大黄素甲醚微乳液及其应用

1.本发明属于农业生物技术领域，具体地说，涉及一种大黄素甲醚微乳液及其应用。


背景技术：

2.大黄素甲醚(physcion)，结构如式ⅰ所示，蒽醌类化合物，cas登记号为521-61-9。
3.化学名称：1,8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式为c
16h12
o5，分子量284.26。
[0004][0005]
纯品为黄色针状结晶；熔点：203℃～207℃；蒸气压(20～25℃)：4.8
×
10-11
pa；溶解度：溶于苯、氯仿、吡啶、甲苯，微溶于乙酸和乙酸乙酯，不溶于甲醇、乙醚、丙酮，少量大黄素甲醚能缓慢溶于乙醇和水中。在强酸条件下水解，在强紫外线下缓慢光解。
[0006]
大黄素甲醚是从中草药廖科植物大黄的根、茎中提取的一种植物源农药，属蒽醌类高活性抗菌化合物，主要作用机制是细菌糖及糖代谢中间产物的氧化和脱氢，抑制氨氮的同化及氨基酸的氧化、脱氢和脱氨，抑制蛋白质和核酸的合成。
[0007]
大黄素甲醚作为高活性植物源杀菌剂已经有广泛的研究，对白粉病、霜霉病、灰霉病、炭疽病等有很好的防治效果。由于其对人畜实际无毒，来源于植物提取，适合于大面积种植生产，有利于生态环境保护。大黄素甲醚也是植物保护性杀菌剂，诱导植物产生保卫反应，抑制病原菌孢子萌发、菌丝的生长、吸器的形成，使得作物免受病原菌的侵害，达到防病的效果。但其在防治畜禽疾病方面报道和应用较少。
[0008]
大黄素甲醚制剂相关报道，cn112841184a公开了一种大黄素甲醚微乳微囊缓释剂及其制备方法，首先将大黄素甲醚制成微乳剂，增加其溶解度，获得可调控的释放速度，然后将其包封于三聚氰胺甲醛微囊中，获得大黄素甲醚的缓慢释放。该微囊缓释剂具颗粒分布均匀、高载药量、药效缓慢持久的特点，并且制备过程易于操作，原料廉价易得，可用于病虫害，尤其是黄瓜白粉病的防治，可减少给药次数，具有重要的实际应用价值。cn102440243a公开了一种大黄素甲醚可溶粒剂的制备方法，将大黄素甲醚与β-环糊精混合，再加入表面活性剂、填料、渗透剂混合，然后造粒。得到的产品能够遇水共溶，对有效成分进行包埋，防止了活性物质的分解，产品保质期得到延长。
[0009]
大黄素甲醚的应用，国内外也有较多报道。张海晖等通过体外抑菌试验证明大黄提取物之一大黄素甲醚对禽巴氏杆菌、禽大肠杆菌、猪大肠杆有较强的抑菌作用，在酸性条件下抑菌活性最强，中性次之，碱性条件下效果较弱(张海晖等.饲料工业，2004(11):24-26)。吴梓凤等证明大黄素甲醚有一定的有抗菌活性，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑根霉和黑曲霉都有良好的抗菌性能，256μg/ml时表现出良好的抗菌性能，抑菌率能达到75.78％(吴梓凤等.广州化工，2017，45(16):72-74)。聂鲡蓉等体外抑菌实验证明大黄素甲醚对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和变形杆菌有良好的抑制效果，最小抑菌浓度分别为
61.2μg/ml、125μg/ml和31.2μg/ml，显示对水产养殖具有一定的应用价值(聂鲡蓉等.水生态学杂志，2010，31(06))。但是，大黄素甲醚临床应用主要限制于农药领域，杀灭致病性的细菌和真菌，在畜禽养殖领域报道较少，这直接影响了大黄素甲醚的应用和推广。
[0010]
随着畜禽养殖业快速发展，畜禽呼吸道、消化道、生殖道疾病严重影响了畜牧业的发展，尤其是鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体、鼻气管炎鸟杆菌和副鸡嗜血杆菌引起的禽呼吸道病，蜡样芽孢杆菌与鸡杆菌混合感染引起的禽类肝脏破裂，蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎和子宫内膜炎。这些疾病对畜禽生长发育的危害尤为严重，严重影响了畜禽养殖业的健康发展。
[0011]
为维护我国动物源食品安全和公共卫生安全，饲料生产企业逐步停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。采用中药治疗畜禽养殖中的呼吸道疾病，产奶家畜乳腺炎、生殖道疾病污染小、残留少，不会存在药物残留问题。
[0012]
鉴于目前我国畜牧业抗菌素限制使用和畜禽疾病的流行，严重危害养殖业的健康发展，开发替代抗菌素的新型制剂以期解决中国畜禽养殖业卡脖子的技术难题。大黄素甲醚已经报道文献和专利技术，主要局限于农药领域，如何解决大黄素甲醚水溶性和应用于畜牧业替代抗菌素，尚存在许多技术难题。本发明针对上述技术难题，创新水溶性技术和应用技术。


技术实现要素：

[0013]
本发明的目的是提供一种大黄素甲醚微乳液及其应用。
[0014]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种大黄素甲醚微乳液，其是以n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺、乙醇、吐温-20和水配制而成的2.5-10％大黄素甲醚微乳液。
[0015]
进一步地，所述大黄素甲醚微乳液是将2.5-10g大黄素甲醚与20-50ml n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺、20-30ml 75％-100％乙醇、0.1-2ml吐温-20和余量水混合而成，用水补齐至总体积100ml。
[0016]
优选地，所述大黄素甲醚微乳液是将10g大黄素甲醚与n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺50ml、无水乙醇20ml，吐温-20 2ml和余量水混合而成，用水补齐至总体积100ml。
[0017]
具体制备方法如下：将配方量的大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺，再加入无水乙醇和吐温-20，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0018]
第二方面，本发明提供所述微乳液在制备抑菌剂或抗菌药物中的应用。所述药物可以是口服剂、注射剂或气雾剂等。
[0019]
所述菌选自鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体、滑液囊支原体、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、鸡杆菌、鼻气管炎鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌和肺炎克雷伯氏菌等。
[0020]
第三方面，本发明提供所述微乳液在制备由鼻气管炎鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌、克雷伯氏菌、鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体等引起的畜禽呼吸道疾病的防治药物中的应用。
[0021]
第四方面，本发明提供所述微乳液在制备由蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、鸡杆菌等引起的畜禽消化道疾病的防治药物中的应用。
[0022]
畜禽消化道疾病的症状可表现为肝脏破裂。
[0023]
本发明中，所述畜禽包括但不限于肉鸡、蛋鸡、肉鸭、蛋鸭、奶牛、羊。
[0024]
第五方面，本发明提供所述微乳液在制备由蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、葡萄球菌等引起的家畜(如奶牛)乳腺炎、子宫内膜炎的防治药物中的应用。
[0025]
大黄素甲醚微乳液的给药方式是口服给药、注射、气雾给药、乳房灌注或子宫灌注。
[0026]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0027]
本发明提供的大黄素甲醚微乳液可以防治临床耐药菌鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体、鼻气管炎鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌鸡杆菌引起的畜禽呼吸道疾病，由蜡样芽孢杆菌与鸡杆菌混合感染引起的畜禽肝脏破裂，由克雷伯氏菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌和葡萄球菌引起的家畜乳腺炎、子宫内膜炎，从而为畜禽呼吸道、消化道和生殖道感染引起的耐药性细菌病的防治提供有效手段，助力我国畜禽养殖业的健康发展。
附图说明
[0028]
图1为本发明较佳实施例中制备的10％大黄素甲醚微乳剂。
[0029]
图2为本发明较佳实施例中大黄素甲醚灌注后6天牛奶的颜色变化。1：正常鲜奶；2和3：大黄素甲醚高剂量；4和5：大黄素甲醚中剂量；6：大黄素甲醚低剂量。
具体实施方式
[0030]
本发明旨在提供大黄素甲醚微乳液的制备方法及其防治畜禽耐药菌引起的疾病中的应用。
[0031]
所述大黄素甲醚微乳液(大黄素甲醚微乳制剂或大黄素甲醚微乳)是由有机溶剂、表面活性剂组成的微乳体系。优选的微乳体系配方包括n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺、乙醇或吐温-20中的一种或几种。
[0032]
优选地，所述10％大黄素甲醚微乳液是由n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺、无水乙醇、吐温-20和水按体积比25:10:1:14组成的体系配制而成。
[0033]
所述大黄素甲醚给药方式是口服给药、注射、气雾给药、灌注(乳房灌注、子宫灌注)。
[0034]
本发明还提供大黄素甲醚微乳在畜禽呼吸道、消化道和生殖道感染引起的耐药性细菌病防治中的应用。
[0035]
本发明所述畜禽是养殖畜禽动物的简称，包括肉鸡、蛋鸡、肉鸭、蛋鸭、奶牛、羊。
[0036]
所述大黄素甲醚可杀灭临床分离耐药菌为鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体、鼻气管炎鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡杆菌、粪肠球菌、克雷伯氏菌和蜡样芽孢杆菌。
[0037]
所述大黄素甲醚微乳剂可以防治临床耐药菌鹦鹉热衣原体、鸡毒支原体、鼻气管炎鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌鸡杆菌引起的畜禽呼吸道疾病，由蜡样芽孢杆菌与鸡杆菌混合感染引起的畜禽肝脏破裂。由克雷伯氏菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌和葡萄球菌引起的家畜乳腺炎、子宫内膜炎。
[0038]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0039]
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分
比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
[0040]
以下实施例中使用的大黄素甲醚购自中国食品药品鉴定研究院，聚氧乙烯蓖麻油购自阿拉丁化学试剂有限公司，乙醇、吐温-20购自国药集团化学试剂有限公司。
[0041]
实施例1大黄素甲醚微乳的制备
[0042]
1.组成：大黄素甲醚10g，n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺20ml，75％乙醇30ml，加水至100ml。
[0043]
2.制备方法：
[0044]
2.1按处方量分别称取原辅料，备用。
[0045]
2.2将大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺，再加入75％乙醇，吐温-20，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0046]
3.结果：制备的微乳呈现棕褐色，50％溶解，放置后沉淀出现。
[0047]
实施例2大黄素甲醚微乳的制备
[0048]
1.组成：大黄素甲醚10g，n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺20ml，95％乙醇30ml，加水至100ml。
[0049]
2.制备方法：
[0050]
2.1按处方量分别称取原辅料，备用。
[0051]
2.2将大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺，再加入95％乙醇，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0052]
3.结果：制备的微乳呈现棕褐色，60％溶解，放置后沉淀出现。
[0053]
实施例3大黄素甲醚微乳的制备
[0054]
1.组成：大黄素甲醚10g，n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基乙酰胺40ml，95％乙醇30ml，吐温-20 2ml，加水至100ml。
[0055]
2.制备方法：
[0056]
2.1按处方量分别称取原辅料，备用。
[0057]
2.2将大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺，再加入95％乙醇，吐温-20，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0058]
3.结果：制备的微乳呈现棕褐色，80％溶解，部分有沉淀出现。
[0059]
实施例4大黄素甲醚微乳的制备
[0060]
1.组成：大黄素甲醚10g，n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基甲酰胺50ml，95％乙醇20ml，吐温-20 2ml，加水至100ml。
[0061]
2.制备方法：
[0062]
2.1按处方量分别称取原辅料，备用。
[0063]
2.2将大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺，再加入95％乙醇，吐温-20，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0064]
3.结果：制备的微乳呈现棕褐色，90％以上溶解，放置后有少量沉淀出现。
[0065]
实施例5大黄素甲醚微乳的制备
[0066]
1.组成：大黄素甲醚10g，n,n-二甲基甲酰胺或n,n-二甲基甲酰胺50ml，无水乙醇20ml，吐温-20 2ml，加水至100ml。
[0067]
2.制备方法：
[0068]
2.1按处方量分别称取原辅料，备用。
[0069]
2.2将大黄素甲醚溶于n,n-二甲基甲酰胺，再加入无水乙醇，吐温-20，混匀后缓慢加水定容至100ml。
[0070]
3.结果：制备的微乳呈现棕褐色，100％溶解，放置后呈现溶解状态。
[0071]
所制备的10％大黄素甲醚微乳剂见图1。
[0072]
实验例1大黄素甲醚对临床耐药菌mic测定
[0073]
1.实验材料：
[0074]
1.1培养基：mh肉汤(购自北京陆桥鸡数股份有限公司)。
[0075]
1.2抗菌药物：大黄素甲醚，用3％碳酸钠配制溶液，用其溶解大黄素甲醚，配制成512μg/ml母液。
[0076]
1.3鸡杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌，由中国农业大学动物医学院分离和鉴定。
[0077]
1.4工作菌液：mh肉汤培养鸡杆菌、粪肠球菌、克雷伯氏菌、芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌，调整菌液浓度为0.5麦氏浊度。
[0078]
2.实验方法
[0079]
在96孔板各行前10格中，将药物大黄素甲醚稀释为256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml，每孔50μl。第11孔作为溶剂对照加入50μl 3％碳酸钠溶液。第12孔作为阴性对照加入纯水50μl。每孔中加入50μl工作菌液，最后加入50μl mh肉汤，混合均匀，每个浓度做3个复孔。37℃培养24小时，肉眼观察，最后一个孔底清晰，不出现浑浊的孔对应的药物浓度即为该药物的试验菌的最小抑菌浓度。
[0080]
3.实验结果
[0081]
大黄素甲醚对鸡杆菌的mic值为64μg/ml，对粪肠球菌mic值为128μg/ml，对克雷伯氏菌mic值为128μg/ml。大黄素甲醚对芽孢杆菌mic值为128μg/ml。大黄素甲醚对蜡样芽孢杆菌的mic值为128μg/ml。
[0082]
实验例2大黄素甲醚对鹦鹉热衣原体mic实验
[0083]
1.实验材料
[0084]
1.1细胞：hela细胞。
[0085]
1.2抗菌药物：大黄素甲醚，使用时用dmso配制成640μg/ml溶液作为母液。
[0086]
1.3毒株：鹦鹉热衣原体：6bc株、hj株(genbank登录号分别为nc_017287.1、jpih00000000.2)由中国农业大学动物医学院分离和鉴定。
[0087]
2.实验方法
[0088]
取生长对数期hela细胞，用细胞培养液调整至1
×
105/ml，每孔100ul接种96孔板，细胞培养箱培养24h。弃上清，鹦鹉热衣原体以moi＝5感染细胞，37℃细胞培养箱孵育2h。弃上清，每孔加入100ul衣原体生长液，再加入100ul不同稀释度的大黄素甲醚溶液，每个稀释度设4个重复孔，并设2个阳性对照孔(无大黄素甲醚)、2个相应浓度溶剂对照孔(碳酸钠溶液对照)和2个空白对照组。37℃细胞培养箱培养48～72h，弃去上清，吉姆萨染色，以镜检观察不到包含体的最低浓度为mic。
[0089]
3.实验结果
[0090]
6bc株和hj株最小抑菌浓度分别为128μg/ml和256μg/ml。
[0091]
实验例3大黄素甲醚对鹦鹉热衣原体人工感染spf鸡的疗效
[0092]
1.实验材料
[0093]
1.1实验动物：spf鸡(购自北京勃林格翰维通生物技术有限公司)25日龄，48只。
[0094]
1.2实验药物：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0095]
对照药物：强力霉素(购自中国食品药品鉴定研究院)含量95％。
[0096]
1.3毒株：
[0097]
鹦鹉热衣原体：hj株(genbank登录号jpih00000000.2)，109ifu/ml，由中国农业大学动物医学院分离和鉴定。
[0098]
2.实验分组：将48只spf鸡随机分为5组，每组8只，分别为大黄素甲醚高剂量组、中剂量组、低剂量组、强力霉素组以及攻毒对照组。
[0099]
3.实验方法：
[0100]
各组均喉头气管接种鹦鹉热衣原体，1
×
107ifu/0.2ml/只，鸡群出现呼吸道症状(攻毒3天后)，开始给药处理，按照分组进行灌服给药，大黄素甲醚高剂量组9mg/只/天；大黄素甲醚中剂量组6mg/只/天，低剂量组4mg/只/天，强力霉素组3mg/只/天，攻毒对照组不给药。连续给药6天。
[0101]
观察指标：记录spf鸡攻毒前、给药前、剖检前体重。停药后处死全部spf鸡，剖检观察其肺、气囊的病理变化并按照病变指数评分标准进行评分。按照病变积分进行测定结果。
[0102]
气囊、肺脏的病变指数评分标准如下：
[0103]
单侧气囊评分：0-表示气囊正常，清洁透明而薄；1-气囊稍有增厚、轻度浑浊，或在个别局部有黄白色露水珠样斑点；2-气囊部分区域有明显的渗出物，同时伴有气囊的中度增厚；3-气囊内布满黄白色干酪样渗出物，并有严重增厚。
[0104]
单侧肺脏评分：0-肺脏正常，无明显病理变化；1-肺脏30％左右面积出血性或坏死性变化；2-肺脏60％左右面积出血性或坏死性变化；3-全部肺脏呈现出血性或坏死性病理变化。
[0105]
病毒载量测定：采用荧光定量pcr(sybrgreen)绝对定量法，测定脾脏鹦鹉热衣原体载量。
[0106]
4.实验结果
[0107]
4.1药物对spf鸡体重的影响：
[0108]
表1药物对spf鸡体重的影响
[0109][0110]
从表1结果可以看出，给药后，各给药组相比攻毒对照组增重率率均增加，其中大黄素甲醚高剂量组增重效果最为明显。
[0111]
4.2药物对spf鸡气囊、肺脏病变的影响
[0112]
经鹦鹉热衣原体鸡的主要病变表现为气囊浑浊、肺脏点状出血以及渗出，病变程度及评分见表2。
[0113]
表2用药后spf鸡气囊、肺脏病变及评分
[0114][0115]
从表2结果可以看出，气囊病变严重程度依次为：攻毒对照组＞大黄素甲醚低剂量组＞大黄素甲醚中剂量组＞大黄素甲醚高剂量组＞强力霉素组。
[0116]
肺脏病变严重程度依次为：大黄素甲醚低剂量组＞攻毒对照组＞大黄素甲醚中剂量组＞大黄素甲醚高剂量组＞强力霉素组。
[0117]
提示大黄素甲醚对鹦鹉热衣原体感染spf鸡有一定的治疗效果，并且呈现剂量效应关系。
[0118]
4.3荧光定量法测定spf鸡肺脏脾脏鹦鹉热衣原体载量
[0119]
采用荧光定量pcr(sybrgreen)绝对定量法检测spf鸡脾脏鹦鹉热衣原体载量见表3。
[0120]
表3鹦鹉热衣原体载量
[0121][0122][0123]
注：**表示与攻毒对照组相比差异极显著(p《0.01)。
[0124]
从表3可以看出，与攻毒对照组相比，给药组衣原体载量均降低，高剂量组、强力霉素组与攻毒对照组差异极显著(p《0.01)；低剂量组、中剂量组差异不显著(p》0.05)。这提示大黄素甲醚高剂量对鹦鹉热衣原体的清除效果显著。
[0125]
5.结论
[0126]
从以上实验结果可以看出，鹦鹉热衣原体感染模型造模成功，大黄素甲醚剂量达
到9mg/只/天时对鹦鹉热衣原体hj株的攻击有较好的抵抗作用，能够增加体重增长速率，显著性降低spf鸡脾脏鹦鹉热衣原体载量以及气囊的病变程度。
[0127]
实验例4大黄素甲醚防治临床鸡杆菌与蜡样芽孢杆菌引起的肝脏破裂
[0128]
1.实验材料
[0129]
1.1试验动物：临床鸡杆菌与蜡样芽孢杆菌混合感染褐种鸡，140日龄，病死鸡存在肝脏质脆、破裂等病变。
[0130]
1.2试验药物：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0131]
2实验方法
[0132]
2.1试验分组：空白组19100只；给药组19100只。
[0133]
2.2给药方式：按照330克/1000斤料，与饲料充分混合，连续给药6天，每天1次。
[0134]
2.3试验指标：死淘率和平均每日耗料量。
[0135]
3.试验结果：
[0136]
3.1大黄素甲醚对鸡杆菌及蜡样芽孢杆菌混合感染病鸡死淘率的影响
[0137]
表4死淘率
[0138][0139]
表4结果显示大黄素甲醚能够显著降低蜡样芽孢感染鸡群的死淘率。
[0140]
3.2大黄素甲醚对鸡杆菌及蜡样芽孢杆菌混合感染病鸡耗料量的影响
[0141]
表5耗料量
[0142][0143][0144]
表5结果显示大黄素甲醚能够增加蜡样芽孢感染鸡群平均每日耗料量。
[0145]
4.结论
[0146]
从以上实验结果可以看出大黄素甲醚，增加病鸡每日耗料量，有效降低鸡杆菌及蜡样芽孢杆菌混合感染病鸡的死淘率。
[0147]
实验例5大黄素甲醚对支原体、临床分离大肠杆菌混合感染的疗效炎症
[0148]
1.实验材料
[0149]
1.1实验动物：spf鸡：21日龄，北京勃林格翰维通生物技术有限公司，64只。
[0150]
2.2实验药物：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0151]
大黄酸：(购自中国食品药品鉴定研究院)。
[0152]
对照药物：强力霉素(购自中国食品药品鉴定研究院)含量95％。
[0153]
2.3毒株：
[0154]
鸡毒支原体：r株，109ifu/ml(genbank登录号为cp001872.1，由山东省滨州畜牧兽
医研究院提供)。
[0155]
3.实验分组：将64只spf鸡随机分为8组，每组8只，分别为4个大黄素甲醚组、强力霉素对照组、大黄酸对照组、空白对照组以及攻毒对照组。
[0156]
4.实验方法：
[0157]
支原体菌液浓度调整至109cfu/ml，处理组每只鸡滴鼻点眼0.1ml，连续感染3天，每天1次。感染7天后，大肠杆菌菌液浓度调整至106cfu/ml，每只鸡腹腔注射0.2ml，感染1次。鸡群出现呼吸道症状(攻毒3天后)，开始给药处理，按照分组进行灌服给药，大黄素甲醚1组25mg/kg/天；大黄素甲醚2组13mg/kg/天，大黄素甲醚3组7mg/只/天，大黄素甲醚4组4mg/kg/天，强力霉素对照组5mg/只/天，大黄酸对照组13mg/kg/天。连续给药6天后剖检。
[0158]
观察指标：记录spf鸡攻毒前、给药前、剖检前体重。停药后处死全部spf鸡，剖检观察其气囊的病理变化并按照病变指数评分标准进行评分。按照病变积分进行测定结果，积分标准见实验例1。
[0159]
病毒载量测定：采用荧光定量pcr(sybrgreen)绝对定量法，测定支原体载量。
[0160]
5.实验结果
[0161]
5.1药物对spf鸡体重的影响：
[0162]
表6药物对spf鸡体重的影响
[0163][0164][0165]
表6结果表明大黄素甲醚剂量越大，平均体重增高越明显。相比强力霉素组，大黄素甲醚25mg/kg、7mg/kg剂量组效果更好，其他较低剂量组效果不如强力霉素组。相比大黄酸组，大黄素甲醚25mg/kg剂量组效果更好，其他较低剂量组效果不如大黄酸组。
[0166]
5.2菌落平板计数法测定spf鸡肝脏大肠杆菌载量
[0167]
采用菌落平板计数法测定spf鸡肝脏大肠杆菌载量见表7。
[0168]
表7大肠杆菌载量
[0169][0170]
注：**表示与攻毒对照组相比差异极显著(p《0.01)。
[0171]
表7结果显示大黄素甲醚能够有效清除肝脏大肠杆菌，且存在剂量效应关系。与强力霉素相比，大黄素甲醚25mg/kg剂量效果与强力霉素相近，较低剂量组效果不如强力霉素。与大黄酸相比，大黄素甲醚效果更好。
[0172]
5.3荧光定量法测定spf鸡肺脏鸡毒支原体载量
[0173]
采用荧光定量pcr(sybrgreen)绝对定量法检测spf鸡肺脏鸡毒支原体载量如下：
[0174]
表8鸡毒支原体载量
[0175][0176]
注：**表示与攻毒对照组相比差异极显著(p《0.01)。
[0177]
表8结果显示大黄素甲醚对鸡肺部鸡毒支原体清楚效果显著，且存在一定的剂量效应关系。与强力霉素对照组相比，效果不如强力霉素对照组。与大黄酸对照组相比，除4mg/kg剂量组外，大黄素甲醚各剂量组均比大黄酸对照组效果好。
[0178]
6.结论
[0179]
以上实验结果显示，大黄素甲醚对的大肠杆菌、鸡毒支原体的清除效果明显，且呈剂量效应关系。
[0180]
实验例6大黄素甲醚防治奶牛乳房炎、子宫内膜炎
[0181]
1实验材料
[0182]
1.1试验动物：临床型乳房炎发病奶牛以及临床子宫内膜炎病牛(黑白花牛，300日龄，体重400公斤，临床诊断为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌混合感染)，由宁夏北方乳业责任有限公司提供。
[0183]
1.2试验药物：
[0184]
1.2.1乳房炎病症治疗药物
[0185]
大黄素甲醚乳房灌注剂：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0186]
对照药物：
[0187]
速单宁(盐酸林可霉素乳房注入剂—泌乳期)：8g/支，20只/盒，河北远征药业有限公司生产，生产批号：ddm200904。
[0188]
赛福魁(硫酸头孢喹肟乳房注入剂—泌乳期)：8g/支，20只/盒，河北远征药业有限公司生产，生产批号：dav210305。
[0189]
1.2.2子宫内膜炎病症治疗药物
[0190]
大黄素甲醚子宫灌注剂：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0191]
宫净油(促孕灌注液)：主要成分为淫羊藿、益母草、红花，100ml/瓶，嘉兴九天元亨生物科技股份有限公司生产，生产批号：2020062201。
[0192]
2.试验方法
[0193]
2.1乳房炎病症治疗组：
[0194]
各病例随机分别归入试验药物组，其剂量如下：
[0195]
大黄素甲醚高剂量组：将大黄素甲醚经患侧乳头向乳池注入乳腺内，每次30ml，每日1次，疗程5天。
[0196]
大黄素甲醚中剂量组：经大黄素甲醚患侧乳头向乳池注入乳腺内，每次25ml，每日1次，疗程5天。
[0197]
大黄素甲醚低剂量组：经大黄素甲醚患侧乳头向乳池注入乳腺内，每次20ml，每日1次，疗程5天。
[0198]
速单宁注射液对照组：经患侧乳头向乳池注入乳腺内，每次1支(8g)，每日1次，疗程5天。
[0199]
赛福魁注射液对照组：经患侧乳头向乳池注入乳腺内，每次1支(8g)，每日1次，疗程5天。
[0200]
各组药物以奶牛通乳针将药物注入乳头口后均轻捏乳头口，温和地按摩乳房，将药物向乳腺上部推挤。
[0201]
2.2子宫内膜炎病症治疗组：
[0202]
大黄素甲醚高剂量组：大黄素甲醚50ml/头牛/天，每日1次，疗程5天。
[0203]
大黄素甲醚中剂量组：大黄素甲醚30ml/头牛/天，每日1次，疗程5天。
[0204]
对照药物：宫净油灌注剂，40ml/头牛/天，每日1次，疗程5天。
[0205]
3.试验结果
[0206]
表9大黄素甲醚对奶牛乳房炎治疗效果
[0207][0208]
表10大黄素甲醚对奶牛子宫内膜炎治疗效果
[0209][0210]
大黄素甲醚灌注后6天牛奶的颜色变化见图2。
[0211]
4.结论
[0212]
以上实验结果证明，乳房灌注大黄素甲醚对奶牛乳房炎有一定的治疗效果，能够提高牛奶品质。大黄素甲醚能够有效减少奶牛阴门脓性分泌物，对治疗子宫内膜炎效果明显。
[0213]
实验例7大黄素甲醚急性毒性实验
[0214]
1.实验材料
[0215]
1.1药物：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0216]
1.2实验动物：spf级icr小鼠(购自北京大学医学部)120只，体重18.0-22.0g，雌雄各半。
[0217]
2.方法
[0218]
2.1试验方法
[0219]
将icr雌雄小鼠230只(雌雄各半)根据体重随机分成23组，隔夜禁食不禁水12h，按a(最低基本毒性剂量)＝200mg/kg体重，r(等比级数)＝1.4，分别灌胃0.10、0.14、0.20、0.28、0.39、0.55、0.77、1.08、1.51、2.11、2.95、g/kg体重剂量的大黄素甲醚，以及一个生理盐水对照组(分组给药情况见表11)，一次性灌胃，连续观察7天。
[0220]
每日记录小鼠体重，分析体重变化。
[0221]
详细记录动物毒性反应情况和死亡情况，采食情况，计算ld50的可信区间。记录中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复期等。
[0222]
死亡动物及时进行尸检，记录病变情况。
[0223]
2.2数据分析
[0224]
试验数据用excel2007和spss20.0统计软件进行数据处理和一维方差分析，试验数据用(x
±
sd)表示。差异显著为p《0.05、差异极显著为p《0.01。
[0225]
根据观察小鼠死亡情况，使用spss软件根据bliss法计算急性毒性ld
50
的剂量。
[0226]
3.试验结果
[0227]
3.1大黄素甲醚对icr小鼠存活率的影响
[0228]
表11大黄素甲醚急性毒性分组和死亡情况
[0229][0230][0231]
使用spss软件根据bliss法计算大黄素甲醚急性毒性ld
50
为2.525g/kg。
[0232]
4结论
[0233]
比对药物急性毒性标准，大黄素甲醚微乳剂属于实际无毒。
[0234]
实验例8大黄素甲醚不同时间点在血浆中的含量测定
[0235]
1.实验材料
[0236]
1.1实验动物：spf鸡(购自北京勃林格翰维通生物技术有限公司)25日龄，8只。
[0237]
1.2实验药物：实施例5制备的大黄素甲醚微乳。
[0238]
2.实验方法
[0239]
spf鸡试验前12h禁食，自由饮水。收集给药前、给药后的血浆，血浆样本置于-80℃冰箱中保存，按20mg/kg体重的剂量一次性灌胃给药。
[0240]
采集给药后15min、30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h和4h的血液于抗凝管中，8000rpm离心10min,取上清于-80℃冰箱中冻存:收集给药后8～12h，20～24h内的类样，置于-80℃保存，备用。
[0241]
取血浆100ul加入到内标管中，涡旋1min，加400ul乙腈进行沉淀蛋白，涡旋2min，
[0242]
超声5min，离心(12000rpm，5min)，取上清液400μl置干净的5ml离心管中，25℃下氮气吹干，加150μl甲醇进行复溶，离心(12000rpm，5min)，取上清液即可。使用hplc法检测各个时间点大黄素甲醚浓度。
[0243]
3.实验结果见表12。
[0244]
表12给药后大黄素甲醚在血浆中浓度
[0245]
时间给药前15min30min1h1.5h浓度mg/ml00.0296
±
0.00240.0287
±
0.00360.0352
±
0.00370.0309
±
0.0009时间2h2.5h3h3.5h4h浓度mg/ml0.0300
±
0.00400.0257
±
0.00130.0259
±
0.00070.0257
±
0.00080.0257
±
0.0015时间6h8h10h12h24h浓度mg/ml0.0250
±
0.00110.0245
±
0.00120.0190
±
0.00110.0170
±
0.00140.009
±
0.0011
[0246]
spf鸡经大黄素甲醚灌胃，1小时内血浆中大黄素甲醚浓度逐渐升高，1小时达到峰值，浓度为0.0309mg/ml，随后逐渐下降。
[0247]
4.结论
[0248]
大黄素甲醚口服进入血液1小时达到高峰，持续稳定存在达到8小时，12小时达到半衰期。
[0249]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。