1.本发明涉及活体生物样品观察
技术领域：
：，特别涉及一种荧光分子定位方法。
背景技术：
：：2.可见光波段的远场光学显微成像具有非接触、无损伤、可探测样品内部的优势，是研究器官、组织和细胞的重要工具。由于衍射现象，点光源经过显微成像系统，在焦平面上无法形成点像，而是形成弥散斑(即艾里斑(airydisc)。由于衍射极限的存在，点光源显微成像的横向和纵向分辨率分别只有200nm和500nm。3.尽管电子显微镜与x射线显微镜都能达到纳米甚至更高的分辨率，但很难用于活体生物样品的观察。近场成像基于倏逝场探测能够在远小于波长的距离上显示局部变化，可获纳米量级的分辨率。原子力显微镜和扫描隧道显微镜也是沿物体表面进行扫描并重构图像。这些技术尽管避免了远场衍射带来的abbe分辨率极限，但仅限于细胞膜表面成像，无法用于活体细胞和细胞内成像。4.对密集重叠分布的荧光分子，稀疏激发和分时成像。采集成千上万帧荧光分子离散随机分布的原始图像。单帧原始图像中只有少量稀疏分布的荧光分子发射光子。衍射极限范围内只有单个荧光分子被激发。5.因此，在现有对活体生物样品观察的基础上，如何对活体细胞和细胞内进行突破衍射极限的超分辨率显微图像，精准确定活体细胞内荧光分子的位置，成为本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：6.鉴于上述问题，本发明提出了一种至少解决上述部分技术问题的荧光分子定位方法，该方法可对活体细胞进行突破衍射极限的超分辨率显微图像，并精准确定活体细胞内荧光分子的位置。7.本发明实施例提供一种荧光分子定位方法，包括如下步骤：8.s1、获取待观察活体细胞的单帧原始图像；9.s2、对所述单帧原始图像进行去噪；10.s3、根据预设插值次数，对去噪后的所述单帧原始图像做插值处理，将插值后的所述单帧原始图像进行置换，得到新图像；11.s4、根据所述新图像保留最大的局部极值点，所述最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。12.进一步地，所述步骤s2中，分别采用三维块匹配滤波或广谱去噪对所述单帧原始图像进行去噪。13.进一步地，所述步骤s3中，将插值后的所述单帧原始图像进行置换，得到新图像，包括：14.s31、获取插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最大值和最小值，计算阈值；15.s32、将插值后的所述单帧原始图像的像素减去所述阈值，小于0的像素值置换为0，得到新图像。16.进一步地，所述cri通过如下公式计算：17.cri＝((max-min)*c min)18.上式中，cri表示所述阈值；max表示插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最大值；min表示插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最小值；c表示预设系数，c的取值范围为[0-1]。[0019]进一步地，所述步骤s4中，根据所述新图像保留最大的局部极值点，包括：[0020]s41、将所述新图像中的非0像素，逐像素与所述像素邻近的预设像素相比较；如果所述像素均大于所述预设像素，则将所述像素作为局部极值点保留；[0021]s42、将所述局部极值点与其他局部极值点作比较，保留最大的所述局部极值点；所述其他局部极值点为以所述局部极值点为中心，点扩散函数的半峰全宽或点扩散函数的标准差范围内的其他局部极值点。[0022]进一步地，所述步骤s4还包括：[0023]将保留的最大的所述局部极值点减去所述新图像的背景噪声估计值，得到新的局部极值；[0024]根据所述新的局部极值，以及所述新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值，计算输出所述荧光分子发出的光子数。[0025]进一步地，所述光子数的计算公式为：[0026]y＝maxgb/maxk*x[0027]上式中，y表示所述荧光分子发出的光子数；maxgb表示所述新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值；maxk表示所述新的局部极值；x表示荧光分子光子数理论值。[0028]本发明实施例提供的上述技术方案的有益效果至少包括：[0029]本发明实施例提供的一种荧光分子定位方法，包括如下步骤：获取待观察活体细胞的单帧原始图像；对单帧原始图像进行去噪；根据预设插值次数，对去噪后的单帧原始图像做插值处理，将插值后的单帧原始图像进行置换，得到新图像；根据新图像保留最大的局部极值点，该最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。该方法可实现对活体细胞及细胞内结构实时可视无损的超分辨显微成像，并精准确定荧光分子的位置。[0030]本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。[0031]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。附图说明[0032]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：[0033]图1为本发明实施例提供的荧光分子定位方法流程图；[0034]图2为本发明实施例提供的单荧光分子弥散斑形成的7*7原始图像；[0035]图3(a)为本发明实施例提供的一帧仅含单荧光分子的无噪原始图像；[0036]图3(b)为本发明实施例提供的添加泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声后的原始图像；[0037]图3(c)为本发明实施例提供的采用wsd去噪后的原始图像；[0038]图3(d)为本发明实施例提供的采用bm3d去噪后的原始图像；[0039]图3(e)为本发明实施例提供的插值后的无噪原始图像；[0040]图3(f)为本发明实施例提供的插值后的含噪原始图像；[0041]图3(g)为本发明实施例提供的将插值后含噪原始图像基于wsd去噪后的原始图像；[0042]图3(h)为本发明实施例提供的将插值后含噪原始图像基于bm3d去噪后的原始图像。具体实施方式[0043]下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。[0044]本发明实施例提供一种荧光分子定位方法，参照图1所示，包括如下步骤：[0045]s1、输入待观察活体细胞的n帧原始图像，提取单帧原始图像；[0046]s2、对单帧原始图像进行去噪；[0047]s3、在预设插值次数的范围内，对去噪后的单帧原始图像做插值处理，将插值后的单帧原始图像进行置换，得到新图像；[0048]s4、根据新图像保留最大的局部极值点，最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。[0049]在无噪环境下，当原始图像中只包含单个荧光分子时，原始图像弥散斑的中心就是荧光分子所在的位置。如果原始图像的分辨率足够高，像素足够小，噪声足够小，那么原始图像最大值像素就是荧光分子的真实位置。本实施例提供的一种荧光分子定位方法，对活体细胞及细胞内结构可实现实时可视无损的超分辨显微成像，并精准确定荧光分子的位置。通过对原始图像的去噪和插值处理，使得原始图像的噪声很小、像素很小，最亮像素的位置即为荧光分子的定位。[0050]下面通过几个具体的例子对本实施例提供的荧光分子定位方法展开详细阐述和验证：[0051]整体执行过程如下：[0052]输入n帧原始图像；设定迭代次数j的范围为[1,n]；[0053]在第j次迭代执行以下步骤；[0054]1.1)通过bm3d或wsd等去噪算法对单帧原始图像去噪；[0055]1.2)对去噪后的单帧原始图像做插值处理，插值次数范围[0-100万]，插值后每个像素可分成1-100万个小像素；[0056]1.3)取得插值后的单帧图像的各像素灰度值的最大值max和最小值min，得到阈值cri＝((max-min)*c min)，c为预设系数，c的取值范围[0-1]或cri取常数；其中，阈值cri可以直接根据个人经验取某个常数，也可以根据上述公式计算，技术人员可以灵活选择，本实施例对其不作限定；[0057]1.4)单帧图像的像素减去cri，小于0的像素值置换为0，得到新图像；[0058]1.5)新图像中的非0像素，逐像素与其邻近的(m2-1)个像素比较，如果比邻近的(m2-1)个像素都大，那么就作为局部极值保留，m的取值范围为[3-100万]，m是奇数(以某像素为中心的正方形的面积是m2个像素，m只能为奇数，因为正中心只有一个像素)；[0059]1.6)逐个分析局部极值点，以局部极值点为中心，搜索点扩散函数的半峰全宽或点扩散函数的标准差范围内的其他局部极值点，将该局部极值点与其他局部极值点比较，只保留最大的局部极值点；其中，半峰全宽(fullwidthathalfmaximum，缩写为fwhm)，也称作半高全宽、半峰全幅、或半高宽；是指在函数的一个峰当中，前后两个函数值等于峰值一半的点之间的距离。[0060]1.7)所有保留的局部极值点减去插值后的新图像的背景噪声估计值d，得到新的局部极值maxk，d的取值范围为[min,((max-min)*c min)]或d取常数，可根据实际情况灵活选择，本实施例对其不作限定；[0061]1.8)取得新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值maxgb，通过maxgb/maxk*荧光分子光子数理论值，算出真实的荧光分子发出的光子数，得到相应的单帧超分辨图像；[0062]叠加各帧超分辨图像生成一张超分辨显微图像并输出。[0063]下面对该方法进行详细阐述：[0064]首先，采集原始图像，生成无噪原始图像。实验参数采用epflwebsite的tubulinslongsequence数据集：显微镜的numericalaperture(na)1.3，wavelengthfluorescence690nm，有效ccdpixelsize100nm。参照图2所示，是单荧光分子弥散斑形成的7*7原始图像，每个像素的大小为100nm*100nm。将像素尺寸为100nm的原始图像划分为网格尺寸为12.5nm的过采样网格，过采样系数为8(是像素大小和网格间距之间的比率)。在模拟实验中，荧光分子位于网格中，16*16网格是荧光分子分布的位置，在不同网格位置的荧光分子可生成256帧无噪原始图像。[0065]其次，对生成的每帧无噪原始图像添加背景、泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声。循环100次后，每帧无噪原始图像可生成100帧含噪原始图像。总计可生成25600帧含噪原始图像。然后对含噪原始图像采用bm3d和wsd去噪。最后对单帧无噪原始图像、含噪原始图像和去噪后的原始图像分别做插值处理。[0066]参照图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)、图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)所示，对一帧原始图像进行插值和去噪形成图像，标尺：1μm。图3(a)、图3(b)、图3(c)和图3(d)是插值前的图像，图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)是插值后的图像。wsd和bm3d是两种不同的去噪方法。三维块匹配滤波(block-matchingand3dfiltering，bm3d)和广谱去噪(widespectrumdenoising，wsd)是两种能有效去除原始图像噪声的算法。对原始图像做插值处理，可将像素有效变小。[0067]具体地，参照图3(a)所示，是基于参数模拟的一帧仅含单荧光分子的无噪原始图像，图像大小20*20。该模拟中，每个荧光分子发射3,000个光子数和每个像素的背景64个光子。[0068]参照图3(b)所示，是添加泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声后的原始图像。含单荧光分子的原始图像像素值最大约364(即，364个荧光分子)。由于光子数少，噪声很大。弥散光斑和背景局部模糊不清，snr(信噪比)仅为3.986db。[0069]参照图3(c)和图3(d)所示，为分别采用wsd(广谱去噪)和bm3d(三维块匹配滤波去噪)去噪后的原始图像，snr分别提高了6.341db和20.223db。去噪效果明显。图3(c)和图3(d)中，由于像素很大(达100nm)，弥散斑的像素都表现出明显的离散块状结构。图3(b)的背景像素也表现出明显的离散块状结构。图3(c)的背景尽管已经较平滑，但像素的离散块状结构依然很明显。[0070]图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)是3次插值后的原始图像。即1个原始图像像素被双三次插值成8*8个像素。由于插值后的像素很小，弥散斑和背景的像素不再是上行的离散块状结构，而是近乎平滑的连续结构。如图3(e)所示，插值后无噪原始图像的snr为18.769db。如图3(f)所示，含噪原始图像的snr为5.812db，提高了1.826db。如图3(g)所示，将插值后含噪原始图像基于wsd去噪后的snr与将含噪原始图像基于wsd去噪后的snr(图3(c))几乎不变，仅为由10.327db升高到10.474db。如图3(h)所示，将插值后含噪原始图像基于bm3d去噪后的snr与将含噪原始图像基于bm3d去噪后的snr(图3(d))下降约5db，但其snr依然高达19.183db。图3(f)和图3(g)的背景表现为平滑的斑状结构。[0071]进一步地，去噪和插值后，如果噪声和像素足够小，那么仅含单荧光分子的原始图像的最大值像素位置就是荧光分子的truepositions定位。并可根据下式计算荧光分子光子数：[0072][0073]上式中，num是计算出的荧光分子光子数；pixmax是插值后图像像素的最大值；numref是每个荧光分子真实发射的光子数；pixref是真实图像像素的最大值。[0074]通过如下公式计算光子数精度：[0075][0076]上式中，pnp是光子数精度；num是计算出的荧光分子光子数；numref是每个荧光分子真实发射的光子数。[0077]光子数精度用于评定光子数的计算误差。插值后的定位精度和光子数精度的均值和标准差如表1所示。其中，raw是指插值后有噪声的原始图像；noiseless是指插值后没有噪声的原始图像；wsd和bm3d是对插值后有噪声的原始图像两种不同去噪的算法。去噪前的定位精度均值为29.742nm，标准差为17.813nm。采用bm3d和wsd去噪后的定位精度均值分别为18.469nm和17.3778，标准差分别为10.053nm和8.9877nm。定位精度提高约10nm，标准差提高约8nm。bm3d和wsd对定位精度的改善能力相近。无噪原始图像的定位精度均值为8.8388nm。去噪后原始图像的定位精度比理想值(无噪原始图像)大近一倍。[0078]table1.单分子的定位精度和光子数精度[0079][0080]采用bm3d和wsd去噪后的光子数精度均值分别为17.36和16.8，标准差分别为5.77和7.52。无噪原始图像的光子数精度均值为16.1，标准差为11.6。去噪后原始图像的光子数精度与理想值(无噪原始图像noiseless)相近，标准差更小。bm3d和wsd对定位精度的改善能力相近。含噪原始图像raw的光子数精度均值仅6.15，其定位精度最差，因此含噪原始图像的定位能力最差。去噪和插值后，bm3d和wsd在维持光子数精度基本不变的情况下可有效提高单分子的定位精度。[0081]最后，采用高斯拟合法对本实施例提供的荧光分子定位方法进行验证。采用高斯拟合法对tubulinslongsequence数据集的2500帧原始图像进行单分子定位，即荧光分子定位，得到超分辨图像和局部放大图。分别根据基于插值前原始图像得到的超分辨图像、对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪后得到的超分辨图像、对原始图像插值后得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪，并插值后，得到的超分辨图像。比较分析超分辨图像和局部放大图，定位能力很相似，没有很明显的差异。[0082]在插值前，去噪后的定位速度明显提高。基于bm3d和wsd，定位时间分别由324.134s，提高到289.83s和306.447s。插值后，由于数据量增长，导致计算耗时大大延长，分别达到1325.86s、1509.188s和860.745s。[0083]基于高斯拟合的单分子定位法本身就具有较强的抗噪能力。因此去噪对其定位能力影响不大。插值不但不能明显提高定位能力，而且导致耗时大大延长。[0084]进一步地，基于插值前原始图像得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪后，得到的超分辨图像。得出由于原始图像像素太大，导致超分辨图像中的微管都很粗。[0085]基于对原始图像插值后得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪，并插值后，得到的超分辨图像。与插值前相比，超分辨图像的微管非常细，与高斯拟合法的定位效果相当。[0086]比较分析超分辨图像的局部放大图，可得两种去噪方法的定位效果相似，细胞内的微管结构均比去噪前的原始图像更清晰。可见，去噪和插值都有助于改善单分子(荧光分子)定位效果。插值后，基于bm3d和wsd，定位时间为135.332s和187.918s。远小于基于高斯拟合的324.134s和289.83s。因此，基于去噪、插值和局域最大值的荧光分子定位方法(dil)可成为有效的荧光分子定位新方法。模拟结果表明本实施例提供的单分子定位精度可达18nm左右。真实实验结果表明，本实施例提供的荧光分子定位方法定位能力与高斯拟合算法相当，耗时更少。[0087]通过本实施例提供的模拟实验结果可知，去噪和插值后可以很容易的确定荧光分子的位置。且可以得到很好的定位精度和光子数精度。在真实的原始图像中尽管荧光分子稀疏分布，但包含的荧光分子数通常是多个，甚至更多。本实施例提供的方法可以很容易地从去噪和插值后的原始图像中提取出局域最大值。局域最大值的位置就是荧光分子的位置，并可由之计算荧光分子发射的光子数。[0088]本实施例提供的荧光分子定位方法，基于可见光波段对活体细胞等微观生命动态观察的过程，可实现实时可视无损的超分辨显微成像。通过弥散斑可精准确定原始图像中荧光分子的位置，将所有荧光分子的定位点叠加就可得到一幅突破衍射极限的超分辨率显微图像。采集成千上万帧荧光分子离散随机分布的原始图像，可实现实时可视无损的超分辨率显微成像精准确定活体细胞内荧光分子的位置，将所有荧光分子的定位点叠加，即可得到一幅突破衍射极限的超分辨显微图像，从而实现对微管微丝和线粒体等细胞内结构的超分辨显微成像。[0089]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，特别涉及一种荧光分子定位方法。
背景技术：
：：2.可见光波段的远场光学显微成像具有非接触、无损伤、可探测样品内部的优势，是研究器官、组织和细胞的重要工具。由于衍射现象，点光源经过显微成像系统，在焦平面上无法形成点像，而是形成弥散斑(即艾里斑(airydisc)。由于衍射极限的存在，点光源显微成像的横向和纵向分辨率分别只有200nm和500nm。3.尽管电子显微镜与x射线显微镜都能达到纳米甚至更高的分辨率，但很难用于活体生物样品的观察。近场成像基于倏逝场探测能够在远小于波长的距离上显示局部变化，可获纳米量级的分辨率。原子力显微镜和扫描隧道显微镜也是沿物体表面进行扫描并重构图像。这些技术尽管避免了远场衍射带来的abbe分辨率极限，但仅限于细胞膜表面成像，无法用于活体细胞和细胞内成像。4.对密集重叠分布的荧光分子，稀疏激发和分时成像。采集成千上万帧荧光分子离散随机分布的原始图像。单帧原始图像中只有少量稀疏分布的荧光分子发射光子。衍射极限范围内只有单个荧光分子被激发。5.因此，在现有对活体生物样品观察的基础上，如何对活体细胞和细胞内进行突破衍射极限的超分辨率显微图像，精准确定活体细胞内荧光分子的位置，成为本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：6.鉴于上述问题，本发明提出了一种至少解决上述部分技术问题的荧光分子定位方法，该方法可对活体细胞进行突破衍射极限的超分辨率显微图像，并精准确定活体细胞内荧光分子的位置。7.本发明实施例提供一种荧光分子定位方法，包括如下步骤：8.s1、获取待观察活体细胞的单帧原始图像；9.s2、对所述单帧原始图像进行去噪；10.s3、根据预设插值次数，对去噪后的所述单帧原始图像做插值处理，将插值后的所述单帧原始图像进行置换，得到新图像；11.s4、根据所述新图像保留最大的局部极值点，所述最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。12.进一步地，所述步骤s2中，分别采用三维块匹配滤波或广谱去噪对所述单帧原始图像进行去噪。13.进一步地，所述步骤s3中，将插值后的所述单帧原始图像进行置换，得到新图像，包括：14.s31、获取插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最大值和最小值，计算阈值；15.s32、将插值后的所述单帧原始图像的像素减去所述阈值，小于0的像素值置换为0，得到新图像。16.进一步地，所述cri通过如下公式计算：17.cri＝((max-min)*c min)18.上式中，cri表示所述阈值；max表示插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最大值；min表示插值后的所述单帧原始图像各像素灰度值的最小值；c表示预设系数，c的取值范围为[0-1]。[0019]进一步地，所述步骤s4中，根据所述新图像保留最大的局部极值点，包括：[0020]s41、将所述新图像中的非0像素，逐像素与所述像素邻近的预设像素相比较；如果所述像素均大于所述预设像素，则将所述像素作为局部极值点保留；[0021]s42、将所述局部极值点与其他局部极值点作比较，保留最大的所述局部极值点；所述其他局部极值点为以所述局部极值点为中心，点扩散函数的半峰全宽或点扩散函数的标准差范围内的其他局部极值点。[0022]进一步地，所述步骤s4还包括：[0023]将保留的最大的所述局部极值点减去所述新图像的背景噪声估计值，得到新的局部极值；[0024]根据所述新的局部极值，以及所述新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值，计算输出所述荧光分子发出的光子数。[0025]进一步地，所述光子数的计算公式为：[0026]y＝maxgb/maxk*x[0027]上式中，y表示所述荧光分子发出的光子数；maxgb表示所述新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值；maxk表示所述新的局部极值；x表示荧光分子光子数理论值。[0028]本发明实施例提供的上述技术方案的有益效果至少包括：[0029]本发明实施例提供的一种荧光分子定位方法，包括如下步骤：获取待观察活体细胞的单帧原始图像；对单帧原始图像进行去噪；根据预设插值次数，对去噪后的单帧原始图像做插值处理，将插值后的单帧原始图像进行置换，得到新图像；根据新图像保留最大的局部极值点，该最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。该方法可实现对活体细胞及细胞内结构实时可视无损的超分辨显微成像，并精准确定荧光分子的位置。[0030]本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。[0031]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。附图说明[0032]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：[0033]图1为本发明实施例提供的荧光分子定位方法流程图；[0034]图2为本发明实施例提供的单荧光分子弥散斑形成的7*7原始图像；[0035]图3(a)为本发明实施例提供的一帧仅含单荧光分子的无噪原始图像；[0036]图3(b)为本发明实施例提供的添加泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声后的原始图像；[0037]图3(c)为本发明实施例提供的采用wsd去噪后的原始图像；[0038]图3(d)为本发明实施例提供的采用bm3d去噪后的原始图像；[0039]图3(e)为本发明实施例提供的插值后的无噪原始图像；[0040]图3(f)为本发明实施例提供的插值后的含噪原始图像；[0041]图3(g)为本发明实施例提供的将插值后含噪原始图像基于wsd去噪后的原始图像；[0042]图3(h)为本发明实施例提供的将插值后含噪原始图像基于bm3d去噪后的原始图像。具体实施方式[0043]下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。[0044]本发明实施例提供一种荧光分子定位方法，参照图1所示，包括如下步骤：[0045]s1、输入待观察活体细胞的n帧原始图像，提取单帧原始图像；[0046]s2、对单帧原始图像进行去噪；[0047]s3、在预设插值次数的范围内，对去噪后的单帧原始图像做插值处理，将插值后的单帧原始图像进行置换，得到新图像；[0048]s4、根据新图像保留最大的局部极值点，最大的局部极值点即为荧光分子所处的位置。[0049]在无噪环境下，当原始图像中只包含单个荧光分子时，原始图像弥散斑的中心就是荧光分子所在的位置。如果原始图像的分辨率足够高，像素足够小，噪声足够小，那么原始图像最大值像素就是荧光分子的真实位置。本实施例提供的一种荧光分子定位方法，对活体细胞及细胞内结构可实现实时可视无损的超分辨显微成像，并精准确定荧光分子的位置。通过对原始图像的去噪和插值处理，使得原始图像的噪声很小、像素很小，最亮像素的位置即为荧光分子的定位。[0050]下面通过几个具体的例子对本实施例提供的荧光分子定位方法展开详细阐述和验证：[0051]整体执行过程如下：[0052]输入n帧原始图像；设定迭代次数j的范围为[1,n]；[0053]在第j次迭代执行以下步骤；[0054]1.1)通过bm3d或wsd等去噪算法对单帧原始图像去噪；[0055]1.2)对去噪后的单帧原始图像做插值处理，插值次数范围[0-100万]，插值后每个像素可分成1-100万个小像素；[0056]1.3)取得插值后的单帧图像的各像素灰度值的最大值max和最小值min，得到阈值cri＝((max-min)*c min)，c为预设系数，c的取值范围[0-1]或cri取常数；其中，阈值cri可以直接根据个人经验取某个常数，也可以根据上述公式计算，技术人员可以灵活选择，本实施例对其不作限定；[0057]1.4)单帧图像的像素减去cri，小于0的像素值置换为0，得到新图像；[0058]1.5)新图像中的非0像素，逐像素与其邻近的(m2-1)个像素比较，如果比邻近的(m2-1)个像素都大，那么就作为局部极值保留，m的取值范围为[3-100万]，m是奇数(以某像素为中心的正方形的面积是m2个像素，m只能为奇数，因为正中心只有一个像素)；[0059]1.6)逐个分析局部极值点，以局部极值点为中心，搜索点扩散函数的半峰全宽或点扩散函数的标准差范围内的其他局部极值点，将该局部极值点与其他局部极值点比较，只保留最大的局部极值点；其中，半峰全宽(fullwidthathalfmaximum，缩写为fwhm)，也称作半高全宽、半峰全幅、或半高宽；是指在函数的一个峰当中，前后两个函数值等于峰值一半的点之间的距离。[0060]1.7)所有保留的局部极值点减去插值后的新图像的背景噪声估计值d，得到新的局部极值maxk，d的取值范围为[min,((max-min)*c min)]或d取常数，可根据实际情况灵活选择，本实施例对其不作限定；[0061]1.8)取得新图像对应插值后像素大小的高斯函数或贝塞尔函数的最大像素值maxgb，通过maxgb/maxk*荧光分子光子数理论值，算出真实的荧光分子发出的光子数，得到相应的单帧超分辨图像；[0062]叠加各帧超分辨图像生成一张超分辨显微图像并输出。[0063]下面对该方法进行详细阐述：[0064]首先，采集原始图像，生成无噪原始图像。实验参数采用epflwebsite的tubulinslongsequence数据集：显微镜的numericalaperture(na)1.3，wavelengthfluorescence690nm，有效ccdpixelsize100nm。参照图2所示，是单荧光分子弥散斑形成的7*7原始图像，每个像素的大小为100nm*100nm。将像素尺寸为100nm的原始图像划分为网格尺寸为12.5nm的过采样网格，过采样系数为8(是像素大小和网格间距之间的比率)。在模拟实验中，荧光分子位于网格中，16*16网格是荧光分子分布的位置，在不同网格位置的荧光分子可生成256帧无噪原始图像。[0065]其次，对生成的每帧无噪原始图像添加背景、泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声。循环100次后，每帧无噪原始图像可生成100帧含噪原始图像。总计可生成25600帧含噪原始图像。然后对含噪原始图像采用bm3d和wsd去噪。最后对单帧无噪原始图像、含噪原始图像和去噪后的原始图像分别做插值处理。[0066]参照图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)、图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)所示，对一帧原始图像进行插值和去噪形成图像，标尺：1μm。图3(a)、图3(b)、图3(c)和图3(d)是插值前的图像，图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)是插值后的图像。wsd和bm3d是两种不同的去噪方法。三维块匹配滤波(block-matchingand3dfiltering，bm3d)和广谱去噪(widespectrumdenoising，wsd)是两种能有效去除原始图像噪声的算法。对原始图像做插值处理，可将像素有效变小。[0067]具体地，参照图3(a)所示，是基于参数模拟的一帧仅含单荧光分子的无噪原始图像，图像大小20*20。该模拟中，每个荧光分子发射3,000个光子数和每个像素的背景64个光子。[0068]参照图3(b)所示，是添加泊松噪声和方差为0.01的高斯噪声后的原始图像。含单荧光分子的原始图像像素值最大约364(即，364个荧光分子)。由于光子数少，噪声很大。弥散光斑和背景局部模糊不清，snr(信噪比)仅为3.986db。[0069]参照图3(c)和图3(d)所示，为分别采用wsd(广谱去噪)和bm3d(三维块匹配滤波去噪)去噪后的原始图像，snr分别提高了6.341db和20.223db。去噪效果明显。图3(c)和图3(d)中，由于像素很大(达100nm)，弥散斑的像素都表现出明显的离散块状结构。图3(b)的背景像素也表现出明显的离散块状结构。图3(c)的背景尽管已经较平滑，但像素的离散块状结构依然很明显。[0070]图3(e)、图3(f)、图3(g)和图3(h)是3次插值后的原始图像。即1个原始图像像素被双三次插值成8*8个像素。由于插值后的像素很小，弥散斑和背景的像素不再是上行的离散块状结构，而是近乎平滑的连续结构。如图3(e)所示，插值后无噪原始图像的snr为18.769db。如图3(f)所示，含噪原始图像的snr为5.812db，提高了1.826db。如图3(g)所示，将插值后含噪原始图像基于wsd去噪后的snr与将含噪原始图像基于wsd去噪后的snr(图3(c))几乎不变，仅为由10.327db升高到10.474db。如图3(h)所示，将插值后含噪原始图像基于bm3d去噪后的snr与将含噪原始图像基于bm3d去噪后的snr(图3(d))下降约5db，但其snr依然高达19.183db。图3(f)和图3(g)的背景表现为平滑的斑状结构。[0071]进一步地，去噪和插值后，如果噪声和像素足够小，那么仅含单荧光分子的原始图像的最大值像素位置就是荧光分子的truepositions定位。并可根据下式计算荧光分子光子数：[0072][0073]上式中，num是计算出的荧光分子光子数；pixmax是插值后图像像素的最大值；numref是每个荧光分子真实发射的光子数；pixref是真实图像像素的最大值。[0074]通过如下公式计算光子数精度：[0075][0076]上式中，pnp是光子数精度；num是计算出的荧光分子光子数；numref是每个荧光分子真实发射的光子数。[0077]光子数精度用于评定光子数的计算误差。插值后的定位精度和光子数精度的均值和标准差如表1所示。其中，raw是指插值后有噪声的原始图像；noiseless是指插值后没有噪声的原始图像；wsd和bm3d是对插值后有噪声的原始图像两种不同去噪的算法。去噪前的定位精度均值为29.742nm，标准差为17.813nm。采用bm3d和wsd去噪后的定位精度均值分别为18.469nm和17.3778，标准差分别为10.053nm和8.9877nm。定位精度提高约10nm，标准差提高约8nm。bm3d和wsd对定位精度的改善能力相近。无噪原始图像的定位精度均值为8.8388nm。去噪后原始图像的定位精度比理想值(无噪原始图像)大近一倍。[0078]table1.单分子的定位精度和光子数精度[0079][0080]采用bm3d和wsd去噪后的光子数精度均值分别为17.36和16.8，标准差分别为5.77和7.52。无噪原始图像的光子数精度均值为16.1，标准差为11.6。去噪后原始图像的光子数精度与理想值(无噪原始图像noiseless)相近，标准差更小。bm3d和wsd对定位精度的改善能力相近。含噪原始图像raw的光子数精度均值仅6.15，其定位精度最差，因此含噪原始图像的定位能力最差。去噪和插值后，bm3d和wsd在维持光子数精度基本不变的情况下可有效提高单分子的定位精度。[0081]最后，采用高斯拟合法对本实施例提供的荧光分子定位方法进行验证。采用高斯拟合法对tubulinslongsequence数据集的2500帧原始图像进行单分子定位，即荧光分子定位，得到超分辨图像和局部放大图。分别根据基于插值前原始图像得到的超分辨图像、对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪后得到的超分辨图像、对原始图像插值后得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪，并插值后，得到的超分辨图像。比较分析超分辨图像和局部放大图，定位能力很相似，没有很明显的差异。[0082]在插值前，去噪后的定位速度明显提高。基于bm3d和wsd，定位时间分别由324.134s，提高到289.83s和306.447s。插值后，由于数据量增长，导致计算耗时大大延长，分别达到1325.86s、1509.188s和860.745s。[0083]基于高斯拟合的单分子定位法本身就具有较强的抗噪能力。因此去噪对其定位能力影响不大。插值不但不能明显提高定位能力，而且导致耗时大大延长。[0084]进一步地，基于插值前原始图像得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪后，得到的超分辨图像。得出由于原始图像像素太大，导致超分辨图像中的微管都很粗。[0085]基于对原始图像插值后得到的超分辨图像，以及对原始图像分别采用bm3d和wsd去噪，并插值后，得到的超分辨图像。与插值前相比，超分辨图像的微管非常细，与高斯拟合法的定位效果相当。[0086]比较分析超分辨图像的局部放大图，可得两种去噪方法的定位效果相似，细胞内的微管结构均比去噪前的原始图像更清晰。可见，去噪和插值都有助于改善单分子(荧光分子)定位效果。插值后，基于bm3d和wsd，定位时间为135.332s和187.918s。远小于基于高斯拟合的324.134s和289.83s。因此，基于去噪、插值和局域最大值的荧光分子定位方法(dil)可成为有效的荧光分子定位新方法。模拟结果表明本实施例提供的单分子定位精度可达18nm左右。真实实验结果表明，本实施例提供的荧光分子定位方法定位能力与高斯拟合算法相当，耗时更少。[0087]通过本实施例提供的模拟实验结果可知，去噪和插值后可以很容易的确定荧光分子的位置。且可以得到很好的定位精度和光子数精度。在真实的原始图像中尽管荧光分子稀疏分布，但包含的荧光分子数通常是多个，甚至更多。本实施例提供的方法可以很容易地从去噪和插值后的原始图像中提取出局域最大值。局域最大值的位置就是荧光分子的位置，并可由之计算荧光分子发射的光子数。[0088]本实施例提供的荧光分子定位方法，基于可见光波段对活体细胞等微观生命动态观察的过程，可实现实时可视无损的超分辨显微成像。通过弥散斑可精准确定原始图像中荧光分子的位置，将所有荧光分子的定位点叠加就可得到一幅突破衍射极限的超分辨率显微图像。采集成千上万帧荧光分子离散随机分布的原始图像，可实现实时可视无损的超分辨率显微成像精准确定活体细胞内荧光分子的位置，将所有荧光分子的定位点叠加，即可得到一幅突破衍射极限的超分辨显微图像，从而实现对微管微丝和线粒体等细胞内结构的超分辨显微成像。[0089]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12当前第1页12
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