重金属污染环境的生物修复方法

5g/l)。
14.第五方面，本发明提供台湾嗜铜菌x1在制备重金属污染环境修复剂中的应用。
15.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
16.(一)本发明提供cd高耐受菌株
‑‑
台湾嗜铜菌x1，可以同时利用胞外吸附与胞内聚集方法去除环境中的cd，为含镉污水的生物修复提供重要菌种资源。
17.(二)梯度平板试验中，菌株x1对cd的最大耐受浓度为2.73mm。液体培养条件下，菌株x1对cd的最大耐受浓度为3mm。
18.(三)通过将菌株x1交联或包埋于固定化材料中，提高其对复杂环境的耐受能力，降低复杂环境中污染物对菌株的毒害作用。生产的菌剂可以直接用于污染土壤与水体的修复。
19.(四)菌株x1对cd
2
浓度为5、10mg/l水中cd
2
的去除效率分别为70％和47％，其中胞内聚集含量高于胞外吸附含量。
20.(五)菌株x1可以同时耐受多种重金属，包括铜、钴、镍、锰在实际环境中具有更强的适应性。
附图说明
21.图1为本发明菌株x1的扫描电镜图。
22.图2本发明较佳实施例中菌株x1对cd的耐受浓度测定图。
23.图3本发明较佳实施例中菌株x1在不同cd浓度下对cd的去除量图。
24.图4本发明较佳实施例中菌株x1在不同温度下对cd的去除量图。
25.图5本发明较佳实施例中菌株x1在不同初始菌量下对cd的去除量图。
26.图6本发明较佳实施例中菌株x1在5mg/l镉含量下胞外吸附量与胞内积累量图。
27.图7本发明较佳实施例中液体培养条件下菌株x1对cd的耐受浓度测试情况。
28.图8本发明较佳实施例中菌株x1对其它重金属(如铜、钴、镍、锰)的最大耐受浓度测试情况。
具体实施方式
29.本发明提供一种水中镉高效去除与富集菌株，并利用该菌株对含镉水环境进行生物修复。
30.本发明采用如下技术方案：
31.本发明提供一株用于水中镉(cd)高效去除与富集菌株
‑‑
台湾嗜铜菌x1(cupriavidus taiwanensis x1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2010223，保藏日期2010年9月15日。菌株x1可参见cn111647592a。
32.台湾嗜铜菌x1为革兰氏阴性菌(图1)，在lb琼脂培养基上生长较快，菌落呈浅色、凸面、圆形、边缘完整、直径为0.5-1.0mm。其生长温度范围为16-42℃，ph范围为4-11，最适温度为37℃，最适ph为7.0。
33.菌株x1是一种cd高耐受菌株，梯度平板试验中，其对cd
2
的最大耐受浓度为2.73mm。
34.菌株x1可以同时利用胞外吸附与胞内聚集去除与富集水中的cd
2
，对cd
2
浓度为
5、10mg/l水中cd
2
的去除效率分别为70％和47％，最大富集倍数为1092倍。
35.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
36.实施例1菌株x1对cd的耐受能力
37.1、将一次性平板以约5
°
的倾角置于玻璃棒上，倒入约10ml事先融化好的lb固体培养基，待培养基凝固后将平板水平放置，倒入融化好的等体积浓度为10mm氯化镉lb固体培养基补齐平板，放置一天后即制成含氯化镉的梯度平板。
38.2、吸取100μl od
600
为0.8的菌悬液于平板上并涂布均匀，将平板置于37℃恒温培养箱中孵育，观察并记录菌株x1生长情况并计算耐受浓度。
39.梯度平板的结果表明，镉对菌株x1的最小抑菌浓度(mic)为2.73
±
0.08mm，菌株x1应对高浓度cd
2
胁迫环境时，表现出足够强的生长能力(图2)。
40.实施例2不同cd
2
浓度对菌株x1去除镉能力的影响
41.配制终浓度分别为5mg/l、10mg/l和20mg/l的含cd
2
lb液体培养基，实验组添加总反应体积1％的od
600
＝0.8的x1菌悬液，对照组则不添加菌悬液。将样品置于37℃、150r/min恒温振荡摇床中培养，于0、12、24、36、48、72、96、120、144h取样吸取适量生长着菌株x1的培养基，使用冷冻高速离心机8000r/min离心10分钟后，吸取适量上清液使用用无菌去离子水进行稀释，经0.22μm水相滤膜对样品进行过滤后，使用火焰原子吸收光谱仪对样品溶液中的cd
2
浓度进行测定。
42.结果如图3所示，菌株x1在含5mg/l、10mg/l和20mg/l cd
2
lb液体培养基中，对cd
2
的最大去除量分别为3.5mg/l、4.7mg/l和3.9mg/l，其对应的cd
2
去除率分别为70％、47％和19.5％。
43.实施例3不同温度对菌株x1去除镉能力的影响
44.配制终浓度为5mg/l含cd
2
lb液体培养基，添加1％总反应体积的od
600
＝0.8的x1菌悬液，不添加菌悬液的培养基作为空白对照组，将样品分别放置于16℃、25℃和37℃三个不同温度下的恒温振荡摇床中活化培养。于0、12、24、36、48、72、96、120、144h吸取一定量生长菌株x1的液体培养基，使用冷冻高速离心机8000r/min离心10分钟后，取上清液用无菌去离子水稀释。样品经0.22μm水相滤膜过滤后使用火焰原子吸收光谱仪对样品溶液中的cd
2
浓度进行测定。
45.结果如图4所示，在总添加浓度为5mg/l的lb液体培养基中，菌株x1在16℃、25℃和37℃对cd
2
的去除量分别为0.23、1.99和3.50mg/l，其对应的去除率分别为4.6％、39.8％和70％。菌株x1在37℃条件下，对cd
2
表现出最佳的去除效果。
46.实施例4不同初始菌量对菌株x1去除镉能力的影响
47.配制od
600
值分别为0.1、0.5和1.0的菌株x1菌悬液，添加至终浓度为5mg/l含cd
2
lb液体培养基中后，置于37℃、150r/min恒温振荡摇床中培养，分别在0、12、24、36、48、72、96、120、144h吸取适量含菌株x1的液体培养基，使用冷冻高速离心机8000r/min离心10分钟，取上清液用无菌去离子水稀释。样品经0.22μm水相滤膜过滤后，使用火焰原子吸收光谱仪对样品溶液中的cd
2
浓度进行测定，每组实验设置三组平行对照实验。
48.结果如图5所示，不同的初始接菌量对菌株的生长在cd
2
环境下的生长影响比较小。当添加菌量较低时(od
600
＝0.1)，菌株x1在含5mg/l cd
2
的lb液体培养基中生长速度最
低，随着添加浓度的提高，细菌在培养基中的生长速度得到提升。
49.实施例5菌株x1表面吸附与细胞内积累重金属镉的能力
50.配制终浓度为0mg/l、5mg/l和20mg/l三种不同浓度的含cd
2
lb液体培养基，向其中均添加总反应体积1％的od
600
＝0.8的x1菌悬液，再将其置于37℃、150r/min恒温振荡摇床中活化培养72h。将培养好的含菌株x1的lb液体培养基使用冷冻高速离心机8000r/min、4℃离心10分钟，收集菌体。使用无菌去离子水对收集得到的菌体重悬清洗三次后，检测清洗后上清液中cd
2
离子浓度。弃去上清液后向剩余菌体中添加10ml、1mm edta缓冲液，充分涡旋后再次置于37℃恒温摇床振荡30min。振荡后的菌悬液8000r/min离心10分钟后，吸取5ml上清液检测其cd
2
离子浓度(此时溶液中的cd
2
增加量可视为洗菌表面吸附螯合的cd
2
的量)。所得菌体添加等体积浓硝酸，使用微波消解仪121℃、10min消解菌体，将消解完全后的消解液用去离子水进行稀释定容，使用火焰原子吸收光谱仪检测其cd
2
离子浓度(消解后cd
2
的增加量即视为洗菌内部吸附cd
2
的量)。
51.结果如图6所示，菌株x1对重金属镉的去除作用是胞外吸附和胞内积累共同参与的结果。随着cd
2
浓度的提升，菌株x1对重金属的胞内、外吸附量也发生了改变，在5mg/l cd
2
实验组中，菌株x1对cd
2
的生物吸附量和生物积累量分别为1.28
±
0.08mg/g和1.33
±
0.12mg/g；在20mg/l cd
2
实验组中，菌株x1对cd
2
的生物吸附量和生物积累量为2.05
±
0.06mg/g和3.11
±
0.05mg/g。在高浓度的cd
2
的胁迫条件下，菌株x1对cd
2
的去除方式以胞内积累为主导。在5-20mg/l cd
2
溶液中菌体细胞内对cd
2
的富集倍数高达209-1092倍。
52.实施例6液体培养条件下菌株x1对cd的耐受浓度测试
53.配制终浓度分别为1mm、2mm、3mm、4mm和5mm浓度的含cd
2
lb液体培养基，添加反应总体积1％的od
600
＝0.8的x1菌悬液，将其置于37℃恒温振荡摇床中，150r/min活化培养，记录菌株x1在不同浓度cd
2
培养基中的生长状况。
54.结果如图7所示，菌株x1对cd
2
表现出了很强的抗性。菌株在3mm浓度的cd
2
液体培养基中仍能够耐受cd
2
进行生长。
55.实施例7菌株x1对其它重金属(如铜、钴、镍、锰)的最大耐受浓度测试
56.1、将一次性平板以约5
°
的倾角置于玻璃棒上，倒入约10ml事先融化好的lb固体培养基，待培养基凝固后将平板水平放置，倒入融化好的等体积浓度为10mm cu
2
,10mm co
2
,10mm ni
2
及40mm mn
2
的lb固体培养基补齐平板，冷却后制成含有相应重金属浓度的梯度平板。
57.2、吸取100μl od
600
＝0.8的x1菌悬液于平板上并涂布均匀，将平板置于37℃恒温培养箱中孵育，观察并记录菌株x1生长情况并计算耐受浓度。
58.结果如图8所示，菌株x1对cu
2
,co
2
,ni
2
,mn
2
的最大耐受浓度分别为6.01
±
0.49mm，4.68
±
0.35mm，6.78
±
0.28mm，17.67
±
1.68mm。
59.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。