萄糖中。
[0152]
在37℃下，在含5％co2的空气气氛中，将mcf 10a(crl-10317
tm
)人乳腺上皮细胞生长在补充有singlequots
tm
补充剂和生长因子(lonza)和100ng/ml霍乱毒素的mebm(lonza)中。
[0153]
在37℃下，在含5％co2的空气气氛中，将hep g2(hb-8065
tm
)人肝癌细胞生长在补充有1％非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、2mm谷氨酰胺以及100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的含有10％fbs的mem(ozyme)中。
[0154]
在37℃下，在含5％co2的空气气氛中，将mdck(ccl-34
tm
)madin-darby犬肾上皮细胞生长在补充有2mm谷氨酰胺以及100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的含有10％fbs的mem(ozyme)中。
[0155]
在37℃下，在含5％co2的空气气氛中，将原代人真皮成纤维细胞生长在补充有10％fbs、1％非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、2mm谷氨酰胺以及100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(ozyme)中。
[0156]
转染测定(96孔格式)
[0157]
转染前一天，将caco-2、mcf 10a、hep g2和mdck细胞分别以每孔(96孔格式)10000、25000、25000、10000个细胞接种在各自的125μl完全培养基中，并且在37℃下、在含5％co2的空气气氛中孵育。在转染当天，将200ng pcmv-egfpluc dna(clontech)添加进20μl optimem(thermo fisher)中，涡旋混合，并且在室温(rt)下孵育5分钟。然后，将0.6或0.8μl通式(i)、优选通式(iii)的化合物(在7.5mm氮浓度下)添加到稀释的dna上，涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。将转染dna溶液(20μl)添加到孔中，并且将板在37℃下、在含5％co2的空气气氛中孵育24小时。
[0158]
对于gfp表达分析，转染后一天，将细胞培养基去除，并且每孔添加50μl胰蛋白酶-edta(1x，lonza)，并且将板在37℃下孵育5分钟。添加150μl完全培养基以中和胰蛋白酶，并
且使用guava easycyte 6ht细胞计数器(millipore)通过流式细胞术(exc 488nm，em 520nm)分析gfp表达(2000个事件)。
[0159]
重组病毒产生
[0160]
hek-293t(crl-3216
tm
)：人胚肾细胞是人胚肾293细胞的高度可转染衍生物，并且含有sv40 t抗原。hek-293t细胞广泛用于重组病毒产生、基因表达和蛋白质产生。
[0161]
对于粘附细胞，将hek-293t细胞以145cm2皮氏培养皿中5x106个细胞接种在15ml补充有10％fbs、2mm谷氨酰胺以及100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem 4.5g/l葡萄糖中，并且在37℃下、在含5％co2的空气气氛中孵育。
[0162]
aav-2是在hek-293t细胞中，使用aav-2无辅助包装系统(录号vpk-402，cell biolabs,inc.)，通过3种质粒(表达rep和cap的paav-rc2载体；表达adeno e2a、adeno e4和adeno va辅助因子的phelper载体；以及表达受cmv启动子控制的gfp的paav-gfp控制载体)的共转染产生的。分别用paav-rc2、phelper和paav-gfp以2:2:1的比例制备转染复合物(每皮氏培养皿中总dna为10μg)。将质粒稀释在总体积为1.5ml的optimem中。然后，将20或30μl化合物添加到稀释的dna上，涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。将转染复合物添加到孔上，并且将板在37℃下、在含5％co2的空气气氛中孵育72小时。
[0163]
对于悬浮细胞，将hek-293t细胞以1x106个细胞/ml接种在125ml erlenmeyer烧瓶(corning)中的27ml补充有4％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.1％pluronic的freestyle f17中。在搅动(130rpm)下，将细胞在37℃下、在含8％co2的空气气氛中孵育24小时。将质粒(paav-gfp
–
paav-rc2
–
phelper，比例为2:2:1)稀释在3ml freestyle f17中。然后，将化合物添加到稀释的dna上(比例为每μg dna 2或3μl)，涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。将转染复合物添加到细胞上(每1x106个细胞2μg dna)，并且在搅动下(130rpm)将板在37℃下、在含8％co2的空气气氛中孵育72小时。
[0164]
使用含有prsv-rev包装载体、pcgpv包装载体和pcmv-vsv-g囊膜载体的virasafe
tm
慢病毒包装系统pantropic(目录号vpk-20，cell biolabs inc.)产生慢病毒颗粒。plenti6.3/v5-gw/emgfp表达控制载体来自thermo fisher。
[0165]
将hek-293t细胞以1x106个细胞/ml接种在125ml erlenmeyer烧瓶(corning)中的27ml补充有4％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.1％pluronic的freestyle f17中。在搅动(130rpm)下，将细胞在37℃下、在含8％co2的空气气氛中孵育24小时。将质粒(prsv-rev
–
pcgpv
–
pcmv-vsv-g-plenti6.3，比例为1:1:1:3)稀释在3ml freestyle f17中。然后，将化合物添加到稀释的dna上(比例为每μg dna 2μl)，涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。将转染复合物添加到细胞上(每1x106个细胞2μg dna)，并且在搅动下(130rpm)将板在37℃下、在含8％co2的空气气氛中孵育72小时。
[0166]
在96孔中感染用于慢病毒载体的许可ht 1080细胞和用于aav-2载体的hek-293t细胞之后，并且在聚凝胺(8μg/ml)的存在下，通过使用表达gfp报告基因的病毒载体测定转导单位(tu/ml)。转导后72小时通过细胞计数分析gfp表达以测定转导单位。
[0167]
实施例1.制备接枝聚合物的一般操作
[0168]
步骤1：接枝
[0169]
将含阳离子聚合物(1当量)的水(4ml/mmol的原料)添加进圆底烧瓶中，随后添加n-甲基吗啉或nmm(2当量)。添加羧酸盐(0.3-1当量)，随后添加meoh(16ml/mmol的聚合物)。
搅拌10分钟后，添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物或dmtmm(0.6-2当量)，并且将混合物在室温下搅拌12-24小时。然后，真空去除meoh，添加水(4ml/mmol的原料)，随后添加3m hcl溶液(1ml/mmol的原料)。使用透析盒在50mm hcl浴中对残余物进行纯化。
[0170]
步骤2：以酸为原料通过《点击(click)》化学来合成三唑
[0171][0172]
将炔烃(1当量)、叠氮化物(1当量)、cuso4(0.01当量)和抗坏血酸钠(0.03当量)添加到nbuoh和水的2:1(v/v)溶液中。将反应在室温下搅拌24小时。然后，添加naoh(5m，2当量)，并且将有机溶剂真空去除。使用含0至100％ch3cn的水作为洗脱剂，通过反相快速色谱法对残余物进行纯化。
[0173]
步骤3：以酯为原料通过《点击》化学来合成三唑
[0174][0175]
将炔烃(1当量)、叠氮化物(1当量)、cuso4(0.01当量)和抗坏血酸钠(0.03当量)添加到nbuoh和水的2:1(v/v)溶液中。将反应在室温下搅拌24小时。然后，添加naoh(5m，2当量)，并且将有机溶剂真空去除。使用含0至100％ch3cn的水作为洗脱剂，通过反相快速色谱法对残余物进行纯化。
[0176]
步骤4：酯部分的皂化
[0177]
向酯于etoh中的溶液中逐滴添加3m lioh溶液，并且将混合物在室温下搅拌度过周末。然后，将溶剂真空去除，并且使用biotage flash纯化系统，使用h2o/mecn作为洗脱剂，在sio2上通过反相fc对残余物进行纯化。将获得的酸冻干以得到固体。
[0178]
步骤5：以酯为原料通过钌催化《点击》化学来合成三唑
[0179]
将cp*rucl(cod)添加到微波小瓶中。然后将小瓶抽真空并且用氩气回填(3x)。在ar下将炔烃(alkyne)(1,1eq.)；链炔(alcyne)(1eq.)和甲苯添加到小瓶中，并且将混合物
在室温下搅拌过夜。将甲苯蒸发，并且使用h2o和mecn在反相色谱上对产物进行纯化。
[0180]
将酯重新加入进etoh和naoh 1m(1,1eq.)中并搅拌直到完成(随后进行hplc)。将etoh蒸发，并且使用h2o和mecn在反相色谱上对产物进行纯化。将产物冻干。
[0181]
步骤6：1,2,3-三唑的合成。
[0182]
80℃下含三唑和k2co3的mecn。逐滴滴加r-br并在80℃下搅拌过夜。过滤并用mecn洗涤固体。将滤液蒸发并通过反相色谱法(h2o:mecn)纯化。收集两个级分。
[0183]
将酯重新加入进etoh和naoh 1m(1,1eq.)中并搅拌直到完成。将etoh蒸发，并且通过反相色谱法h2o:mecn对产物进行纯化。
[0184]
实施例2.本发明的化合物的合成
[0185]-产物2.19的合成
[0186]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.19a。收率＝87％；m＝520mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.75(s,1h),7.34
–
7.25(m,2h),7.18
–
7.04(m,2h),5.50(s,2h),2.65(t,j＝7.2hz,2h),2.17(t,j＝7.1hz,2h),1.55(dq,j＝23.6,7.8hz,3h)。
[0187]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.19。收率＝36％；m＝21mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.12
–
6.41(m,5h),5.68
–
4.93(m,2h),4.05
–
2.88(m,17h),2.79
–
0.87(m,8h)。
[0188]-产物2.20的合成
[0189]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.20a。收率＝51％；m＝261mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.75(s,1h),7.34
–
7.25(m,2h),7.18
–
7.04(m,2h),5.50(s,2h),2.65(t,j＝7.2hz,2h),2.17(t,j＝7.1hz,2h),1.64
–
1.45(m,3h)。
[0190]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.20。收率＝71％；m＝31mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.17
–
6.68(m,5h),5.60
–
5.28(m,2h),4.10
–
2.93(m,27h)。
[0191]-产物2.21的合成
[0192]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.21a。收率＝27％；m＝148mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.71(s,1h),7.32
–
7.24(m,2h),7.09(td,j＝8.8,2.0hz,2h),5.55
–
5.46(m,2h),2.86(t,j＝7.5hz,2h),2.45(t,j＝7.5hz,2h)。
[0193]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.21。收率＝29％；m＝12mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.90
–
6.37(m,5h),5.58
–
5.25(m,2h),4.20
–
2.91(m,36h)。
[0194]-产物2.22的合成
[0195]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.22a。收率＝28％；m＝78mg；1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.57(s,1h),6.93
–
6.84(m,2h),6.68
–
6.60(m,2h),4.54
–
4.45(m,2h),3.04(t,j＝7.4hz,2h),2.99
–
2.91(m,2h),2.53
–
2.44(m,2h)。
[0196]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.22。收率＝87％；m＝44mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.82
–
6.34(m,5h),4.60
–
4.06(m,2h),4.00
–
3.07(m,22h),3.06
–
2.24(m,7h)。
[0197]-产物2.23的合成
[0198]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体
2.23a。收率＝87％；m＝258mg；1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.53(s,1h),6.98
–
6.87(m,2h),6.75
–
6.63(m,2h),4.53(t,j＝7.1hz,2h),3.08(t,j＝7.1hz,2h),2.69(t,j＝7.6hz,2h),2.26
–
2.16(m,2h),1.91(tt,j＝8.3,6.9hz,2h)。
[0199]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.23。收率＝100％；m＝48mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.14
–
6.01(m,5h),4.62
–
4.11(m,2h),3.99
–
2.76(m,26h),2.73
–
0.92(m,8h)。
[0200]-产物2.24的合成
[0201]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.24a。收率＝67％；m＝379mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.62(s,1h),7.24
–
7.14(m,2h),7.05
–
6.92(m,2h),5.35(s,2h),2.54(t,j＝7.6hz,2h),2.08(t,j＝7.5hz,2h),1.73(tt,j＝8.2,7.0hz,2h)。
[0202]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.24。收率＝97％；m＝42mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.90
–
6.74(m,5h),5.57
–
5.15(m,2h),4.19
–
3.11(m,35h),2.91
–
1.47(m,6h)。
[0203]-产物2.25的合成
[0204]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.25。收率＝85％；m＝41mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.84
–
6.46(m,5h),5.54
–
4.94(m,2h),4.15
–
3.11(m,26h),2.97
–
1.11(m,8h)。
[0205]-产物2.26的合成
[0206]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物
2.26。收率＝80％；m＝44mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.00
–
6.36(m,5h),5.60
–
4.93(m,2h),4.12
–
3.01(m,19h),2.79
–
0.93(m,8h)。
[0207]-产物2.27的合成
[0208]
与一般操作步骤3(实施例1)类似地制备中间体2.27a。收率＝65％；m＝305mg；1h nmr(400mhz,氯仿-d)δ8.03(s,1h),8.00
–
7.91(m,2h),7.31
–
7.21(m,2h),5.36(s,2h),3.96(s,3h)。
[0209]
与一般操作步骤4(实施例1)类似地制备中间体2.27b。收率＝35％；m＝97mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.07(s,0h),7.71
–
7.59(m,1h),7.19
–
7.04(m,1h),4.96(s,1h)。
[0210]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.27。收率＝67％；m＝28mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.33
–
7.35(m,5h),6.13
–
5.19(m,2h),4.17
–
3.22(m,42h)。
[0211]-产物2.28的合成
[0212]
与一般操作步骤3(实施例1)类似地制备中间体2.28a。收率＝62％；m＝272mg；1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.59(d,j＝5.0hz,1h),8.50(s,1h),8.10(dt,j＝7.9,1.1hz,1h),7.93(td,j＝7.8,1.8hz,1h),7.38(ddd,j＝7.6,4.9,1.2hz,1h),5.45(s,2h),3.83(s,3h)。
[0213]
与一般操作步骤4(实施例1)类似地制备中间体2.28b。收率＝94％；m＝236mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.44
–
8.38(m,1h),8.23(s,1h),7.89
–
7.74(m,2h),7.31(ddd,j＝6.0,5.0,2.8hz,1h),5.02(s,2h)。
[0214]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.28。收率＝47％；m＝23mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.06
–
6.11(m,5h),5.55
–
4.96(m,2h),4.26
–
2.20(m,20h)。
[0215]-产物2.29的合成
[0216]
与一般操作步骤3(实施例1)类似地制备中间体2.29a。收率＝81％；m＝355mg；1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ9.08(s,1h),8.64
–
8.46(m,2h),8.28(tt,j＝6.3,1.6hz,1h),7.55(dd,j＝8.0,4.7hz,1h),5.44(s,2h),3.84(s,2h)。
[0217]
与一般操作步骤4(实施例1)类似地制备中间体2.29b。收率＝88％；m＝287mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.76(dd,j＝2.3,0.9hz,1h),8.40(dd,j＝5.0,1.6hz,1h),8.23(s,1h),8.07(ddd,j＝8.0,2.3,1.6hz,1h),7.42(ddd,j＝8.0,5.0,0.9hz,1h),5.01(s,2h),1.09(t,j＝7.1hz,2h)。
[0218]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.29。收率＝76％；m＝29mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.28
–
7.21(m,5h),5.94
–
5.16(m,2h),4.19
–
2.35(m,19h)。
[0219]-产物2.30的合成
[0220]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.30。收率＝66％；m＝32mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.47
–
7.87(m,5h),6.08
–
5.50(m,2h),4.32
–
2.94(m,50h)。
[0221]-产物2.31的合成
[0222]
与一般操作步骤3(实施例1)类似地制备中间体2.31a。收率＝82％；m＝354mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.46
–
7.68(m,5h),6.03
–
5.32(m,2h),4.28
–
2.83(m,50h)。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.34(s,1h),7.88
–
7.80(m,2h),7.51
–
7.41(m,2h),7.41
–
7.32(m,1h),5.39(s,2h),3.83(s,3h)。
[0223]
与一般操作步骤4(实施例1)类似地制备中间体2.31b。收率＝99％；m＝325mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.08(s,1h),7.71
–
7.62(m,2h),7.46
–
7.37(m,2h),7.41
–
7.30(m,1h),4.94(s,2h)。
[0224]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.31。收率＝58％；m＝24mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.60
–
6.52(m,6h),5.90
–
5.15(m,2h),4.23
–
2.90(m,32h)。
[0225]-产物2.32的合成
[0226]
与一般操作步骤3(实施例1)类似地制备中间体2.32a。收率＝
87％；m＝380mg；1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.82
–
8.45(m,3h),7.92(s,2h),5.45(s,2h),3.84(s,3h)。
[0227]
与一般操作步骤4(实施例1)类似地制备中间体2.32b。收率＝100％；m＝351mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.49
–
8.43(m,2h),8.34(s,1h),7.70
–
7.64(m,2h),5.02(s,2h)。
[0228]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.32。收率＝91％；m＝32mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.17
–
8.00(m,5h),6.13
–
5.23(m,2h),4.21
–
3.01(m,74h)。
[0229]-产物2.33的合成
[0230]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.33a。收率＝59％；m＝49mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.90(s,1h),4.40
–
4.32(m,2h),3.69
–
3.62(m,6h),2.52
–
2.45(m,4h),2.14
–
2.00(m,4h)。
[0231]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.33。收率＝89％；m＝15mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.63
–
7.84(m,1h),4.52
–
4.23(m,3h),4.13
–
2.86(m,27h),2.74
–
1.54(m,4h)。
[0232]-产物2.34的合成
[0233]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体
2.34a。收率＝48％；m＝51mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.92(s,1h),7.35
–
7.26(m,2h),7.09
–
7.01(m,2h),6.98(tt,j＝7.4,1.1hz,1h),4.41
–
4.33(m,2h),3.71(s,2h),3.14
–
3.07(m,4h),2.69
–
2.61(m,4h),2.14
–
2.00(m,4h)。
[0234]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.34。收率＝98％；m＝17mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.67
–
7.86(m,1h),7.64
–
6.61(m,5h),4.66
–
4.19(m,3h),4.11
–
3.09(m,31h),2.80
–
1.74(m,4h)。
[0235]-产物2.35的合成
[0236]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.35a。收率＝19％；m＝20mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.24(d,j＝4.9hz,2h),7.95(s,1h),6.64(t,j＝4.9hz,1h),4.40
–
4.33(m,2h),3.81
–
3.77(m,2h),3.67
–
3.60(m,4h),2.66
–
2.58(m,4h),2.12
–
2.00(m,4h)。
[0237]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.35。收率＝44％；m＝7mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.58
–
7.90(m,3h),7.07
–
6.43(m,1h),4.57
–
4.19(m,3h),4.23
–
2.99(m,32h),2.83
–
1.68(m,4h)。
[0238]-产物2.36的合成
[0239]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.36a。收率＝51％；m＝78mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.39(ddd,j＝5.0,1.7,1.0hz,1h),8.21(s,1h),7.85
–
7.71(m,1h),7.30(ddd,j＝7.3,5.0,1.5hz,1h),4.43
–
4.35(m,2h),2.20
–
2.03(m,4h)。
[0240]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.36。收率＝77％；m＝14mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.15
–
7.11(m,5h),4.57
–
4.15(m,1h),4.07
–
2.86(m,13h),2.74
–
1.68(m,4h)。
[0241]-产物2.37的合成
[0242]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.37a。收率＝14％；m＝38mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.00(s,1h),7.57
–
7.47(m,2h),7.09
–
6.95(m,2h),4.26(t,j＝7.0hz,2h),2.08(t,j＝7.5hz,2h),1.76(p,j＝7.2hz,2h),1.49
–
1.35(m,2h)。
[0243]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.37。收率＝24％；m＝9mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.23
–
6.04(m,5h),4.39
–
2.72(m,18h),2.70
–
0.56(m,6h)。
[0244]-产物2.38的合成
[0245]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.38a。收率＝11％；m＝27mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.97(s,1h),7.51(dd,j＝8.7,5.3hz,2h),
7.02(t,j＝8.9hz,2h),4.23(t,j＝7.1hz,2h),2.04(t,j＝7.5hz,2h),1.76(p,j＝7.2hz,2h),1.45(p,j＝7.6hz,2h),1.21
–
1.09(m,2h)。
[0246]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.38。收率＝18％；m＝6mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.31
–
6.11(m,5h),4.33
–
2.72(m,21h),2.68
–
0.15(m,6h)。
[0247]-产物2.39的合成
[0248]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.39a。收率＝35％；m＝11mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.01(s,1h),7.60
–
7.53(m,2h),7.39
–
7.25(m,3h),4.24(t,j＝7.1hz,2h),2.09(t,j＝7.5hz,2h),1.76(p,j＝7.2hz,2h),1.48
–
1.35(m,2h)。
[0249]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.39。收率＝53％；m＝133mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.49
–
6.15(m,6h),4.52
–
2.83(m,21h),2.66
–
0.54(m,6h)。
[0250]-产物2.40的合成
[0251]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.40a。
收率＝76％；m＝184mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.88(s,1h),7.54
–
7.47(m,2h),7.35
–
7.20(m,3h),4.14(t,j＝7.1hz,2h),2.04(t,j＝7.5hz,2h),1.76
–
1.64(m,2h),1.43(p,j＝7.6hz,2h),1.21
–
1.06(m,2h)。
[0252]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.40。收率＝12％；m＝4mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.94
–
6.37(m,6h),4.43
–
2.84(m,19h),2.68
–
0.23(m,8h)。
[0253]-产物2.41的合成
[0254]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.41a。收率＝26％；m＝46mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.41(s,1h),7.20
–
7.01(m,5h),4.08(t,j＝7.0hz,2h),3.78(s,2h),2.00(t,j＝7.5hz,2h),1.72
–
1.50(m,2h),1.32(tt,j＝15.0,9.9hz,2h)。
[0255]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.41。收率＝75％；m＝26mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.99
–
6.38(m,6h),4.32
–
1.58(m,30h)。
[0256]-产物2.42的合成
[0257]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.42a。收率＝57％；m＝96mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.15(s,1h),7.05
–
6.86(m,5h),3.92(t,j＝7.2hz,2h),3.67(s,2h),1.97(t,j＝7.6hz,2h),1.54
–
1.42(m,2h),1.39
–
1.27(m,2h),1.05
–
0.92(m,2h)。
[0258]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.42。收率＝87％；m＝27mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.58
–
6.61(m,6h),4.55
–
0.72(m,33h)。
[0259]-产物2.43的合成
[0260]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.43a。收率＝24％；m＝36mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.78(s,1h),8.43
–
8.37(m,1h),8.29(s,1h),8.09(dt,j＝8.1,1.9hz,1h),7.43(ddd,j＝8.0,5.0,0.9hz,1h),4.38(t,j＝7.0hz,2h),2.06(t,j＝7.5hz,2h),1.91
–
1.79(m,2h),1.54
–
1.42(m,2h),1.26
–
1.14(m,2h)。
[0261]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.43。收率＝38％；m＝17mg；；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ9.38
–
7.80(m,5h),4.58
–
0.92(m,31h)。
[0262]-产物2.44的合成
[0263]
与一般操作步骤2(实施例1)类似地制备中间体2.44a。收率＝25％；m＝38mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.45
–
8.40(m,1h),8.24(s,1h),7.85
–
7.79(m,2h),7.34
–
7.30(m,1h),4.37(t,j＝7.0hz,2h),2.05(t,j＝7.4hz,2h),1.91
–
1.79(m,2h),1.54
–
1.42(m,2h),1.27
–
1.14(m,2h)。
[0264]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.44。收率＝64％；m＝29mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.79
–
7.46(m,5h),4.56
–
2.83(m,23h),2.72
–
0.78(m,8h)。
[0265]-产物2.45的合成
[0266]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.45。收率＝49％；m＝18mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.01
–
6.82(m,5h),5.62
–
5.23(m,2h),4.04
–
3.18(m,66h),2.95
–
1.63(m,6h)。
[0267]-产物2.46的合成
[0268]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.46。收率＝93％；m＝156mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.98
–
8.37(m,3h),8.27(s,1h),7.90(s,1h),4.61
–
4.32(m,2h),4.05
–
3.13(m,18.5h),2.56
–
2.18(m,2h),2.12
–
1.79(m,2h),1.73
–
1.42(m,2h),1.42
–
1.14(m,2h)。
[0269]-产物2.47的合成
[0270]
与一般操作步骤1(实施例1)类似地制备产物2.47。收率＝99％；m＝44mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.00
–
6.02(m,5h),4.66
–
4.05(m,1h),3.97
–
2.01(m,32h)。
[0271]-产物2.48的合成
[0272]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.48。收率＝28％；m＝83mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.75
–
7.23(s,1h),7.15
–
6.38(m,4h),4.64
–
4.17(m,2h),4.14
–
2.00(m,25h)。
[0273]-产物2.49的合成
[0274]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.49。收率＝5％；m＝13mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.78
–
7.32(s,1h),7.20
–
6.31(m,4h),4.66
–
4.31(m,2h),4.22
–
2.20(m,27h)。
[0275]-产物2.50的合成
[0276]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.50。收率＝18％；m＝29mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.71
–
7.19(s,1h),7.15
–
6.34(m,4h),4.65
–
4.09(m,2h),4.06
–
0.57(m,26h)。
[0277]-产物2.51的合成
[0278]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.51。收率＝36％；m＝13mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.68
–
7.45(m,1h),7.14
–
6.62(m,4h),4.67
–
4.42(m,2h),4.39
–
4.17(m,5h),3.38
–
2.73(m,16h),2.58
–
2.33(m,2h),1.99
–
1.01(m,35h)。
[0279]-产物2.52的合成
[0280]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.52。收率＝43％；m＝63mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.84
–
7.31(s,1h),7.28
–
6.48(m,4h),4.69
–
4.33(m,2h),4.30
–
1.04(m,25h)。
[0281]-产物2.53的合成
[0282]
与一般操作步骤3和4类似地制备中间体2.53a。收率＝34％；m＝151mg；1hnmr(400mhz,meod)δ6.69(s,1h),3.39
–
3.21(m,2h),1.20
–
0.94(m,4h),0.26(s,9h)。
[0283]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.53。收率＝37％；m＝25mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.07
–
7.88(m,1h),4.60
–
3.35(m,2h),4.08
–
3.05(m,24h),2.90
–
1.97(m,4h),1.55
–
1.05(m,9h)
[0284]-产物2.54的合成
[0285]
与一般操作步骤3和4类似地制备中间体2.54a。收率＝69％；m＝287mg；1hnmr(400mhz,meod)δ6.64(s,1h),3.32(d,j＝6.9hz,2h),1.17
–
1.00(m,4h),0.90(tt,j＝8.4,5.0hz,1h),-0.02
–‑
0.18(m,2h),-0.22
–‑
0.35(m,2h)。
[0286]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.54。收率＝34％；m＝24mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.99
–
7.78(m,1h),4.61
–
4.38(m,2h),4.06
–
3.26(m,21h),2.66
–
1.95(m,5h),1.15
–
1.01(m,2h),0.88
–
0.70(m,2h)。
[0287]-产物2.55的合成
[0288]
与一般操作步骤3类似地制备中间体2.55a。收率＝52％；m＝251mg；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.28(s,1h),4.39(t,j＝6.9hz,2h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),3.28
–
3.09(m,1h),2.34(t,j＝6.9hz,2h),2.22(p,j＝7.0hz,2h),2.11(s,2h),1.88
–
1.56(m,6h),1.26(t,j＝7.1hz,3h)。
[0289]
与一般操作步骤4类似地制备中间体2.55b。收率＝定量(quantitative)；m＝223mg；1h nmr(400mhz,meod)δ7.65(s,1h),4.35
–
4.21(m,2h),3.12
–
2.96(m,1h),2.15
–
1.91(m,6h),1.77
–
1.49(m,6h)。
[0290]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.55。收率＝40％；m＝22mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.04
–
7.83(m,1h),4.59
–
4.34(m,2h),4.07
–
3.04(m,25h),2.60
–
1.97(m,6h),1.80
–
1.47(m,6h)
[0291]-产物2.56的合成
[0292]
与一般操作步骤3类似地制备中间体2.56a。收率＝80％；m＝350mg；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.26(s,1h),4.38(t,j＝6.9hz,2h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),3.09(hept,j＝6.9hz,1h),2.34(dd,j＝7.4,6.4hz,2h),2.29
–
2.14(m,2h),1.31(s,3h),1.29(s,3h),1.26(td,j＝7.1,0.6hz,3h)。
[0293]
与一般操作步骤4类似地制备中间体2.56b。收率＝定量；m＝340mg；1h nmr(400mhz,meod)δ7.75(d,j＝0.8hz,1h),4.39(td,j＝6.4,5.8,2.8hz,2h),3.03(pd,j＝6.9,0.7hz,1h),2.25
–
2.05(m,4h),1.30(s,3h),1.29(s,3h)。
[0294]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.56。收率＝45％；m＝32mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ8.09
–
7.90(m,1h),4.61
–
4.36(m,2h),4.09
–
3.20(m,21h),3.17
–
2.97(m,1h),2.62
–
2.03(m,4h),1.45
–
1.16(m,6h)。
[0295]-产物2.57的合成
[0296]
与一般操作步骤5类似地制备中间体2.57a。收率＝55％；m＝287mg；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.73
–
7.66(m,2h),7.56
–
7.40(m,4h),7.38
–
7.27(m,2h),4.39(t,j＝7.1hz,2h),4.31(t,j＝6.9hz,1h),4.14(q,j＝7.1hz,2h),4.04(q,j＝7.1hz,1h),2.48(s,3h),2.43(t,j＝7.0hz,2h),2.30(s,2h),2.31
–
2.23(m,1h),2.27
–
2.19(m,2h),2.15
–
2.03(m,1h),1.26(t,j＝7.1hz,3h),1.19(t,j＝7.1hz,2h)。
[0297]
与一般操作步骤4类似地制备中间体2.57b。收率＝定量；m＝280mg；1h nmr(400mhz,meod)δ7.79
–
7.10(m,5h),4.56
–
4.17(m,2h),2.57
–
1.89(m,7h)。
[0298]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.57。收率＝55％；m＝44mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.68
–
6.86(m,5h),4.53
–
3.03(m,20h),2.62
–
1.58(m,7h)。
[0299]-产物2.58的合成
[0300]
与一般操作步骤5类似地制备中间体2.58a。收率＝49％；m＝224mg；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ4.35
–
4.25(m,2h),4.19
–
4.08(m,2h),3.23
–
2.96(m,1h),2.42
–
2.34(m,4h),2.22
–
2.09(m,2h),1.36
–
1.30(m,6h),1.29
–
1.18(m,3h)。
nmr(400mhz,氧化氘)δ8.09
–
7.95(m,1h),7.89
–
7.76(m,1h)4.59
–
4.41(m,2h),4.04
–
3.12(m,16h),2.55
–
1.99(m,4h)。
[0311]-产物2.61的合成
[0312]
与一般操作步骤6类似地制备中间体2.61a。收率＝27％；m＝362mg；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.59(s,2h),4.51(td,j＝6.6,1.1hz,2h),4.13(qd,j＝7.1,1.2hz,2h),2.36
–
2.26(m,4h),1.24(td,j＝7.1,1.1hz,3h)。
[0313]
与一般操作步骤4类似地制备中间体2.61b。收率＝定量；m＝350mg；1h nmr(400mhz,meod)δ7.54(s,2h),4.42
–
4.34(m,2h),2.16
–
2.00(m,4h)。
[0314]
与一般操作步骤1类似地制备产物2.61。收率＝41％；m＝29mg；1h nmr(400mhz,氧化氘)δ7.84
–
7.67(m,2h),4.60
–
4.39(m,2h),4.08
–
3.12(m,16h),2.57
–
1.99(m,4h)。
[0315]
实施例3.化合物2.19至2.26
[0316]
转染活性的筛选
[0317]
对化合物2.19至2.26将dna转染到以下四种不同细胞系中的能力进行了评价：caco-2(人结肠上皮细胞)、hep g2(人肝癌细胞)、mdck(madin-darby犬肾上皮细胞)和mcf-10a(人乳腺上皮细胞)。通过转染200ng与0.6μl或0.8μl的一种本发明化合物(即一种选自化合物2.19至2.26的化合物)复合的pcmv-egfpluc dna(clontech)(在7.5mm氮浓度下)来在96孔板中进行化合物的筛选(图2)，从而分别定义1μg dna/3μl化合物的比例(比例1:3)或1μg dna/4μl化合物的比例(比例1:4)。转染后一天通过细胞计数测定来确定表达gfp的细胞的百分比(％gfp)。用作为对照进行转染，所述对照是22kda的线性聚乙烯亚胺并且代表所测试化合物的亲本阳离子聚合物主链。
[0318]
化合物2.19至2.26代表聚合物，其中三唑环用于接枝氟苄基或羟基苯酚(或4-羟基苯乙基)部分并且其中阳离子聚合物接枝到式(iii)的r或v上。所有化合物都表现出显著的转染活性，然而最佳化合物依赖于所使用的细胞系。
[0319]
实施例4.用化合物2.22、2.23、2.41、2.42、2.43、2.46和2.47生物产生重组病毒。
[0320]
dna转染是通过瞬时基因表达(tge)过程生物产生重组蛋白和病毒的主要使用技术之一。关于aav和慢病毒的产生，最常用的方法是用于将病毒性和治疗性基因递送进生产者细胞系(producer cell line)(hek293粘附或悬浮细胞)中的转染。在大多数系统中，许多质粒的共转染是通过化学方法进行的，如与磷酸钙共沉淀或通过阳离子聚合物聚乙烯亚胺(pei)介导的转染，如商业上推荐用于重组病毒的此种生物产生的(polyplus-transfection)。
[0321]
aav和慢病毒颗粒是通过若干质粒的瞬时共转染从hek-293t细胞产生的，所述质粒含有感兴趣的基因和必要的病毒组分以产生完整的重组病毒粒子。表达gfp报告基因的aav-2和慢病毒载体是用各种化合物产生的，并且病毒产生率是通过转染后3天对转导单位(tu/ml)进行评估来确定的。将产生率水平与使用广泛用于粘附和悬浮病毒产生系统中的转染试剂获得的产生率水平进行比较。
[0322]
对实施例3的许多化合物以及其他化合物的aav-2产生进行测试，在所述其他化合
物中，三唑环通过苄基(2.41或2.42)或吡啶基(2.43至2.46)部分接枝，并且阳离子聚合物与式(iii)的位置z1中的三唑环连接。图3呈现了一些获得的结果。在用于转染的比例为1:2(每μl化合物1μg总dna)时，一些化合物在病毒产生率方面的表现与相似，但这些化合物中的大多数使病毒滴度显著提高了3至8倍。大多数化合物都证实了这种改进，并且通过使用1:3的比例来增强，其中对于化合物2.43，病毒滴度的最高增加超过10倍。
[0323]
相似地，在4种质粒(prsv-rev包装载体、pcgpv包装载体、pcmv-vsv-g囊膜载体和plenti6.3/v5-gw/emgfp表达控制载体)的共转染之后，在悬浮hek-293t细胞中产生了慢病毒。转染后72小时测定慢病毒滴度(tu/ml)(图4)。通过以1:3的比例使用化合物2.22，与使用的产生率相比，lv产生率提高了约10倍。
[0324]
实施例5.化合物2.53至2.61
[0325]
转染活性的筛选
[0326]
通过转染200ng与0.6μl或0.8μl的一种本发明化合物复合的pcmv-egfpluc dna(clontech)(在7.5mm氮浓度下)，在96孔板中在与如先前对实施例3的化合物所描述的相似的转染中筛选化合物2.53至2.61(图6)，从而分别定义了1μg dna/3μl化合物的比例或1μg dna/4μl化合物的比例。
[0327]
化合物2.53至2.61代表具有三唑环的化合物，其中阳离子聚合物连接在式(iii)的z1处，并且其中各种烷基或环部分添加在式(iii)的位置r或v上。图6示出在三唑环上的位置r或v处接枝烷基或环烷基部分提供了有效的转染化合物，如通过化合物2.54、2.56、2.58或2.57所例示的。令人惊讶地，在式(iii)的r和v位上具有未取代的三唑环的化合物2.60和2.61不能有效地转染hep g2细胞。
[0328]
重组病毒的生物产生
[0329]
对化合物2.53至2.61的aav-2产生进行了测试，并且图7呈现了化合物以比例1:2μg dna/μl试剂获得的结果。转染后72小时测定aav滴度(转导单位，tu/ml)。结果被表达为相对aav-2转导单位/ml(tu/ml)。
[0330]
化合物2.22用作阳性对照。化合物2.54和2.57表现出有希望的结果，并且与图6中所呈现的转染活性相关。与在hep g2细胞中转染的实验相反，其中r和v＝h的化合物2.60和2.61在hek-293t细胞中表现出高水平的aav-2产生率。
[0331]
实施例6.从悬浮hek-293t细胞产生aav-2的关键参数。
[0332]
重组病毒的产生是通过hek293细胞中许多质粒的共转染来实现的。病毒产生率受质粒总量和转染试剂体积的影响很大。图8展示了使用化合物2.22(在15mm氮浓度下配制)的aav-2产生。使用不同量的质粒来转染悬浮的hek293-t细胞。还对转染试剂的许多比例进行了测试，并且被表达为转染当天每百万个细胞中的μg dna/μl试剂。结果表明，病毒产生率取决于转染的质粒的量。此外，对于转染的每个dna量，最佳产生率取决于μg dna/μl试剂的比例。此实施例展示了可以容易地调整使用式(iii)的化合物的转染条件以获得最佳的病毒产生率。图9呈现了dna与化合物2.22复合的时间对从悬浮hek-293t细胞产生aav-2的影响。在将转染复合物添加到细胞培养物中之前，需要最短15分钟的dna复合时间，以获得高产率的病毒产生。可以使用超过15分钟的更长的dna复合时间而不会影响病毒产率，这表明转染复合物在病毒产生活动中具有良好的稳定性。这种特性表明，化合物2.22特别适用于生物反应器中的大规模应用，其中需要根据细胞培养物体积来调整转染复合物混合物转
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