一种神经导管的制备方法

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种神经导管的制备方法。


背景技术：

2.在医学领域，通常运用显微外科手术对周围神经短距离缺损的离断伤进行端对端的外膜缝合，以修复周围神经，或者通过自体神经移植或应用其他神经替代物解决周围神经缺损的问题。然而，这些修复方法存在一定的缺陷，很难避免神经束的错对，神经断端的卷曲、逃逸及吻合口的结缔组织增生等现象。
3.随着生物医用材料领域的发展，科研工作者们将研究的重点转向使用神经导管进行周围神经的修复。神经导管是将生物或非生物的材料预制成合适的管状支架，桥接在神经断端，在为神经再生提供微环境的同时，还可促进神经趋化诱导、促进神经再生。采用神经导管修复受损的周围神经能够减轻缝合口的张力、引导神经纤维的生长，提高神经束对合的精确度，防止瘢痕组织侵入再生的神经纤维。
4.常用的神经导管的材料有合成高分子和天然高分子，例如，合成高分子有聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸等，天然高分子有壳聚糖、明胶、胶原等。相比而言，合成高分子制成的神经导管具有良好的力学支撑和加工工艺多样性优势，但是这类材料的神经细胞亲和性和生物相容性较差；天然高分子制备得到的神经导管的神经细胞亲和性好，生物可降解性好，且降解产物温和，对病灶区域无刺激，然而天然高分子制备成神经导管在兼顾神经导管力学支撑性能和良好的生物相容性能的基础上制备工艺技术有限，限制了其在临床上的应用。
5.纳米纤维结构的材料表现出较好的细胞相容性和组织通透性，在神经导管应用中，具有良好的应用。纳米纤维结构可通过静电纺丝技术和熔喷工艺制备得到，这其中静电纺丝被广泛应用于神经导管材料的制备。静电纺丝技术可以得到均匀的纳米级尺寸的纤维，但其生产效率较低，且其制备设备需要配备高电压的工作条件。熔喷工艺制备的纤维相比于静电纺丝技术有较高的生产效率，其过程为通过狭窄的孔口挤出熔融聚合物，进入高速热风流。热空气在聚合物表面上的拖曳使得聚合物熔体表面上的热空气阻塞聚合物在最佳条件下伸长成纤维。尽管熔喷工艺是一种商业化生产纳米纤维产品经济有效的方法，但其得到的纤维直径较粗，纤维直径不可控。在神经导管领域尤其是天然高分子神经导管的制备研究中鲜有应用。因此，研究出一种能够得到纳米级纤维、纤维直径可控且高效的神经导管制备方法具有重要意义。
6.气纺丝技术是兼顾静电纺丝与熔喷技术的一种新型纳米纤维制备技术，该技术不依赖高电压的工作条件，且能够形成与纳米静电纺丝技术相比拟的纳米级纤维结构，其工作效率与熔喷相近，是一个具有广泛应用及经济价值的制备技术。
7.矿化胶原是一种仿生天然组织的材料，是通过胶原的原位矿化形成胶原与矿物质的复合结构材料，结合了天然生物材料和仿生矿物质的优势，具有生物相容性好，机械强度适宜，易于体内降解的优点。同时还能微量释放无机离子，适宜的浓度范围下，为周围神经
的再生提供促进作用，在临床上有广泛的应用空间。
8.综上所述，本发明将提供一种气纺制备矿化胶原神经导管的方法，将在无需高电压条件下，大大提高神经导管纤维材料的制备效率，使其形成可控的纳米纤维结构，并将利用其可控的定向和非定向结构构建复合的纤维结构神经导管，使最终导管具有良好的力学支撑和离子缓释效果，促进神经的黏附增殖，进而促进神经再生。


技术实现要素：

9.本发明提供一种神经导管的制备方法，该制备方法采用气纺丝技术制备矿化胶原神经导管，具有纤维直径可控、高效的优点。
10.本发明提供一种神经导管的制备方法，包括以下步骤：
11.1)将胶原与矿化胶原在乙酸中混合，得到纺丝液；
12.所述胶原与所述矿化胶原的质量比≥20:5；
13.2)对所述纺丝液进行气纺丝处理，得到纤维膜；
14.3)对所述纤维膜进行交联处理，得到所述神经导管。
15.如上所述的制备方法，其中，步骤2)包括：
16.1)所述纺丝液在气流作用下纤维化，并利用第一滚筒旋转接收纤维得到定向纤维膜，利用第二滚筒接收纤维得到非定向纤维膜；
17.2)将所述定向纤维膜沿轴向收集于实心圆柱磨具上后，在所述定向纤维膜上覆盖所述非定向纤维膜，得到所述纤维膜。
18.如上所述的制备方法，其中，步骤2)包括：
19.1)所述纺丝液在气流作用下纤维化，利用滚筒旋转接收纤维得到定向纤维膜后，将所述定向纤维膜沿轴向收集于实心圆柱磨具上；
20.2)利用所述滚筒继续接收纤维得到非定向纤维膜，将所述非定向纤维膜覆盖于所述定向纤维膜的外表面，得到所述纤维膜。
21.如上所述的制备方法，其中，所述气纺丝处理包括：
22.1)将所述纺丝液注入针头内径为0.2～0.4mm的注射器中，使所述注射器的针头位于气流环境中；
23.所述气流环境的压力为10～100psi，气流速度为50～150m/s；
24.2)在4～7ml/h的注速下推动所述注射器，并在距离所述针头10～20cm处的位置接收所述纺丝液纤维化后的纤维。
25.如上所述的制备方法，其中，所述矿化胶原通过胶原的原位自组装矿化得到；
26.矿物在所述矿化胶原中的质量含量≤86％。
27.如上所述的制备方法，其中，所述纺丝液的质量浓度为10～30％。
28.如上所述的制备方法，其中，所述矿物选自羟基磷灰石、β-tcp。
29.如上所述的制备方法，其中，所述神经导管中的钙元素的质量含量≤15％。
30.如上所述的制备方法，其中，步骤1)中，所述第一滚筒的转速为1000～2000rpm。
31.如上所述的制备方法，其中，所述交联处理包括：将所述纤维膜放置于交联剂中交联固定24h；
32.所述交联剂为包括n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺
的乙醇溶液，其中，n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺的摩尔浓度为40mmol/l，n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为20mmol/l。
33.本发明的神经导管的制备方法通过气纺丝技术进行矿化胶原神经导管的制备，制备得到的神经导管具有纳米级的纤维尺寸，且纤维直径易于控制。且该方法具有高效、装置简单、安全便捷、成本低廉的优势。
附图说明
34.图1为在一种视角下的实施例2的神经导管实物图；
35.图2为在另一种视角下的实施例2的神经导管实物图；
36.图3为本发明实施例2的神经导管的定向纤维sem图；
37.图4为本发明实施例2的神经导管的非定向纤维sem图；
38.图5为本发明实施例2的神经导管的钙元素分布图；
39.图6为本发明实施例3的神经导管内壁的细胞粘附结果图。
具体实施方式
40.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.本发明提供一种神经导管的制备方法，包括以下步骤：
42.1)将胶原与矿化胶原在乙酸中混合，得到纺丝液；
43.其中，胶原与矿化胶原的质量比≥20:5；
44.2)对纺丝液进行气纺丝处理，得到纤维膜；
45.3)对纤维膜进行交联处理，得到神经导管。
46.步骤1)中，控制胶原与矿物的质量比在上述范围内有利于纺丝液在气纺丝处理下顺利进行纤维化，得到纤维膜，胶原与矿物可以在乙酸中完全溶解混合，得到具有一定浓度的纺丝液，纺丝液即为制备纤维的前驱体溶液；
47.步骤2)中，对纺丝液进行气纺丝处理是指在气流作用下，利用气体/溶液界面处的压力差和剪切力细化分裂为多股纺丝液，并进行拉伸细化分裂纤维化将多股纺丝液拉伸细化分裂，纺丝液中的溶剂组分快速挥发进行纤维化得到纤维，对纤维进行排列处理即可得到纤维膜。
48.步骤3)中，对纤维膜进行交联处理，可以进一步提升纤维膜的微观结构致密度和力学性能，从而得到具有优异力学性能的神经导管。
49.本发明以胶原和矿化胶原作为原料得到纺丝液，并对纺丝液进行气纺丝处理，通过对纺丝液浓度，气纺丝处理过程中的气体压力、气流速度、接收装置的距离、纺丝液的注射速度等因素进行控制可得到直径可控的纳米纤维，并对纤维进行排布处理和交联处理即可得到满足不同需求的胶原神经导管。
50.此外，该方法仅需要简单的气纺丝装置就可实现神经导管的制备，具有生产效率高、纤维直径可控、操作简单、安全便捷、成本低廉的优势。
51.在一种的具体的实施方式中，步骤2)包括：
52.1)使纺丝液在气流作用下纤维化，并利用第一滚筒旋转接收纤维得到定向纤维膜，利用第二滚筒接收纤维得到非定向纤维膜；
53.2)将定向纤维膜沿轴向收集于实心圆柱磨具上后，在定向纤维膜上覆盖非定向纤维膜，得到纤维膜。
54.在上述过程中，第一滚筒和第二滚筒即为纤维的接收装置，采用第一滚筒旋转接收纤维即可得到定向纤维膜，采用第二滚筒静止接收纤维即可得到非定向纤维膜。本发明不限定第一滚筒和第二滚筒接收纤维的顺序，可以先采用第一滚筒接收再采用第二滚筒接收，也可以先采用第二滚筒接收再采用第一滚筒接收，或者采用第一滚筒和第二滚筒同时进行接收。
55.在得到定向纤维膜和非定向纤维膜后，将定向纤维膜沿轴向收集于实心圆柱磨具上，再在定向纤维膜的外表面覆盖非定向纤维膜，即可得到纤维膜。
56.在另一种的具体的实施方式中，步骤2)包括：
57.1)使纺丝液在气流作用下纤维化，利用滚筒旋转接收纤维得到定向纤维膜后，将定向纤维膜沿轴向收集于实心圆柱磨具上；
58.2)利用滚筒继续接收纤维得到非定向纤维膜，将非定向纤维膜覆盖于定向纤维膜的外表面，得到纤维膜。
59.在上述实施方式中，仅采用一个滚筒分别收集定向纤维膜和非定向纤维膜。
60.在以上两种实施方式中，均可以得到内层具有沿轴向分布的定向纤维及外层为非定向纤维结构的纤维膜，纤维膜的内层定向结构具有引导神经细胞定向黏附生长的优势，可诱导损伤神经定向再生，纤维膜的外层非定向结构可加强材料的力学性能，有利于动物实验导管和神经的缝合。
61.进一步的，以上两种实施方式在定向纤维的制备过程中，滚筒的旋转速度在1000～2000rpm时能够得到定向排布效果更好的定向纤维。
62.具体的，本发明制备方法中的气纺丝处理包括：
63.1)将纺丝液注入针头内径为0.2～0.4mm的注射器中，使注射器的针头位于气流环境中；
64.其中，气流环境的压力为10～100psi，气流速度为50～150m/s；
65.2)在4～7ml/h的注速下推动注射器，并在距离针头10～20cm处的位置接收纺丝液纤维化后的纤维。
66.上述气流环境是指能够提供一定压力和流速的气体环境，本发明不限定气体的种类。本发明的纺丝液中的物质在空气中稳定性强，无副反应的发生，因此在空气环境下即可完成气纺丝的过程。具体的，可通过空气压缩机提供具有一定压力和流速的空气环境。
67.发明人在研究过程中发现，通过限定注射器的针头内径及推注速度，气流的压力及气流速度和纤维的接收距离在上述范围内，可得到直径为200～400nm的纤维，且通过控制以上参数得到的纤维具有优异的连续性和稳定性。
68.进一步的，步骤1)中使用的矿化胶原通过胶原的原位自组装矿化得到，其中，矿物在矿化胶原中的质量含量≤86％。
69.具体的，矿物选自羟基磷灰石、β-tcp。以上矿物具有良好的生物形容性，能够在生
物体内自行降解，且以上矿物中均含有钙元素，制备得到的矿化胶原神经导管具有钙离子缓释特性，对神经轴突再生具有重要的促进和诱导作用。
70.纺丝液的质量浓度也是影响纤维形成的重要因素，若浓度过大，则会导致制备出的纤维出现粘结现象，严重时会导致注射器针头堵塞，无法从注射器中推注出纺丝液；若浓度过小，也会导致纺丝液在纺丝过程中无法形成稳定的射流，纺丝液中的溶剂组分难以挥发，容易变成液滴滴落，从而无法形成纤维。当控制纺丝液的质量浓度为10～30％时，纺丝液更容易进行纤维化进而形成纤维膜。
71.进一步的，当神经导管中的钙元素的质量含量为≤15％时，神经导管对神经轴突再生的促进和诱导作用更为显著。
72.具体的，神经导管中钙元素的质量含量可根据加入的矿化胶原粉中矿物的钙元素含量、矿物在矿化胶原中的含量以及胶原与矿化胶原的质量比换算得到。例如，在一种具体的实施方式中，步骤1)中加入的胶原和矿化胶原的质量比为20:5(即矿化胶原在神经导管中所占的质量分数为20％)，矿化胶原通过胶原与羟基磷灰石自组装原位矿化得到，羟基磷灰石在矿化胶原中所占的质量分数为86％，钙元素在羟基磷灰石中所占的质量分数为40％，那神经导管中钙元素的质量含量的计算方式为20％
×
86％
×
40％＝6.88％。
73.进一步的，步骤3)中的交联处理包括：将纤维膜放置于交联剂中交联固定24h；
74.交联剂为包括n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的乙醇溶液，其中，edc的摩尔浓度为40mmol/l，nhs的摩尔浓度为20mmol/l。
75.edc和nhs体系是一种水溶性交联剂，其本身及交联中间产物均可溶于水，不会在基质中引入毒性成分。胶原具有亲水性，采用乙醇作为溶液可避免胶原纤维膜的亲水收缩，卷曲等现象的出现，有利于交联反应的进行。
76.本发明的制备方法采用胶原与矿化胶原为原料制成纺丝液，并对纺丝液进行气纺丝处理，对于气纺丝处理中的纺丝液浓度、气流速度、气体压力、接收装置的距离、纺丝液的注射速度等因素进行控制即可得到纤维直径可控的纳米纤维，通过对纳米纤维进一步进行成膜化和交联处理即可得到纤维直径可控的矿化胶原神经导管。本发明可通过对纤维直径的控制得到满足不同力学性能、生物性能的矿化胶原神经导管。
77.以下将通过具体的实施例对本发明提供的神经导管的制备方法进行详细地阐述。
78.实施例1
79.本实施例的神经导管的制备方法如下：
80.1)将胶原和矿化胶原粉按照质量比为20:5充分溶解于乙酸中，得到质量浓度为20％的纺丝液；
81.其中，矿化胶原粉通过胶原与羟基磷灰石自组装原位矿化得到，其中，矿化在矿化胶原粉中的质量分数为86％，钙元素在羟基磷灰石中的质量分数为40％；
82.2)将纺丝液注入针头内径为0.2mm的注射器中，设置空气压缩机的压力为50psi，气流速度为100m/s，使注射器的针头位于空气压缩机的气压中心区域，以5ml/h的速度推注注射器，使注射器内的纺丝液在气流作用下得到连续稳定的纤维，采用旋转接收滚筒接收纤维，在旋转速度为2000rpm得到厚度为0.5cm的定向纤维膜；再在旋转速度为0rpm下得到厚度为0.5cm的非定向纤维膜；其中，旋转接收滚筒与针头的距离为15cm；
83.3)将定向纤维膜沿轴向方向收集于直径为10cm的实心圆柱磨具上，再将非定向纤
维膜覆盖于定向纤维膜的外表面上，得到复合纤维膜；
84.4)将复合纤维膜置于交联剂中交联固定24小时，冷冻干燥，得到神经导管。其中，交联剂为摩尔浓度为40mmol/l的edc与20mmol/l的nhs的乙醇溶液。
85.采用扫描电镜对本实施例的神经导管的形貌进行表征，表征可知本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm。
86.实施例2
87.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：1。
88.对本实施例的神经导管进行形态的观察，图1为在一种视角下的实施例2的神经导管实物图，图2为在另一种视角下的实施例2的神经导管实物图。
89.采用扫描电镜对本实施例的神经导管的形貌进行表征，图3为本发明实施例2的神经导管的定向纤维sem图，图4为本发明实施例2的神经导管的非定向纤维sem图，表征可知本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm。
90.采用sem对本实施例的神经导管的钙元素分布状态进行表征，图5为本发明实施例2的神经导管的钙元素分布图，如图5所示，钙元素均匀分布在胶原纤维当中。
91.实施例3
92.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.5。
93.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
94.对本实施例的神经导管内壁的定向胶原纤维进行细胞粘附测试，测试方法为：将细胞放置于神经导管的内壁上培养，并采用罗丹明-鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，观察细胞在神经导管内壁上的粘附生长情况。图6为本发明实施例3的神经导管内壁的细胞粘附结果图，如图6所示，细胞可以沿着定向胶原纤维定向粘附生长。
95.实施例4
96.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.8。
97.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
98.实施例5
99.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.6。
100.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
101.实施例6
102.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.4。
103.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
104.实施例7
105.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.2。
106.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
107.实施例8
108.本实施例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中的胶原与矿化胶原粉的质量比为20：0.1。
109.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
110.实施例9
111.本实施例神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤1)中纺丝液的质量浓度为10％。
112.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
113.实施例10
114.本实施神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于：步骤2)中，旋转接收滚筒与针头的距离为20cm。
115.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
116.实施例11
117.本实施例神经导管的制备方法与实施例10基本一致，不同之处在于：步骤2)中，旋转速度为1500rpm。
118.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
119.实施例12
120.本实施例神经导管的制备方法与实施例10基本一致，不同之处在于：步骤2)中，旋转速度为1000rpm。
121.本实施例的神经导管的纤维直径为200nm～400nm，测定方法与实施例1一致。
122.对比例1
123.本对比例神经导管的制备方法如下：
124.1)将胶原和矿化胶原粉混合，胶原与矿化胶原粉质量比为20:20充分溶解于乙酸中，得到质量浓度为10％的纺丝液；其中，矿化胶原粉的组成与实施例1一致；
125.2)将纺丝液注入针头内径为0.2mm的注射器中，设置空气压缩机的压力为50psi，气流速度为100m/s，使注射器的针头位于空气压缩机的气压中心区域，以5ml/h的速度推注注射器，在距离针头20cm处的旋转接收滚筒中得到非丝状产物，为分散且大小不一的液滴，无法得到纤维膜。
126.因此本对比例的神经导管制备失败。
127.对比例2
128.本对比例的神经导管制备方法与对比例1基本一致，不同之处在于：步骤2)中，注射器的推注速度为10ml/h。
129.本对比例也无法得到纤维膜，神经导管制备失败。
130.对比例3
131.本对比例的神经导管的制备方法与对比例2基本一致，不同之处在于：步骤2)中，空气压缩机的压力为100psi。
132.本对比例也无法得到纤维膜，神经导管制备失败。
133.对比例4
134.本对比例的神经导管的制备方法与对比例3基本一致，不同之处在于：步骤2)中，
注射器的针头内径为0.4mm。
135.本对比例也无法得到纤维膜，神经导管制备失败。
136.对比例5
137.本对比例的神经导管的制备方法与对比例3基本一致，不同之处在于：步骤2)中，空气压缩机的气流速度为150m/s。
138.本对比例也无法得到纤维膜，神经导管制备失败。
139.对比例6
140.本对比例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于，将步骤1)中的乙酸替换为六氟异丙醇(hfip)，制备得到的纺丝液无法进行纺丝，神经导管制备失败。
141.对比例7
142.本对比例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于，将步骤1)中的乙酸替换为二甲基亚砜(dmso)，制备得到的纺丝液无法进行纺丝，神经导管制备失败。
143.对比例8
144.本对比例的神经导管的制备方法与实施例1基本一致，不同之处在于，将步骤1)中的乙酸替换为二甲基甲酰胺(dmf)，dmf无法溶解胶原，不能得到纺丝液，因此导致神经导管制备失败。
145.试验例
146.对实施例2、3制备得到的神经导管进行cck8实验，实验方法为：用cck8试剂盒检测细胞活力。实验结果如表1所示。
147.表1
[0148] 1天吸光度3天吸光度5天吸光度实施例20.301.183.3实施例30.331.493.4
[0149]
从表1的数据中可以看出，实施例2、3的神经导管都可以促进细胞增殖，说明神经导管具有良好的生物相容性，其中实施例3细胞增殖最快，说明实施例3的钙含量更能促进细胞增殖。
[0150]
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。