一种试管苗支架及其在柑橘茎尖微芽嫁接脱毒中的应用

1.本发明属于柑橘无病毒良种繁育技术领域，更具体地，涉及一种试管苗支架及其在柑橘茎尖微芽嫁接脱毒中的应用。


背景技术：

2.柑橘黄龙病是由亚洲韧皮杆菌侵染所引起的、发生在柑橘上的毁灭性病害，严重地影响了柑橘产业的持续发展。由于病原菌难以培养，也给黄龙病的防控带来了很大的阻碍，控制柑橘黄龙病造成严重的经济损失是果树研究人员亟待解决的任务。柑橘木虱是黄龙病病原的传播媒介，带病苗木的调运也加速了柑橘黄龙病的传播。迄今，控制柑橘黄龙病及其它病毒和类似病毒病，还没有有效的药剂治疗方法。目前，主要采用的措施是：挖除病树，防治木虱，搭建防虫网，加强园区管理，这些技术措施可以产生一定的效果，但投入的成本很高，效果有限。加强培育无毒苗，保证苗木健康无毒是非常重要的防病途径之一。此外，利用茎尖微芽嫁接培育无病毒苗木也是控制柑橘衰退病、柑橘黄脉病等病毒性病害的重要途径之一。
3.茎尖微芽嫁接脱毒是获得柑橘良种无病毒苗木的有效方法。1977年，navarro教授研究出利用茎尖微芽嫁接获得无病毒苗木的方法(navarro et al.,1977)。柑橘茎尖微芽嫁接脱毒的原理是利用茎尖分生组织所含病毒浓度含量低或者不带病毒，或者是由于疏导组织还没有形成，病原无法运输到顶端分生组织，因而可以利用茎尖进行脱毒。最新研究表明：茎尖分生组织一定范围内的细胞受到干细胞的保护，这也为解释植物茎尖一定范围内细胞不带病原提供了理论依据。由于柑橘为木本植物，它在进行组织培养时，生根是非常困难的，因此，只有利用砧木进行嫁接，从而解决生根难的问题。在双目实体显微镜下，利用柑橘黄化砧木进行接穗品种的微芽嫁接，可以获得无病毒苗木，这就为柑橘优良品种无病毒苗木推广应用奠定了良好的基础。目前，我国柑橘优良品种的无病毒苗木供不应求，培育无病毒苗木还存在着技术难度大，成活率不高等多种问题。
4.在柑橘茎尖微芽嫁接脱毒过程中，培养基对试管苗脱毒至关重要。对试管苗进行培育操作时，传统的方法是利用定性滤纸制作滤纸桥，用于支撑试管苗并为其生根供给一定营养。但本技术发明人在试验中发现，目前使用的试管苗的支撑材料，即滤纸桥，存在一些缺陷：试管苗培育过程中滤纸的加入对培养基的ph影响较大，并且滤纸长时间浸泡在培养基中，会引起沉淀物的产生，从而影响柑橘茎尖微芽嫁接脱毒的效果。


技术实现要素：

5.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种试管苗支架及其在柑橘茎尖微芽嫁接脱毒中的应用，旨在解决现有柑橘茎尖微芽嫁接脱毒过程中利用滤纸桥支撑试管苗存在ph值变化大、产生沉淀物等问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种试管苗支架，该试管苗支架由食品级聚丙烯材料制成，用于在试管内固定并支撑试管苗。
7.优选地，该试管苗支架包括中心环，所述中心环沿其内沿向中心延伸出放射状条，用于固定并支撑插入所述中心环内的试管苗；所述中心环沿其外沿向外延伸出至少两个第一支撑脚，用于向垂直于所述中心环所在平面的方向翻折以支撑所述中心环。
8.优选地，所述放射状条对称排布。
9.优选地，所述至少两个第一支撑脚沿所述中心环的外沿等间距分布。
10.优选地，所述中心环沿其外沿向外还延伸出至少两个第二支撑脚，用于向垂直于所述中心环所在平面且与所述第一支撑脚翻折方向相反的方向翻折。
11.优选地，所述第二支撑脚的数量与所述第一支撑脚的数量相同，且所述第二支撑脚与所述第一支撑脚交替分布。
12.优选地，所述第一支撑脚为山字形，且其顶部与所述中心环连接；所述第二支撑脚为t形。
13.另一方面，本发明还提供了试管苗支架在柑橘茎尖微芽嫁接脱毒中的应用，应用时，所述试管苗支架浸入所述柑橘茎尖微芽嫁接专用培养基中。
14.优选地，在培养试管苗之前，对装有所述试管苗支架和所述柑橘茎尖微芽嫁接专用培养基的试管进行灭菌处理。
15.优选地，所述柑橘茎尖微芽嫁接专用培养基为以下5种培养基中的任意一种：
16.培养基a：ms培养基 30g/l蔗糖，ph＝6.3；
17.培养基b：mt培养基 30g/l蔗糖，ph＝6.3；
18.培养基c：mt培养基 30g/l蔗糖，ph＝6.4；
19.培养基d：mt培养基 30g/l蔗糖 0.5mg/l赤霉素，ph＝6.3；
20.培养基e：3/4浓度的mt培养基 30g/l蔗糖 0.5mg/l赤霉素，ph＝6.4。
21.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
22.(1)本发明利用聚丙烯材料制成的试管苗支架替代传统的滤纸桥，聚丙烯试管苗支架耐高温高压，稳定性更好，安全无毒，在高温高压灭菌前后对培养基的ph影响较小，同时食品级聚丙烯pp材料的试管苗支架长时间浸泡在培养基中，也不容易析出杂质，操作使用方便，可以减少人工劳动强度，且清洗方便，可重复使用，经济性好。
23.(2)本发明提供的聚丙烯支架结构，操作方便，整个支架可以稳定放于试管底部，且插入其中的柑桔试管苗根系有较舒适的生长空间，试管苗的固定效果好。
24.(3)将本发明聚丙烯试管苗支架应用于柑橘茎尖微芽嫁接脱毒苗培养过程中，可大大减小支架对脱毒苗生长过程可能产生的影响，相比传统的滤纸桥表现出明显的优势，应用价值高。
附图说明
25.图1为本发明实施例1提供的聚丙烯支架展开的平面图。
26.图2为本发明实施例1提供的聚丙烯支架使用时的立体结构图。
27.图3为本发明实施例2中采用聚丙烯支架与滤纸桥在灭菌前后液体培养基的ph值变化。
28.图4为本发明实施例3中利用聚丙烯支架进行柑橘茎尖嫁接培养的照片。
29.图5为本发明实施例3中利用滤纸桥最初进行柑橘茎尖嫁接时(a)和培养一段时间(b)的照片。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.本发明提供的试管苗支架，该支架由食品级聚丙烯材料制成，用于在试管内固定并支撑试管苗。
32.本发明试管苗支架材料选择食品级聚丙烯(pp)，颜色白色半透明，熔点在200℃以上，耐高温高压，不会析出杂质，稳定性好。利用食品级聚丙烯pp材料制作成试管苗支架，相比传统的滤纸桥，对液体培养基的ph值及成分的影响更小，从而避免了支架和培养基变化对柑橘茎尖微芽嫁接脱毒效果造成的影响，安全可靠。本发明聚丙烯试管苗支架操作使用方便，清洗方便，可以减少人工劳动强度；且可重复使用，节约了成本。
33.以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
34.实施例1
35.本实施例提供了一种聚丙烯材料制成的试管苗支架，如图1所示，其包括中心环1，中心环1的外径宜略小于试管的内径，中心环1沿其内沿向中心延伸出放射状条2，用于固定并支撑插入中心环1内的试管苗；中心环1沿其外沿向外延伸出至少两个第一支撑脚3，用于向垂直于中心环1所在平面的方向翻折以支撑中心环1，此外，中心环1沿其外沿向外还延伸出至少两个第二支撑脚4，用于向垂直于中心环1所在平面且与第一支撑脚3翻折方向相反的方向翻折。优选地，第一支撑脚3的数量与第二支撑脚4的数量相同，且第一支撑脚3与第二支撑脚4位置呈交替分布。进一步地，放射状条2对称排布，任意相邻两个第一支撑脚3的间距相等，任意相邻两个第二支撑脚4的间距相等。
36.本发明对各支撑脚的形状不作特别限定，可以是柱状、块状或任意多边形，也可以是t形或山字形。在一个具体实施例中，参见图1，放射状条2包含8条柱状条，各柱状条远离中心环1的一端为自由端；第一支撑脚3为山字形，其顶部与中心环1的外沿连接，数量为4个；第二支撑脚4为t形，数量也为4个。
37.本实施例中，中心环1的内径为1.5cm，外径为1.8cm；山字形第一支撑脚3的长度为3cm；t形第二支撑脚4的长度为1.1cm。
38.由于聚丙烯材料具有一定柔性，在实际使用本实施例试管苗支架时，将第一支撑脚3垂直向下翻折，第二支撑脚4垂直向上翻折，将试管苗支架放入试管靠近底部的位置，第一支撑脚3底部浸入培养基中，多个第一支撑脚3的自由端、多个第二支撑脚4的自由端均与试管内壁接触，由于摩擦力使得支架能够固定于试管中而不发生移动。在培养试管苗时，将试管苗插入中心环1内，放射状条2的自由端抵持该试管苗并使之固定，试管苗的底部也浸入培养基中。使用聚丙稀pp材料制作的支架，操作方便，柑桔试管苗的根系有较舒适的生长空间，试管苗的固定效果良好。
39.实施例2研究聚丙烯支架与滤纸桥对培养基ph的影响
40.本实施例设置实验组和对照组，实验组试管底部放置实施例1提供的聚丙烯支架，
对照组试管底部放置普通定性滤纸制作的滤纸桥。实验组分别设置a、b、c、d、e五组，各组对应加入茎尖微芽嫁接常用的五种不同的培养基，每组6个重复；对照组同样相应设置五组，聚丙烯支架和滤纸桥均部分浸入培养基中。该五种不同的培养基分别如下：培养基a：ms 30g/l蔗糖，ph＝6.3；b：mt 30g/l蔗糖，ph＝6.3；c：mt 30g/l蔗糖，ph＝6.4；d：mt 30g/l蔗糖 0.5mg/lga3(赤霉素)，ph＝6.3；e：3/4mt 30g/l蔗糖 0.5mg/lga3，ph＝6.3。培养基e中3/4mt表示该培养基中大量元素、微量元素和有机物质浓度仅为原mt配方的3/4。用ph计检测灭菌前、后实验组试管和对照组试管中培养基的ph值变化。
41.如图3所示，当定性滤纸作滤纸桥浸泡到液体培养中后，经过高温高压灭菌处理，培养基的ph发生了明显的变化，在5种培养基配方中，其变化量分别为0.53、0.58、0.55、0.51和0.53；而采用耐高温高压的食品级聚丙稀pp材料制作试管苗支架，ph变化量较小，在5种培养基中变化量分别为0.33、0.35、0.24、0.4和0.41。结果表明，用聚丙稀pp材料作支架时，在灭菌前和灭菌后a、b、c和d4种培养基的ph值的变化值均小于滤纸桥引起的ph变化值。经统计学分析，ph变化值差异均达到显著水平(p《0.05)。仅仅在培养基e中，用聚丙稀pp材料作支架，在灭菌前和灭菌后培养基ph值的变化值与滤纸桥引起的ph变化值相比，差异有所减小，没有达到差异显著水平。
42.由于聚丙稀pp材料在高温高压条件下性能稳定，并且可以重复使用，当它被多次灭菌时，也不会造成形态的变化，并保持良好的支撑功能。因此，利用食品级聚丙烯pp材料替代滤纸桥，有明显的优点。
43.实施例3研究聚丙烯支架和滤纸桥在培养物中析出物的差异
44.茎尖嫁接后，试管苗通常要在液体培养基中连续培养30天至60天的时间，本实施例分别用聚丙烯支架和滤纸桥对试管苗进行支撑，使得苗木被固定在试管底部位置上生长。培养一段时间，分别肉眼观察采用聚丙烯支架和滤纸桥的试管中培养基的变化。
45.试验表明，耐高温高压的聚丙烯材料，在培养基中不会产生明显的析出物，如图4所示；而滤纸在培养基中，经长时间的浸泡，滤纸软塌，会产生白色混浊物，并有析出物沉降到试管底部，滤纸的成分也容易对液体培养基造成干扰，如图5所示。
46.本实施例还对聚丙烯支架和滤纸溶出物进行了比较分析。制备茎尖微芽嫁接常用的5种培养基，分别将本发明所提供的聚丙烯支架和滤纸桥置于含有不同培养基的试管中，对培养基进行高温高压灭菌。冷却后，将培养基用0.22微米水性过滤膜过滤，每种培养基做3个生物学重复样品分析，共分析了30个样品。利用液相色谱质谱联用仪(liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry system,lc-qtof-ms)分析，其中，前端液相色谱为安捷伦1260高分辨液相色谱(1260infinity uhplc,agilent technologies,usa)，质谱为6540q-tof四极杆飞行时间串联质谱联用系统。化合物色谱分离基于pinnacle ii c18色谱柱(250mm
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4.6mm,5μm)进行，进样量为10μl，二元泵流量为0.500ml/min，梯度洗脱条件为10％甲醇以固定比例在5分钟内升至90％。化合物检测由tof/q-tof质谱仪(g6540,agilent technologies,usa)在大气压化学电离模式(apci)下检测，喷雾器温度450℃，压力35psig，气流量13l/min。数据处理采用agilent mass hunter workstation software(version b.03.01)软件包进行。
47.通过对质谱中的精确的质量数和同位素组成模式的分析，获得了潜在化合物分子。聚丙烯支架和滤纸桥置于含有不同培养基的试管中，经过液相色谱质谱联用分析后可
以识别的化合物分子数，经质谱仪检测表明，滤纸长时间在液体培养基中产生析出物的种类明显多于使用聚丙烯支架的培养基，参见表1。
48.表1分别使用聚丙烯支架和滤纸桥的不同培养基中的化合物分子数量的比较
49.培养基编号abcde聚丙烯支架8685727659滤纸桥10891798670
50.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。