一种双金属共价有机框架材料及其电化学发光传感器和应用

1.本发明涉及功能复合材料的制备及应用技术领域，特别涉及一种双金属共价有机框架材料及其电化学发光传感器和检测microrna的应用。


背景技术：

2.microrna（mirna）是一种内源性表达的单链非蛋白编码rna，在细胞发育、分化、代谢和凋亡等多种生物过程中发挥着重要的调节作用。此外，一些研究人员最近在组织样本中发现了特定的mirna序列作为癌症生物标志物，并在血清中检测到与肿瘤相关的mirna。然而，由于mirna体积小、序列同源性高、丰度低、易降解等特点，对其准确、无误检测仍是一个挑战。因此，开发一种准确、灵敏、低成本的mirna定量方法对生物学研究和临床诊断具有重要意义。
3.近年来，cus纳米粒子、银离子纳米粒子和pt纳米粒子都被用来作为共反应加速器来构建ecl传感系统。特别是，在与s2o
82-反应过程中，由co
2
转化的co
3
可以重新转化为co
2
，因此含有co
2
的纳米材料可以促进更多so
4-•
自由基的产生，从而增强ecl信号。同时，获得的co
3
被h2o还原，生成大量的oh
•
，进而还原s2o
82-得到更多的so
4-•
，从而再次放大了ecl信号。然而，在这些ecl体系中，发射极与强氧化中间体so
4-•
之间的距离不够短，导致能量损失较大，限制了共反应促进剂对ecl体系的共反应加速效率。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种检测microrna的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架复合材料及其电化学发光传感器和应用。
5.本发明采用以下技术方案：一种用于检测microrna的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架，其特征在于，它的制备方法如下：（1）将多壁碳纳米管（mwcnts）、钴卟啉（cotapp）、锌卟啉（zntapp）、对苯二甲醛、1,3,5-三甲基苯、无水乙醇和乙酸（6 m）水溶液加入到耐玻璃管中。其中多壁碳纳米管（mwcnts）、钴卟啉（cotapp）、锌卟啉（zntapp）、对苯二甲醛的质量比为1：1.1-1.2：1.1-1.2：0.8-1.0，1,3,5-三甲基苯、无水乙醇和乙酸（6 m）水溶液体积比5：5：1，体积为50-60 ml，超声处理3 h后，将管抽真空至50 mtorr的内部压力并火焰密封，在110-130
ꢀ°
c下加热70-80 h；（2）用1,4-二氧六烷、四氢呋喃和丙酮洗涤产物。在50-70
ꢀ°
c的烘箱中干燥24 h后，得双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
6.一种用于检测microrna的电化学发光传感器，包括玻碳电极以及涂覆在玻碳电极上的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
7.所述用于检测microrna的电化学发光传感器制备方法如下：（1）对玻碳电极（gce）进行预处理。将4-6 μl的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架
复合材料滴在预处理过的抛光玻碳电极（gce）表面，室温下暗处干燥；（2）将9-11 μl戊二醛（2.5 wt %，ga）滴在电极表面孵育40-60 min。在此过程中，双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料通过经典的ga偶联反应进行改性。将改性后的抛光玻碳电极(gce)置于3-5
ꢀ°
c浓度为2 μm的h1溶液（10 μl）中孵育11-13 h，用超纯水轻轻洗涤以去除未结合的h1；（3）洗涤后，用9-11 μl 2 mm 6-巯基己醇（mch）去除非特异性活性位点。用9-11 μl h2（2 μm）和不同浓度的mirna-155混合溶液对电极表面固定的h1进行修饰，然后在37
ꢀ°
c条件下孵育1-3 h，然后洗涤以除去未结合的链；（4）在ecl检测单元中加入9-11 ml含0.10 m k2s2o8的pbs（0.1 m，ph 7.4），测量ecl响应。扫描电压设置为-1.7 ~ 0 v，扫描速度为0.1 v/s，光电倍增管高压为850 v。
8.与现有的技术相比，本发明的有益效果：双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料具有较大的比表面积，可以固定大量的发夹结构h1，结合其优异的ecl性能和循环放大策略，mirna-155的浓度从1.0
×
10-13 m增加到1.0
×
10-5 m，ecl强度逐渐降低，与mirna-155浓度的对数值呈良好的线性关系。该ecl生物传感器实现了mir-155的超灵敏分析，检出限低为0.51 fm。该策略为建立高效ecl电化学发光传感器提供了新的途径，具有巨大的临床诊断潜力。
附图说明
9.图1是双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的透射电镜图；图2是双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的高分辨率透射电镜图；图3是xps测量光谱图；图4是原始多壁碳纳米管和双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的傅里叶变换红外光谱；图5是不同浓度mirna-155的电化学发光传感器的ecl响应图；图6是ecl强度与mirna-155浓度对数的线性关系图；图7是ecl电化学发光传感器对不同干扰物质的特异性示意图；图8是ecl电化学发光传感器稳定性示意图；图9是ecl电化学发光传感器长期储存稳定性示意图。
具体实施方式
10.下面将结合本发明中的附图说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
11.应当理解，本发明实例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围，下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
12.当实施例给出的数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间的任何一个数值均可选用，除非另外定义，本发明中使用的所有技
术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
13.实施例1 双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的制备方法1.1（1）多壁碳纳米管（10 mg）、钴卟啉（11 mg）、锌卟啉（11 mg）、对苯二甲醛（8 mg）、1,3,5-三甲基苯（25 ml）、无水乙醇（25 ml）和乙酸水溶液（6 m，5 ml）在耐玻璃管里混合。超声处理3 h后，然后，将管抽真空至50 mtorr的内部压力，并火焰密封，在110
ꢀ°
c下加热70 h。随后，依次用1,4-二氧六烷、四氢呋喃和丙酮离心收集产物。最终，在70
ꢀ°
c的烘箱中干燥24 h后，得到预期的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料；（2）对得到的产物进行全面表征，图1图2分别是双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的透射电镜和高分辨率透射电镜图，显示了复合材料的晶体结构和形貌。双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的高分辨率透射电镜图像具有d间距为0.35 nm的晶格条纹，对应于多壁碳纳米管（mwcnts）的（002）平面。高分辨率透射电镜图像还显示了多壁碳纳米管被有机骨架纳米片修饰，涂层厚度约为0.75 nm；如图3所示，通过xps测量光谱图显示双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料结构中c、n、o、zn、co元素共存。如图4所示，傅里叶变换红外光谱图显示与原始的mwcnts相比，在双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料中还在1338、1172、997和794 cm-1处发现了cof-366-zn/co新的特征峰，表明了cof-366-zn/co衍生物成功地附着在mwcnts表面1.2（1）多壁碳纳米管（10 mg）、钴卟啉（11.5 mg）、锌卟啉（11.5 mg）、对苯二甲醛（9 mg）、1,3,5-三甲基苯（25.5 ml）、无水乙醇（25.5 ml）和乙酸水溶液（6 m，5.1 ml）在耐玻璃管里混合。超声处理3 h后，然后，将管抽真空至50 mtorr的内部压力，并火焰密封，在115
ꢀ°
c下加热73 h。随后，依次用1,4-二氧六烷、四氢呋喃和丙酮离心收集产物。最终，在60
ꢀ°
c的烘箱中干燥24 h后，得到预期的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料；（2）对得到的固态产物进行全面表征：结果与1.1一致1.3（1）多壁碳纳米管（10 mg）、钴卟啉（12 mg）、锌卟啉（12 mg）、对苯二甲醛（10 mg）、1,3,5-三甲基苯（26 ml）、无水乙醇（26 ml）和乙酸水溶液（6 m，5.2 ml）在耐玻璃管里混合。超声处理3 h后，然后，将管抽真空至50 mtorr的内部压力，并火焰密封，在130
ꢀ°
c下加热80 h。随后，依次用1,4-二氧六烷、四氢呋喃和丙酮离心收集产物。最终，在60
ꢀ°
c的烘箱中干燥24 h后，得到预期的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料；（2）对得到的固态产物进行全面表征：结果与1.1一致。
14.实施例2 microrna的电化学发光传感器制备（1）对玻碳电极（gce）进行预处理。然后，将5 μl的双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料滴在预处理过的抛光gce表面，室温下暗处干燥；（2）将10 μl戊二醛（2.5 wt %，ga）滴在电极表面孵育50 min。在此过程中，双金属
zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料通过经典的ga偶联反应进行了改性。将改性后的gce置于4
ꢀ°
c浓度为2 μm的h1溶液（10 μl）中孵育12 h，用超纯水轻轻洗涤以去除未结合的h1；（3）洗涤后，用9 μl 2 mm 6-巯基己醇（mch）去除非特异性活性位点。用9 μl h2（2 μm）和不同浓度的mirna-155混合溶液对电极表面固定的h1进行修饰，然后在37
ꢀ°
c条件下孵育2 h，然后洗涤以除去未结合的链，即可得到microrna的电化学发光传感器。
15.实施例3 microrna的电化学发光传感器性能测试（1）双金属zn-/co-卟啉共价有机框架/多壁碳纳米管/k2s2o8体系对mirna-155的定量检测：随着mirna-155的浓度从1.0
×
10-13 m增加到1.0
×
10-5 m，ecl强度逐渐降低。图5是不同浓度mirna-155的电化学发光传感器的ecl响应图，从图6可以看出ecl强度与mirna-155浓度的对数值呈良好的线性关系；（2）ecl电化学发光传感器的选择性测试：使用了三种不同的mirna，包括mirna-141、let-7a和mirna-21作为干扰物质。图7是ecl电化学发光传感器对不同干扰物质的特异性选择示意图，表明干扰是可以忽略的，这种ecl免疫分析具有良好的特异性；（3）ecl电化学发光传感器的稳定性测试：电极扫描20个周期，相对标准偏差（rsd）为0.29 %，图8是ecl电化学发光传感器稳定性示意图，表明电极在恒扫描下能够保持稳定。图9是长期储存稳定性示意图，当免疫传感器在4
ꢀ°
c中保存3周时，反应下降到初始反应的98 %左右，表明ecl电化学发光传感器具有可接受的长期稳定性。
16.上述实施例仅示例性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。