ESI-09在防治SVCV感染中的应用

esi-09在防治svcv感染中的应用
技术领域
1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及esi-09的用途，可用于制备预防和治疗svcv感染的药物或添加剂。


背景技术：

2.esi-09是一种特定的环腺苷酸结合蛋白(exchange protein directly activated by camp，epac)抑制剂。epac是细胞内重要第二信使camp的效应分子，能够通过epac-rap1信号通路介导camp传递的信号，调节细胞增殖、炎症反应、离子转运、基因表达或者细胞粘附和迁移等多种生理活动。目前，研究表明epac在促进肿瘤细胞的增殖、粘附、转移的过程中发挥重要功能，esi-09则作为epac的特异性拮抗剂，能够特异性阻断epac介导的rap1活化和akt磷酸化，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前，对于esi-09的研究多集中于抗癌及抗细菌功能，而其在抗病毒方面的功能尚未见报道，尚未见有将esi-09应用于水生病毒防治的实例。
3.鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，svcv)属弹状病毒科，水疱病毒属，是一种单股负义链rna病毒。svcv引起的鲤春病毒血症(svc)是一种具高传染性，高致死性的水产疾病，能够造成鲤科鱼类大量死亡，形成巨大的经济损失。目前，svcv的结构及遗传多样性已有较多研究和报道。同样地，svcv的致病机理被发现包括影响细胞凋亡，造成氧化应激损伤，针对免疫系统实现免疫逃逸等。
4.尽管svcv的研究较为丰富，药物研究较多，仍然缺乏行之有效的防治手段，尚无商品化的特效药。目前，研究人员尝试使用新手段治疗svcv的感染，例如利用rna干扰诱导病毒基因表达的沉默，但是，该方式具有成本较高，干扰rna保存困难的缺点。另外，svcv的疫苗开发目前尚处于探索阶段，包括灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。但尚未研发出保护率、成本、接种方式三项均满足规模化生产，能够实现市场投放的疫苗。因此，在当前的研究背景下，寻找高效安全的药物作为svcv的防治手段仍然是首选。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供esi-09在防治svcv感染中的应用，esi-09能够显著抑制鱼类离体培养细胞中svcv病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的转录，抗病毒实验证实esi-09对于svcv感染起到保护作用，esi-09能够用于制备防治svcv感染的药物或添加剂。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.esi-09在防治svcv病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染svcv的epc细胞系在加入20μm esi-09处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，esi-09处理之后，epc细胞中病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的表达被显著抑制，svcv在转录及蛋白表达水平均被清除，同时细胞系中抗病毒免疫相关基因(包括epcifn,epcisg15,epcvig1)表达量基本恢复正常水平。
8.本发明实施例中选取鱼类细胞系源于svcv重要宿主，因此通过建立细胞感染病毒
的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知esi-09适用于svcv的病毒防治。
9.esi-09作为预防或治疗svcv感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，抗病毒效果佳的优点。esi-09的结构式如下：
10.附图说明
11.图1为esi-09对svcv感染细胞的影响。
12.图2为esi-09对细胞中svcv病毒基因转录水平的影响。
13.图3为esi-09对细胞中svcv病毒蛋白表达水平的影响。
14.图4为esi-09对感染svcv的细胞中抗病毒免疫相关因子转录水平的影响。
具体实施方式
15.实施例1：esi-09对svcv感染细胞的影响
16.抗病毒实验用于检测svcv病毒在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。epc细胞用于检测svcv病毒滴度。取生长状态良好的epc细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种moi＝10的svcv于epc细胞，同时加入20μm esi-09处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。固定细胞前收集上清，保存于4℃备测病毒滴度。取生长状态良好的epc细胞传代接入96孔板，28℃培养过夜；接种收集的上清后，分别使用tcid
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方法计算esi-09未处理组和处理组病毒滴度。结果如图1所示，20μmesi-09处理后的感染病毒细胞中，细胞病变效应明显被抑制，病毒滴度显著降低。
17.实施例2：esi-09对svcv病毒基因转录的影响
18.检测感染svcv之后的epc细胞用20μm esi-09处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的epc细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒浓度接种并进行药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用trizol(invitrogen)裂解细胞沉淀后提取细胞总rna，由goscript逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。通过qpcr检测病毒相关基因(包括g，l，m，n和p)的转录水平，相关方法参照文献
1.。结果表明：20μm esi-09处理后，细胞中svcv病毒相关基因(包括g，l，m，n，p)的转录水平显著下降(图2)。
19.实施例3：esi-09对svcv增殖的影响
20.检测感染svcv之后的epc细胞用20μm esi-09处理后，细胞中病毒相关蛋白的表达情况。取生长状态良好的epc细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，pbs润洗一遍后放入-80℃冰箱保存；向冰冻保存的细胞沉淀中加入适量ripa弱裂解液，置于4℃裂解1小时，使细胞充分裂解；吸取细胞裂解物至新的1.5ml离心管中，样品加入1/4体积的5
×
sds sample buffer，涡旋混匀，100℃沸水浴10min，置于冰上备用。使用western blot实验检测esi-09处理后svcv
蛋白表达水平(核蛋白n、磷酸化蛋白p)，相关方法参照文献
2.。实验结果表明，20μm esi-09处理后，细胞中svcv病毒蛋白n、p的表达水平显著降低(图3)。
21.实施例4：esi-09对宿主抗病毒免疫相关基因表达水平的影响
22.感染svcv之后的epc细胞用20μm esi-09处理后，检测细胞中抗病毒免疫相关基因的表达情况。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法及病毒浓度接种病毒并进行药物处理；继续培养24h后，用trizol(invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总rna，由goscript逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。使用qpcr检测抗病毒免疫相关因子的转录水平(包括epcifn，epcisg15，epcvig1)，相关方法参照文献
3.。实验结果表明，20μm esi-09处理后，经svcv病毒刺激后表达水平较高的抗病毒免疫相关因子(包括epcifn，epcisg15，epcvig1)在esi-09处理后显著恢复(图4)。
23.参考文献
24.[1]zhou x y,lu l f,li z c,et al.temperature effects on svcv propagation and the related ifn response in zebrafish[j].aquaculture,2021,533.
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