新型神经元标记技术

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及神经元标记技术。


背景技术：

2.哺乳动物的大脑是一个复杂的器官，包含数十亿个神经元。这些神经元形成各种神经回路，控制感知、认知、情感和行为。发展体内神经元标记和成像技术对于研究神经回路的结构和功能至关重要，可以提供体外方法无法提供的真实生理信息。
3.目前拥有的神经元标记技术大多为带有荧光的光学标记技术，通过在神经元内表达荧光蛋白我们可以看到神经元的结构和对特定的神经元进行标记。但是由于光的穿透能力差，在目前的全脑成像技术(双光子，三光子等)中无法实现深部组织的光学成像(大脑皮层以下无法进行活体光学成像)(kim et al.，2012；liu et al.，2020)。而mri成像具有极高的深度穿透性和较好的分辨率，可以实现深度和较高分辨率的全脑成像。目前已经有一些利用mri成像技术标记神经元来进行神经环路示踪的技术，例如锰增强mri(memri)技术，通过使用活性锰造影剂，使神经元在t1w中产生高信号。活性锰造影剂(mncl2)可以通过电压门控ga2 通道进入神经元，并沿着轴突顺行转运，memri已经用于视觉，疼痛等感觉神经环路的追踪，该方法被用于探索神经元的功能联系。然而，mn2 具有毒性，这会带来安全问题，且它在大脑中的运输是非特异性的，这使得其很难进行准确的神经元标记，也无法针对特定的神经回路，因此memri的使用范围有限(deng et al.，2019)。还有一种技术是通过使用铁蛋白来进行神经元标记，铁离子具有顺磁性，铁蛋白与铁结合后具有良好的顺磁效应，在 t2w或t2
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上呈现低信号，而且铁蛋白被认为是用于检测基因表达的mri 报告蛋白。目前有通过嗜神经病毒将铁蛋白基因传递到神经元中，使得神经元可以表达大量铁蛋白，再通过聚集内源性铁离子，使得神经元在t2w 上显示低信号，达到标记相应环路中的神经元的目的。由于成像对比度依赖于不同组织区域内内源性铁离子的富集，铁蛋白也需要一定的时间来补充铁离子，这增加了mri信号的复杂性，并导致成像对比度不够理想(caiet al.，2021；zheng et al.，2019)。


技术实现要素：

4.为了在mri成像中相比于铁蛋白有更好的神经元标记后成像的图像效果，且不依赖于内源性物质对成像效果的限制，还相比于memri可以感染特异性神经元，我们研究了利用嗜神经病毒(raav2-retro)(可商购，例如购自武汉枢密公司(brain vta))传递oatp1a1蛋白基因，并在神经元膜中表达oatp1a1蛋白，再通过gd-eob-dtpa的注射，被病毒感染的神经元会通过oatp1a1蛋白摄取gd-eob-dtpa，进而在t1w图像中会出现高信号，而未被病毒感染的神经元则不出现gd-eob-dtpa的摄取现象，在t1w图像中不会出现高信号。我们进一步采用了一种基于动态对比度增强(dce)的方法来提供整个大脑中标记神经元的定量信息。利用此技术实验已经测试了可以进行神经元的标记及相应环路的示踪。
5.在现有技术中，在对小鼠行为学研究中，人们利用c-fos蛋白在神经元中的表达作
为行为中神经元激活的标志，针对此性质人们做了fostrap 系统(c-fos-cre-ert鼠及其stop系统)，可以对在注射塔莫昔芬期间进行的行为学所激活的神经元进行荧光标记。但此方法的缺陷在于，对于全脑组织的观察只能通过将小鼠处死的方式进行，而根据本发明的技术，构建了表达optp1a1蛋白的新的小鼠品系r26-e(cag-lsl-oatp1a1
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p2a-egfp-wpre-polya)1，而后再进行gd-eob-dtpa的鞘内注射进行 t1w成像，可以实现对在注射塔莫昔芬期间进行的行为学所激活的神经元进行标记并进行成像。
6.在以往研究中，人们希望将体内各种有用的相关蛋白在神经元上进行应用，但在实际操作中均难以实现。原因在于，正如我们所知道的那样细胞中基因的选择性表达，每种蛋白只能特异性出现在特殊的细胞中，从而使得每种细胞拥有其独特的功能。将蛋白转移到神经元中要考虑到此蛋白基因能否在组织细胞中进行表达，表达了蛋白之后蛋白质能否在新的细胞中进行折叠，大多数情况下，往往蛋白质要想折叠成有功能的蛋白质需要分子伴侣的存在，oatp1a1蛋白为膜蛋白，有研究报道oatp1a1蛋白定位在细胞膜中需要pdzk1蛋白的协助，因此尽管蛋白表达，但是空间的正确折叠以及蛋白质定位在正确的亚细胞结构中都是研究的巨大问题。而往往这些条件满足，蛋白质能否发挥相应的功能也不得而知，因为机体是复杂的，更是一个整体，脑组织结构复杂多样，蛋白质的过表达是否会导致神经类疾病的发生或者脑组织萎缩的发生在动物体内研究中都是需要考虑的重大问题。蛋白质翻译后修饰也是一个重大问题，神经类疾病中我们所熟知阿尔兹海默病的病因，tau蛋白磷酸化，tau蛋白的聚集已经证实与此类疾病相关。将某个蛋白从一个细胞中转移到神经元，使其有能翻译，正确折叠，正确修饰，正确定位，有正常功能都是困难的。并且，由于神经元细胞存在着血脑屏障，蛋白质很难进入到神经元细胞中进行表达。
7.综上，虽然本领域技术人员一直在尝试将各种相关蛋白应用于神经元，但是由于以上各种原因均难以实现。而本发明通过大量实验和创造性劳动，出乎意料地发现oatp1a1蛋白可成功表达于神经元细胞中，然后通过鞘内注射gd-eob-dtpa，可实现动物体内成像，且成像效果很好。
8.本发明与现有技术的最大区别在于通过病毒将oatp1a1蛋白运送到神经元的细胞膜中，并将gd-eob-dtpa通过oatp1a1蛋白运送到神经元内部，由此可以达到仅病毒感染的神经元可以表达oatp1a1，而注射的gd-eob-dtpa会被摄取到仅被病毒感染表达oatp1a1蛋白的神经元， gd-eob-dtpa在t1成像中显示高信号，因此被病毒感染的神经元由于胞内包含gd-eob-dtpa，在t1w图像中这些神经元会在图像中亮起来。用此技术达到特异性病毒感染神经元后，可对小鼠进行全脑图像采集，而不是如传统荧光(如切片，透明脑)一样必须将小鼠处死后进行标记神经元的图像采集。
9.具体地，本发明描述了一种利用mri对神经元进行标记和量化的新策略。为了验证这种新方法的能力，本发明使用嗜神经病毒将oatp1a1基因传递到靶神经回路。oatp1a1蛋白表达于神经细胞膜，可增加特异性磁共振造影剂(gd-eob-dtpa)的摄取。用t1加权图像观察，标记神经元在mri上“亮起来”。本发明进一步使用基于动态对比度增强的方法来获得提供标记神经元的定量信息的措施。
10.具体地，本发明提供了以下实施方案：
11.1、oatp1a1基因或optp1a1蛋白在制备用于标记神经元的组合物或试剂盒中的用途。
12.2、根据项目1所述的用途，其中，优选通过嗜神经病毒(例如 raav2-retro病毒)在神经元细胞中引入并表达oatp1a1基因。
13.3、根据项目1所述的用途，其中，所述组合物或试剂盒还包括特异性磁共振造影剂(例如gd-eob-dtpa)。
14.4、oatp1a1基因或optp1a1蛋白在神经元示踪和/或监测神经元细胞活动中的应用。
15.5、根据项目4所述的应用，其中，优选通过嗜神经病毒(例如 raav2-retro病毒)在神经元细胞中引入并表达oatp1a1基因。
16.6、根据项目1-3任一项的用途或项目4-5任一项的应用，其中，将所述oatp1a1基因引入哺乳动物的神经元。
17.7、根据项目6所述的用途或应用，其中所述哺乳动物为啮齿动物(例如小鼠、大鼠)，或猴。
18.8、转基因小鼠的制备方法，其包括在小鼠中引入并表达oatp1a1基因。
19.9、根据项目8所述的制备方法，其中所述小鼠为c57bl/6j小鼠。
20.10、根据项目8-9所述的制备方法获得的转基因小鼠在探索神经元功能和/或监测神经元细胞活动中的用途。
21.在本发明的具体实施方案中，ssp是指初级体感皮层(primarysomatosensory cortex)，sss是指次级体感皮层(secondary somatosensorycortex)，mop是指初级运动区域(primary motor area)，mos是指次级运动区域(secondary motor area)，rt是指网状核(reticular nucleus)，vis是指视区(visual area)，po是指丘脑后核组(posterior thalamic nuclear group)，epv 是指内梨状核，腹侧部分(endopiriform nucleus，ventral part)。
22.在本发明的具体实施方案中，所述oatp1a1蛋白的氨基酸序列如 seq id no：5所示，所述oatp1a1基因的核苷酸序列如seq id no：6所示。
23.技术效果：
24.本发明提出了一种新的神经元标记、成像和量化策略。具体地，本发明使用嗜神经病毒将报告基因oatp1a1送入靶向神经回路，并展示了其标记和成像神经元的能力，这为获得靶向神经回路中标记神经元的全脑映射提供了一种有效的方法。结果表明，oatp1a1可以作为一个有效的报告基因，它可以用于观察神经元，可能会对结构和功能神经科学的研究产生潜在的帮助，并有望在基础神经科学和慢性神经系统疾病的研究中有各种应用前景。并且，本发明的方法还可以提供神经元标记的定量分析。
25.通过oatp1a1蛋白摄取药物gd-eob-dtpa，可以不用借助脑组织中内在的物质，例如现有技术中的铁蛋白技术需要借助组织内源性铁离子的富集，而内源性铁离子富集需要一定的时间，且富集铁离子的程度也会影响其在t2中的成像效果(zheng et al.，2019)。且在实验中，本发明所述技术的成像效果好于铁蛋白在t2中的图像效果，标记神经元的信号与周围未标记区域的脑组织信号值对比明显。并且，本发明所述的技术相比于 memri在基因可操作空间中有着极大的应用潜力，现有技术中人们已经利用cre系统和荧光蛋白结合嗜神经病毒进行特异性神经元的标记及这些神经元所参与的环路的结构和功能解析(huang et al.，2019；xu et al.，2020)。在本发明中，将传统的荧光蛋白基因换成oatp1a1
蛋白基因从而达到相同的特定神经元标记效果，并且还可以实现空间深度高分辨率的小鼠脑成像。利用本发明的神经元标记技术可以进行神经环路示踪，且神经环路示踪效果已经在本次实验验证中已经阐明。由实验结果可以看出在挑选的体感环路示踪中，在图像中标记的环路中的神经元与未进行标记的神经元有着明显强烈的对比。进一步地，在探索神经元功能上通过构建含有oatp1a1基因的新的小鼠品系r26-e(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya)1 获得活跃神经元的标记效果，实现了在塔莫昔芬作用的一段时间中进行的特殊行为活动所激活神经元的标记，并可在注射gd-eob-dtpa后一段时间进行成像，而不像传统那样只有将鼠处死后才能进行观察(guenthner etal.，2013)。
附图说明
26.图1a-b显示了改造前后病毒质粒图谱，其中
27.图1a)显示了改造前raav2-retro-egfp病毒基因组的质粒 raav-ef1a-egfp-wpre-hgh poly a的图谱。
28.图1b)显示了将病毒基因组质粒改造后的病毒基因组质粒 raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre的图谱，其将oatp1a1基因与egfp 相连，利用p2a进行蛋白断裂，使得oatp1a1与egfp形成非融合蛋白。
29.图2a-f显示了对已知神经环路(ssp/sss
→
po)的神经追踪的离体验证和证明oatp1a1蛋白的表达及其在神经元膜中的定位。其中，
30.图2a)raav2-retro-ef1α-oatp1a1-p2a-egfp(上)和raav2-retro-ef1 α-egfp(下)重组载体的病毒基因组的示意图。
31.图2b)当raav2-retro被注入po时，病毒会逆向感染ssp和sss(即神经元轴突在po区域，胞体在ssp-sss区域，病毒通过神经元轴突逆向运送到神经元胞体)。
32.图2c)感染两种病毒的脑切片的荧光图像。箭头表示包含投射到po 的神经元的ssp和sss(即初级体感皮层和次级体感皮层区域)区域。egfp (上)和oatp1a1-egfp(下)标记的脑切片取自相似的水平。图中比例尺代表500um。
33.图2d)通过脑组织切片中的免疫荧光染色检测脑组织中oatp1a1的表达和与egfp的共定位。左边示意图代表共聚焦拍摄时拍摄的脑切片的位置，右边为拍摄的神经元的荧光图，按照顺序分别是egfp，a594(免疫荧光染色oatp1a1蛋白)，dapi(荧光染色dna)，三幅图的merge 图像，代表了egfp，a594(即oatp1a1蛋白)，dapi(即dna细胞核) 三者的共定位现象。图片中的比例尺代表50um。
34.图2e)通过同源重组的方式将病毒基因序列的oatp1a1蛋白基因与质粒骨架上的mcherry基因进行相连，使得可以形成带有mcherry荧光蛋白基因的oatp1a1蛋白，从而看出在细胞层面中对oatp1a1蛋白在神经元中的亚细胞结构中的定位。
35.图2f)在sh-sy5y细胞中由箭头所指区域可以看出，在荧光显微镜和微分干涉的拍摄下可以看到红色荧光聚集在细胞膜中，由此我们可以看到 oatp1a1蛋白在神经元细胞中定位在细胞膜上。
36.图3a-f显示了gd-eob-dtpa在脑组织中的扩散和代谢。其中，
37.图3a)在14t中采集正常小鼠鞘内注射gd-eob-dtpa后不同时期的t1w和t2w图像。所有图像均进行了配准，并取自同一层面。显示了 gd-eob-dtpa从颅骨下部向大脑上部扩
散，并在gd-eob-dtpa注射一周后消失。
38.图3b)在3t中采集对于左脑po区域感染病毒 (raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa)21天后的小鼠，在鞘内注射 gd-eob-dtpa前和后的一段时间中gd-eob-dtpa药物在脑组织中各个区域的代谢情况。从图中可以看出仅被病毒感染区域的神经元出现了代谢延迟，即未表达oatp1al蛋白区域的脑组织在注射gd-eob-dtpa一天后药物便代谢完毕，而表达oatp1a1蛋白区域的神经元则因为神经元对 gd-eob-dtpa的摄取，在一天后与周围组织信号形成巨大的对比差异。即一天后为信号差异对比最大时间点，为观察的最佳时间。
39.图3c)在14t中也有着和上述3t一样的结果，且由于14t分辨率相较于3t较高，图中箭头标示出lp和s2区域的信号随时间的变化情况。
40.图3d)显示了对于图3b中分别取左右脑的丘脑区域(图3b中重叠到图像中的画圈区域)为roi进行统计在各个时间点中药物 gd-eob-dtpa的代谢情况。下面一条曲线为对照脑区(图3b左圆圈)随时间变化gd-eob-dtpa的代谢曲线图，上面一条曲线为oatp1a1蛋白表达脑区(图3b右圆圈)药物gd-eob-dtpa随时间变化的代谢曲线图，从图中可以看出药物gd-eob-dtpa被表达oatp1a1蛋白的神经元摄取，并在一天后与对照脑组织有着最大的信号差别。
41.图3e)显示了以图3c中图像虚线的最左端的像素点的信号值为原点，描绘出不同时间段同一层面同一行像素点数值的变化，图中5条曲线分别代表图3c中5个关键的时间点。图中峰值最上端为一天后的信号值，峰值下端的一条线为注射后2小时的信号值，由lp和s2可以看出在一天后时间点中左右两边信号差异最大。
42.图3f)mri数据采集后，将小鼠大脑切片进行荧光观察。结果表明，与gd-eob-dtpa共定位的标记神经元的荧光在t1w上诱导高信号(如箭头所示)。
43.图4a-b显示了在14t收集的高分辨率t1w和t2w图像中来评估脑实质完整性。所有图像均已配准。其中，
44.图4a)感染病毒(raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa)后21 天，进行鞘内注射gd-eob-dtpa后一天，同一只小鼠的不同层面中的t1w 和对应t2w图像，图示箭头位置为病毒感染区域，对这些区域进行t1w 和t2w图像对比，除了针道部位损伤呈现低信号之外，其余位置仅 gd-eob-dtpa富集区域呈现低信号。
45.图4b)上述同一只小鼠在不同时间点同一注射层面的图像可以看出随着gd-eob-dtpa的代谢及其在脑组织中的浓度降低，由箭头所指的 gd-eob-dtpa富集部位在t2w中的低信号在减少。在一周后 gd-eob-dtpa代谢完毕恢复基态时t2w中的低信号消失。因此除注射针道损伤外，其余t2w中的低信号是由于gd-eob-dtpa的富集而出现的，而非组织病变。由于t2w中可以反映组织的病变，而在gd-eob-dtpa 注射前后，除了打病毒时针道的伤口，小鼠脑组织无任何病变及损伤。
46.图5a-e显示了mri和荧光结果之间的比较。其中，
47.图5a)在14t时从两只感染了两种病毒的小鼠身上采集的t1w图像 (上图：raav2-retro-oatp1a1-p2a-egfp；下图：raav2-retro-egfp)，在五个关键时间点收集的图像。图中箭头表示病毒感染区域。上图感染raav2-retro-oatpla1-p2a-egfp病毒小鼠脑区出现gd-eob-dtpa的神经元摄取现象，下图感染raav2-retro-egfp病毒小鼠脑区未出现 gd-eob-dtpa摄取现象。
48.图5b)mri图像与荧光图像进行比较，所有图像都是从图5a)中使用的相同小鼠收集的。箭头表示具有高信号的注射部位和皮质区域(病毒感染区域)。
49.图5c)病毒注射示意图，其中，左脑注射200nl raav2-retro-egfp，右脑注射200nl raav2-retro-oatp1a1-p2a-egfp。
50.图5d)将本发明的mri图像与其相对应小鼠上的荧光图像进行比较。箭头分别表示两种病毒的注射部位(right：raav2-retro-oatp1a1-p2a-egfp； left：raav2-retro-egfp)。其中，在right部位，由于oatp1a1蛋白摄取 gd-eob-dtpa其在mri中皮层(箭头所指)处出现高信号，而在left 处由于被对照病毒感染神经元不表达oatp1a1蛋白，因此无 gd-eob-dtpa摄取现象的发生。
51.图5e)在鞘内注射gd-eob-dtpa后4个时间点获得的正常小鼠(未感染病毒)和用改造前egfp病毒感染的小鼠的t1w图像。两种情况在注射后一天都没有摄取gd-eob-dtpa，并且注射后一周获得的所有图像都返回到基线。
52.图6a-b显示了t1w信号的区域比较。t1w图像被配准到 tmbta-brain-template并从tmbta-brain-atlas获得roi。其中，
53.图6a)t1w图像配准到tmbta-brain-template上。 tmbta-brain-atlas的roi(ssp、sss、mop、mos、rt、vis、po、epv) 在图像上重叠。
54.图6b)比较6个roi的左侧和对侧区域之间的t1w信号强度。比较的p值显示在每个图的上方。(p＜0.01：**；0.01＜p＜0.05：*；n＝5)。
55.图7使用tofts模型对标记的神经元进行定量评估。图7a)在1397 分钟获取的t1w图像。位于有(右边)和没有(左边)投影的区域中的两个像素的拟合曲线显示在图7b)中。csf(脑脊液，cerebro-spinal fluid) (cc)中gd浓度曲线用黑色标记。拟合参数k和vt分别显示在图7c)和图 7d)中。
56.图8显示了转基因小鼠r26-e(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp
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wpre-polya)1的系统设计策略示意图。
具体实施方式
57.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
58.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
59.实施例1：
60.体外实验
61.材料和方法
62.1、动物准备
63.本研究动物均按照中国科学技术大学动物伦理委员会批准的方案 (syxk2017-005)进行处理。雄性c57bl/6j小鼠(6-8周龄)购自spf(北京) 生物技术有限公司。所有的动物都被饲养在一个12小时/12小时的明暗循环的房间里，在合适的温度下，足够的食物和水可以自由取用。
64.2、病毒构建
65.raav2-retro是一种可以逆向感染神经元的病毒，在ncbi的核酸数据库中查找oatp1a1蛋白的基因序列(nm_013797.5)，将oatp1a1蛋白基因插入病毒基因组中，获得重组病毒 raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa，使得该重组病毒在感染神经元时可以在被感染的神经元中表达oatp1a1蛋白。(其中，重组病毒 raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa的图谱参见图1b，其制作由武汉枢密科技公司完成)。
66.3、病毒注射
67.术前，将实验小鼠固定在立体定位装置(rwd，深圳，中国)中，给予氯胺酮以减轻疼痛。手术期间，小鼠使用麻醉机(rwd，深圳，中国)用异氟烷气体麻醉，用加热垫维持小鼠体温。微量注射器连接玻璃微电极，将病毒立体定位注射到左脑丘脑后核组(po)区域：背腹侧(dv)3.15mm、前后侧(ap)2.03mm、中外侧(ml)1.30mm。注射步骤2构建的重组病毒作为实验组以及改造前的病毒作为对照组，其总量控制在200-300nl之间，注射速度设置为30nl/min。注射后，玻璃微电极在注射部位放置5分钟后取出。手术后缝合手术部位周围皮肤并消毒。实验结束时，停止气体麻醉，将实验小鼠放回笼子。
68.4、荧光成像和免疫荧光
69.将感染病毒超过21天的小鼠用于离体实验。用异氟烷麻醉小鼠，用 pbs和4％pfa灌注心脏，取出大脑并在4％pfa中浸泡一夜。之后，大脑用蔗糖溶液脱水。先用20％蔗糖溶液脱水沉降，再用30％蔗糖溶液脱水沉降。使用冷冻切片机(leica，cm1950)和oct(optimal cuttingtemperature compound)对脱水的大脑进行冠状切片。对于荧光成像，切片厚度为40um，对于免疫荧光，切片厚度为30um。脑切片储存在防冻液 (30％乙二醇、20％甘油、50％pbs)中。
70.对于荧光成像，在24孔板中用pbs(3次，每次5分钟)清洗脑切片，然后在载玻片上展平。最后，用抗荧光猝灭剂(cc/mounttm sigma) 和盖玻片固定脑切片。对于免疫荧光，切片在24孔板中用pbs(3次，每次5分钟)洗涤，然后使用用于免疫染色的封闭缓冲液(proteintech目录号pr30008，室温，振荡器封闭，1小时)封闭。切片与一抗(抗-slco1a1 多克隆抗体，1∶300，rabbit，bioss)在4℃孵育过夜。之后，切片用pbst清洗(3次，每次5分钟)并与二抗(cl594-偶联山羊抗兔igg(h l)， 1∶500，山羊，proteintech，室温，1小时，避光)一起进行孵育。洗片(pbst， 3次，每次5分钟)后，在黑暗环境中用dapi(美伦生物ma0128)染色 dna 10分钟。然后将切片用pbs洗涤(2次，每次5分钟)并逐滴加入抗荧光猝灭剂以固定切片。nikon ti2-e共聚焦显微镜、fv-3000共聚焦显微镜和slideview vs200用于切片的荧光成像。
71.5、质粒构建
72.同时，本发明还对oatp1a1蛋白在神经元细胞中的表达情况进行了体外细胞实验，其将包含oatp1a1基因的重组质粒转染到神经元细胞中。其中，所述重组质粒的构建如下：
73.pcdna3.1是带有mcherry荧光蛋白的载体骨架(由中国科技大学仓春蕾老师惠赠，或者可购自赛默飞，v87020)。从步骤2构建的病毒质粒(raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa)中扩增出oatp1a1基因。并通过同源重组将全长的oatp1a1基因克隆到pcdna3.1载体骨架中。首先，正向和反向引物从general biol公司根据图谱进行合成。
74.oatp1a1-mcherry的正向引物：
75.gaaaactaagctgtgagaattctgcagatatccagcac(seq id no：1)；
76.oatp1a1-mcherry的反向引物：
77.tcctctgtttcttccatggatcccttgtac agctcgtcc(seq idno：2)。
78.oatp1a1的正向引物：
79.atggaagaaacagagaaaaagg(seq id no：3)；
80.oatp1a1的反向引物：
81.tcacagcttagttttcagttctc(seq id no：4)。
82.50ul pcr体系如下：98℃5min；98℃30s、58℃30s、72℃2min30s 35个循环；72℃20min。pcr后，我们进行dna凝胶电泳和凝胶回收以回收目标片段。其次，使用clonexpress multis一步克隆试剂盒(vazyme) 用于同源重组(反应体系：5x ce multis buffer＝2ul，exnase multis＝1ul， oatp1a1片段的pcr产物，pcdna3.1-oatpla1-mcherry载体骨架与同源臂，和ddh2o＝7ul)。离心后将反应体系置于pcr中(37℃30min)。第三，将构建好的质粒pcdna3.1-oatp1a1-mcherry(10ul)转移到dh5α感受态细胞(擎科生物)中。然后将dh5α在冰上孵育20-25分钟以进行质粒富集，然后在42℃水浴中加热1分钟30秒。之后，向dh5α感受态细胞中加入 1ml lb培养基，全部置于37℃摇床中1h。离心后，将菌液涂于耐氨苄青霉素lb培养基(1∶1000)中，37℃培养箱中孵育过夜。挑选并培养单克隆菌，送至公司(general biol)进行测序。序列比对后，提取质粒用于细胞实验(质粒提取试剂盒axygen)。
83.6、细胞实验
84.使用jetprime转染试剂(polyplus)用2μg步骤5所构建的质粒的oatp1a1-mcherry的cdna转染sh-sy5y细胞(由中国科技大学仓春蕾老师惠赠，或者可购自欣润生物公司，ch1030)24小时，然后接种到涂有聚l-赖氨酸的玻璃底培养皿上。使用由eclipse ti倒置显微镜 (nikon)、csu-x1旋转磁盘单元(yokogawa)、du-897u emccd相机 (andor)、激光控制模块(andor)和带有100倍油浸镜头的iq3成像软件 (andor)进行成像。
85.实验结果
86.通过离体荧光成像验证ssp/sss投射到po
87.在本实施例中，使用了两种病毒，一种是实验组病毒(raav2-retro-ef1 α-oatp1a1-p2a-egfp)，它在受感染的神经元中同时表达oatp1a1和 egfp。另一种是对照组病毒(raav2-retro-ef1d-egfp)，它只表达egfp。两种病毒的载体结构如图2a所示，重组病毒基因组质粒图和病毒基因组质粒图谱如图1a和1b所示。将病毒注入后丘脑核组(po)区域，如图2b 所示。po是体感信息处理的重要丘脑核。皮质中的初级体感皮层(ssp)和次级体感皮层(sss)区域都有投射到po区域的神经元。病毒注射后21天，用荧光成像检查脑切片。在共聚焦拼图拍摄后，图2c显示了相似层面的脑切片。两组的荧光结果表明，po区域接受来自皮质中ssp和sss区域的投影(图2c)，这与之前文献中的报道一致。通过荧光图像，我们可以看到oatp1a1蛋白在神经元中表达并与egfp共定位(图2d)，即 oatp1a1蛋白可通过实验组重组病毒传递到神经元中并表达。三个荧光通道的共定位展示在图2d中。
88.在本实施例的细胞实验中，oatp1a1蛋白是一种细胞膜蛋白。本发明人构建了融合蛋白oatp1a1-mcherry来确定这种蛋白在神经元细胞中的位置。构建的质粒如图2e所示(构建方法参见上述“材料和方法”的步骤5“质粒构建”)。将重组质粒转入sh-sy5y细胞，基因表达后形成 oatp1a1-mcherry融合蛋白(图2f)。使用荧光显微镜检查oatp1a1蛋白在神经元细胞内的定位。荧光成像和微分干涉成像结果支持oatp1a1蛋白位于神经元细胞膜上的结
论(图2f)。图2f中的箭头标记了重组质粒转染后mcherry的位置，表明oatp1a1蛋白主要分布在sh-sy5y细胞的细胞膜上。
89.实施例2：
90.体内实验
91.在此，以利用此技术对所有投射到后丘脑核组po区域的神经元进行标记为例，进行体内神经元标记实验，并采取如下做法。
92.1、动物准备
93.本研究动物均按照中国科学技术大学动物伦理委员会批准的方案 (syxk2017-005)进行处理。雄性c57bl/6j小鼠(6-8周龄)购自spf(北京) 生物技术有限公司。所有的动物都被饲养在一个12小时/12小时的明暗循环的房间里，在合适的温度下，足够的食物和水可以自由取用。
94.2、病毒构建
95.raav2-retro是一种可以逆向感染神经元的病毒，在ncbi的核酸数据库中查找oatp1a1蛋白的基因序列(nm_013797.5)，将oatp1a1蛋白基因插入病毒基因组中，获得重组病毒 raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa，使得该重组病毒在感染神经元时可以在被感染的神经元中表达oatp1a1蛋白。(其中，重组病毒 raav-ef1a-oatp1al-p2a-egfp-wpre-pa的图谱参见图1b其制作由武汉枢密科技公司完成)
96.3、病毒注射
97.术前，将实验小鼠固定在立体定位装置(rwd，深圳，中国)中，给予氯胺酮以减轻疼痛。手术期间，小鼠使用麻醉机(rwd，深圳，中国)用异氟烷气体麻醉。用加热垫维持小鼠体温。微注射器连接玻璃微电极，将病毒立体定位注射到左脑丘脑后核组(po)区域：背腹侧(dv)3.15mm、前后侧 (ap)2.03mm、中外侧(ml)1.30mm。注射步骤2构建的重组病毒作为实验组以及改造前的病毒作为对照组，其总量控制在200-300nl之间，注射速度设置为30nl/min。注射后，玻璃微电极在注射部位放置5分钟后取出。手术后缝合手术部位周围皮肤并消毒。实验结束时，停止气体麻醉，将实验小鼠放回笼子。
98.4、mri体内实验
99.mri使用14t(bruker avance neo 600wb)扫描仪。先用1％～1.5％异氟烷和0.3～0.5l/min空气诱导麻醉小鼠，成像时用1％～ 1.5％异氟烷和0.3～0.4l/min空气维持麻醉。14t成像采用标准 bruker 2d t1-rare-inv-rec序列(ti＝1.05s；te＝5ms；tr＝3.8s； pixel size＝78.1
×
78.1μm2；slice thickness＝0.5mm；scan time＝12 min)获取t1w图像，采用标准2d t2-turborare序列(机器自带序列)(te＝2.8ms；tr＝2.8s；pixel size＝58.6
×
58.6μm2；slice thickness＝0.5mm；scan time＝9min)获取t2w图像。病毒感染小鼠21天后，将 gd-eob-dtpa(5ul-8ul，bayer)经鞘内注射入小鼠脊髓，收集 gd-eob-dtpa注射前后的mri图像。鞘内注射gd-eob-dtpa后，将针(0.5ml，29g x1/2，kruuse)于注射位置停留5分钟。在 gd-eob-dtpa注射前，分别采集一个t1 w和t2w图像，在 gd-eob-dtpa注射后，采集注射后一天的t1 w和t2w图像。
100.5、数据分析
101.使用matlab(r2021a)对mri图像进行分析。在fsl中使用flirt (oxford，uk)对t1w和t2w图像进行配准。由于fsl是为人类mri图像处理而设计的，因此在配准前收集到的所有
小鼠图像的分辨率都提高了10 倍。在mri图像上绘制感兴趣区域(roi)，并计算每个感兴趣区域内的统计数据(均值、中位数和标准变异)。使用仿射配准，mri图像也被匹配到一个小鼠大脑图谱(一个公共的小鼠大脑模板tmbta数据库)。通过将 t1w和t2w图像与小鼠脑图谱进行匹配，我们选取目标roi，其中包括 po、rt、ssp、sss、mos、mop、vis和epv。利用matlab的anova 检验计算各个roi左右脑内的p值。其中，epv为对照区域，其无明显向 po区域投射的神经元(p＞0.05)，其余区域为投射到po区域中被标记的神经元所在的脑区(p＜0.01：**；0.01＜p＜0.05：*；n＝5)。
102.6、定量分析
103.t1_rare_inv_rec序列(机器自带序列)用于在14t扫描仪(brukeravance neo 600wb)上获取t1w图像。近似的mr信号强度s由下式给出。
104.s＝s0·
[1-2exp(-r1·
ti) exp(-r1·
tr)]
·
exp(-r2·
te)#(1)
[0105]
其中s0是与自旋密度成比例的比例因子。ti＝1.05s和tr＝3.8s 分别代表翻转恢复间隔和重复时间，r1和r2分别是纵向和横向弛豫速率常数。将第n个时间点(sn)的信号除以注入前的信号，自动消除s0 和r2。
[0106][0107]
应该注意的是，准确测定gd浓度(c)需要r1(＝1/t1)映射。这里我们假设r
10
＝1s-1
并且对于gd-eob-dtpa使用r1＝6.9s-1
mm-1
，c可以使用方程式确定(2)。
[0108]
gd-eob-dtpa从csf进入组织空间的流量由标准toffs模型确定。
[0109][0110]
其中c
t
和cc分别代表组织和脑脊液中的gd浓度。k是传递常数， v
t
是吸收gd-eob-dtpa的组织的体积分数。方程的解决方案如下所示。
[0111][0112]
在gd注射之前(t＝0min)和之后(分别为t＝114、258、1397和 9996min)的五个时间点获取图像。cc(t)是第四脑室内c值的平均值。定量参数k和v
t
可以通过将实验曲线拟合到方程式来确定(4)。
[0113]
7、r26-e(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya)1转基因小鼠品系构建及行为测试
[0114]
将重组病毒质粒raav-ef1a-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-pa中片段 oatp1a1-p2a-egfp利用pcr的方式进行pcr扩增片段。采用crispr/cas9 技术，通过同源重组的方式，在rosa26基因位点定点插入 cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya表达框。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和 grna(ggggacacactaagggagcttgg)；通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.3kb 5’同源臂、 cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya和3.3kb 3’同源臂。将cas9 mrna、grna和donor vector显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。pcr扩增及测序鉴定阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配获得阳性f1代小鼠。(此过程由上海南方模式生物公司完成)。
1.30、-2.03、
ꢀ‑
3.15)(图5c)。荧光和mri图像均显示神经元在两个半球从皮层到 po的投影(图5d)。表明了本发明的标记方法与荧光标记方法结果一致。
[0122]
4、使用体内mri对整个大脑中的标记神经元进行成像
[0123]
病毒注射后21天(200nl体积)，实验小鼠(n＝5)用gd-eob-dtpa 进行鞘内给药。所有mri图像均在gd-eob-dtpa注射后一天收集。 t1w图像被配准到tmbta-brain-template，并计算z值分数以标准化来自不同实验的信号强度。如图6a所示，ssp和sss区域显示出高信号，这与之前的报道一致，表明这些区域包含投射到po的神经元。在rt (网状核)、mos(次级运动区)、mop(初级运动区)和vis(视觉区) 也发现了高信号，所有这些都有投射到po的神经元。将这些大脑区域的信号与对侧区域进行了比较(图6b)，发现了显著差异(p值《0.05)。在对照epv(内梨状核，腹侧部分)中未发现显著差异，表明该区域没有投射到po区域的神经元(图6b)。表明了通过嗜神经病毒表达oatp1a1 蛋白进行神经元标记后，可解析神经元相应的环路结构。
[0124]
5、基于dce的分析可以对神经元标记进行量化
[0125]
toffs模型用于拟合gd浓度曲线以获得定量参数k和v
t
，如图7所示。与不包含标记神经元的区域相比，包含标记神经元的区域显示出显着更高的v
t
值，表明参数v
t
是神经元标记的有用生物标志物，定量地动态证明了包含oatp1a1蛋白的神经元可有效摄取gd-eob-dtpa。
[0126]
6、r26-(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya)转基因小鼠进行神经元活动功能检测
[0127]
嗜神经病毒进行神经元标记后，可解析相应的环路结构。在解析环路的基础上我们进一步利用此技术进行转基因鼠的制备来进行神经元功能的解析。转基因鼠r26-(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp-wpre-polya)制备如图8和实施例2的“7、r26-e(cag-lsl-oatp1a1-p2a-egfp
‑ꢀ
wpre-polya)1转基因小鼠构建及行为测试”部分中所示。在注射塔莫昔芬后，在药物时间窗口进行小鼠刺激，从而诱导此期间相应功能神经元的 c-fos表达，进而此神经元中与c-fos相连的cret2也进行表达，cret2 进入细胞核中切割loxp中的stop序列，启动目的蛋白oatp1a1蛋白的表达和egfp蛋白表达。由于oatp1a1蛋白定位于神经元膜中，在3天后可以进行鞘内注射gd-eob-dtpa，在第四天进行药物作用时间行为所激活神经元的t1w成像。由图像可以观察激活的功能神经元所在的脑区。由于不同行为的研究对于人类大脑疾病至关重要，比如某些区域大脑神经元活动受损导致抑郁症，因此本发明构建的转基因小鼠可用于探索神经元功能的基础研究。
[0128]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0129]
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