白屈菜红碱联合多黏菌素E在抑制多黏菌素E耐药菌中的应用

白屈菜红碱联合多黏菌素e在抑制多黏菌素e耐药菌中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及白屈菜红碱联合多黏菌素e在抑制多黏菌素e耐药菌中的应用，多黏菌素e耐药菌为mcr阳性细菌。


背景技术：

2.多黏菌素属聚阳离子抗菌肽，对大多数革兰阴性菌有较强较快的杀菌作用。多黏菌素抗菌机理是其能与革兰阴性菌细胞膜中带负电荷的lps结合，造成细菌细胞膜通透性改变，导致细菌核酸、氨基酸等重要物质外漏，从而抑制细菌生长并导致细菌死亡。近年来，随着细菌耐药性形式日益严峻，多黏菌素成为临床治疗多重耐药革兰氏阴性杆菌感染的“最后一道防线”之一。
3.2015年底首次报道了从人和动物分离的大肠埃希菌中分离到质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1，随后在越来越多的cre菌株中检出mcr基因。目前，已报道多种mcr基因型，包括mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8、mcr-9和mcr-10。mcr基因的出现及广泛流行严重威胁了多黏菌素的临床应用。因此，急需找到提高细菌对多黏菌素敏感性的增效剂，从而使细菌恢复对多黏菌素敏感性。
4.白屈菜红碱是一种苯并菲啶类异喹啉生物碱，存在于植物白屈菜中，具有清热解毒、抗菌消炎、降压抗癌作用，它是一种广泛使用的体外蛋白激酶c抑制剂，并且是g蛋白偶联cb1受体的有效拮抗剂。研究表明，白屈菜红碱对多种类型的人类癌细胞具有抗癌作用，已成为许多潜在的抗癌新药的基础。截至目前，未见白屈菜红碱抑制mcr阳性细菌的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是如何抑制多黏菌素e耐药菌。
6.本发明首先保护一种用于抑制多黏菌素e耐药菌的药物组合，包括白屈菜红碱和多黏菌素e。
7.上述药物组合具体由白屈菜红碱和多黏菌素e组成。
8.所述药物组合中，白屈菜红碱和多黏菌素e的质量比可为32-128：1(如32-64：1、64-128：1、32：1、64：1或128：1)。
9.所述药物组合中，白屈菜红碱的最低抑菌浓度可为8-32μg/ml(如8-16μg/ml、16-32μg/ml、8μg/ml、16μg/ml或32μg/ml)。多黏菌素的最低抑菌浓度可为0.25-1μg/ml(如0.25-0.50μg/ml、0.50-0.75μg/ml、0.75-1μg/ml、0.25μg/ml、0.50μg/ml、0.75μg/ml或1μg/ml)。
10.本发明还保护白屈菜红碱联合多黏菌素e的应用，可为a1)或a2)：
11.a1)抑制多黏菌素e耐药菌；
12.a2)制备用于抑制多黏菌素e耐药菌的药物。
13.本发明还保护白屈菜红碱在提高多黏菌素e耐药菌对多黏菌素e的敏感性中的应用。
14.本发明还保护白屈菜红碱在恢复多黏菌素e对多黏菌素e耐药菌的抑制作用中的应用。
15.上述任一所述的应用中，白屈菜红碱和多黏菌素e的质量比可为32-128：1(如32-64：1、64-128：1、32：1、64：1或128：1)。白屈菜红碱的最低抑菌浓度可为8-32μg/ml(如8-16μg/ml、16-32μg/ml、8μg/ml、16μg/ml或32μg/ml)。多黏菌素的最低抑菌浓度可为0.25-1μg/ml(如0.25-0.50μg/ml、0.50-0.75μg/ml、0.75-1μg/ml、0.25μg/ml、0.50μg/ml、0.75μg/ml或1μg/ml)。
16.上述任一所述多黏菌素e耐药菌可为mcr阳性细菌。
17.上述任一所述mcr阳性细菌可为mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91或mcr-9阳性沙门氏菌slm183。
18.本发明的发明人通过大量实验发现，白屈菜红碱能够协同多黏菌素e抑制多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91或mcr-9阳性沙门氏菌slm183)，逆转多黏菌素e耐药菌对多黏菌素e的耐药性，在降低多黏菌素e使用量的同时实现抑制多黏菌素e耐药菌的效果。本发明首次发现白屈菜红碱在恢复多黏菌素e对多黏菌素e耐药菌的抑制作用。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
19.图1为采用棋盘法检测白屈菜红碱联合多黏菌素e对mcr-1阳性大肠杆菌zj807的最小抑菌浓度。
20.图2为采用棋盘法检测白屈菜红碱联合多黏菌素e对mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91的最小抑菌浓度。
21.图3为采用棋盘法检测白屈菜红碱联合多黏菌素e对mcr-9阳性沙门氏菌slm183的最小抑菌浓度。
22.图4为白屈菜红碱联合多黏菌素e对mcr-1阳性大肠杆菌zj807的时间—杀菌曲线。
具体实施方式
23.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
24.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.多黏菌素为北京偶合科技有限公司的产品，有效含量为98％。
26.白屈菜红碱为上海陶术生物科技有限公司的产品，有效含量为99.19％。
27.下述实施例中涉及的培养基的制备方法如下：
28.mh液体培养基：向适量蒸馏水中加入25g mh肉汤培养基(北京陆桥技术股份有限公司)，之后用蒸馏水定容至500ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却。
29.mcr-1阳性大肠杆菌zj807记载于如下文献中：y wang，gb tian，r zhang，y shen，jm tyrrell，x huang，h zhou，l lei，hy li，y doi.supplementary material:
prevalence，risk factors，outcomes，and molecular epidemiology of mcr-1-positive enterobacteriaceae in patients and healthy adults from china：an epidemiological and clinical study.the lancet infectious diseases.2017.mcr-1阳性大肠杆菌zj807的基因组序列已上传至ncbi，biosample accession number：samn05437814。mcr-1阳性大肠杆菌zj807为多黏菌素e耐药菌。
30.mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91记载于如下文献中：x wang，y wang，z ying，j li，y wang.emergence of a novel mobile colistin resistance gene，mcr-8，in ndm-producing klebsiella pneumoniae.emerging microbes&infections.2018.mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91的基因组序列已上传至ncbi，biosample accession number：samn14228398。mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91为多黏菌素e耐药菌。
31.mcr-9阳性沙门氏菌slm183记载于如下文献中：na lyu,et al.genomic characterization of salmonella enterica isolates from retail meat in beijing，china.front.microbiol.2021.mcr-9阳性沙门氏菌slm183的基因组序列已上传至ncbi，biosample accession number：samn16708049。mcr-9阳性沙门氏菌slm183为多黏菌素e耐药菌。
32.实施例1、采用棋盘法检测白屈菜红碱联合多黏菌素e对多黏菌素e耐药菌的最小抑菌浓度
33.根据clsi m27-a3药敏试验标准采用棋盘法检测白屈菜红碱单用、多黏菌素e单用和“白屈菜红碱和多黏菌素e联用”对多黏菌素e耐药菌(mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91或mcr-9阳性沙门氏菌slm183)的抑菌活性，进而获得对多黏菌素e耐药菌的最小抑菌浓度。具体步骤如下：
34.1、取生长至对数生长期的多黏菌素e耐药菌菌液，先用麦氏比浊仪调节至麦氏0.5，之后用mh肉汤培养基稀释100倍，得到多黏菌素e耐药菌稀释液。多黏菌素e耐药菌稀释液中，多黏菌素e耐药菌的浓度约为1
×
106cfu/ml。
35.2、取多黏菌素e，用去离子水稀释，得到浓度为2560μg/ml的多黏菌素e溶液；之后将多黏菌素e溶液用无菌滤膜(孔径为0.22μm)过滤，得到多黏菌素e储存液。取白屈菜红碱，用去离子水稀释，得到浓度为1280μg/ml的白屈菜红碱溶液；之后将白屈菜红碱溶液用无菌滤膜(孔径为0.22μm)过滤，得到白屈菜红碱储存液。
36.3、取96孔微孔板，每孔接种100μl多黏菌素e耐药菌稀释液和100μl药物溶液(由多黏菌素e储存液和白屈菜红碱储存液混合而成)。
37.对于mcr-1阳性大肠杆菌zj807，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的白屈菜红碱的浓度依次为0μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml、32.0μg/ml、64.0μg/ml；从上至下每行中，每孔的多黏菌素e的浓度依次为0μg/ml、0.125μg/ml、0.250μg/ml、0.500μg/ml、1.000μg/ml、2.000μg/ml、4.000μg/ml。
38.对于mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的白屈菜红碱的浓度依次为0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml、32.0μg/ml、64.0μg/ml、128.0μg/ml；从上至下每行中，每孔的多黏菌素e的浓度依次为0μg/ml、0.250μg/ml、0.500μg/ml、1.000μg/ml、2.000μg/ml、4.000μg/ml、8.000μg/ml、16.000μg/ml。
39.对于mcr-9阳性沙门氏菌slm183，96孔微孔板中，从左至右每列中每孔的白屈菜红
碱的浓度依次为0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml、32.0μg/ml、64.0μg/ml、128.0μg/ml、256.0μg/ml；从上至下每行中，每孔的多黏菌素e的浓度依次为0μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.250μg/ml、0.500μg/ml、1.000μg/ml、2.000μg/ml、4.000μg/ml。
40.4、完成步骤3后，取所述96孔微孔板，37℃孵育16-18h。
41.5、完成步骤4后，计算每孔的mic值，进一步计算联合抑菌分数fic。
42.第1列中白屈菜红碱的浓度为0μg/ml，多黏菌素e的浓度进行倍比稀释，该列可用于测量多黏菌素e的mic，记为mic
多黏菌素e单用
。第1行中多黏菌素e的浓度为0μg/ml，白屈菜红碱的浓度进行倍比稀释，该行可用于测量白屈菜红碱的mic，记为mic
白屈菜红碱单用
。其它均为白屈菜红碱和多黏菌素e联合用药，多黏菌素e的mic记为mic
多黏菌素e联合
，白屈菜红碱的mic记为mic
白屈菜红碱联合
，计算联合作用指数fic。
43.联合作用指数fic＝mic
多黏菌素e联合
/mic
多黏菌素e单用
mic
白屈菜红碱联合
/mic
白屈菜红碱单用
44.部分检测结果见图1-图3。以fici法换算的药物最佳组合用三角形标注。
45.实验重复三次，结果取平均值。统计结果见表1。
46.表1
[0047][0048]
结果表明，白屈菜红碱和多黏菌素e联用均能够显著降低多黏菌素e对mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91和mcr-9阳性沙门氏菌slm183的mic值。对于mcr-1阳性大肠杆菌zj807，白屈菜红碱和多黏菌素e的最优质量比为32：1；此时白屈菜红碱的最低抑菌浓度为8μg/ml，多黏菌素的最低抑菌浓度为0.25μg/ml。对于mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91，白屈菜红碱和多黏菌素e的最优质量比为32：1；此时白屈菜红碱的最低抑菌浓度为32μg/ml，多黏菌素的最低抑菌浓度为1μg/ml。对于mcr-9阳性沙门氏菌slm183，白屈菜红碱和多黏菌素e的最优质量比为128：1；此时白屈菜红碱的最低抑菌浓度为32μg/ml，多黏菌素的最低抑菌浓度为0.25μg/ml。
[0049]
上述结果表明，白屈菜红碱能协同多黏菌素e发挥抗菌作用，从而治疗多黏菌素e耐药菌引发的感染。
[0050]
实施例2、白屈菜红碱联合多黏菌素e对多黏菌素e耐药菌的时间-杀菌曲线
[0051]
多黏菌素e耐药菌为mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91或mcr-9阳性沙门氏菌slm183。
[0052]
1、取生长至对数生长期的多黏菌素e耐药菌菌液，用麦氏比浊仪调节至麦氏0.5，得到多黏菌素e耐药菌稀释液。多黏菌素e耐药菌稀释液中，多黏菌素e耐药菌的浓度约为1
×
106cfu/ml。
[0053]
2、取12只试管，每只加入2970μl mh液体培养基和30μl多黏菌素e耐药菌稀释液，混匀；之后将12只试管随机分为白屈菜红碱组、多黏菌素e组、联合组和空白组4组，每组3只试管，进行如下处理：
[0054]
白屈菜红碱组：向每只试管加入37.5μl浓度为1280μg/ml的白屈菜红碱溶液，使白屈菜红碱在体系中的浓度为16μg/ml，此时即为第0h；之后37℃、200rpm培养24h；
[0055]
多黏菌素e组：向每只试管加入0.29μl浓度为2560μg/ml的多黏菌素e溶液，使多黏菌素e在体系中的浓度为0.25μg/ml，此时即为第0h；之后37℃、200rpm培养24h；
[0056]
联合组：向每只试管加入37.5μl浓度为1280μg/ml的白屈菜红碱溶液和0.29μl浓度为2560μg/ml的多黏菌素e溶液，使白屈菜红碱在体系中的浓度为16μg/ml、多黏菌素e在体系中的浓度为0.25μg/ml，此时即为第0h；之后37℃、200rpm培养24h；
[0057]
空白组：试管中不加入任何药物，此时即为第0h；之后37℃、200rpm培养24h。
[0058]
培养期间，分别在第0h、第2h、第4h、第8h、第12h和第24h取100μl培养液涂布于mh固体培养基(向适量蒸馏水中加入19g mh琼脂培养基(北京陆桥技术股份有限公司)，之后用蒸馏水定容至500ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板，冷却)，37℃、200rpm培养24h，进行菌落计数。
[0059]
3、完成步骤2后，以培养时间为横坐标，菌落数的log10值为纵坐标，绘制时间—杀菌曲线。
[0060]
mcr-1阳性大肠杆菌zj807的时间-杀菌曲线见图4(cfu为菌落形成单位)。
[0061]
结果表明，白屈菜红碱组、多黏菌素e组和空白组均不能抑制多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91、mcr-9阳性沙门氏菌slm183)，三组之间无显著差异；联合组可以显著抑制多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91、mcr-9阳性沙门氏菌slm183)。与白屈菜红碱组、多黏菌素e组和空白组相比，联合组抑制多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91、mcr-9阳性沙门氏菌slm183)的效果显著提高且抑制效果稳定。
[0062]
由此可见，白屈菜红碱联合多黏菌素e能恢复多黏菌素e对多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91、mcr-9阳性沙门氏菌slm183)的抑制作用，即白屈菜红碱联合多黏菌素e可以抑制多黏菌素e耐药菌(如mcr-1阳性大肠杆菌zj807、mcr-8阳性肺炎克雷伯菌kp91、mcr-9阳性沙门氏菌slm183)。
[0063]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。