调节植物中的还原糖含量（INV）的制作方法

no:1)、ntinv3-t(seq id no:3)、ntinv4-s (seq id no:5)和ntinv4-t(seq id no:7)。本文还描述了来自普通烟草的几个inv多肽序列，即ntinv3-s(seq id no:2)、ntinv3
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t(seq id no:4)、ntinv4-s(seq id no:6)和ntinv4-t(seq idno:8)。特别地，示出ntinv4-s和ntinv4-t在干制期间在糖代谢中起作用。在烟草干制期间，烟道干制烟草(例如弗吉尼亚烟)通常包含比晾干的烟草(例如白肋烟)多至少八倍的还原糖，这主要是由于其积累高水平的淀粉的基因倾向。在叶子收获之后和衰老过程(黄化阶段)中，大部分淀粉首先被转化为蔗糖，并且然后转化为可能涉及inv的还原糖。
10.ntinv4-s和ntinv4-t多肽序列非常相似，共有96％的同一性。 ntinv3-s和ntinv3-t多肽序列的情况相似，它们也非常相似并且共有 96％的同一性。值得注意的是，ntinv4-s和ntinv4-t对以及ntinv3-s 和ntinv3-t对共享仅约60％的低同一性，表明不同的功能或调节。令人惊讶的是，仅ntinv4-s和ntinv4-t在干制期间过表达，而ntinv3
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s和ntinv3-t在干制期间未过表达。在某些实施方案中，ntinv3-s和 ntinv3-t的活性或表达未被调节。ntinv3-s和ntinv3-t可能参与其他代谢途径，并且其表达的变化可能导致农艺学上有害的表型(例如，缓慢生长)。知道哪些inv基因在干制期间过表达有利地允许选择仅在相关基因中有变化的植物，并减少对其他代谢过程的潜在负面影响。
11.对一种或多种inv的表达或活性的修饰可以与对一种或多种蔗糖合成酶(sus)的表达或活性的修饰组合在一起，以进一步调节干制叶子中的糖的水平。相应地，公开了对inv和sus的修改的组合。例如，降低如本文所述的一种或多种inv的表达或活性可以增加或降低干制叶子中的葡萄糖或果糖水平或其组合并增加蔗糖水平。作为另一个实例，增加如本文所述的一种或多种inv的表达或活性可以增加干制叶子中的葡萄糖或果糖水平或其组合并降低蔗糖水平。作为另一个的实例，与单独降低一种或多种inv的表达或活性相比，降低如本文所述的一种或多种inv和一种或多种sus的表达或活性可以进一步降低干制叶片中的葡萄糖或果糖水平或其组合。作为另一个的实例，与单独增加一种或多种inv的表达或活性相比，增加如本文所述的一种或多种inv和一种或多种sus的表达或活性可以进一步增加干制叶片中的葡萄糖或果糖水平或其组合。
12.公开了ntsus1-s(seq id no:10)、ntsus1-t(seq id no:12)、 ntsus2-s(seq id no:14)、ntsus2-t(seq id no:16)、ntsus3-s (seq id no:18)、ntsus3-t(seq id no:20)、ntsus4-s(seq idno:22)、ntsus4-t(seq id no:24)、ntsus5-s(seq id no:26)、 ntsus5-t(seq id no:28)、ntsus6-s(seq id no:30)和ntsus6-t (seq id no:32)。还公开了ntsus1-s(seq id no:11)、ntsus1
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t(seq id no:13)、ntsus2-s(seq id no:15)、ntsus2-t(seqid no:17)、ntsus3-s(seq id no:19)、ntsus3-t(seq id no: 21)、ntsus4-s(seq id no:23)、ntsus4-t(seq id no:25)、 ntsus5-s(seq id no:27)、ntsus5-t(seq id no:29)、ntsus6
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s(seq id no:31)和ntsus6-t(seq id no:33)的相应推导的多肽序列。ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s和 ntsus4-t可在干制期间在糖代谢中起作用。特别地，ntsus2-s、 ntsus3-s、ntsus3-t和ntsus4-s可在干制期间在糖代谢中起作用。
13.在一个方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞包含：(i)多核苷酸，所述多核苷酸包含与seq id no:5(ntinv4-s)具有至少81％序列同一性或与seq id no:7(ntinv4-t)具有至少62％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成；(ii)多肽，所述多肽由(i)
中所示的所述多核苷酸编码；(iii)多肽，所述多肽包含与seq id no:6 (ntinv4-s)具有至少84％或至少85％序列同一性或与seq id no:8 (ntinv4-t)具有至少85％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成；或(iv)构建体、载体或表达载体，其包含(i)中所示的经分离的多核苷酸，其中与所述多核苷酸或多肽的表达或活性未被修饰的对照植物细胞相比，所述植物细胞包含至少一种修饰，所述至少一种修饰调节(a)所述多核苷酸的表达或活性或(b)所述多核苷酸或所述多肽的表达或活性。
14.适当地，与含有对照植物细胞的对照植物的干制叶子中的一种或多种还原糖的水平相比，调节的表达或调节的活性调节包含植物细胞的植物的干制叶子中的一种或多种还原糖的水平，合适地其中还原糖是葡萄糖或果糖或它们的组合。
15.适当地，调节的表达或调节的活性还调节包含植物细胞的植物的干制叶子中的蔗糖水平。
16.适当地，与对照干制叶子相比，干制叶子具有至少约63％的降低的葡萄糖水平。
17.适当地，与对照干制叶子相比，干制叶子具有至少约43％的降低的果糖水平。适当地，与对照干制叶子相比，干制叶子分别具有至少约63％和至少约43％的降低的葡萄糖和果糖水平。
18.适当地，干制叶子来自植物上的中间位置叶。
19.适当地，对包含植物细胞的植物的表型的影响可忽略不计。例如，植物的表型可以不变。
20.适当地，与包含对照植物细胞的对照植物相比，总游离氨基酸没有变化。
21.适当地，至少一种修饰是植物细胞基因组中的至少一种修饰，或者是构建体、载体或表达载体中的至少一种修饰，或者是至少一种转基因修饰。
22.适当地，至少一种修饰是多核苷酸中的遗传突变。
23.适当地，植物是普通烟草。
24.适当地，植物细胞还包含ntsus多核苷酸或由其编码的多肽中的至少一种修饰，更适当地，其中ntsus多核苷酸或由其编码的多肽选自由以下组成的组：ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s、ntsus4-t 或其两种或更多种的组合，更适当地，其中ntsus多核苷酸或由其编码的多肽选自由以下组成的组：ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和 ntsus4-s或其两种或更多种的组合。
25.适当地，植物细胞包含ntinv4多核苷酸或ntinv4多肽中的至少一个突变，以及ntsus多核苷酸或由其编码的多肽中的至少一个突变。
26.在另一方面，提供了一种包含本文所述的植物细胞的植物或其部分。
27.在另一方面，公开了从植物或部分衍生或获得的植物材料、干制植物材料或均质植物材料，适当地，其中植物材料选自由以下组成的组：生物质、种子、茎、花或叶或其两种或更多种的组合。干制植物材料可以选自由以下组成的组：烟道干制的植物材料、晒干的植物材料或晾干的植物材料或者其两种或更多种的组合。
28.在另一方面中，提供一种包含植物细胞、植物的一部分或植物材料的烟草产品。
29.在另一方面，提供了一种用于生产本文所述的植物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供本文所述的包含至少一种修饰的植物细胞；以及(b)将植物细胞繁殖成植物。
30.适当地，在步骤(a)中，通过基因组编辑引入至少一种修饰，适当地，其中基因组编
辑选自crispr介导的基因组编辑、锌指核酸酶介导的诱变、化学或放射诱变、同源重组、寡核苷酸定向诱变和大范围核酸酶介导的诱变。
31.适当地，在步骤(a)中，使用干扰多核苷酸或通过引入至少一种突变或其组合来引入至少一种修饰。
32.在另一方面，公开了一种用于制备干制植物材料的方法，与对照植物材料相比，所述干制植物材料具有改变量的还原糖，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文所述的植物或其部分或植物材料；(b)自其收获植物材料；以及(c)干制植物材料。
33.在另一方面，提供了一种产生液体烟草提取物的方法，所述方法
34.包括以下步骤：(a)由含有植物细胞的植物或其部分制备烟草起始材料，所述植物细胞包含调节如本文所述的ntinv的表达或活性的至少一种修饰；(b)在合适的提取温度下加热烟草起始材料；(c)在加热期间收集从烟草起始材料释放的挥发性化合物；以及(d)合并从烟草起始材料释放的所收集的挥发性化合物并形成液体烟草提取物。
35.在另一方面，公开了一种产生液体烟草提取物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)由含有其中ntinv的表达或活性如本文所述被修饰的植物细胞的植物或其部分制备第一烟草起始材料；(b)由含有其中ntsus的表达或活性如本文所述被修饰的植物细胞的植物或其部分制备第二烟草起始材料；(c)在第一提取温度下加热第一烟草起始材料；(d)在第二提取温度下加热第二烟草起始材料；(e)在加热期间收集从第一烟草起始材料和第二烟草起始材料释放的挥发性化合物；以及(f)合并从第一烟草起始材料和第二烟草起始材料释放的所收集的挥发性化合物并由所合并的挥发性化合物形成液体烟草提取物。
36.在另一方面，公开了一种液体烟草提取物，其通过如本文所述的生产液体烟草提取物的方法生产、获得或能够获得。
37.在另一方面，公开了一种植物细胞，所述植物细胞包含：(i)多核苷酸，所述多核苷酸包含与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7具有至少60％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成；多肽，所述多肽包含与seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8具有至少50％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成；(ii)多肽，所述多肽由(i)中所示的多核苷酸编码；(iii)多肽，所述多肽包含与seqidno:2或seqidno:4具有至少80％序列同一性以及与seqidno:6或seqidno:8具有80％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成；(iv)构建体、载体或表达载体，其包含(i)中所示的经分离的多核苷酸，其中与所述多核苷酸或多肽的表达或活性未被修饰的对照植物细胞相比，所述植物细胞包含至少一种修饰，所述至少一种修饰调节所述多核苷酸或所述多肽的表达或活性。
38.一些优点
39.有利地，改变烟草中的糖-氨基酸平衡可影响在气溶胶和烟雾中加热时的风味化合物和丙烯酰胺(由葡萄糖(果糖)与天冬酰胺相互作用产生的致癌化合物)的释放。
40.有利地，加热烟草棒的再造烟草材料需要还原糖用于适当的铸叶制备。本公开可影响糖的含量和平衡，从而影响铸叶制备。
41.有利地，可以产生消费者更可接受的非遗传修饰植物。
42.有利地，本公开不限于ems突变植物的使用。
43.本公开可以应用于各种植物品种或农作物。通常，衰老叶(源叶)产生蔗糖作为碳
源和天冬酰胺作为库叶和种子的同化氮源。因此，蔗糖和天冬酰胺必须首先从薄壁(光合)衰老叶细胞转运到韧皮部，并且然后再转运到上部储存组织。操纵ntinv或由其编码的多肽可以影响还原糖(诸如葡萄糖和果糖)的水平，对游离氨基酸具有低影响。此方法可以允许开发具有较低葡萄糖和果糖以及更多蔗糖含量的新型烟草品种。
44.有利地，本公开可以与调节其他基因(诸如本文所述的ntsus或由其编码的多肽)的表达组合在一起。
附图说明
45.图1是示出以下的一系列曲线图：(a)在弗吉尼亚烟烟道干制时间过程期间的还原糖(葡萄糖和果糖)的释放；(b)在弗吉尼亚烟烟道干制时间过程期间ntinv3-s、ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t的表达；以及(c)在弗吉尼亚烟烟道干制时间过程期间衰老相关基因 sag12的表达。
46.图2是示出以下的一系列曲线图：(a)葡萄糖的释放；(b)果糖的释放；以及(c)蔗糖在深色烟草的晾干时间过程期间的释放。数据由代谢区室的代谢分析生成(无可用单位)。
47.图3是示出使用gateway载体使ntinv4-s和ntinv4-t沉默的结果以及在干制48小时后在弗吉尼亚烟叶中ntinv4-s和ntinv4-t表达的测量结果的图(qpcr)。t0-inv4是生成的转基因系，并且ct0-inv4 是对应的对照系。
48.图4是示出以下的一系列曲线图：(a)葡萄糖；(b)果糖；以及 (c)沉默的35s:inv4-rnai(inv4-t0)干制叶子和对照(ct0)干制叶子中的蔗糖含量(ct0，n＝4；以及t0，n＝4)。呈现了箱形图以及t 检验统计分析。
49.图5是示出了在白肋烟、弗吉尼亚烟和东方烟中收获(成熟)后、干制两天(干制48小时)后和干制结束时每种还原糖含量的条形图。
具体实施方式
50.本公开中所用的章节标题用于组织目的并且不旨在进行限制。
51.1.定义
52.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所披露的所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
53.术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及它们的变体打算是开放性过渡短语、术语或措辞，不排除额外动作或结构的可能性。
54.除非上下文另外明确规定，否则单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物。
55.本公开考虑了“包含”本文呈现的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确地阐述。
56.为了叙述本文的数值范围，明确涵盖它们之间具有相同精确度的每一个插入数值。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数值7和 8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、 6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
57.如整个说明书和权利要求书中所使用，以下术语具有以下含义：
[0058]“编码序列”或“多核苷酸编码”是指包含编码多肽的多核苷酸的核苷酸(rna或dna分子)。编码序列还可包括可操作地连接到调节元件的起始和终止信号，所述调节元件包括能够指导在施用多核苷酸的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可以经密码子优化。
[0059]“互补”或“互补的”可以指核苷酸或核苷酸类似物之间的watson
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crick(例如，a-t/u和c-g)或hoogsteen碱基配对。“互补性”是指两个多核苷酸之间共有的性质，使得当它们彼此反平行排列时，每个位置处的核苷酸碱基将是互补的。
[0060]“构建体”是指包含一种或多种多核苷酸的双链重组多核苷酸片段。构建体包括与互补“有义链或编码链”碱基配对的“模板链”。给定构建体可以在两个可能方向中插入载体内，所述两个可能方向是关于位于载体 (诸如表达载体)内的启动子方向来说相同(或有义)方向或相反(或反义)方向。
[0061]
在对照植物或对照植物细胞的上下文中，术语“对照”是指其中一个或多个基因或多肽的表达、功能或活性未被修饰(例如，增加或减少) 并且因此其可以与其中相同的一个或多个基因或多肽的表达、功能或活性已被修饰的植物进行比较的植物或植物细胞。“对照植物”是除了测试参数以外全部参数大体上等效于测试植物或经修饰植物的植物。例如，当提及已引入多核苷酸的植物时，对照植物是没有引入这种多核苷酸的等同植物。对照植物可以是已引入对照多核苷酸的等同植物。在此类情况下，对照多核苷酸是预期对植物几乎不产生或不产生表型作用的多核苷酸。对照植物可以包含空白载体。对照植物可对应于野生型植物。对照植物可以是其中t1分离体不再具有转基因的空分离体。
[0062]
术语“减少”或“减少的”是指减少约10％至约99％，或减少至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少 99％、或至少100％、或至少150％、或至少200％或更多的数量或功能，诸如多肽功能、转录功能或多肽表达。术语“减少的”或短语“减少的量”可以指数量或功能，其小于在以相同方式加工的未被修饰的植物或来自相同品种的植物的产品中发现的数量或功能。因此，在一些情况下，将已经以相同方式加工的相同品种的野生型植物用作对照，通过该对照测量是否获得数量的减少。
[0063]“供体dna”或“供体模板”是指包括至少一部分目的基因的双链 dna片段或分子。供体dna可以编码功能性多肽。
[0064]“内源基因或多肽”是指源自生物体的基因组并且没有经历改变(诸如遗传物质的丢失、获得或交换)的基因或多肽。内源基因进行标准基因传递和基因表达。内源多肽经历正常表达。
[0065]“增强子序列”是指可以增加基因表达的序列。这些序列可以位于经转录区的上游、内含子内或下游。经转录区从启动子到转录终止区包含外显子和插入内含子。基因表达的增强可以通过多种机制进行，包括提高转录效率、稳定成熟的mrna和翻译增强。
[0066]“表达”是指功能产物的产生。例如，多核苷酸片段的表达可以指多核苷酸片段的转录(例如，产生mrna或功能rna的转录)或mrna 翻译成前体或成熟多肽，或其组合。
[0067]“过表达”指的是转基因生物体中产生的基因产物超过来自同一实验的空分离(或非转基因)生物体产生的水平。
[0068]“功能”描述具有生物学功能或活性的多肽。“功能基因”是指转录成 mrna的基因，其被翻译成功能或活性多肽。
[0069]“基因构建体”是指包含编码多肽的多核苷酸的dna或rna分子。编码序列可包括可操作地连接到调节元件的起始和终止信号，所述调节元件包括能够指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
[0070]“基因组编辑”通常指通过其改变细胞中的基因组核酸的过程。例如，这可以通过去除、插入或替换基因组核酸中的一个或多个核苷酸来进行。核酸内切酶可用于在基因组中的限定位置处产生特定的断裂或裂口，并且在本文中进一步描述。
[0071]
术语“同源性”或“相似性”是指通过序列比对比较的两个多肽之间或两个多核苷酸分子之间的序列相似性程度。被比较的两个离散多核苷酸之间的同源性程度是在可比较位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。同源性或相似性可在受试者序列的全长上确定。
[0072]
在两个或更多个多核苷酸或多肽的上下文中，“相同”或“同一性”是指序列在特定区域上具有特定百分比的相同残基。百分比可以通过最佳比对两个序列，比较两个序列的指定区域，测定两个序列中存在相同残基的位置数产生匹配位置数，匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且结果乘以100产生序列一致性百分比来计算。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错端并且指定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而非分子中。当比较dna 和rna时，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)视为相当。同一性可以人工鉴定或通过使用计算机序列算法诸如clustalw、clustalx、blast、 fasta或smith-waterman测定。clustalw的合适参数可能如下：对于多核苷酸比对：缺口开放罚分＝15.0，缺口延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于多肽比对：缺口开放罚分＝10.o，缺口延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝gonnet。对于dna和蛋白质比对：endgap＝-1，并且 gapdist＝4。
[0073]
术语“增加”或“增加的”是指增加约10％至约99％，或增加至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少 99％、至少100％、至少150％、或至少200％或更多的数量或功能或活性，诸如但不限于多肽功能或活性、转录功能或活性和多肽表达中的一种或多种。术语“增加的”或短语“增加的量”可以指植物或由植物产生的产物中的数量或功能或活性，其大于以相同方式加工的未经修饰的植物或来自相同品种的植物的产物中发现的数量或功能或活性。因此，在一些情况下，将已经以相同方式加工的相同品种的野生型植物用作对照，通过该对照测量是否获得数量的增加。
[0074]
术语“抑制”或“被抑制”是指减少约98％至约100％，或减少至少98％、至少99％，但特别是100％的数量或功能或活性，诸如但不限于多肽功能或活性、转录功能或活性和多肽表达中的一种或多种。
[0075]
术语“引入”是指将多核苷酸(例如，构建体)或多肽提供到细胞中。引入包括提及多核苷酸向真核细胞中的掺入，其中多核苷酸可掺入细胞的基因组中，并且包括提及多核苷酸或多肽向细胞的瞬时提供。引入包括稳定或短暂转型法，以及性别交叉。因此，在将多核苷酸(例如，重组构建体/表达构建体)插入细胞的上下文中，“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及多核苷酸向真核细胞中的掺入，其中多核苷酸可以掺入细胞的基
因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体 dna)中，转化为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mrna)。
[0076]
术语“分离的”或“纯化的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。纯度和均质性通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术测定。作为制剂中存在的主要种类的多肽是基本上纯化的。特别地，分离的多核苷酸与位于所需基因侧面并编码除所需多肽之外的多肽的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示多核苷酸或多肽在电泳凝胶中产生实质上一个带。特别地，它是指多核苷酸或多肽的纯度为至少85％，更优选为至少95％，并且最优选为至少 99％。分离的多核苷酸可以从其天然存在的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规多核苷酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。术语还涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
[0077]“液体烟草提取物”描述对烟草起始材料进行的提取方法的直接产物。用于生产液体烟草提取物的提取方法可包括在特定的加热条件下加热烟草起始材料并收集所生成的挥发性化合物。液体烟草提取物可含有源自烟草起始材料并在提取过程期间去除的化合物的混合物组成，通常与液体载体或溶剂组合。
[0078]“调节(modulate/modulating)”是指引起或促进所关注的过程、途径、功能或活性的定性或定量变化、改变或修饰。非限制性地，这样的变化、改变或修饰可以是所关注的相关过程、途径、功能或活性的增加或减少。例如，可以调节基因表达或多肽表达或多肽功能或活性。通常，将通过与对照比较来确定相关变化、改变或修饰。
[0079]
术语“非天然存在”描述的不是自然界形成的或自然界中不存在的实体，诸如多核苷酸、基因突变、多肽、植物、植物细胞和植物材料。可以通过本文中所描述或本领域已知的方法来制备、合成、起始、修饰、干预或操纵这类非天然存在的实体或人工实体。可以由人制备、合成、起始、修饰、干预或操纵这类非天然存在的实体或人工实体。因此，例如，非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，可使用传统植物育种技术(例如回交)或通过遗传操纵技术(例如反义rna、干扰rna、大范围核酸酶等等)进行制备。进一步举例来说，可以通过第一植物或植物细胞基因渗入第二植物或植物细胞(其自身可以是天然存在的)内，或通过将一个或多个基因突变(例如一种或多种多态性)从第一植物或植物细胞转移到第二植物或植物细胞内来制备非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，使得所得到的植物、植物细胞或植物材料或其后代包括并非天然形成或在自然界中不存在的基因组成(例如基因组、染色体或其区段)。所得到的植物、植物细胞或植物材料因此是人工的或非天然存在的。相应地，可以通过修饰第一天然存在的植物或植物细胞中的基因序列来制备人工的或非天然存在的植物或植物细胞，即使所得到的基因序列在第二植物或植物细胞中天然存在，所述第二植物或植物细胞包括与第一植物或植物细胞不同的基因背景。在某些实施方案中，突变不是天然存在于多核苷酸或多肽(诸如基因或多肽)中的天然发生的突变。遗传背景的差异可以通过表型差异或通过本领域已知的分子生物学技术来检测，这些分子生物学技术诸如多核苷酸测序、是否存在遗传标记(例如，微卫星 rna标记)。
[0080]“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义互补链的序列。因此，多核苷酸也涵盖所描绘的单链的互补链。多核苷酸的许多变体可以用于与给定多核苷酸相同的目的。因此，多核苷酸也涵盖基本上相同的多核苷酸及其互
补物。单链提供可以在严格杂交条件下与给定序列杂交的探针。因此，多核苷酸也涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以包含双链和单链序列的部分。多核苷酸可以是dna(基因组dna和cdna两者)、rna或杂交体，其中多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
[0081]
单链dna杂交互补片段的特异性由反应条件的“严格性”决定(sambrook等人,molecularcloningandlaboratorymanual,seconded.,coldspringharbor(1989))。在“严格条件”下杂交描述了杂交方案，其中彼此至少60％同源的多核苷酸保持杂交。一般来说，选择严格条件比规定的离子强度和ph值下的特异性序列的热熔点(tm)低约5℃。tm是与给定序列互补的50％探针与给定序列在平衡下杂交的温度(在确定的离子强度、ph和多核苷酸浓度下)。由于给定序列通常过量存在，因此在tm下，50％的探针处于平衡状态。
[0082]
严格条件通常包括：(1)低离子强度和高温洗涤，例如15mm氯化钠、1.5mm柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；(2)杂交过程中的变性剂，例如，50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mm磷酸钠缓冲液(750mm氯化钠，75mm柠檬酸钠，ph6.5)，在42℃下；或(3)50％甲酰胺。洗涤通常还包含42℃下的5xssc(0.75mnacl、75mm柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x邓波特溶液(denhardt'ssolution)、超声处理的鲑鱼精子dna(50μg/ml)、0.1％sds以及10％硫酸葡聚糖，以及42℃下的0.2xssc(氯化钠/柠檬酸钠)中以及55℃下的50％甲酰胺中，随后由55℃下的含有edta的0.1xssc组成的高严格度洗涤。适当地，条件使得彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源的序列通常保持彼此杂交。
[0083]“中等严格条件”使用洗涤溶液和较不严格的杂交条件，使得多核苷酸将与多核苷酸的整体，片段、衍生物或类似物杂交。一个实例包含在55℃下在6xssc、5x邓波特溶液、0.5％sds以及100μg/ml变性鲑鱼精子dna中杂交，随后在37℃下在1xssc、0.1％sds中一次或多次洗涤。可以调整温度、离子强度等来适应实验因素，例如探针长度。其他中等严格条件已经进行了描述(参见ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，第1-3卷，johnwiley&sons,inc.,hoboken,n.j.(1993)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual,stocktonpress,newyork,n.y.(1990)；perbal,apracticalguidetomolecularcloning，第2版，johnwiley&sons,newyork,n.y.(1988))。
[0084]“低严格条件”使用洗涤溶液和不如中等严格性的较不严格的杂交条件，使得多核苷酸将与多核苷酸的整体，片段、衍生物或类似物杂交。低严格性杂交条件的非限制性实例包括在35％甲酰胺、5xssc、50mmtrishcl(ph7.5)、5mmedta、0.02％pvp、0.02％ficoll、0.2％bsa、100μg/ml变性鲑鱼精子dna、10％(重量/体积)硫酸葡聚糖在40℃下杂交，然后在2xssc、25mmtrishcl(ph7.4)、5mmedta和0.1％sds中在50℃下洗涤一次或多次。低严格性的其他条件(诸如跨物种杂交的条件)已进行了充分描述(参见ausubel等人，1993；kriegler，1990)。
[0085]“可操作地连接”是指基因的表达处于与其空间连接的启动子的控制之下。启动子
在其控制下可以位于基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与启动子和产生启动子的基因中其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，可以调节这一距离的变化而不损失启动子功能。“可操作地连接”是指多核苷酸片段在单个片段中的缔合，从而一个片段的功能由另一个片段调节。例如，当启动子能够调节多核苷酸片段的转录时，其可操作地与该多核苷酸片段连接。
[0086]
术语“植物”指处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其后代。在一个实施方案中，植物是烟草植物，它指的是属于烟草属的植物。该术语包括提及的完整植物、植物器官、植物组织、植物繁殖体、植物种子、植物细胞及其后代。植物细胞包括(但不限于)来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶子、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉以及花粉粒的细胞。本文描述了烟草植物的合适的种类、栽培种、杂种和品种。
[0087]“植物材料”包括叶、根、萼片、根尖、花瓣、花、芽、茎、种子和梗。植物材料可以是活的或不可存活的植物材料。
[0088]“多核苷酸”、“多核苷酸序列”或“多核苷酸片段”在本文中可互换使用，并且是指单链或双链的rna或dna的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。本公开的多核苷酸在所附序列表中列出。
[0089]“多肽”或“多肽序列”是指其中一种或多种氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸的聚合物，以及天然存在的氨基酸的聚合物。该术语还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和adp-核糖基化。本公开的多肽在所附序列表中列出。
[0090]“启动子”是指能够赋予、激活或增强细胞中多核苷酸的表达的合成或天然来源的分子。该术语是指通常位于双链多核苷酸片段的上游并与其可操作地连接的多核苷酸元件/序列。启动子可以完全源自邻近感兴趣的天然基因的区域，或者可以由来源于不同天然启动子或合成多核苷酸片段的不同元件组成。启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列以进一步增强表达或改变空间表达或改变时间表达。启动子还可以包含末端强化子或抑制子元件，其可位于来自转录起始位点的多达几千个碱基对。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的源。启动子可以关于发生表达的细胞、组织或器官或关于发生表达的发育阶段，或回应于外部刺激(例如生理学压力、病原体、金属离子或诱发剂)组成性或有差异地调节基因组分的表达。
[0091]
如本文可互换使用的“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”指的是主要但并非必须专门在一种组织或器官中表达，而是还可以在一种特异性细胞中表达的启动子。“发育调节型启动子”是指其功能由发育事件决定的启动子。“组成型启动子”是指引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子。响应于内源或外源刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导剂)或响应于环境、激素、化学或发育信号或其两种或更多种的组合，“诱导型启动子”选择性表达可操作连接的dna序列。诱导型或调节型启动子的实例包括由光、热、压力、洪水或干旱、病原体、植物激素、创伤或化学药品诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂调节的启动子。
[0092]“重组”是指两个另外分离的序列片段的人工组合，诸如通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的多核苷酸片段。该术语还包括提及的已通过引入异源多核苷酸而被修饰的细胞或载体或来源于如此修饰的细胞的细胞，但不涵盖由于天然发生的事件(例如，自
发突变、天然转化或转导或转座)诸如在没有人为干预的情况下发生的事件对细胞或载体的改变。
[0093]“重组构建体”是指自然界中通常不被一起发现的多核苷酸的组合。因此，重组构建体可包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于相同来源但以不同于自然界通常发现的方式排列的调节序列和编码序列。重组构建体可以是重组dna构建体。
[0094]
本文可互换使用的“调节序列”和“调节元件”是指位于编码序列上游 (5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译的多核苷酸序列。调节序列包括启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。术语“调节序列”和“调节元件”在本文中可以互换使用。
[0095]
术语“烟草”在总体意义上用于指烟草作物(例如，在田间生长的多种烟草植物而不是水培生长的烟草)、烟草植物及其部分，包括但不限于如本文所述制备或获得的根、茎、叶、花和种子。应当理解，“烟草”包括普通烟草植物及其产品。
[0096]
术语“烟草产品”是指消费者烟草产品，包括但不限于吸烟材料(例如，香烟、雪茄和烟斗烟草)、鼻烟、嚼用烟草、口香糖和锭剂，以及用于制造消费者烟草产品的组分、材料和成分。适宜地，这些烟草产品由从烟草收获的烟草的叶和茎制造，并且根据烟草制备中的常规技术对其进行切割、干燥、干制或发酵。
[0097]“转录终止子”、“终止序列”或“终止子”是指位于编码序列下游的 dna序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mrna加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常特征为影响聚腺苷酸段向mrna前驱体的3'端的添加。
[0098]“转基因”是指任何细胞、细胞系、愈伤组织、植物部分或植物，其基因组由于异源多核苷酸诸如重组构建体的存在而被改变，包括那些初始转基因事件以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因事件产生的那些。该术语不包括通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件(诸如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)的基因组(染色体或染色体外)的改变。
[0099]“转基因植物”是指在其基因组内包含一种或多种异源多核苷酸的植物，即，含有通常在其中未发现的重组遗传物质并且已通过人工操作引入所述植物中(或引入植物的祖细胞中)的植物。例如，异源多核苷酸可以稳定地整合到基因组内，使得多核苷酸传递到连续的世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组构建体的一部分整合到基因组中。基因改良胚质的商业开发还发展到向作物植物中引入多种特性的阶段，通常称为基因堆叠法。在这一方法中，可以向植物中引入赋予所关注的不同特征的多个基因。基因堆叠可以通过许多方式实现，包括(但不限于)共转型、重新转型以及用不同转基因品系交叉。因此，从通过转型引入重组 dna的植物细胞生长的植物是转基因植物，全部是含有所以引入转基因的植物的子代(有性产生或无性产生)。应当理解，术语转基因植物包括整个植物或树木以及该植物或树木的部分，例如谷粒、种子、花、叶、根、果实、花粉、茎等。各异源多核苷酸可以赋予转基因植物不同性状。
[0100]“转基因”是指包含已从一种生物中分离并引入到不同生物中的基因序列的基因或遗传物质。这种dna的非天然片段可以保留在转基因生物中产生rna或多肽的能力，或者它可以改变转基因生物遗传密码的正常功能。
[0101]
关于多核苷酸的“变体”是指：(i)多核苷酸的一部分或片段；(ii) 多核苷酸或其
部分的互补物；(iii)与目的多核苷酸或其互补物基本上相同的多核苷酸；或(iv)在严格条件下与目的多核苷酸、其互补物或与其基本上相同的多核苷酸杂交的多核苷酸。
[0102]
关于肽或多肽的“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在序列上不同但保留至少一种生物学功能或活性的肽或多肽。变体也可以指保留至少一种生物学功能或活性的多肽。氨基酸的保守取代，即，用性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)相似的不同氨基酸取代氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。
[0103]
术语“品种”指共享恒定特征的植物群体，所述恒定特征使其与相同物种的其他植物分开。尽管具有一种或多种独特性状，但品种的特征进一步在于所述品种内个体之间的极小整体变化。品种通常在市场上有出售。
[0104]“载体”指包含用于使得能够转运多核苷酸的多核苷酸组分、多核苷酸构建体和多核苷酸缀合物等的组合的多核苷酸媒介物。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是 dna或rna载体。合适的载体包括能够进行染色体外复制的附加体，例如环状双链核苷酸质粒；线性化的双链核苷酸质粒；以及任何来源的其他媒介。“表达载体”是包含用于使得能够表达多核苷酸的多核苷酸组分、多核苷酸构建体和多核苷酸缀合物等的组合的多核苷酸媒介物。合适的表达载体包括能够进行染色体外复制的附加体，例如环状双链核苷酸质粒；线性化的双链核苷酸质粒；以及任何来源的其他功能等效的表达载体。表达载体包含位于多核苷酸、多核苷酸构建体或多核苷酸缀合物的上游并与其可操作地连接的至少一个启动子，如下文所定义。
[0105]
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有所属领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及多肽和多核苷酸化学和杂交有关使用的任何命名和技术是本领域熟知和常用的那些。术语的含义和范围应该明确；然而在具有任何潜在不明确性的事件中，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
[0106]
2.多核苷酸
[0107]
公开了一种经分离的多核苷酸，其包含与本文所述的任何序列具有至少60％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成，所述序列包括序列表中所示的任何多核苷酸。适当地，经分离的多核苷酸包含与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0108]
适当地，本文所述的多核苷酸编码具有序列表中所示多肽的至少约 50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多的功能或活性的活性多肽。
[0109]
在另一个实施方案中，提供一种分离的ntinv多核苷酸，其包含与 seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7或seq idno:9具有至少60％序列同一性的多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
[0110]
在另一个实施方案中，提供一种分离的ntsus多核苷酸，其包含与 seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seqid no:18、seq id no:20、seq id no:22或seq id no:24；seq idno:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32具有至少60％序列同一性的多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
no:7或seq id no:9具有实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的片段，所述片段与seq id no:1、seq id no:3、 seq id no:5、seq id no:7或seq id no:9的对应片段具有至少约 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性。
[0120]
在另一个实施方案中，提供与seq id no:10、seq id no:12、 seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seqid no:22或seq id no:24；seq id no:26、seq id no:28、seq idno:30或seq id no:32具有实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的片段，所述片段与seq id no:10、seq id no:12、seq id no: 14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22 或seq id no:24；seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或 seq id no:32的对应片段具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、 99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性。
[0121]
在另一个实施方案中，提供编码起inv作用的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含与seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seqid no:7或seq id no:9足够或相当程度的同一性或相似性。
[0122]
在另一个实施方案中，提供编码起sus作用的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸包含与seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、 seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22或 seq id no:24；seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或 seq id no:32足够或相当程度的同一性或相似性。
[0123]
在另一个实施方案中，提供了一种多核苷酸的聚合物，所述聚合物包含在本文中命名为seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、 seq id no:7或seq id no:9的多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
[0124]
在另一个实施方案中，提供了一种多核苷酸的聚合物，所述聚合物包含在本文中命名为seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、 seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22或 seq id no:24；seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或 seq id no:32的多核苷酸，由其组成或基本上由其组成。
[0125]
适当地，本文所述的多核苷酸编码分别具有inv活性或sus活性的inv家族或sus家族的成员。
[0126]
多核苷酸可包括核苷酸的聚合物，其可以是未经修饰的或经修饰的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。因此，多核苷酸可以是 (但不限于)基因组dna、互补dna(cdna)、mrna或反义rna 或其片段。此外，多核苷酸可以是单链或双链dna、单链和双链区混合的dna、包括dna和rna的杂交分子或具有单链和双链区的混合物的杂交分子或其片段。另外，多核苷酸可以由包括dna、rna或两者的三链区或者其片段构成。多核苷酸可以含有一个或多个经修饰的碱基，如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸。一般来说，多核苷酸可以由分离的或克隆的cdna片段、基因组dna、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合组装。尽管本文描述的多核苷酸显示为dna序列，但是它们包括其相应的rna序列以及它们的互补(例如，完全互补)的dna或 rna序列，包括其反向互补物。
s和ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变) 可以包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和ntsus4-s中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、 ntsus2-t、ntsus4-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中。
[0138]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv4-s和 ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种 ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s和ntsus4-t中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中。
[0139]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv4-s和 ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种 ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和ntsus4-s中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、ntsus2-t、ntsus4-t、 ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中。
[0140]
3.多肽
[0141]
还提供了一种经分离的多肽，所述多肽包含与本文所述的任何多肽具有至少60％序列同一性的多肽，由其组成或基本上由其组成，所述多肽包括序列表中所示的任何多肽。适当地，经分离的多肽包含与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、 70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0142]
还提供了一种ntinv多肽，所述ntinv多肽包含与seq id no:2、 seq id no:4、seq id no:6或seq id no:8具有至少69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、 99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0143]
还提供了一种多肽，所述多肽包含与seq id no:2、seq id no:4、 seq id no:6或seq id no:8具有至少80％、81％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0144]
还提供了一种多肽，所述多肽包含与seq id no:2、seq id no:4、 seq id no:6或seq id no:8具有至少95％、96％、97％、98％、99％、 99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0145]
还提供了由seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seq idno:8编码的多肽。
[0146]
多肽可包含与seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6或seqid no:8具有足够或相当程度的同一性或相似性以用作inv的序列。
[0147]
还提供了一种ntsus多肽，所述ntsus多肽包含与seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seqid no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq idno:29或seq id no:31；或seq id no:33具有至少69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0148]
还提供了一种多肽，所述多肽包含与seq id no:11、seq id no: 13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、 seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31；或seq id no:33具有至少80％、81％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0149]
还提供了一种多肽，所述多肽包含与seq id no:11、seq id no: 13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、 seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或 seq id no:31；或seq id no:33具有至少95％、96％、97％、98％、 99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、 99.9％或100％序列同一性的序列，由其组成或基本上由其组成。
[0150]
还提供了由seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seqid no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq idno:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31；或seq idno:33编码的多肽。
[0151]
多肽可包含与seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、 seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seqid no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31；或seqid no:33具有足够或相当程度的同一性或相似性以用作sus的序列。
[0152]
多肽的片段通常保留全长序列的一些或全部功能或活性，诸如inv 或sus活性。多肽的片段的范围可以是至少约25个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸，并且至多本文所述的全长多肽。
[0153]
多肽还包括通过引入任何类型的改变(例如，氨基酸的插入、缺失或取代；糖基化状态的改变；影响重折叠或异构化的改变、三维结构或自缔合状态)而产生的突变体，其可以被有意地工程化或天然地分离，条件是它们仍然具有其功能或活性中的一些或全部。合适地，该功能或活性被调节。
[0154]
缺失是指从多肽中去除一种或多种氨基酸。插入指被引入多肽中的预定位点内的一个或多个氨基酸残基。插入可包含单个或多个氨基酸的序列内插入。取代指多肽的氨基酸由具有相似特性(诸如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏a-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸取代。氨基酸取代通常为单个残基，但可以是成簇的，取决于对多肽施加的功能制约，并且范围可为约1至约10个氨基酸。氨基酸取代优选是如下所述的保守氨基酸取代。氨基酸取代、缺失或插入可使用肽合成技术例如固相肽合成或通过重组dna操纵进行制备。用于操作 dna序列以产生多肽的取代、插入或缺失变体的方法是本领域所熟知的。该变体可具有产生沉默变化并产生功能上等同的多肽的改变。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和两亲特性的相似性做出有意的氨基酸取代，只要该物质的次级结合得以保持即可。举例来说，带负电的氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包含赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值含不带电极性首基的氨基酸包含亮氨酸、异
亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。保守取代可以例如根据下表进行。第二列中的相同块和优选第三列中的相同行中的氨基酸可以彼此取代：
[0155][0156]
多肽可以是成熟多肽或不成熟多肽或来源于不成熟多肽的多肽。多肽可以采取线性形式或使用已知方法环化。多肽通常包含至少10、至少 20、至少30或至少40个邻接氨基酸。
[0157]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv3-s、 ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t中。
[0158]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv4-s和 ntinv4-t中。
[0159]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv3-s、 ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t中。任选地，至少一种或多种另外的修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、 ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s、ntsus4-t、 ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中，适当地包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s和 ntsus4-t中。
[0160]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv3-s、 ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变) 可以包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、 ntsus4-s和ntsus4-t中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和 ntsus6-t中。
[0161]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv3-s、ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变) 可以包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和ntsus4-s 中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、 ntsus1-t、ntsus2-t、ntsus4-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s 和ntsus6-t中。
[0162]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv4-s和 ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus2-t、ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s和 ntsus4-t中，然而没有修饰(例如，突变)包括在一种或多种ntsus1
‑ꢀ
s、ntsus1-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中。
[0163]
至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntinv4-s和 ntinv4-t中，并且至少一种修饰(例如，突变)可以包括在一种或多种ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和ntsus4-s中，然而没有修饰 (例如，突变)包括在一种或多种ntsus1-s、ntsus1-t、ntsus2-t、 ntsus4-t、ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t中。
[0164]
4.修饰植物
[0165]
a.转化
[0166]
重组构建体可用于转化植物或植物细胞，以调节多肽表达、功能或活性。重组多核苷酸构建体可以包括编码如本文所述的一种或多种多核苷酸的多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸可操作地连接于适合表达多肽的调节区。因此，多核苷酸可以包括编码如本文所述的多肽的编码序列。调节了多肽表达、功能或活性的植物或植物细胞可以包括突变的、非天然存在的、转基因的、人造的或基因工程的植物或植物细胞。适当地，转基因植物或植物细胞包括已通过重组dna的稳定整合而改变的基因组。重组dna包含已在细胞外部经基因工程改造和构建的dna，并且包含含有天然存在的dna或cdna或合成dna的dna。转基因植物可包括由最初转化的植物细胞再生的植物，以及来自经转化的植物的以后世代或杂交的后代转基因植物。合适地，与对照植物相比，转基因修饰改变了本文所述的多核苷酸或多肽的表达、功能或活性。
[0167]
由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。在一些情况下，重组构建体含有可操作地连接于调节区的调节表达的多核苷酸。在本文中描述了合适调节区的实例。
[0168]
还提供含有重组多核苷酸构建体的载体，如本文中所描述的那些。合适的载体主链包含例如本领域常规使用的载体主链，如质粒、病毒、人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体或噬菌体人工染色体。合适的表达载体包含但不限于源自例如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质粒和病毒载体。众多载体和表达系统是商购可得的。
[0169]
载体可以包含例如复制起点、支架附着区域或标记。标记基因可以赋予植物细胞可选择表型。举例来说，标记可以赋予杀生物剂抗性，如对抗生素(例如卡那霉素(kanamycin)、g418、博来霉素(bleomycin) 或潮霉素(hygromycin))或除草剂(例如草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorsulfuron)或草胺膦(phosphinothricin))的抗性。另外，表达载体可以包含设计为促进所表达多肽的操纵或检测(例如纯化或定位) 的标签序列。标签序列，诸如荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、绿色荧光多肽、谷胱甘肽s-转移酶、聚组氨酸、c-myc或血凝素序列通常表达为与所编码的多肽的融合体。这类标签可以插入多肽内的任何地方，包括在羧基或氨基末端处。
[0170]
植物或植物细胞可以通过使重组多核苷酸整合到其基因组来进行转化，以变得稳定转化。本文中所描述的植物或植物细胞可以是稳定转化的。稳定转化的细胞在每次细胞分裂中通常保留引入的多核苷酸。植物或植物细胞可以进行瞬时转化，使得重组多核苷酸不整合到其基因组内。瞬时转化的细胞在每次细胞分裂中通常失去引入的重组多核苷酸的全部或一部分，使得在足够数目的细胞分裂后，引入的重组多核苷酸无法在子细胞中检测到。
[0171]
本领域中的许多方法可用于转化植物细胞，包括生物射弹、基因枪技术、农杆菌介导的转化、病毒载体介导的转化、冻融法、微粒轰击、直接dna摄取、超声处理、显微注射、植物病毒介导的转移和电穿孔。
[0172]
如果细胞或培养的组织用作转化的受体组织，那么需要时，通过本领域技术人员已知的技术，可以由经转化的培养物再生植物。
[0173]
有待包含在重组构建体中的调节区的选择取决于几个因素，包含但不限于效率、
可选择性、可诱导性、所需表达水平和细胞或组织优先表达。通过适当选择调节区且相对于编码序列放置调节区，调节编码序列的表达对于本领域技术人员是常规工作。多核苷酸的转录可以相似方式进行调节。一些合适的调节区仅或占优势地在某些细胞类型中起始转录。用于鉴定且表征植物基因组dna中的调节区的方法是本领域已知的。
[0174]
示例性启动子包括由组织特异性因子识别的组织特异性启动子，所述组织特异性启动子存在于不同组织或细胞类型中(例如根特异性启动子、枝条特异性启动子、木质部特异性启动子)，或存在于不同发育阶段期间，或响应不同环境条件存在。合适的启动子包括组成型启动子，其可在大多数细胞类型中活化，而无需特异性诱导剂。用于控制多肽表达的启动子的实例包含花椰菜花叶病毒35s(camv/35s)、ssu、ocs、 lib4、usp、stls1、b33、nos或泛素启动子或菜豆蛋白启动子。本领域技术人员能够产生重组启动子的多种变体。
[0175]
组织特异性启动子是仅在植物发育期间的特定时间，在特定细胞或组织中(如在营养组织或生殖组织中)活跃的转录控制元件。在发育控制下的组织特异性启动子的实例包括可仅(或主要仅)在某些组织中起始转录的启动子，所述组织诸如营养组织(例如根或叶)或生殖组织 (诸如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊、花或任何胚胎组织)。生殖组织特异性启动子可以是例如花药特异性、胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子和种皮特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性或其组合。
[0176]
示例性叶特异性启动子包括来自c4植物(玉蜀黍)的丙酮酸正磷酸双激酶(ppdk)启动子、来自玉蜀黍的cab-m1ca 2启动子、拟南芥 (arabidopsis thaliana)myb相关基因启动子(atmyb5)、二磷酸核酮糖羧化酶(rbcs)启动子(例如，在叶和光生长幼苗中表达的番茄 rbcs 1、rbcs2和rbcs3a基因，在发育中的番茄果实中表达的 rbcs1和rbcs2，或几乎专一地以高水平在叶片和叶鞘的叶肉细胞中表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子)。
[0177]
示例性衰老特异性启动子包含在果实催熟、叶枯萎和脱落期间活跃的番茄启动子、编码半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍启动子、82e4的启动子和sag基因的启动子。可使用示例性花药特异性启动子。可选择本领域技术人员已知的示例性根优先启动子。示例性种子优选的启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子，诸如种子储存多肽的启动子)和种子发芽启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。
[0178]
诱导型启动子的实例包含响应病原体攻击、厌氧条件、高温、光、干旱、寒冷温度或高盐浓度的启动子。病原体诱导型启动子包括来自与发病机理相关的多肽(pr多肽)的启动子，这些启动子在病原体(例如，pr多肽、sar多肽、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶)感染后被诱导。
[0179]
除植物启动子之外，其他合适的启动子可以来源于细菌来源，例如，章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子，并且其他启动子来源于ti质粒，或者可以来源于病毒启动子(例如，花椰菜花叶病毒(camv)的35s 和19s rna启动子、烟草花叶病毒的组成型启动子、花椰菜花叶病毒 (camv)19s和35s启动子或玄参花叶病毒35s启动子)。
[0180]
b.突变
[0181]
公开了包含本文所述的一种或多种多核苷酸或多肽中的至少一个突变的植物或植物细胞，其中所述突变导致ntinv或由其编码的多肽的功能或活性，或ntinv和ntsus或由其编码的多肽的功能或活性受调节。本文中讨论了这些突变的组合。
[0182]
提供了一种用于调节(干制)植物或(干制)植物材料中的ntinv 多肽或ntinv多肽
和ntsus多肽的水平的方法，所述方法包括将调节至少一种ntinv基因或至少一种ntinv基因和至少一种ntsus基因的表达的一个或多个突变引入所述植物的基因组中，其中所述至少一种基因选自根据本公开的任何序列。
[0183]
还提供了一种用于鉴定具有调节的还原糖水平的植物的方法，所述方法包括针对根据本公开的序列中一个或多个突变(诸如ntinv或 ntinv和ntsus或其组合)的存在筛选来自目的植物的多核苷酸样品，并且任选地将所鉴定的突变与已知调节的还原糖水平的突变相关联。
[0184]
还公开了对于根据本公开的ntinv基因或ntinv基因和ntsus基因中的一个或多个突变是杂合的或纯合的植物或植物细胞，其中所述突变导致基因的表达或由其编码的ntinv多肽或ntinv和ntsus多肽的功能或活性受调节。
[0185]
大量方法可用于组合一种植物中的突变，包含有性杂交。在根据本公开内容的基因中具有一个或多个有利的杂合或纯合突变(其调节基因的表达或由其编码的多肽的功能或活性)的植物可以与在一个或多个其他基因中具有一个或多个有利的杂合或纯合突变(其调节基因的表达或由其编码的多肽的功能或活性)的植物杂交。在一个实施方案中，进行杂交以在同一植物内在根据本公开的基因内引入一个或多个有利的杂合或纯合突变。
[0186]
如果植物中本公开的一种或多种多肽的功能或活性低于或高于植物中相同多肽的功能或活性，则功能或活性增加或降低，所述植物未被修饰以抑制所述多肽的功能或活性并且已经使用相同方案培养、收获和干制。
[0187]
在一些实施方案中，使用诱变方法将突变引入植物或植物细胞中，并且使用本领域技术人员已知的方法诸如southern印迹分析、dna测序、pcr分析或表型分析来鉴定或选择引入的突变。可以使用本领域众所周知的方法来确定影响基因表达或干扰所编码的多肽的功能的突变。基因外显子中的插入突变通常导致空突变。保守残基中的突变在抑制编码的多肽的代谢功能方面可以特别有效。例如，应当理解，一个或多个高度保守区域中的突变可能改变多肽功能，而那些高度保守区域之外的突变可能对多肽功能有很小影响或没有影响。此外，单个核苷酸中的突变可产生终止密码子，这将导致截短的多肽，并且取决于截短的程度，丧失功能。
[0188]
还公开了用于获得突变型多核苷酸和多肽的方法。任何目的植物，包含植物细胞或植物材料，可以通过多种已知诱导诱变的方法进行遗传修饰，所述方法包含定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、化学诱导的诱变、辐射诱导的诱变、利用经修饰的碱基的诱变、利用缺口双链体dna的诱变、双链断裂诱变、利用修复缺陷型宿主株的诱变、通过全基因合成的诱变、dna改组和其他等效方法。
[0189]
本文所述的多核苷酸和多肽中的突变可包括人为突变或合成突变或基因工程突变。本文所述的多核苷酸和多肽中的突变可以是通过包括体外或体内操作步骤的过程获得或可获得的突变。本文所述的多核苷酸和多肽中的突变可以是通过包括人为干预的过程获得或可获得的突变。突变多肽变体的功能或活性可以更高、更低或与未突变多肽大约相同。
[0190]
在多核苷酸中随机引入突变的方法可包括化学诱变和放射诱变。化学诱变涉及使用外源添加的化学物质(诸如诱变、致畸或致癌的有机化合物)来诱发突变。主要产生点突变和短缺失、插入、错义突变、简单序列重复、颠换或转换的诱变剂(包括化学诱变剂或辐射)可用于产生突变。诱变剂包括甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、n-乙基-n-亚硝基脲、三乙基三
聚氰胺、n-甲基-n-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、n-甲基-n'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基
‑ꢀ
苯并(a)蒽、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安(bisulfan)、二环氧烷烃(二环氧辛烷、二环氧丁烷等)、2-甲氧基-6-氯-9-[3-(乙基-2-氯-乙基) 氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐和甲醛。
[0191]
还设想了可能不是由诱变剂直接引起的基因座中的自发突变，只要它们产生所需表型。合适的诱变试剂还可以包含例如电离辐射，如x射线、γ射线、快中子照射和uv辐射。对于每种类型的植物组织，诱变化学物质或辐射的剂量通过实验确定，使得获得低于以致死性或繁殖不育为特征的阈值水平的突变频率。本领域技术人员已知的任何植物多核苷酸制备方法均可用于制备用于突变筛选的植物多核苷酸。
[0192]
突变过程可包括一种或多种植物杂交步骤。
[0193]
在突变后，可以执行筛选，以鉴定产生提前终止密码子或者无功能基因的突变。突变后，可以进行筛选以鉴定产生能够以增加或降低的水平表达的功能基因的突变。突变体的筛选可以通过测序或通过使用对该基因或多肽特异的一种或多种探针或引物来进行。还可在多核苷酸中产生特异性突变，其可导致调节的基因表达、调节的mrna稳定性或调节的多肽稳定性。这类植物在本文中被称为“非天然存在的”或“突变型”植物。通常，突变型或非天然存在的植物将包括在被操作之前在植物中不存在的外来或合成或人造核苷酸的至少一部分(例如，dna或rna)。外来核苷酸可以是单个核苷酸、两个或更多个核苷酸、两个或更多个连续核苷酸或两个或更多个非连续核苷酸，例如至少10、20、30、40、50、 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400或1500或更多个连续或非连续核苷酸。
[0194]
c.转基因和基因组编辑
[0195]
可干扰一个或多个内源基因转录的序列特异性多核苷酸；可干扰 rna转录物(例如，双链rna、sirna、核酶)翻译的序列特异性多核苷酸；可干扰一种或多种多肽的稳定性的序列特异性多肽；可干扰一种或多种多肽的酶功能或一种或多种多肽相对于底物或调节多肽的结合功能的序列特异性多核苷酸；对一种或多种多肽表现出特异性的抗体；可干扰一种或多种多肽的稳定性或一种或多种多肽的酶功能或一种或多种多肽的结合功能的小分子化合物；结合一种或多种多核苷酸的锌指多肽；以及具有针对一种或多种多核苷酸的功能的大范围核酸酶可用于调节本文所述的一种或多种多核苷酸或多肽的表达或功能或活性。基因组编辑技术是本领域众所周知的，并且在下文进一步论述。
[0196]
d.锌指核酸酶
[0197]
锌指多肽可用于调节本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和 ntsus多核苷酸的表达或功能或活性。锌指核酸酶的使用描述于naturerev.genet.(2010)11(9):636-646)中。
[0198]
e.大范围核酸酶
[0199]
大范围核酸酶诸如i-crei可用于调节本文所述的一种或多种ntinv 或ntinv和ntsus多核苷酸的表达或功能或活性。大范围核酸酶的使用描述于curr gene ther.(2011)feb；11(1):11-27以及int j mol sci.(2019) 20(16),4045中。
[0200]
f.talen
[0201]
转录激活子样效应子核酸酶(talen)可用于调节本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的表达或功能或活性。 talen的使用描述于nature rev.mol.cell biol.(2013)14:49-55以及intj mol sci.(2019)20(16),4045中。
[0202]
g.crispr
[0203]
crispr系统可用于调节本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和 ntsus多核苷酸的表达或功能或活性，并且是优选的方法。该技术描述于例如plant methods(2016)12:8；front plant sci.(2016)7:506； biotechnology advances(2015)33,1,第41-52页；acta pharmaceuticasinica b(2017)7,3,p292-302；curr.op.in plant biol.(2017)36,1
–
8以及 int j mol sci(2019)20(16),4045中。如本领域众所周知的，crispr编辑系统通常包括两个组分：crispr相关核酸内切酶(cas)(例如，cas9) 和指导rna(grna)。cas在基因组中的位点处形成双链dna断裂，所述位点由与cas结合的grna分子的序列限定。cas断裂dna的位置由与其结合的grna的独特序列限定。grna是专门设计的rna序列，其识别目的靶dna区域并指导cas核酸酶用于编辑。它具有两个区段： (i)充当cas核酸酶的结合支架的tracr rna；以及(ii)crispr rna (crrna)，与靶dna互补的17-20个核苷酸序。待靶向的dna的确切区域将取决于具体应用。例如，为了活化或抑制靶多核苷酸，可以将grna靶向驱动靶多核苷酸表达的启动子。用于设计grna的方法是本领域众所周知的，包括chop chop harvard。
[0204]
基于cas9的基因组编辑在拟南芥和烟草中的应用描述于例如 methods enzymol.(2014)546:459-72和plant physiol biochem.(2018) 131:37-46中。crispr技术已在植物中广泛应用(参见例如 wo2015/189693)。
[0205]
除cas9之外，还描述了用于crispr系统的其他rna引导的核酸酶，包括casl、caslb、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、 caslo、cpfl、csyl、csy2、csy3、csel、cse2、cscl、csc2、csa5、 csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、 cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3、csxl7、csxl4、csxlo、csxl6、 csax、csx3、csxl、csxl5、csfl、csf2、csf3和csf4。在某些实施方案中，使用cas9是优选的。
[0206]
本公开还提供了包含rna引导的核酸酶和grna的基于crispr的基因组编辑系统，其中基于crispr的基因组编辑系统调节本文所述的一种或多种多核苷酸的活性。本公开还提供了切割植物细胞中的一种或多种多核苷酸的方法，所述方法包括将grna和rna引导的核酸酶引入植物细胞中，其中grna与rna引导的核酸酶联合起作用以在本文所述的一种或多种多核苷酸中产生链断裂。还公开了crispr构建体，所述crispr构建体包含：(i)编码crispr相关核酸内切酶的多核苷酸；以及(ii)包含与待靶向的如本文所述的多核苷酸的dna互补的多核苷酸序列(通常为约17-20个核苷酸)的grna。
[0207]
h.反义修饰
[0208]
反义技术是可以用于调节一种或多种ntinv多肽或一种或多种 ntinv和ntsus多肽的表达或活性的另一熟知方法。参见例如gene (1988)10；72(1-2):45-50。
[0209]
i.可动遗传因子
[0210]
作为另外一种选择，可通过将转座子(例如is元件)引入目的植物的基因组内，靶向基因以灭活。参见例如cytology and genetics(2006) 40(4):68-81。
[0211]
j.核酶
[0212]
或者，可以通过将源自许多小环状rna的核酶引入植物中来靶向 ntinv或ntinv和
ntsus多核苷酸以灭活，所述小环状rna能够自切割和复制。参见例如fems microbiology reviews(1999)23,3,257
–
275。
[0213]
5.植物
[0214]
突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以具有一种或多种ntinv 或ntinv和ntsus基因一种或一种或多种ntinv或ntinv和ntsus中的一种或多种修饰(例如突变)的任何组合，其导致那些多核苷酸或其多核苷酸产物的表达或功能或活性受调节。例如，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以具有单个ntinv或单个ntinv和单个ntsus多核苷酸或多肽中的单个修饰；单个ntinv或单个ntinv和单个ntsus 多核苷酸或多肽中的多个修饰；两种或更多种或三种或更多种或四种或更多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸或多肽中的单个修饰；或两种或更多种或三种或更多种或四种或更多种ntinv或ntinv和ntsus 多核苷酸或多肽中的多个修饰。作为另一个的实例，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以在ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸或多肽的特定部分中(诸如在编码ntinv或ntsus多肽或其部分的活性位点的ntinv或ntinv和ntsus的区域中)具有一种或多种修饰。作为另一个的实例，突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以在一种或多种 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸或多肽之外的区域(诸如在其调节的 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的上游或下游区域)中具有一种或多种修饰，条件是它们调节ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的功能或表达。上游元件可以包括启动子、增强子或转录因子。一些元件如增强子可以置于它调节的基因的上游或下游。元件无需定位接近于它调节的基因，因为一些元件已发现位于它调节的基因上游或下游几十万个碱基对处。突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以具有位于基因的前100 个核苷酸内、基因的前200个核苷酸内、基因的前300个核苷酸内、基因的前400个核苷酸内、基因的前500个核苷酸内、基因的前600个核苷酸内、基因的前700个核苷酸内、基因的前800个核苷酸内、基因的前900个核苷酸内、基因的前1000个核苷酸内、基因的前1100个核苷酸内、基因的前1200个核苷酸内、基因的前1300个核苷酸内、基因的前1400个核苷酸内、或基因的前1500个核苷酸内的一种或多种修饰。突变型或非天然存在的植物或植物细胞可以具有位于基因的100个核苷酸的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五集合或其组合内的一种或多种修饰。公开了包括突变型多肽变体的突变型或非天然存在的植物或植物细胞(例如，如本文所述的突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞等)。
[0215]
在一个实施方案中，使来自植物的种子诱变且随后生长成第一代突变型植物。随后使第一代植物自花授粉，并且使来自第一代植物的种子生长成第二代植物，所述第二代植物随后就其基因座中的突变进行筛选。尽管诱变的植物材料可以针对突变进行筛选，但筛选第二代植物的优点在于所有体细胞突变都对应于生殖系突变。本领域技术人员应理解，包含但不限于种子、花粉、植物组织或植物细胞的多种植物材料可以进行诱变，以便产生突变型植物。然而，当筛选植物多核苷酸的突变时，诱变的植物材料的类型可能有影响。举例来说，当在非诱变植物授粉之前对花粉实施诱变时，使授粉获得的种子生长成第一代植物。第一代植物的每一个细胞将含有在花粉中产生的突变；因此这些第一代植物随后可针对突变进行筛选，而不是等到第二代进行。
[0216]
6.修饰植物的制备、筛选和杂交
[0217]
从个体植物、植物细胞或植物材料制备的ntinv或ntinv和ntsus 多核苷酸可以任
选地合并，以加速在源自诱变的植物组织、细胞或材料的植物群体中筛选突变。可以筛选植物、植物细胞或植物材料的一个或多个后续世代。任选合并的群组的大小取决于使用的筛选方法的灵敏度。
[0218]
任选合并样品后，可以对其进行多核苷酸特异性扩增技术，诸如 pcr。对该基因或紧邻该基因的序列特异的任何一种或多种引物或探针可用于扩增任选合并的样品内的序列。合适地，一个或多个引物或探针设计为扩增最可能出现有用突变的基因座的区域。最优选地，引物设计为检测多核苷酸区域内的突变。另外，引物和探针优选避免已知的多态性位点，以便容易筛选点突变。为了便于扩增产物的检测，可以使用任何常规标记方法来标记一个或多个引物或探针。使用本领域充分理解的方法，可以基于本文中所描述的序列来设计引物或探针。
[0219]
为了便于检测扩增产物，可以使用任何常规标记方法来标记引物或探针。使用本领域充分理解的方法，可以基于本文中所描述的序列来设计这些引物或探针。
[0220]
可以通过本领域已知的方法鉴定多态性，并且一些多态性已在文献中得到描述。
[0221]
在一些实施方案中，植物可以从植物、植物组织或植物细胞再生或生长。可以使用从植物细胞或植物组织再生或生长植物的任何适合方法，例如(但不限于)从原生质体组织培养或再生。适当地，植物可以通过在愈伤组织诱导培养基、嫩芽诱导培养基或根部诱导培养基上生长经转型植物细胞再生。参看例如mccormick等人,plant cell reports 5:81-84 (1986)。这些植物接着可生长，并且经相同经转型品系或不同品系授粉，并且鉴别具有所要表型特征表达的所得杂交体。可以生长两代或更多代来确保所要表型特征的表达稳定保持和遗传，并且采摘种子以确保获得所要表型特征的表达。因此，“经转型种子”指的是种子含有稳定整合到植物基因组中的核苷酸构建体。
[0222]
因此，在另一方面，提供了制备突变型植物的方法。该方法涉及提供植物的至少一个细胞，所述植物包含编码本文所述的功能性多核苷酸 (或如本文所述的其任何组合)的ntinv或ntinv和ntsus基因。接下来，在有效调节多核苷酸功能的条件下处理植物的至少一个细胞。然后将至少一个突变型植物细胞繁殖成突变型植物，其中与对照植物相比较，所述突变型植物具有本文所述的调节水平的ntinv或ntinv和ntsus 多肽(或如本文所述的其任何组合)。在这一制备突变型植物的方法的一个实施方案中，处理步骤涉及在有效获得至少一个突变型植物细胞的条件下，使至少一个细胞经受如上所述的化学诱变剂。在这一方法的另一个实施方案中，处理步骤涉及在有效获得至少一个突变型植物细胞的条件下，使至少一个细胞经受辐射源。术语“突变型植物”包括其中与对照植物相比基因型被修饰(合适地，通过除基因工程或基因修饰之外的方式)的突变型植物。
[0223]
在某些实施方案中，突变型植物、突变型植物细胞或突变型植物材料可以包括一个或多个突变，所述一个或多个突变在另一种植物、植物细胞或植物材料中天然存在，且赋予所需性状。该突变可引入(例如基因渗入)另一种植物、植物细胞或植物材料(例如具有与突变源自于其的植物不同的遗传背景的植物、植物细胞或植物材料)内，以对其赋予该性状。因此，例如，可以将在第一植物中天然发生的突变引入第二植物中，诸如具有与第一植物不同的遗传背景的第二植物。技术人员因此能够搜索且鉴定在基因组中天然携带本文中所描述基因的一种或多种突变等位基因的植物，所述基因赋予所需性状。可以通过多种方法(包含育种、回交和基因渗入)将天然存在的突变体等位基因转移到第二植物，以产生在
本文中所描述基因中具有一个或多个突变的品系、品种或杂交物。相同的技术也可以应用于一个或多个非天然突变从第一植物到第二植物的基因渗入。可以在突变型植物的库中筛选展示所需性状的植物。合适地，利用如本文所述的多核苷酸的知识进行选择。因此，能够与对照相比筛选基因性状。这样的筛选方法可以涉及如本文讨论的常规扩增或杂交技术的应用。因此，本公开的另一方面涉及用于鉴定突变型植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含来自植物的一种或多种 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的样品；以及(b)确定多核苷酸的序列，其中多核苷酸的序列与对照植物的多核苷酸相比的差异指示所述植物是突变型植物。在另一方面，提供了用于鉴定突变型植物的方法，所述突变型植物与对照植物相比累积了增加或降低水平的还原糖，该方法包括以下步骤：(a)提供来自待筛选植物的样品；(b)确定所述样品是否包含本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸中的一个或多个突变；以及(c)测定所述植物的至少一种还原糖(合适地葡萄糖或果糖或其组合)的水平。合适地，确定干制叶子中至少一种还原糖的水平。在另一方面，提供了制备突变型植物的方法，该突变型植物与对照植物相比具有增加或降低的至少一种还原糖(适当地葡萄糖或果糖或其组合)的水平，该方法包括以下步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b)确定所述样品是否在本文所述的一种或多种ntinv或 ntinv和ntsus多核苷酸中包含导致至少一种还原糖的调节水平的一个或多个突变；以及(c)将一个或多个突变转移到第二植物中。合适地，确定干制叶子中至少一种还原糖的水平。可以使用本领域已知的多种方法，如通过基因工程改造、基因操纵、基因渗入、植物育种、回交等等，将突变转移到第二植物内。在一个实施方案中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施方案中，第二植物具有与第一植物不同的基因背景。在另一方面，提供了制备突变型植物的方法，该突变型植物与对照植物相比具有增加或降低的至少一种还原糖(合适地葡萄糖或果糖或其组合) 的水平，该方法包括以下步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b) 确定所述样品是否在本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸中包含导致至少一种还原糖的调节水平的一个或多个突变；以及 (c)将一个或多个突变从第一植物基因渗入到第二植物中。合适地，确定干制叶子中至少一种还原糖的水平。在一个实施方案中，基因渗入步骤包括植物育种，任选地包含回交等等。在一个实施方案中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施方案中，第二植物具有与第一植物不同的基因背景。在一个实施方案中，第一植物不是栽培品种或优良栽培品种。在一个实施方案中，第二植物是栽培品种或优良栽培品种。另一方面涉及通过本文中所描述的方法获得或可获得的突变型植物(包含栽培品种或优良栽培品种突变型植物)。在某些实施方案中，突变型植物可具有仅定位于植物的特定区域，诸如在本文所述的一种或多种ntinv 或ntinv和ntsus多核苷酸的序列内的一个或多个突变。根据这一实施方案，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物相同或基本上相同。
[0224]
在某些实施方案中，突变型植物可具有位于植物的一个以上基因组区域中的一个或多个突变，诸如在本文所述的一种或多种ntinv或 ntinv和ntsus多核苷酸的序列内以及在基因组的一个或多个其他区域内。根据这一实施方案，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物不同或基本上不同。在某些实施方案中，突变型植物可以不具有本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个外显子中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者
五个或更多个内含子中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv 或ntinv和ntsus多核苷酸的启动子中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的3’非翻译区中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的5’非翻译区中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv 或ntinv和ntsus多核苷酸的编码区中的一个或多个突变；或可以不具有本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的非编码区中的一个或多个突变；或其部分中的其两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个；或者六个或更多个的任何组合。
[0225]
在另一方面，提供了鉴定植物、植物细胞或植物材料的方法，所述植物、植物细胞或植物材料包含编码本文所述的ntinv或ntinv和 ntsus多核苷酸的基因中的突变，所述方法包括：(a)使植物、植物细胞或植物材料经受诱变；(b)从所述植物、植物细胞或植物材料或其后代获得样品；以及(c)确定ntinv或ntinv和ntsus基因或其变体或片段的多核苷酸序列，其中所述序列的差异指示其中的一个或多个突变。该方法还允许选择具有突变的植物，所述突变发生在影响植物细胞中ntinv或ntinv和ntsus基因表达的基因组区域中，诸如转录起始位点、起始密码子、内含子区域、外显子-内含子的边界、终止子或终止密码子。
[0226]
7.植物科、物种、品种、种子和组织培养
[0227]
适用于本公开中的植物包括单子叶和双子叶植物和植物细胞系统，并且可以包括山茶属、大麻属或烟草属的成员。山茶属和大麻属的合适的物种包括茶树(camellia sinensis)(茶)、普通大麻(cannabissativa)、印度大麻(cannabis indica)和野生大麻(cannabisruderalis)。
[0228]
各种实施方案涉及突变型烟草、非自然存在的烟草或转基因烟草植物或烟草植物细胞，并且可以应用于烟草属的任何物种，包括黄花烟草 (n.rustica)和普通烟草(例如，la b21、ln ky171、ti 1406、 basma、galpao、perique、beinhart 1000-1和petico)。其他物种包括无茎烟草(n.acaulis)、尖叶烟草(n.acuminata)、非洲烟草(n. africana)、花叶烟草(n.alata)、阿米基诺氏烟草(n.ameghinoi)、抱茎烟草(n.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(n.arentsii)、渐狭叶烟草(n.attenuata)、阿姆布吉烟草(n.azambujae)、贝纳莫特氏烟草 (n.benavidesii)、本赛姆氏烟草(n.benthamiana)、印度烟草(n. bigelovii)、博内里烟草(n.bonariensis)、洞生烟草(n.cavicola)、克利夫兰氏烟草(n.clevelandii)、心叶烟草(n.cordifolia)、伞床烟草(n.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(n.debneyi)、木丝烟草(n. excelsior)、福尔吉特氏烟草(n.forgetiana)、香烟草(n.fragrans)、粉蓝烟草(n.glauca)、粘烟草(n.glutinosa)、古特斯比氏烟草(n. goodspeedii)、哥西氏烟草(n.gossei)、杂交烟草(n.hybrid)、因古儿巴烟草(n.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(n.kawakamii)、奈特氏烟草(n.knightiana)、郎氏烟草(n.iangsdorffii)、渐尖叶烟草(n. linearis)、长花烟草(n.iongiflora)、海滨烟草(n.maritima)、特大管烟草(n.megalosiphon)、摩西氏烟草(n.miersii)、夜花烟草(n. noctiflora)、裸茎烟草(n.nudicaulis)、欧布斯特烟草(n. obtusifolia)、西方烟草(n.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(n. occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(n.otophora)、圆维烟草(n. paniculata)、少花烟草(n.pauciflora)、矮牵牛状烟草(n. petunioides)、蓝茉莉叶烟草(n.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草 (n.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(n.raimondii)、波缘烟草(n. repanda)、莲座烟草(n.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草
(n. rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(n.rotundifolia)、赛特氏烟草(n. setchellii)、拟似烟草(n.simulans)、前叶烟草(n.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(n.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(n.stocktonii)、香甜烟草(n.suaveolens)、美花烟草(n.sylvestris)、拟穗状烟草(n. thyrsiflora)、绒毛烟草(n.tomentosa)、绒毛状烟草(n. tomentosiformis)、三角叶烟草(n.trigonophylla)、荫生烟草(n. umbratica)、波叶烟草(n.undulata)、颤毛烟草(n.velutina)、序叶烟草(n.wigandioides)和花烟草(n.x sanderae)。在一个实施方案中，植物是烟草。
[0229]
本文还涵盖使用烟草栽培品种和优良烟草栽培品种。因此，转基因、非天然存在的或突变型植物可以是烟草品种或优良烟草栽培品种，其包括一种或多种转基因、或者一个或多个基因突变或其组合。基因突变 (例如，一种或多种多态性)可以是非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培品种(例如，优良烟草栽培品种)中的突变，或可以是的确天然存在的基因突变，条件是所述突变并非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培品种(例如，优良烟草栽培品种)中。
[0230]
特别有用的烟草品种包括白肋烟型、黑烟型、烤烟型和东方型烟草。品种或栽培品种的非限制性实例是：bd 64、cc 101、cc 200、cc 27、 cc 301、cc 400、cc 500、cc 600、cc 700、cc 800、cc 900、coker176、coker 319、coker 371 gold、coker 48、cd 263、df911、dt 538 lc galpao烟草、gl 26h、gl 350、gl 600、gl 737、gl 939、gl 973、 hb 04p、hb 04p lc、hb3307plc、杂交403lc、杂交404lc、杂交 501lc、k 149、k 326、k 346、k 358、k394、k 399、k 730、kdh959、kt 200、kt204lc、ky10、ky14、ky 160、ky 17、ky 171、 ky 907、ky907lc、ky14xl8 lc、little crittenden、mcnair 373、 mcnair 944、msky 14xl8、窄叶madole、窄叶madole lc、nbh 98、 n-126、n-777lc、n-7371lc、nc 100、nc 102、nc 2000、nc 291、 nc 297、nc 299、nc 3、nc 4、nc 5、nc 6、nc7、nc 606、nc 71、 nc 72、nc 810、nc bh 129、nc 2002、neal smith madole、oxford207、pd 7302lc、pd 7309lc、pd 7312lc、'perique'烟草、pvh03、 pvh09、pvh19、pvh50、pvh51、r 610、r 630、r 7-11、r 7-12、 rg 17、rg 81、rg h51、rgh 4、rgh 51、rs 1410、speight 168、 speight 172、speight 179、speight 210、speight 220、speight 225、 speight 227、speight 234、speight g-28、speight g-70、speight h-6、speight h20、speight nf3、ti 1406、ti 1269、tn 86、tn86lc、tn 90、 tn 97、tn97lc、tn d94、tn d950、tr(tom rosson)madole、va309、va359、aa 37-1、b13p、xanthi(mitchell-mor)、bel-w3、79
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615、samsun holmes nn、ktrdc 2号杂交49、白肋21、ky8959、 ky9、md 609、pg01、pg04、po1、po2、po3、rg11、rg 8、 va509、as44、banket a1、巴斯玛drama b84/31、巴斯玛i zichnazp4/b、巴斯玛xanthi bx 2a、batek、besuki jember、c104、coker 347、 criollo misionero、delcrest、djebel 81、dvh 405、comum、 hb04p、希克斯阔叶、kabakulak elassona、kutsage e1、la bu 21、nc2326、nc 297、pvh 2110、red russian、samsun、saplak、simmaba、 talgar 28、wislica、yayaldag、prilep hc-72、prilep p23、prilep pb156/1、prilep p12-2/1、yaka jk-48、yaka jb 125/3、ti-1068、kdh-960、 ti-1070、tw136、巴斯玛、tkf 4028、l8、tkf 2002、gr141、basmaxanthi、gr149、gr153、petit havana。即使本文未特别指明，也设想上述的低转化亚变种。
[0231]
实施方案还涉及用于产生已被修饰以调节本文所述的一种或多种 ntinv或ntinv
和ntsus多核苷酸(或如本文所述的其任何组合)的表达或功能的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的组合物和方法。有利地，所获得的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物可以在整体外观上与对照植物相似或基本上相同。多种表型特征，如成熟程度、每一植物叶数、秆高、叶插入角度、叶大小(宽度和长度)、节间距离以及叶片-中脉比可以通过田地观测进行评价。
[0232]
一个方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的种子。优选地，所述种子是烟草种子。另一方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的花粉或胚珠。此外，提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物，其还包含赋予雄性不育的多核苷酸。
[0233]
还提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物或其一部分的可再生细胞的组织培养物，其中培养物再生能够表达亲本的所有形态和生理特征的植物。可再生细胞包括来自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、根、根尖、花药、花及其部分、胚珠、芽、茎、柄、髓和囊的细胞或来源于它们的愈伤组织或原生质体。
[0234]
本文所述的植物材料可以是干制烟草材料，诸如来自弗吉尼亚烟型或东方烟型的干制烟草材料。干制烟草材料可以是烟道干制或晒干或晾干的烟草材料。
[0235]
对于烟草干制的coresta推荐描述于：coresta guide n 17， 2016年4月，sustainability in leaf tobacco production。
[0236]
8.调节糖含量
[0237]
本公开的突变型、转基因或非天然存在的植物或其部分在植物材料中，诸如在干制叶子中表现出至少一种还原糖(诸如葡萄糖或果糖或其组合)的调节水平。在某些实施方案中，当葡萄糖或果糖或其组合的水平降低时，蔗糖水平可以增加。
[0238]
适当地，在至少干制叶子、适当地完全干制叶子中观察到至少一种还原糖的调节水平。适当地，干制叶子取自植物上的中间位置叶。适当地，与对照植物相比，表型上不存在或可忽略不计，诸如视觉植物适合度。适当地，与对照植物相比，总游离氨基酸没有变化或变化可忽略不计。在某些实施方案中，可以调节通过加热干制叶子或由其衍生的产品获得的烟雾中的丙烯酰胺水平。
[0239]
另一个方面涉及如本文所述的突变型、非天然存在或转基因植物或细胞，与其中所述ntinv或ntinv和ntsus多肽的表达或功能未被调节的对照植物相比，所述突变型、非天然存在或转基因植物或细胞中至少一种还原糖的水平降低至少5％。
[0240]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖或果糖或其组合的水平降低约30％或更多，诸如约40％、或约50％、或约60％或约70％或约 80％或约90％或更多。
[0241]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖或果糖或其组合的水平降低约40％或更多，诸如约50％、或约60％或约70％或约80％或约 90％或更多。
[0242]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖的水平降低至少60％或更多或至少63％或更多，并且果糖的水平降低至少约40％或更多或至少63％或更多。
[0243]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖的水平降低至少60％或更多或至少63％或更多，并且果糖的水平降低至少约40％或更多或至少63％或更多，并且蔗糖的水平增加至少2倍、至少3倍或至少4倍。
[0244]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖和果糖的水平增加。
[0245]
在某些实施方案中，与对照植物相比，葡萄糖的水平增加，果糖的水平增加，并且蔗糖的水平降低。
[0246]
与对照植物相比，所述增加可以是约25％、50％、100％、250％或 500％或更多的增加。与对照植物相比，所述降低可以是约25％、50％或 75％或更多的降低。
[0247]
又一方面涉及来源于或可来源于突变型、非天然存在的或转基因植物或细胞的干制植物材料，诸如干制叶子或干制烟草，其中本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的表达或由此编码的 ntinv或ntinv和ntsus多肽的功能被调节，并且其中与对照植物相比，葡萄糖、果糖和任选蔗糖的水平如上所述被调节。
[0248]
实施方案还涉及用于产生突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞的组合物和方法，所述突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞已被修饰以调节本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus 多核苷酸或ntinv或ntinv和ntsus多肽的表达或功能，其可产生具有调节的葡萄糖、果糖和任选蔗糖含量的植物或植物组分(例如，叶
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诸如干制叶子)或植物细胞。
[0249]
在一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的表型与对照植物基本上相同。在一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重与对照植物基本上相同。在一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重和叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施方案中，例如在田间移植后一、二或三或更多个月或者在打顶后10、20、30或36或更多天，突变型、非天然存在的或转基因植物的秆高与对照植物基本上相同。例如，突变型、非天然存在的或转基因植物的秆高不低于对照植物的秆高。在另一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在另一个实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的秆高与对照植物基本上相同，并且突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在其他实施方案中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶的大小、或形状、或数目、或着色与对照植物基本上相同。
[0250]
在另一方面，提供了一种用于调节植物的至少一部分(例如，叶子 (诸如干制叶子)或烟草)中的至少一种还原糖的量的方法，该方法包括以下步骤：(i)调节本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和 ntsus多肽(或如本文所述的其任何组合)的表达或功能，合适地，其中ntinv或ntinv和ntsus多肽由本文所述的相应ntinv或ntinv和 ntsus多核苷酸编码；(ii)测量步骤(i)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少一部分(例如，叶子(诸如干制叶子)或烟草或烟雾)中的至少一种还原糖(例如，葡萄糖和果糖)和任选的至少一种非还原糖(诸如蔗糖)的水平；以及(iii)鉴定与对照植物相比其中至少一种还原糖和任选地至少一种非还原糖的水平已被调节的突变型、非天然存在的或转基因植物。
[0251]
在另一方面，提供了一种用于调节干制植物材料(诸如干制叶子) 的至少一部分中的至少一种还原糖的量的方法，该方法包括以下步骤： (i)调节一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多肽(或如本文所述的其任何组合)的表达或功能，合适地其中ntinv或ntinv和ntsus多肽由本文所述的相应ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸编码；(ii)收获植物材料(诸如一种或多种叶子)并干制一段时间；(iii)测量在步骤(ii)中或在步骤(ii)期间获得的干制植物材料的至少一部分中的至少一种还原糖(例如，葡萄糖和果糖)和任选地至少一
种非还原糖(诸如蔗糖)的水平；以及(iv)鉴定与对照植物相比其中至少一种还原糖和任选地其中至少一种非还原糖的水平已被调节的干制植物材料。
[0252]
与对照相比，表达的增加可以为约5％至约100％，或增加至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％或更多，诸如200％、300％、500％、1000％或更多，其包括转录功能或 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸表达或ntinv或ntinv和ntsus多肽表达或其组合的增加。
[0253]
与对照相比，功能或活性的增加可以为约5％至约100％，或增加至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少 98％或100％或更多，诸如200％、300％、500％、1000％或更多，其包括转录功能或ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸表达或ntinv或ntinv 和ntsus多肽表达或其组合的增加。
[0254]
与对照相比，表达的减少可以为约5％至约100％，或减少至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或 100％，其包括转录功能或ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸表达或 ntinv或ntinv和ntsus多肽表达或其组合的减少。
[0255]
与对照相比，功能或活性的减少可以为约5％至约100％，或减少至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少 98％或100％，其包括转录功能或ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸表达或ntinv或ntinv和ntsus多肽表达或其组合的减少。
[0256]
本文所述的多核苷酸和重组构建体可用于调节目的植物物种(合适地为烟草)中的本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸或ntinv 或ntinv和ntsus多肽的表达或功能或活性。
[0257]
许多基于多核苷酸的方法可用于增加基因在植物和植物细胞中的表达。作为实例，可以制备与待转化的植物相容的构建体、载体或表达载体，其包括目的基因连同能够在植物或植物细胞中过表达所述基因的上游启动子。示例性启动子在本文中描述。转化后，并且当在合适的条件下生长时，启动子可驱动表达，以调节植物或其特定组织中ntinv或 ntinv和ntsus的水平。在一个示例性实施方案中，生成携带本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸(或如本文所述的其任何组合)的载体，以在植物或植物细胞中过表达所述基因。所述载体携带位于转基因上游的合适启动子(如花椰菜花叶病毒camv 35s启动子)，从而驱动所述转基因在植物的所有组织中的组成型表达。所述载体还携带抗生素抗性基因，以便对经转化的愈伤组织和细胞系赋予选择。
[0258]
来自启动子的序列的表达可以通过包括表达控制序列来增强，所述表达控制序列是本领域众所周知的。专门指示与衰老相关的信号和在干制程序期间活跃的信号。
[0259]
因此，各种实施方案涉及通过将ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的多个拷贝整合到植物基因组中来调节本文所述的一种或多种ntinv或 ntinv和ntsus多核苷酸(或如本文所述的其任何组合)的表达水平的方法，所述方法包括：用包含与本文所述的一种或多种ntinv或ntinv 和ntsus多核苷酸可操作地连接的启动子的表达载体转化植物细胞宿主。由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。
[0260]
在一个实施方案中，本公开中使用的植物是烟道干制的植物，因为这样的植物具有高还原糖含量(在干制结束时田间生长时大于约14％干重)。烟道干制的突变型、转基因或非天然存在的植物或其部分可具有在干制结束时田间生长时小于约14％干重的还原糖含量，诸如在干制结束时田间生长时小于约10％干重的还原糖含量，或在干制结束时田间生长时小于约5％干重的还原糖含量，或在干制结束时田间生长时小于约1％干重的还原糖含量。
[0261]
在一个实施方案中，本公开中使用的植物是晒干的植物，因为这样的植物具有还原糖含量(在干制结束时田间生长时大于约6.8％干重)。晒干的突变型、转基因或非天然存在的植物或其部分可具有在干制结束时田间生长时小于约5％干重的还原糖含量，诸如在干制结束时田间生长时小于约2.5％干重的还原糖含量，或在干制结束时田间生长时小于约 1％干重的还原糖含量。
[0262]
在一个实施方案中，本公开中使用的植物是晾干的植物。这样的植物在干制结束时田间生长时具有大于约1.7％干重的还原糖含量。晒干的突变型、转基因或非天然存在的植物或其部分可具有在干制结束时田间生长时小于约1.5％干重的还原糖含量，诸如在干制结束时田间生长时小于约1％干重的还原糖含量，或在干制结束时田间生长时小于约0.5％干重的还原糖含量。
[0263]
在某些实施方案中，优选使用烟道干制或晒干的植物。
[0264]
9.育种
[0265]
携带本文中所描述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸 (或如本文所述的其任何组合)的突变体等位基因的植物可以用于植物育种计划，以产生有用的品系、品种和杂种。特别地，可以使该突变体等位基因渗入到上述商业上重要的品种中。因此，提供了用于植物育种的方法，其包括将如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物与含有不同遗传一致性的植物进行杂交。所述方法可以进一步包括将后代植物与另一植物杂交，且任选地重复杂交直到获得具有期望的基因性状或基因背景的后代。这类育种方法发挥的一个目的是将期望的基因性状引入其他品种、育种品系、杂种或栽培品种，尤其是具有商业利益的那些。另一个目的是便于在单个植物品种、品系、杂种或栽培品种中叠加不同基因的基因修饰。考虑种内以及种间交配。源自这类杂交的后代植物，也称为育种品系，是本公开的非天然存在的植物的实例。
[0266]
在一个实施方案中，提供了用于产生非天然存在的植物的方法，该方法包括：(a)将突变型或转基因植物与第二植物杂交以产生后代烟草种子；(b)在植物生长条件下生长后代烟草种子以产生非天然存在的植物。该方法还可包括：(c)将上一代非天然存在的植物与其自身或另一种植物杂交以产生后代烟草种子；(d)在植物生长条件下生长步骤(c)的后代烟草种子，以产生另外的非天然存在的植物；以及(e) 重复(c)和(d)的杂交和生长步骤多次以产生非天然存在的植物的进一步后代。所述方法可以任选包括在步骤(a)之前提供亲本植物的步骤，所述亲本植物包含得到表征且不同于突变型或转基因植物的遗传一致性。在一些实施方案中，取决于育种计划，将杂交和生长步骤重复0 至2次、0至3次、0至4次、0至5次、0至6次、0至7次、0至8次， 0至9次或0至10次，以便产生非天然存在的植物的世代。回交是这类方法的实例，其中后代与其亲本之一或与其亲本基因相似的另一植物进行杂交，以便获得在下一代中具有更接近于亲本之一的基因一致性的后代植物。用于植物育种，
特别是植物育种的技术是众所周知的，并且可用于本公开的方法中。本公开还提供了通过这些方法产生的非天然存在的植物。某些实施方案不包含选择植物的步骤。
[0267]
在本文中所描述方法的一些实施方案中，使用标准田地程序在田地评估源自育种和筛选变体基因的品系。包含原始未诱变亲本的对照基因型包含在内，并且按随机化完全区组设计或其他适当的田地设计，将入选者(entry)排列于田地。对于烟草，使用标准的农学实践，例如将烟草收获、称量且取样，用于在干制之前和干制期间的化学及其他常见测试。执行数据的统计分析，以确认所选择品系与亲本品系之间的相似性。任选地执行所选植物的细胞基因学分析，以确认染色体组和染色体配对关系。
[0268]
dna指纹鉴定、单核苷酸多态性、微卫星标记或类似技术可用在标记辅助选择(mas)的育种计划中，以如本文所述的，将基因的突变等位基因转移或培育到其他烟草内。举例来说，育种者可通过含有突变体等位基因的基因型与农学期望的基因型的杂交来产生分离的群体。可使用本文中所列出的技术之一，使用从基因组序列或其片段所开发的标记来筛选f2中的植物或回交世代。鉴定为具有突变体等位基因的植物可以回交或自花授粉，以产生待筛选的第二群体。取决于预期遗传模式或所用mas技术，有必要在每轮回交之前对所选择的植物进行自花授粉，以帮助鉴定所需个体植物。可重复进行回交或其他育种操作，直到恢复轮回亲本的所需表型。
[0269]
根据本公开内容，在育种计划中，成功的杂交获得能育的f1植物。所选择的f1植物可与亲本之一杂交，并且第一回交世代植物进行自花授粉，以产生再次筛选变体基因表达(例如，基因的无效版本)的群体。将回交、自花授粉和筛选的过程重复例如至少4次，直到最终筛选产生可育且与轮回亲本相当相似的植物。如果需要的话，这种植物进行自花授粉，并且随后再次筛选后代，以确认植物展现变体基因表达。在一些实施方案中，筛选f2代中植物群体的变体基因表达，例如根据标准方法鉴定由于缺乏基因而不能表达多肽的植物，例如通过使用pcr方法，其中引物基于本文所述的多核苷酸(或如本文所述的其任何组合)的多核苷酸序列信息。
[0270]
杂交烟草品种可通过以下方式产生：阻止第一品种的雌性亲本植物 (即，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使雌性亲本植物受精，且允许f1杂种种子在雌性植物上形成。可通过在花发育早期阶段将花朵去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。举例来说，可通过细胞质雄性不育(cms)或转基因雄性不育来产生雄性不育，其中转基因抑制小孢子或花粉形成、或自交不相容。含有cms的雌性亲本植物是特别有用的。在雌性亲本植物是cms的实施方案中，从雄性可育植物收获花粉并人工施用于cms雌性亲本植物的柱头，并且收获所得到的f1种子。
[0271]
本文所述品种和品系可用于形成单杂交烟草f1杂种。在这类实施方案中，亲本品种的植物可生长为基本上同质的相邻群体，以便于雄性亲本植物与雌性亲本植物的天然异花授粉。通过常规方式选择性地收获在雌性亲本植物上形成的f1种子。还可大批种植两个亲本植物品种，并收获由于自花授粉而在雌性亲本上形成的f1杂种种子和在雄性亲本上形成的种子的掺合物。或者，可进行三系杂交，其中单杂交f1杂种用作雌性亲本，并且与不同的雄性亲本杂交。作为另一替代方案，可产生双杂交杂种，其中两个不同单杂交的f1后代进行自身杂交。
[0272]
可在突变型、非天然存在的或转基因植物群体中，筛选或选择具有所需性状或表型的那些群体成员。例如，可以筛选单个转化事件的后代群体中的具有所需表达水平或由其编码多肽的功能的那些植物。可使用物理和生物化学方法来鉴定表达或活性水平。这些方法包括用于检测多核苷酸的southern分析或pcr扩增；用于检测rna转录物的northern 印迹、s1 rnase保护、引物延伸或rt-pcr扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶功能的酶分析；以及用于检测多肽的多肽凝胶电泳、western印迹、免疫沉淀和酶联免疫分析。其他技术诸如原位杂交、酶染色、免疫染色和酶测定也可用于检测ntinv或ntinv和ntsus多肽或多核苷酸的存在或表达、功能或活性。
[0273]
如本文所述的突变型、非天然存在的或转基因植物细胞和植物包括一种或多种重组多核苷酸、一种或多种多核苷酸构建体、一种或多种双链rna、一种或多种结合物或者一种或多种载体/表达载体。
[0274]
10.其他基因的修饰
[0275]
非限制性地，本文所述的植物及其部分可以在根据本公开的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸或ntinv或ntinv和ntsus多肽的表达、功能或活性已被调节之前或之后被修饰。
[0276]
在突变型、非天然存在的或转基因植物及其部分中可以存在一种或多种下列进一步的基因修饰。
[0277]
可以修饰涉及氮代谢中间体转化的一个或多个基因，从而降低至少一种烟草特异性亚硝胺(tsna)的水平。此类基因的非限制性实例包括编码尼古丁脱甲基酶的那些(诸如wo2006/091194、wo2008/070274、 wo2009/064771和wo2011/088180中所述的cyp82e4、cyp82e5和 cyp82e10)，以及硝酸还原酶，如wo2016/046288中所述的。
[0278]
可以修饰参与重金属吸收或重金属转运的一个或多个基因，从而降低重金属含量。非限制性实例包括以下中的基因：多药抗性相关多肽家族、阳离子扩散促进因子(cdf)家族、zrt-irt样多肽(zip)家族、阳离子交换剂(cax)家族、铜转运蛋白(copt)家族、重金属atp酶家族(例如hma，如wo2009/074325和wo2017/129739中所述)、天然抗性相关巨噬细胞多肽(nramp)的同系物家族和atp结合盒 (abc)转运蛋白家族的其他成员(例如mrp)，如wo2012/028309 中所述，其参与重金属诸如镉的转运。
[0279]
其他示例性修饰可产生具有调节的表达或功能的异丙基苹果酸合酶的植物，这导致蔗糖酯组成的改变，其可用于改变喜好概况(参见 wo2013/029799)。
[0280]
其他示例性修饰可产生具有调节的表达或功能的苏氨酸合酶的植物，其中甲硫氨酸的水平可以被调节(参见wo2013/029800)。
[0281]
其他示例性修饰可产生具有调节的表达或功能的新黄质合酶、番茄红素β环化酶和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶中的一种或多种的植物，以调节β-大马酮含量来改变风味特征(参见wo2013/064499)。
[0282]
其他示例性修饰可产生具有调节的表达或功能放入氯化物通道的 clc家族成员的植物，以调节其中的硝酸盐水平(参见wo2014/096283 和wo2015/197727)。
[0283]
其他示例性修饰可产生具有调节的一种或多种天冬酰胺合成酶的表达或功能的植物，以调节叶子中的天冬酰胺的水平和调节在加热或燃烧叶子时产生的气溶胶中的丙烯酰胺的水平(参见wo2017/129739)。
[0284]
其他示例性修饰可导致在干制期间具有调节的蛋白酶活性的植物 (参见wo2016/009006)。
[0285]
其他示例性修饰可以通过改变硝酸还原酶(例如，nia2)的基因表达或由其编码的蛋白质的活性而导致植物具有降低的硝酸盐水平(参见 wo2016/046288)。
[0286]
其他示例性修饰可以通过改变推定的abc-2转运蛋白ntabcgl-t和 ntabcgl-s的基因表达或由其编码的蛋白质的活性而导致植物具有修饰的生物碱水平(参见wo2019/086609)
[0287]
其他示例性修饰可通过改变编码终花1(tfl1)的基因的基因表达或由其编码的蛋白质的活性而导致植物具有调节的开花时间(参见 wo2018/114641)。其他示例性修饰可产生具有调节的一种或多种天冬酰胺合成酶的表达或功能的植物，以调节叶子中的天冬酰胺的水平和调节在加热或燃烧叶子时产生的气溶胶中的丙烯酰胺的水平(参见 wo2017/042162)。
[0288]
其他修饰的实例包括调节除草剂耐受性，例如，草甘膦是许多广谱除草剂的活性成分。通过转移aroa基因(来自鼠伤寒沙门氏菌 (salmonella typhimurium)和大肠杆菌(e.coli)的草甘膦epsp合成酶)，已开发草甘膦抗性转基因植物。通过转化来自拟南芥的突变als (乙酰乳酸合成酶)基因已产生了抗磺脲植物。来自突变绿穗苋 (amaranthus hybridus)的光系统ii的ob多肽已被转移到植物中以产生抗阿特拉津转基因植物；并且抗溴苯腈转基因植物已通过掺入来自细菌克雷伯氏肺炎菌(klebsiella pneumoniae)的bxn基因而产生。
[0289]
另一示例性修饰导致对昆虫具有抗性的植物。苏云金芽孢杆菌 (bacillus thuringiensis，bt)毒素可以提供一种有效方式来延迟抗bt害虫的出现，如在花椰菜中最近说明的，其中金字塔形cry1ac和cry1c bt 基因控制对任一单个多肽具有抗性的小菜蛾，并且显著延迟抗性昆虫的进化。
[0290]
另一示例性修饰产生对由病原体(例如病毒、细菌、真菌)引起的疾病具有抗性的植物。已经设计了表达xa21基因(抗白叶枯病)的植物和表达bt融合基因和几丁质酶基因(抗三化螟和耐鞘)的植物。
[0291]
另一示例性修饰产生改变的生殖能力，例如雄性不育。
[0292]
另一示例性修饰产生耐受非生物胁迫(例如，干旱、温度、盐度) 的植物，并且通过转移来自拟南芥属的酰基甘油磷酸酶，已产生耐受的转基因植物；编码甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶的基因改善抗旱性，所述甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶涉及甘露醇和山梨糖醇合成。
[0293]
另一种示例性修饰产生其中一种或多种尼古丁n-脱甲基酶的活性被调节的植物，使得可以调节在干制期间形成的降烟碱和降烟碱代谢物的水平(参见wo2015169927)。
[0294]
其他示例性修饰可以产生具有改善的储存多肽和油的植物、具有增强的光合效率的植物、具有延长的保存期限的植物、具有增强的碳水化合物含量的植物和抗真菌的植物。也可设想s-腺苷-l-甲硫氨酸(sam) 或胱硫醚γ-合酶(cgs)或其组合的表达已被调节的转基因植物。
[0295]
参与尼古丁合成途径的一个或多个基因可以被修饰，从而产生在干制时产生调节水平的尼古丁的植物或植物部分。尼古丁合成基因可以选自由以下组成的组：a622、bbla、
bblb、jre5l1、jre5l2、mate1、 mate 2、mpo1、mpo2、myc2a、myc2b、nbb1、nic1、nic2、nup1、 nup2、pmt1、pmt2、pmt3、pmt4和qpt或它们中的一个或多个的组合。
[0296]
参与控制一种或多种生物碱的量的一个或多个基因可以被修饰，从而得到产生调节水平的生物碱的植物或植物部分。生物碱水平控制基因可以选自由以下组成的组：bbla、bblb、jre5l1、jre5l2、mate1、 mate 2、myc2a、myc2b、nic1、nic2、nup1和nup2或它们中的一个或多个的组合。
[0297]
一种或多种此类性状可基因渗入来自另一栽培品种的突变型、非天然存在的或转基因植物，或可直接转化到其内。
[0298]
各种实施方案提供了突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物，以及生物质，其中根据本公开的一种或多种多核苷酸的表达水平被调节，从而调节由其编码的多肽的水平。
[0299]
11.消耗品
[0300]
本文所述植物的部分，特别是这些植物的叶片和中脉，可以掺入或用于制备各种消耗品，包括但不限于气溶胶形成材料、气溶胶形成装置、吸烟制品、可抽吸制品、无烟产品、医药或美容产品、静脉内制剂、片剂、粉末和烟草产品。气溶胶形成材料的实例包括烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、干制的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。吸烟制品和可抽吸制品是气溶胶形成装置的类型。吸烟制品或可抽吸制品的实例包含香烟、小雪茄和雪茄。无烟产品的实例包括嚼烟和鼻烟。在某些气溶胶形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气溶胶形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气溶胶。在另一类型的被加热的气溶胶形成装置中，通过将热量从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气溶胶形成材料来产生气溶胶，所述气溶胶形成材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。无烟烟草产品和多种含烟草的气雾形成材料可包含任何形式的烟草，包括沉积在其他成分上、混合于其他成分中、由其他成分包围或以其他方式与其他成分组合的干燥颗粒、碎片、小颗粒、粉末或浆料，所述其他成分采取任何形式，例如絮片、膜、卡(tab)、泡沫或珠。术语“烟雾”用于描述由例如香烟等吸烟制品或通过燃烧气溶胶形成材料而产生的一类气溶胶。
[0301]
在一个实施方案中，本发明还提供了来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的干制的植物材料。干制绿色烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于如本文所述的晾干、火烤干制、烟道干制和晒干。
[0302]
在另一个实施方案中，本发明描述了包括含有烟草的气雾形成材料的烟草产品，所述气雾形成材料包含来自本文所述的突变型烟草植物、转基因烟草植物或非天然存在的烟草植物的植物材料，例如叶，优选干制的叶。本文中所描述的烟草产品可以是掺合的烟草产品，其还可包括未修饰的烟草。
[0303]
12.用于作物管理和农业的产品和方法
[0304]
突变型、非天然存在的或转基因植物可具有在例如农业中的其他用途。
[0305]
本公开还提供了用于产生种子的方法，其包括培养本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物，并且从栽培的植物收集种子。来自本文所述植物的种子可通过本领域中已知的方式进行条件处理，且包装在包装材料中，以形成制造物品。如纸和布等包装材料是本领域众所周知的。种子的包装可带有描述其中种子的性质的标记，例如固定
到包装材料的标签或标记、印刷在包装上的标记。
[0306]
用于对植物基因分型以鉴定、选择或育种的组合物、方法和试剂盒可包括检测多核苷酸样品中的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸存在的方式。因此，描述了一种组合物，其包含用于特异性扩增一种或多种 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的至少一部分的一种或多种引物，以及用于进行扩增或检测的任选地一种或多种探针和任选地一种或多种试剂。
[0307]
相应地，公开了基因特异性的寡核苷酸引物或探针，其包含对应于本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的约10个或更多个邻接多核苷酸。所述引物或探针可包含以下或由以下组成：约15、20、25、 30、40、45或50个或更多个邻接多核苷酸，所述引物或探针与本文所述的一种或多种ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸杂交(例如，特异性地杂交)。在一些实施方案中，引物或探针可包含约10至50个连续核苷酸、约10至40个连续核苷酸、约10至30个连续核苷酸或约15至30 个连续核苷酸，或由其组成，其可用于基因鉴定(例如，southern杂交) 或分离(例如，细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)或基因检测(例如，作为扩增或检测中的一种或多种扩增引物)的序列依赖性方法。可设计一个或多个特异性引物或探针，且用于扩增或检测多核苷酸的部分或全部。作为具体实例，可以在pcr方案中使用两种引物来扩增多核苷酸片段。 pcr也可以使用来源于多核苷酸序列的一种引物和与多核苷酸序列上游或下游序列杂交的第二种引物进行，所述多核苷酸序列诸如启动子序列、 mrna前体的3'端或来源于载体的序列。用于体外扩增多核苷酸的热和等温技术的实例是本领域众所周知的。样品可以是或可源自植物、植物细胞或植物材料，或者由如本文所述的植物、植物细胞或植物材料制备或衍生的烟草产品。
[0308]
在另一方面，还提供了检测样品中本文所述的ntinv或ntinv和 ntsus多核苷酸(或如本文所述的其任何组合)的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含或疑似包含多核苷酸的样品；(b)使所述样品与一种或多种引物或一种或多种探针接触，以特异性检测ntinv或 ntinv和ntsus多核苷酸的至少一部分；以及(c)检测扩增产物的存在，其中扩增产物的存在指示样品中ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的存在。在另一方面，还提供了一种或多种引物或探针用于特异性检测 ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的至少一部分的用途。还提供了用于检测至少一部分ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的试剂盒，其包含用于特异性检测至少一部分ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的一种或多种引物或探针。试剂盒可包含用于多核苷酸扩增(如pcr)的试剂，或用于探针杂交检测技术(如dna印迹、rna印迹、原位杂交或微阵列) 的试剂。试剂盒可包括用于抗体结合检测技术(如蛋白质印迹、elisa、 seldi质谱法或测试条)的试剂。试剂盒可包括用于dna测序的试剂。试剂盒可包括试剂和使用说明。
[0309]
在一些实施方案中，试剂盒可包括用于所述方法中的一种或多种的说明书。所述试剂盒可用于遗传一致性确定、系统发生研究、基因分型、单倍体分型、谱系分析或植物育种，特别是共显性评分。
[0310]
本公开还提供了对包括如本文所述的ntinv或ntinv和ntsus多核苷酸的植物、植物细胞或植物材料进行基因分型的方法。基因分型提供了区分染色体对的同源物的手段，并且可用于区分植物群体中的分离体。分子标记方法可用于系统发生研究、表征作物品种之间的遗传关系、鉴定杂交或体细胞杂种、定位影响单基因性状的染色体区段、图位克隆和定量遗传研究。基因分型的具体方法可采用任意数目的分子标记分析技术，包含扩增片段
mp 1471rev 5 2011,resana,italy:chelab silliker s.r.l,m
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rieuxnutrisciences company。为了确定干制植物叶子中的氨基酸，如果需要，去除中脉后，将干制叶子在40℃下干燥2-3天。然后，在分析氨基酸含量之前，将烟草材料磨成细粉(约100um)。测量植物材料中氨基酸含量的另一种方法描述在uni en iso 13903:2005中。可以根据uni eniso 13903:2005进行游离氨基酸含量的测量。
[0323]
测量还原糖含量
[0324]
还原糖含量可以使用skalar instrument co(west chester,pa)开发并在tobacco science 20:139-144(1976)中描述的用于分析烟草样品的分段流比色法来测量。还原糖含量的测量也描述于coresta recommendedmethod 38、crm38、crm和iso 15154:2003中。为了确定干制叶子中的还原糖，如果需要，去除中脉后，将干制叶子在40℃下干燥2-3天。然后，在分析还原糖之前，将烟草材料磨成细粉(约100um)。还原糖含量的测量是根据iso 15154:2003进行的。
[0325]
实施例2-植物组织中ntinv4-s和ntinv4
–
t的表达的分析
[0326]
表1显示了ntinv4-s和ntinv4
–
t在整个植物组织中表达，特别是在花瓣中，并且还在田间生长的弗吉尼亚烟草植物的未成熟花、萼片、底叶、中叶和上叶中表达程度较低。相比之下，ntinv3-s和ntinv3
–
t 在所研究组织中具有极低的表达，仅在田间生长的弗吉尼亚烟草植物的未成熟花朵中出现明显的表达，尽管非常低。
[0327]
实施例3-还原糖(葡萄糖和果糖)在弗吉尼亚烟烟道干制时间过程期间的释放
[0328]
在弗吉尼亚(烟道干制)烟草干制期间，还原糖，主要是葡萄糖和果糖在黄化叶中显著增加，在一两天后达到最高水平(参见图1a)。有趣的是，ntinv4-s和ntinv4-t表达在1或2天后增加约2倍(以log2 计)以达到平台期(参见图1a)。ntinv4-t在干制期间表达的程度大于ntinv4-s(参见图1b和表2)。ntinv3的两个拷贝均未在干制叶子 (参见图2b)或绿叶(参见表1)中显著表达。作为对照，sag12，植物中衰老的一般标记物在干制一天后完全表达(参见图1c)。
[0329]
实施例4-还原糖(葡萄糖和果糖)在深色烟草中的晾干时间过程期间的释放
[0330]
为了确定ntinv4-s和ntinv4-t的诱导是否对弗吉尼亚烟草不具有特异性，研究了深色烟草中的表达数据。在这种情况下，叶子被晾干。在前120小时期间，在24、48、96和120小时后采集样本，冷冻、冻干并进行代谢组学分析。如在弗吉尼亚烟叶中所观察到的，葡萄糖和果糖 (还原糖)从0小时到120小时的干制(黄化期结束)增加4-6倍(参见图2)。在完全干制的叶中(在干制开始后约10天)，葡萄糖和果糖水平在叶基质中与在烟道干制的烟草中一样降低(比较图1和2)，但程度更大。蔗糖在前120小时干制期间保持几乎稳定，由此表明在叶黄化期间蔗糖分子的供应维持在深色烟草中。在干制结束时，蔗糖完全水解并且因此可能完全代谢(参见图2c)。
[0331]
在相同样品中，冷冻叶材料用于分离rna以分析ntinv3-s、 ntinv3-t、ntinv4-s和ntinv4-t的表达。如在烟道干制的烟草中所观测到的，ntinv3基因既不在收获的叶中表达，也不在深色烟草的晾干期间上调。另一方面，ntinv4-s和ntinv4-t上调因子》10，在5个干制日后达到最大(120小时，参见表2)。如在烟道干制的烟草中所观察到的， sag12更快速地上调，并且然后在5个干制日后(120小时)降低。
[0332]
实施例5-烟道干制的烟草中ntinv4的沉默
[0333]
对烟道干制的烟草中ntinv4的沉默进行了研究，以确定这些基因是否有助于降低干制烟草叶中的还原糖含量。在ntinv4-s和ntinv4
–
t 两者的编码序列内的特定dna片段(seq id no:9)与强组成型紫茉莉花叶病毒(mmv)启动子一起克隆在gateway载体中。在mmv 与根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因的3’nos 终止子序列之间侧接ntinv4基因片段。使用标准农杆菌介导的转化方案转化烟草品系k326。关于四种对照和四种转基因35s:inv4-rnai品系的inv4表达水平的结果在图3中示出。为了能够选择低还原糖含量的植物，在干制48小时后分析独立的t0植物叶片和相应的对照品系，以确定对还原糖含量的影响。通过qpcr选择显示与对照品系相比最低水平的ntinv4表达的最佳t0品系。从这些最佳t0品系收获种子。操作ntinv4基因(例如，使用组成型启动子或特定的衰老启动子，诸如 sag12或e4)可改变干制烟草叶的化学性质。类似地，使用基因编辑策略(诸如crispr或突变体选择)敲除ntinv4基因可改变商品烟草的主要品种的氨基酸叶子化学性质。
[0334]
实施例6-四种对照和四种转基因35s:inv4-rnai品系的完全干制叶片中的葡萄糖、果糖和蔗糖的分析
[0335]
在图3中描述的四种对照和四种转基因35s:inv4-rnai品系的五个中间位置叶在成熟时收集并经受烟道干制。在完全干制的叶中分析糖 (葡萄糖、果糖和蔗糖)。图4中呈现的数据显示，抗inv4植物中的葡萄糖和果糖强烈且显著地减少。葡萄糖和果糖的水平分别降低约63％和约43％。有趣的是，蔗糖在35s:inv4-rnai品系中显著地高4.1倍，由此表明在叶干制期间累积的一部分蔗糖池不被沉默品系中的inv4基因水解。未观察到对视觉植物适合性和在对照与35s:inv4-rnai品系之间的总游离氨基酸变化的影响。
[0336]
敲除或下调ntinv4-s和ntinv4-t的表达可有助于减少干制叶子中还原糖的含量。为了甚至进一步减少还原糖的量，可以考虑敲除或下调 ntsus和ntinv的组合。为了增加干制叶子中的还原糖汇集，可以考虑使用衰老诱导型启动子如sag12或e4来过表达ntinv4-s或ntinv4-t (使用组成型启动子可能会强烈改变改变营养阶段下的植物新陈代谢。
[0337]
实施例7-白肋烟、弗吉尼亚烟和东方烟烟草叶子干制后的sus基因的鉴定
[0338]
为了鉴定在白肋烟、弗吉尼亚烟和东方烟烟草叶子的早期干制期间导致蔗糖代谢的关键功能，在白肋烟、弗吉尼亚烟和东方烟中，对干制 48小时后的干制叶子中与收获时成熟的叶子相比上调的基因功能进行了过表达分析(log2倍数变化＞2，调整的p值＜0.05)。鉴定了涉及产生还原糖的基因，这些基因在干制48小时后是有活性的，与干制类型和烟草品种无关。鉴定了参与还原糖产生的烟草基因。
[0339]
在叶子的早期干制期间直接参与还原糖产生的关键基因属于sus基因家族。sus可能是驱动还原糖在干制的离体叶子中积累的关键酶。
[0340]
发现该烟草基因组具有12个ntsus基因产物，分布在6个家族中，每个原型具有一个s和一个t拷贝：ntsus1-s(seq id no:10)、 ntsus1-t(seq id no:12)、ntsus2-s(seq id no:14)、ntsus2-t (seq id no:16)、ntsus3-s(seq id no:18)、ntsus3-t(seq idno:20)、ntsus4-s(seq id no:22)、ntsus4-t(seq id no:24)、 ntsus5-s(seq id no:26)、ntsus5-t(seq id no:28)、ntsus6-s (seq id no:30)和ntsus6-t(seq id no:32)。
[0341]
sus转录物来自基因组序列ntsus2-s(seq id no:14)、ntsus3
‑ꢀ
s(seq id no:18)、ntsus3-t(seq id no:20)和ntsus4-s(seqid no:22)。这些基因在叶子干制(衰老)期
间被上调，如表3所示。这证实了s拷贝特别地参与了早期干制叶子的化学修饰，并且在这种特定情况下，葡萄糖和果糖增加。
[0342]
尽管在白肋烟的干制叶子中发现的还原糖水平较低，但与弗吉尼亚烟和东方烟相比，ntsus基因仍在白肋烟中被激活(参见表3)，这可能是作为组成型响应，也确保了在早期干制阶段用于氨基酸合成的可用碳源。
[0343]
在白肋烟(bu)和弗吉尼亚烟(fc)中，在早期干制期间未表达的ntsus1-s和ntsus1-t(参见表3)在根和茎中特别表达，表明在这些组织中可能存在特定功能来递送碳水化合物用于细胞壁合成或在缺氧状态下供应碳源(参见表4)。在另一方面，在叶子早期干制期间诱导的ntsus3-s、ntsus3-t、ntsus4-s也在所有器官中表达，而ntsus2-s 和ntsus2-t主要在未成熟的花和花瓣中表达。ntsus5-s、ntsus5-t、ntsus6-s和ntsus6-t在所有分析的植物组织中均以低水平表达(见表 4)。
[0344]
为了增加干制叶子中的还原糖库，可以考虑使用衰老诱导型启动子如sag12或e4来过表达ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t或ntsus4-s 或其组合(使用组成型启动子可能会强烈改变植物的新陈代谢。在另一方面，敲除ntsus2-s、ntsus3-s、ntsus3-t和/或ntsus4-s可有助于降低干制叶子中还原糖的含量。
[0345]
实施例8
–
弗吉尼亚烟烟草叶中ntsus表达的沉默
[0346]
对白肋烟中ntsus的沉默进行了研究，以确定这些基因是否有助于降低干制的弗吉尼亚烟烟草叶中的还原糖含量。在ntsus的编码序列内的特定dna片段与强组成型紫茉莉花叶病毒(mmv)启动子一起克隆在gateway载体中。在mmv与根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因的3’nos终止子序列之间侧接ntsus基因片段。
[0347]
为了能够选择低还原糖含量的植物，在干制60小时后分析独立的 t0植物叶片和相应的对照品系，以确定对还原糖含量的影响。选择显示最低还原糖水平的最佳t0品系。从这些最佳t0品系收获种子。通过 qpcr测定t1子代以确定与降低还原糖含量相关的ntsus沉默事件的效率。
[0348]
操作ntsus基因(例如，使用组成型启动子或特定的衰老启动子，诸如sag12或e4)可改变干制烟草叶的化学性质。类似地，使用基因编辑策略(诸如crispr或突变体选择)敲除ntsus基因可改变商品烟草的主要品种的氨基酸叶子化学性质。
[0349]
实施例9-由ntinv4修饰的烟草植物和ntsus修饰的烟草植物制备液体烟草提取物，其各自具有调节的还原糖含量。
[0350]
烟草起始材料由根据本公开的ntinv4修饰的烟草植物或ntsus修饰的烟草植物的干制叶子制备。将烟草材料切割以形成具有2.5毫米
×
2.5毫米的尺寸的烟草碎片，并且将烟草碎片装载到提取室中，而不进行压缩。在提取腔室内加热烟草起始材料。在加热期间，氮气流以约40 升/分钟的流速流经提取腔室。对于每种烟草起始材料，通过在负10摄氏度下和用750rpm的搅拌吸收到由丙二醇形成的液体溶剂中来收集加热步骤期间释放的挥发性化合物。将丙二醇与所收集的挥发性化合物的溶液在脱水过程中干燥以将溶液的水分水平降低到大约15％。收集从烟草起始材料收集的挥发物的浓缩溶液。
[0351]
可以制备组合的液体烟草提取物。对于如上所述处理的每种烟草起始材料，第一烟草起始材料在不同于第二烟草起始材料的温度和时间段内加热。对于每种烟草起始材料，收集并干燥在加热步骤中释放的挥发性化合物。从第一和第二烟草起始材料收集的挥
发物的所得浓缩溶液可以限定的比率共混以产生液体烟草提取物。
[0352]
在本文中引用的或描述的任何出版物都提供了在本技术的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施方案来描述本发明，但应理解，如所要求的本发明不应不恰当地限于此类特定实施方案。实际上，细胞生物学、分子生物学和植物生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求书的范围内。
[0353]
表1
[0354]
ntinv3和ntinv4基因在田间生长的白肋烟植物的根、茎、中叶、未成熟花、萼片和花瓣中的表达(rnaseq，fpkm)
[0355][0356]
表2
[0357]
图2中呈现的深色烟草的晾干时间段期间ntinv3-s、ntinv3-t、 ntinv4-s和ntinv4-t的表达
[0358][0359]
表3
[0360]
白肋烟(bu)、弗吉尼亚烟(fc)和东方烟(or)在早期干制期间的ntsus基因的表达
[0361][0362]
表4
[0363]
ntsus基因在田间生长的白肋烟(bu)和弗吉尼亚烟(fc)植物的根、茎、中叶、未成熟花(imflower)、萼片和花瓣中的表达
[0364]
序列表
[0365]
seq id no 1：ntinv3-s的多核苷酸序列
[0366]
atggcggaaacaaacaatagcgttccttacacccaattaccggcggaggacaataacacctccgttaat tctccggccggatgccggctacgacccaaaagagtgtcgtttatagtattaacagggctggtggcagctttgtta ctttttgtggcagtgaaatatgggaaaaacgaggcggaggatgtgaatccagggccagtaccaccacaagaa accgtgtgcaatatgcttggttctaatctaatgccgctgaccagcatgaagacggtggcgcgtggggtggcag aaggtgtctccgccaagtcacgcggtcgtttcttgggattacggccgtttccatggaccaaacaaatgttggctt ggcaaagaacatccttccactttcaacctaagaagaattggatgaatggttagtaattctttttctcttatgttattaat tttcataaatcaactttattattattattatacaataaatcaacattgcttattgatgaattttaacataaacccgccttat gcttgacgagattaactagaactatatatacaatgaatgattatctccattccattacataaccatgaattatgtttctt aattaattaaagatttgacatgacattatatttcgtttatagtttaagaaaagctttgtattgatgtaaaagaaaccatt acagcttcgaatatgggataccttgtctttttcttttcctaagatggatctttgattgc
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[0367]
seq id no 2：ntinv3-s的多肽序列
[0368]
maetnnsvpytqlpaednntsvnspagcrlrpkrvsfivltglv aalllfvavkygkneaedvnpgpvppqetvcnmlgsnlmpltsmkt vargvaegvsaksrgrflglrpfpwtkqmlawqrtsfhfqpkknw mndpngplfykgwyhlfyqynpeaavwgnivwghavsrdlihwq hlpvamvadqwydingvwtgsatilpdgklvmlytgstnesvqvq nlaypadpsdpllikwvkyegnpvlvpppgiaakdfrdpttawttpq gkwritigskvnktgislvydtidfknfelldgvlhgvsgtgmwecv dfypvskvvengldtsdngpavkhvlkssldddrndyyalgtyda vagkwvpdnptidvgiglrydygnfyasktfydqekkrrvlwawit esdseaadickgwaslqpiprtikydkktgsniitwpvaevenlrfns kefdkvevkpgnvvplevgtatqldimaefevdpkvleklegsnaty ecrssggsaergalgpfgllvltdkglseqtpiyfyiakdaagnfttf fcndltrsseatdvrkliygstvpvlqgeklslrtlvdhsivesfaqn grtaitsrlyptkaiyedaklylfnnatdvtitasvkiwqihsaniqss
[0369]
seq id no 3：ntinv3-t的多核苷酸序列
[0370]
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[0371]
seq id no 4：ntinv3-t的多肽序列
[0372]
maetnnsvpytqlpaednntssnspakcrrrpkrvsfivltglv aalllfvavkygnneaedvnpgpvppqetvcnmlgsnlmplttmrt vargvaegvsaksrgrflglrpfpwtkqmlawqrtsfhfqpkknw mngplfykgwyhlfyqynpeaavwgnivwghavsrdlihwqhlpv amvadqwydingvwtgsatilpdgklvmlytgstnesvqvqnlay padpsdpllrkwvkyegnpvlvpppgiatkdfrdpttawttpqgkw ritigskvnktgislvydtidfkkfelldgvlhgvpgtgmwecvdfyp vskvvengldtsdngpavkhvlkssldddrndyyalgtydavagk wipdnptidvgiglrydygnfyasktfydqekkrrvlwawitegdse aadickgwaslqpiprtikydkktgsniitwpvaevenlrlnskefdk vevkpgsvfplevgtatqldimaefeidpkvlerlegnnatyecrssg gsaergalgpfgllvltdkglseqtpiyfyiakdaagnfttffcndlt rsseatdvrkliygstvpvlqgeklslrtlvdhsivesfaqsgrtaits rvyptkaiyedaklylfnnatdvstaslkiwqmnsaniqss
[0373]
seq id no 5：ntinv4-s的多核苷酸序列
[0374]
atggccacccaccattcccattatgacccggaaaactccacgacccattacactgtcctaccggatcaa cccgaatccgccggcgccgggcgccggaagtctcttaaagttgtctccggcattttgctctcctctttctttttgct ttctttagtctttgtgatcctcaaccagtcttcagatttatcacaagaaaactcccgctcgtcggagactttgacgcc ggcgttgtcacgaggtgtatctcagggagtttccgagaagactttcaaggatgtttccggtagaagcctttcgta ctacccgtggactaatgctatgcttacttggcaaaggactgcttaccattttcaacctcaaaagaattggatgaac ggtaaattttttggcttatctttctcttattaattcttttaataaaacatgaattttaagatacttatactggctttttcttatt gattcttatggctattttgttggggtatcctatggattctgattggatgatatgctgcagatcctaatggtgagtttact tattaccataattactttttattatttattattcccaaaccatgattagtgcatccg
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[0375]
seq id no 6：ntinv4-s的多肽序列
[0376]
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[0377]
seq id no 7：ntinv4-t的多核苷酸序列
[0378]
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[0379]
seqidno8：ntinv4-t的多肽序列
[0380]
mathhshydpenstthytvlpdqpesagsghrkslkvvsgillssffllslvfvivnqssdlsqknshssetltpalsrgvsqgvsektfrdvsggslsyypwtnamltwqrtayhfqpqknwmngplyhkgwyhlfyqynpdsaiwgnitwghaistdlihwlylpfalvpdqwydingvwtgsatflpdgqimmlytgdtndyvqvqnlaypanlsdpllidwvkyrgnpvmvpppgigvkdfrdpttawtgpqngqwlltigskigktgiaivygtsnftnfklldgvlhavpgtgmwecvdfypvstdeangldtsyngpgikhvlkasldddkhdyyaigtydpvknkwtpdnpqldvgiglrldygkyyasktfydpkeqrrilwgwigetdseaadllkgwasvqsiprtvlydketrthvlqwpvkeieslrigdplvkrvnlqpgsielvhvdsaaqldveasfevdkaalegtieadvgfncstsggaakrgilgpfgvvviadqtlseltpvyfyiakgpdgraetyfcadetrsseapgvakqvygssvpvlddeqhsmrllvdhsivesfaqggrtvitsriyptkaingaarlfvfnnatrsvtaslkiwslesadirsfpldq
[0381]
seqidno9：用于沉默ntinv4-t和ntinv4-s的核苷酸序列
[0382]
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[0383]
seqidno:10：ntsus1-s的多核苷酸序列
[0384]
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[0385]
seq id no:11：ntsus1-s的多肽序列
[0386]
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seq id no:32：ntsus6-t的多核苷酸序列
[0428]
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[0429]
seq id no:33：ntsus6-t的多肽序列
[0430]
matapalkrsesiadsmpealrqsryhmkkcfakyieqgkrmm klhnlmdelekviddpaernhvlegllgyilcttmeaavvppyiafa trqnpgfweyvkvnandlsvegitatdylkfkemivdeswakdeya leidfgavdfstprltlsssignglsyvskfltsklnatsasaqclvdy lltlnhqgdklminetlgtvsklqaalvvaeasisslptdtpyqsfel rfkqwgfekgwgdtaervrdtmrtlsevlqapdplniekffgrvpt vfnivlfsvhgyfgqanvlglpdtggqvvyvldqvvafeeemlqri kqqglnikpqilvltrlipdakgtkcnqelepikntkhshilrvpfrte kgvlnqwvsrfdiypylerytqdaadkiielmegkpdliignytdgn lvaslmarklgitlgtiahalektkyedsdiklkeldpkyhfscqfta dliamnsadfiitstyqeiagskdrpgqyeshsaftlpglyrvasginv fdpkfniaapgadqsvyfpytekqtrltafrpaieellfskvdndehig yledrkkpilftmarldtvkntsgltewygknkrlrslvnlvvvgg sfdptkskdreeaaeikkmhmliekyqlkgqirwiaaqtdryrnsel yrtiadskgafvqpalyeafgltvieamncglptfatnqggpaeiivd gvsgfhidpnngdessnkvanffqkcredpeywnrisvqglnriyec ytwkiyankvlnmgsiytfwrtlyrdqkqakqryietfynlefrnl vknvpirqdetpqgpkerrekvkpqisqrhalkllpivfqetlvysst klelysmqlasavhlskspvmsikltksinsafpfpmldcyysyfvyg slpslfspvllllqly