一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用与流程

1.本发明涉及病理检测试剂领域，具体涉及一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用。


背景技术：

2.免疫组化（ihc）是目前病理诊断过程中不可或缺的重要技术手段，在肿瘤确诊、分型鉴定、指导用药、预后评价及疗效评估等方面起到了不可估量的作用。
3.top2a、p27kip1、gst-pi、epcam、podoplanin、vegfa等六种抗体在即用型抗体试剂（免疫组化）中，含量极其微量，用传统的抗体稀释液配制抗体试剂时表现很不稳定，配制的即用型抗体试剂（免疫组化）有效期极短。
4.即用型免疫组化抗体（蛋白质）试剂一般以溶液形式存在，保存于2-8℃，对用户而言，即取即用，十分方便，而抗体（蛋白质）在溶液中往往不稳定。
5.抗体（蛋白质）失去功效的原因主要有以下几点：1）蛋白质的变性：抗体（蛋白质）试剂的储存与应用，往往会有一个较大的温度变化，如常见的现象是抗体试剂储存于冰箱（2-8℃）中，使用时的温度往往是37℃。温度的变化对一些抗体（蛋白质）将引起蛋白质构象的改变，从而抗体（蛋白质）失去原来的功能（活性）， 目前临床应用的抗体往往是人工制备，如重组表达，其结构的稳定性本身就不如天然的抗体，尤其是抗体含量极低的抗体试剂（免疫组化）极不稳定，在溶液中容易发生抗体构型的变化而失去抗体应有的活性；2）蛋白质的酶解或水解：在配制抗体试剂液（免疫组化）时，常常会带入一些蛋白质的降解酶或水解酶，这些酶会将溶液中的抗体进行酶解或水解，从而引起目标抗体的降解，抗体试剂也就失去了活性；3）微生物的污染，引起蛋白质的降解，而微生物的生长与繁殖，需要消耗生长环境中的营养物质，所以微生物生长会分泌一些蛋白质分解酶来分解蛋白质转化为氨基酸，将氨基酸吸收入微生物中转化为营养物质。
6.总而言之，传统的抗体稀释液配制抗体试剂不稳定，易使抗体（蛋白质）失去功效，有效期短。


技术实现要素：

7.基于上述现有的抗体稀释液配制抗体试剂不稳定，易使抗体（蛋白质）失去功效，有效期短的问题，本发明提供一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，以使针对上述现有的抗体稀释液配制抗体试剂不稳定，易使抗体（蛋白质）失去功效，有效期短的技术问题提出如下技术方案：本发明提供一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，它包括通用型抗体稀释液，所述通用型抗体稀释液包括生物缓冲液、蛋白保护剂、蛋白稳定剂、高分子加速剂（增敏剂）、蛋白分散剂、高效蛋白酶抑制剂。
8.进一步地，所述通用型抗体稀释液还包括防腐剂。
9.进一步地，所述生物缓冲液为tris-hcl缓冲液或者磷酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液由1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、8g氯化钠、0.2g氯化钾配制而成，配制1000ml，调节ph值为7.4。
10.进一步地，所述蛋白保护剂包括bsa、明胶、酪蛋白、蛋白胨中的任意一种或两种以上的组合，优选采用其中的牛血清白蛋白（bsa）、明胶以及酪蛋白组合，其组成分别为牛血清白蛋白（bsa）0.01-5%、明胶0.01-0.25%、酪蛋白0.01-0.5%，以此降低目标蛋白的降解程度，从而有效地保护目标蛋白的活性。
11.进一步地，所述蛋白稳定剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的任意一种或两种以上的组合，优选采用蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚乙二醇及海藻糖的组合，其组成分别为蔗糖0.05-10%、聚乙烯吡咯烷酮0.01-1%、葡聚糖0.01-5%、聚乙二醇0.05-10%、海藻糖0.05-5%，防止抗体试剂溶液发生温度变化或长期处于高温环境条件下引起抗体（蛋白）的变性，从而有效地稳定目标蛋白的活性。
12.进一步地，所述高分子加速剂（增敏剂）包括聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上的组合，采用聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，其组成分别为聚乙二醇0.05-10%、葡聚糖0.01-5%、聚乙烯吡咯烷酮0.01-1%，以此加速抗体与抗原的结合，从而有效地提高抗体的活性。
13.进一步地，所述蛋白分散剂包括表面活性剂s3、表面活性剂s9、triton-x100、tween-20、tween-80中的一种或二种以上的组合，优选采用tween-20，其组成为0.01-1%，以此降低目标蛋白的自凝集，防止目标蛋白的沉淀，从而有效地保护目标蛋白的活性。
14.进一步地，所述高效蛋白酶抑制剂包括蛋白酶抑制剂复合物中的一种或两种以上的组合，以此抑制目标蛋白的酶解，从而有效地防止目标蛋白被降解。
15.进一步地，所述防腐剂包括叠氮化钠、麝香草酚、proclin300、硫柳汞中的任意一种或两种以上组合，，优选使用proclin300，其组成为0.01-0.15%，以此抑制抗体试剂溶液中微生物的生长，从而有效地防止目标蛋白被微生物降解。
16.进一步地，所述通用型抗体稀释液以液体形式配制，使用时不需要进行二次复配，加入合适抗体的量直接使用，配制的即用型抗体试剂中抗体含量均小于100ng/ml。
17.本发明的技术方案，具有如下的优点：（1）抗体稀释液中不仅有蛋白质保护剂还使用了蛋白质稳定剂，进一步提高了抗体蛋白的稳定性，有效地防止因蛋白质表面分子（伴侣分子）的丢失或缺失导致蛋白质构象被破坏的情况发生，从而使溶液中极微量的抗体蛋白更加稳定。
18.（2）抗体稀释液中加入了高分子加速剂（增敏剂），加速抗体与抗原的结合速度，避免了抗体含量极其微量而需要延长抗体孵育时间，最终提高抗体的检测灵敏度。
19.（3）抗体稀释液中加入了高效的蛋白酶抑制剂复合物，防止蛋白酶对微量抗体蛋白的降解作用，从而进一步地保护微量抗体。
20.（4）极其微量抗体的抗体试剂（免疫组织）在组织染色时，往往本底较浅，背景好，表现出较好的染色效果。
21.（5）极微量抗体含量的即用型抗体试剂（免疫组织），在2-8℃的保存条件下，长期储存，抗体试剂有效期大于12个月，抗体稳定性好。
附图说明
22.图1为本发明提供的一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用的染色效果图（利用实施例1中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中top2a抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）；图2为本发明提供的一种极微量抗体含量即用型抗体试剂（免 疫组化）的配制及其应用的染色效果图（利用实施例1中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中p27kip1抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）；图3为本发明提供的一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用的染色效果图（利用实施例2中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中gst pi抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）；图4为本发明提供的一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用的染色效果图（利用实施例2中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中epcam抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）；图5为本发明提供的一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用的染色效果图（利用实施例3中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中podoplanin抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）；图6为本发明提供的一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用的染色效果图（利用实施例3中的通用型抗体稀释液，通过实施例4中vegfa抗体试剂的配制方法进行稀释，按照实施例5的实验方法进行免疫组化）。
具体实施方式 23.下面结合图1至图6以及具体实施方式对本发明作进一步的描述。
24.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的配制手段。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
25.本发明提供一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，它包括通用型抗体稀释液，所述通用型抗体稀释液包括生物缓冲液、蛋白保护剂、蛋白稳定剂、高分子加速剂（增敏剂）、蛋白分散剂、高效蛋白酶抑制剂。
26.进一步地，所述通用型抗体稀释液还包括防腐剂。
27.进一步地，所述生物缓冲液为tris-hcl缓冲液或者磷酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液由1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、8g氯化钠、0.2g氯化钾配制而成，配制1000ml，调节ph值为7.4。
28.进一步地，所述蛋白保护剂包括bsa、明胶、酪蛋白、蛋白胨中的任意一种或两种以上的组合，优选采用其中的牛血清白蛋白（bsa）、明胶以及酪蛋白组合，其组成分别为牛血清白蛋白（bsa）0.01-5%、明胶0.01-0.25%、酪蛋白0.01-0.5%，以此降低目标蛋白的降解程度，从而有效地保护目标蛋白的活性。
29.进一步地，所述蛋白稳定剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的任意一种或两种以上的组合，优选采用蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚
乙二醇及海藻糖的组合，其组成分别为蔗糖0.05-10%、聚乙烯吡咯烷酮0.01-1%、葡聚糖0.01-5%、聚乙二醇0.05-10%、海藻糖0.05-5%，防止抗体试剂溶液发生温度变化或长期处于高温环境条件下引起抗体（蛋白）的变性，从而有效地稳定目标蛋白的活性。
30.进一步地，所述高分子加速剂（增敏剂）包括聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种以上的组合，采用聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，其组成分别为聚乙二醇0.05-10%、葡聚糖0.01-5%、聚乙烯吡咯烷酮0.01-1%，以此加速抗体与抗原的结合，从而有效地提高抗体的活性。
31.进一步地，所述蛋白分散剂包括表面活性剂s3、表面活性剂s9、triton-x100、tween-20、tween-80中的一种或二种以上的组合，优选采用tween-20，其组成为0.01-1%，以此降低目标蛋白的自凝集，防止目标蛋白的沉淀，从而有效地保护目标蛋白的活性。
32.进一步地，所述高效蛋白酶抑制剂包括蛋白酶抑制剂复合物中的一种或两种以上的组合，以此抑制目标蛋白的酶解，从而有效地防止目标蛋白被降解。
33.进一步地，所述防腐剂包括叠氮化钠、麝香草酚、proclin300、硫柳汞中的任意一种或两种以上组合，，优选使用proclin300，其组成为0.01-0.15%，以此抑制抗体试剂溶液中微生物生长，从而有效地防止目标蛋白被微生物降解。
34.进一步地，所述通用型抗体稀释液以液体形式配制，使用时不需要进行二次复配，加入合适抗体的量直接使用，配制的即用型抗体试剂中抗体含量均小于100ng/ml。
35.本发明提出了一种极微量抗体含量即用型抗体试剂（免疫组化）的配制及其应用，为了实现本发明的目的，首先配制通用型抗体稀释液，利用该抗体稀释液配制top2a、p27kip1、gst-pi、epcam、podoplanin、vegfa等抗体的即用型抗体试剂（免疫组化），然后通过病理组织切片的免疫组化染色验证。
36.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，生物缓冲液为磷酸盐缓冲液，其有效成分为：na2hpo4、kh2po4、nacl、kcl。
37.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，蛋白保护剂主要为蛋白类物质，其有效成分为：bsa、明胶、酪蛋白。
38.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，蛋白稳定剂主要为高分子糖类物质，其有效成分为：蔗糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、海藻糖。
39.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，高分子加速剂（增敏剂）主要为有机高分子类物质，其有效成分为：葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮。
40.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，蛋白分散剂主要为表面活性类物质，其有效成分为：tween-20。
41.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，高效蛋白酶抑制剂为一种复合物，其有效成分为：蛋白酶抑制剂复合物（protease inhibitor cocktail，cat#:p1860）。
42.实现本发明所述“通用型抗体稀释液”，防腐剂也是一种复合物，其商品通用名为proclin300。
43.为了实现本发明所述的“通用型抗体稀释液”，其各组分配比如下：生物缓冲液：
有效组份：实现本发明所述，提出的“一种极微量抗体含量即用型抗体试剂（免疫组化）的配制”，是通过配制top2a、p27kip1、gst-pi、epcam、podoplanin、vegfa等抗体的即用型抗体试剂（免疫组化）来验证的。配制如下：top2a抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为top2a重组兔单克隆抗体，克隆号ep1102y，品牌abcam，抗体浓度0.16mg/ml，ihc应用稀释比1:8000。
44.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释8000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到8ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为20ng/ml。
45.p27kip1抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为p27kip1重组兔单克隆抗体，克隆号epr18388-138，品牌abcam，抗体浓度0.605mg/ml，ihc应用稀释比1:40000。
46.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释40000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到40ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为15ng/ml。
47.gst pi抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为gst pi重组兔单克隆抗体，克隆号epr20554，品牌abcam，抗体浓度0.281mg/ml，ihc应用稀释比1:4000。
48.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释4000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到4ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为70ng/ml。
49.epcam抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为epcam重组兔单克隆抗体，克隆号epr20532-222，品牌abcam，抗体浓度0.747mg/ml，ihc应用稀释比1:16000。
50.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释16000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到16ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为47ng/ml。
51.podoplanin抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为podoplanin重组兔单克隆抗体，克隆号epr22182，品牌abcam，抗体浓度0.294mg/ml，ihc应用稀释比1:4000。
52.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释4000倍即可，如：取1ul抗体原液加
入到4ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为73.5ng/ml。
53.vegfa抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为vegfa重组兔单克隆抗体，克隆号epr21220，品牌abcam，推荐使用浓度为100ng/ml，为小鼠组织ihc染色专用。
54.配制方法是利用通用型抗体稀释液将抗体稀释5000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到5ml抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为100ng/ml。
55.具体而言：本发明涉及一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，可用于免疫组织化学抗体试剂（一抗）的配制与即用型抗体试剂（免疫组化）生产。本发明核心内容是通用型的抗体稀释液配制，并利用该抗体稀释液配制即用型抗体试剂（免疫组化）及其临床应用。通用型抗体稀释液包括如下的有效成分：生物缓冲液、蛋白保护剂、蛋白稳定剂、高分子加速剂（增敏剂）、蛋白分散剂、高效蛋白酶抑制剂、防腐剂等成份，此处所指的常规抗体含量是指即用型抗体试剂（免疫组化）中抗体浓度大于0.5ug/ml；而极微量抗体含量是指即用型抗体试剂（免疫组化）中抗体浓度低于0.1ug/ml（100ng/ml）。利用本发明的通用型抗体稀释液配制的极微量抗体含量即用型抗体试剂（免疫组化）具有高敏感性、低本底、染色清晰、有效期长的特点。
56.实施例1：一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，所述的通用型抗体稀释液，其配制的原料组成：生物缓冲液：有效组份：配制过程如下：配制操作步骤1：配制生物缓冲液（磷酸盐缓冲液，ph7.4，1000ml）,称取1.44g na2hpo4、0.24g kh2po4、8g nacl、0.2g kcl，溶解于1000ml的蒸馏水中，充分溶解后，调节ph
proclin300加入到s2液中，充分搅拌混匀，即为通用型抗体稀释液。
61.实施例3：一种即用型抗体试剂（免疫组化）的配制方法及其应用，所述的通用型抗体稀释液，其配制的原料组成：生物缓冲液：有效组份：葡聚糖1.0% 聚乙烯吡咯烷酮0.15% 蔗糖 3% 海藻糖1% bsa 5%明胶0.1%酪蛋白0.05% 聚乙二醇
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1.5%tween-20 0.05%蛋白酶抑制剂复合物 0.5%proclin300 0.05%配制过程如下：配制操作步骤1：配制生物缓冲液（磷酸盐缓冲液，ph7.4，1000ml）,称取1.44g na2hpo
4、
0.24g kh2po4、8g nacl、0.2g kcl，溶解于1000ml的蒸馏水中，充分溶解后，调节ph值为7.4即可。
62.配制操作步骤2：量取生物缓冲液100ml，称取0.1g明胶、0.05g酪蛋加入，60-80℃水浴溶解，即为s1液。
63.配制操作步骤3：称取1.0g葡聚糖、0.15g聚乙烯吡咯烷酮、3g蔗糖、1g海藻糖、5gbsa、1.5g聚乙二醇加入到s1液中，充分搅拌溶解，即为s2液。配制操作步骤4：量取0.05ml tween20、0.5ml蛋白酶抑制剂复合物、0.05ml proclin300加入到s2液中，充分搅拌混匀，即为通用型抗体稀释液。
64.实施例4：实现本发明所述，提出的“一种极微量抗体含量即用型抗体试剂（免疫组化）的配制”，是通过配制top2a、p27kip1、gst-pi、epcam、podoplanin、vegfa等抗体的即用型抗体试剂（免疫组化）来验证的。配制如下：（1）top2a抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为top2a重组兔单克隆抗体，克隆号
ep1102y，品牌abcam，抗体浓度0.16mg/ml，ihc应用稀释比1:8000。
65.配制方法是利用实施例1中的通用型抗体稀释液将抗体稀释8000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到8ml实施例1中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为20ng/ml。
66.（2）p27kip1抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为p27kip1重组兔单克隆抗体，克隆号epr18388-138，品牌abcam，抗体浓度0.605mg/ml，ihc应用稀释比1:40000。
67.配制方法是利用实施例1中的通用型抗体稀释液将抗体稀释40000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到40ml实施例1中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为15ng/ml。
68.（3）gst pi抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为gst pi重组兔单克隆抗体，克隆号epr20554，品牌abcam，抗体浓度0.281mg/ml，ihc应用稀释比1:4000。
69.配制方法是利用实施例2中的通用型抗体稀释液将抗体稀释4000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到4ml实施例2中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为70ng/ml。
70.（4）epcam抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为epcam重组兔单克隆抗体，克隆号epr20532-222，品牌abcam，抗体浓度0.747mg/ml，ihc应用稀释比1:16000。
71.配制方法是利用实施例2中的通用型抗体稀释液将抗体稀释16000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到16ml实施例2中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为47ng/ml。
72.（5）podoplanin抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为podoplanin重组兔单克隆抗体，克隆号epr22182，品牌abcam，抗体浓度0.294mg/ml，ihc应用稀释比1:4000。
73.配制方法是利用实施例3中的通用型抗体稀释液将抗体稀释4000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到4ml实施例3中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为73.5ng/ml。
74.（6）vegfa抗体试剂（免疫组化）：抗体原料为vegfa重组兔单克隆抗体，克隆号epr21220，品牌abcam，推荐使用浓度为100ng/ml，为小鼠组织ihc染色专用。
75.配制方法是利用实施例3中的通用型抗体稀释液将抗体稀释5000倍即可，如：取1ul抗体原液加入到5ml实施例3中的抗体稀释液中混匀即可。抗体终浓度约为100ng/ml。
76.实施例5：即用型抗体试剂（免疫组化）的应用验证取相关的石蜡组织切片，置于烤箱（65-75℃）中烤片30分钟，移入“四合一”脱蜡修复阻断液中沸水浴20分钟，一次性完成脱蜡、水化、修复、阻断过程。
77.使用pbs-t漂洗液冲洗切片，冲洗3次，每次3分钟。
78.滴加即用型抗体试剂（免疫组化）100ul，充分覆盖样本，室温下孵育30分钟。
79.使用pbs-t漂洗液冲洗切片，冲洗3次，每次3分钟。
80.滴加免疫组化兔鼠通用型二抗（ployhrp-anti-mouse/rabbit igg）100ul，充分覆盖样本，室温下孵育30分钟。
81.使用pbs-t漂洗液冲洗切片，冲洗3次，每次3分钟。
82.滴加dab显色试剂(3 ,3二氨基联苯胺)100μl，充分覆盖样本，室温避光孵育5-10min显色。显色结束后加入苏木素孵育3-5min复染。洗去苏木素后用10％盐酸中浸泡分化5秒，并迅速用去离子水冲洗5分钟。
83.将切片依次浸入85％乙醇（3分钟）、95％乙醇（3分钟）、无水乙醇（3分钟）进行脱水处理。脱水完成后将切片浸泡于环保型脱蜡剂中，1-3分钟就可以封片或侵泡着等待封片。在组织处于湿润状态下添加中性树胶，盖上盖玻片封片，晾干后阅片。
84.免疫组化染色结果表明：染色好，定位正确，本底低，染色的石蜡组织切片清晰。
85.本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明所述原理的情况下，本发明的实施方式可以有任何的变形或修改。
86.由此可以看到本发明目的可被充分有效完成。用于解释本发明功能和结构原理的该实施例已被充分说明和描述，在没有背离这些原理的情况下可以进行改变。因此，本发明包括涵盖在附属权利要求范围和精神之内的所有修改。