一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法与流程

1.本发明属于胶体金检测技术领域，具体涉及一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法。


背景技术：

2.胶体金免疫层析技术(colloidal gold immunochromatography assay， gica)是以胶体金标记技术、免疫技术和层析技术为基础发展出来的一项快速检测技术，因便捷性和时效性被广泛用于定性筛查，但由于定性筛查的局限性使得胶体金试纸无法阶梯式定量评估危重症疾病的严重程度，使得胶体试纸的适用范围仅局限于检测血清学指标的有无，而无法直接动态监测疾病生物学指标的浓度与量。
3.胶体金免疫层析技术其基本原理是通过将硝酸纤维素膜作为载体，利用微孔膜的毛细作用，滴加的液体样品从膜条一端的缓慢渗移至另一端过程中，通过胶体金聚集显色将试纸中抗原抗体结合反应显示出来。传统的胶体金方法当检测线和质控线同时显现红紫色，表明结果有效，要根据t线的显示条数来判断其浓度区间；如果质控线不显色，则表明试纸结果失效。传统方法只能对抗原抗体的存在做定性判断，不能对检测物质进行定量判断。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法，适用于半定量检测大分子抗原和细胞，制得的这种新式能够分段显示被检测物的浓度范围的胶体金试纸检测工具，适用于疾病早筛和动态评估，同时也可以在其他非医学场景中应用，例如农药检测、食品安全检测和水物质检测。以医学为例，制备好的试纸在滴加患者的一滴血液后其分段式的颜色反应结果可用于快速检测血清学指标，便于疾病的早期筛查和动态评估临床某些高危特殊疾病的患病风险、严重程度，划定危险人群。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种基于双抗体夹心的抗原检测胶体金试纸条，所述胶体金试纸条上包括依次粘贴在pvc板上的样品垫、一抗ab1包被的胶体金垫、一抗ab2包被后的硝酸纤维素膜、二抗包被后的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
7.所述包被后的硝酸纤维素膜包含多条检测线和一条质控线；
8.每条所述检测线上包被相同浓度或不同浓度的一抗ab2；
9.质控线c线上包被二抗。
10.所述二抗与一抗ab1能够结合；其中一抗ab1和一抗ab2是针对同一抗原的不同抗体决定簇。
11.在所述pvc底板中央粘贴包被后的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜下缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜上缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫上缘粘贴样品垫。
12.所述每条检测线上包被的一抗ab2的量对应相应的分段检测浓度。
13.所述抗原包括大分子抗原和细胞，下述实验过程以cd4 t细胞为例 (cd4就是指分化决定族抗原4，文中cd4 t细胞指的是表面有cd4分子的t淋巴细胞)。
14.在所述胶体金试纸条上的硝酸纤维素膜上设置3条检测线；当所述抗原为cd4 t细胞时，3条检测线上，检测线t1上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t 细胞抗体ab2溶液2.0μl，检测线t2上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t细胞抗体ab2溶液2.0μl，检测线t3上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t细胞抗体 ab2溶液4.0μl。
15.当所述抗原为cd4 t细胞时，当只有质控线c显示为红紫色时，cd4 t 细胞浓度为(0，12.5
×
106/l]，当质控线c与t1同时显示为红紫色时，cd4 t 细胞浓度区间为(12.5
×
106/l，25
×
106/l]；当质控线c与t1、t2同时显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度区间为(25
×
106/l，50
×
106/l]；当质控线 c与三条t线显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度区间为(50
×
106/l， ∞)；当质控线c不显色时实验结果失效。
16.有益效果：本发明提供了一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法，保留了传统胶体金试纸便携实用、检测迅速、适合于医院、疾控、基层卫生单位检测及家庭自测等多种场景且适于推广等多方面的优点。制得的这种一种新式能够分段显示被检测物的浓度范围的胶体金试纸检测工具，首次实现了胶体金试纸可检测血清学物质浓度区间，与相关疾病的临床风险系统对应即得出患者感染的状态。有望扩大可使用胶体金试纸进行早筛的疾病病种范围，并能同时辅助临床医生及时制定治疗方案，改善患者预后。同时也可以在其他非医学场景中应用，例如农药检测、食品安全检测和水物质检测。
附图说明
17.图1为本发明所述胶体金试纸条的结构图；
18.图2为本发明所述胶体金试纸条的检测结果示意图。
具体实施方式
19.本发明提供了一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法，所述胶体金试纸条上包括依次粘贴在pvc板上的样品垫、一抗ab1包被的胶体金垫、一抗ab2包被后的硝酸纤维素膜、二抗包被后的硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
20.所述包被后的硝酸纤维素膜包含多条检测线和一条质控线；
21.每条所述检测线上包被相同浓度或不同浓度的一抗ab2；
22.质控线上包被二抗；其中一抗ab1和一抗ab2是针对同一抗原的不同抗体决定簇。
23.本发明所述一抗ab1和一抗ab2为针对同一抗原所产生的不同单抗，且所述二抗与一抗ab1能够结合。
24.本发明所述胶体金试纸条的结构优选如图1所示，在所述pvc底板中央优选粘贴包被后的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜上缘粘贴抗体胶体金垫，胶体金垫上缘粘贴样品垫。
25.在本发明中，将样本滴落在胶体金试纸条上时依次经过胶体金结合垫、检测线t1、检测线t2
……
检测线tn和质控线c，检测线t1-tn各自表示不同浓度梯度的生物标志物，本
发明所述抗原优选包括细胞抗原和大分子抗原；以cd4 t细胞为例，当所述抗原为cd4 t细胞时，一抗优选来源于鼠源：抗cd4 t细胞抗体ab1和抗cd4 t细胞抗体ab2，二抗优选来源于兔源：与鼠源抗cd4 t细胞抗体ab1结合的兔抗鼠抗体。由于cd4 t细胞抗原是细胞抗原，根据胶体金试纸条检测原理，对cd4 t细胞抗原采用双抗夹心法，样本滴落在胶体金试纸条上时依次经过金标垫、检测线t1、检测线t2、检测线t3和质控线c。检测线t1-t3和质控线c在检测前均无显色。聚集呈红紫色的免疫胶体金与鼠源抗cd4 t细胞抗体ab1结合物(胶体金-一抗-ab1复合物)均匀分布于胶体金结合垫上。检测线t中含有事先已经吸附着针对cd4 t细胞抗原的鼠源抗cd4 t细胞抗体ab1，可与胶体金-一抗-ab1复合物结合。质控线c中含有可以与胶体金-一抗-ab1复合物结合的与鼠源抗cd4 t细胞一抗ab1结合的兔抗鼠抗体。若样本血液中不含cd4 t细胞抗原时，检测线不显色，质控线显色。若样本血液中含有该抗原时，当样本中的cd4 t细胞抗原经过免疫胶体金时，鼠源抗cd4 t细胞抗体会与cd4 t细胞抗原结合。当免疫胶体金随着血液样本移动至检测线时，结合样本中抗原的免疫胶体金会被吸附至检测t线，进一步聚集后使检测线t呈紫红紫色。三条检测线t1-t3根据其对应的疾病风险划分区间被设置有固定的免疫胶体金结合上限，在样本血液量固定的情况下，通过三条检测线显示的颜色组合情况可得出样本中抗原的含量范围从而判断患者是否为患有疾病的高危人群。质控线c位置吸附的是与鼠源抗cd4 t细胞一抗ab1结合的兔抗鼠抗体，在没有捕获吸附鼠源抗cd4 t细胞抗体的胶体金时，由于与鼠源抗cd4 t细胞抗体ab1结合的兔抗鼠抗体是无色蛋白，故c线不显色，但捕获到吸附鼠源抗cd4 t细胞抗体的胶体金时，就会显示为红紫色条带。只有质控线c显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度为(0， 12.5
×
106/l]，当质控线c与t1同时显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度区间为(12.5
×
106/l，25
×
106/l]；当质控线c与t1、t2同时显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度区间为(25
×
106/l，50
×
106/l]；当质控线c与三条t 线显示为红紫色时，cd4 t细胞浓度区间为(50
×
106/l， ∞)。
26.本发明对所述胶体金的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行制备即可，可利用柠檬酸三钠还原法制备，也可利用其它方法进行制备。
27.本发明所述胶体金垫的制备方法，优选包括：利用碳酸钾溶液调节胶体金溶液的ph值后，与一抗ab1混合，室温反应10～30min，与封闭液混合后再静置5～10min，4℃2000rpm离心收集上清，4℃12000rpm离心60min，弃上清，沉淀溶于pbs(内含质量分数0.2％bsa)中，得胶体金标记物；取胶体金标记物以pbs(内含质量分数0.2％bsa)稀释1～2倍，利用喷涂仪均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为0.1～0.5ml/cm2，30％的湿度以下， 37～40℃干燥18～24小时，得到金标垫。将金标垫用锡箔袋密封，内装干燥剂，常温保存；打开和使用应在30％的湿度以下。
28.本发明对所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线的设置并没有特殊限定，以设置3条检测线和1条质控线为例，将针对抗原的一抗ab2用pbs稀释至浓度为1～4mg/ml，在3条硝酸纤维素膜(硝酸纤维素膜)上等距离划线 (或喷于硝酸纤维素膜上)，作为检测线。在离检测线6mm处，用1～4mg/ml 的对应与鼠源一抗ab1结合的兔抗鼠抗体(二抗)再划一条线(或喷于硝酸纤维素膜上)，作为质控线，使检测带和质控线固化在硝酸纤维素膜上。
29.本发明提供了一种基于双抗夹心法的抗原检测胶体金分段半定量检测试纸的制作方法包括上述胶体金试纸条。
30.本发明优选在所述胶体金试纸条上的硝酸纤维素膜上设置3条检测线；且当所述
抗原为cd4 t细胞时，3条检测线上，检测线t1上喷涂1～4mg/ml 的抗cd4 t细胞抗体ab2溶液2.0μl，检测线t2上喷涂1～4mg/ml的抗 cd4 t细胞抗体ab2溶液2.0μl，检测线t3上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t 细胞抗体ab2溶液4.0μl；当所述抗原为cd4 t细胞时，3条检测线上，检测线t1上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t细胞抗体ab2溶液3.0μl，检测线 t2上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t细胞抗体ab2溶液3.0μl，检测线t3上喷涂1～4mg/ml的抗cd4 t细胞抗体ab2溶液6.0μl。
31.在本发明中，优选以血液为检测样本，若质控线显色，则试纸有效，我们可以根据检测线的条数确定患者血液cd t细胞浓度范围；若质控线不显色，则试纸条失效(图2)；当只有质控线c显示红紫色时，结果其对应一阶段浓度；当质控线c与t1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线c与t1、t2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线 c与三条t线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度；更优选的，在实施例中，cd4 t细胞的一阶段浓度位于(0，12.5
×
106/l]区间内，cd4 t细胞的二阶段浓度位于(12.5
×
106/l，25
×
106/l]区间内；cd4 t细胞的三阶段浓度位于(25
×
106/l，50
×
106/l]区间内；cd4 t细胞的四阶段浓度位于 (50
×
106/l， ∞)区间内。
32.下面结合实施例对本发明提供的一种基于双抗体夹心的抗原检测胶体金试纸条及分段半定量检测体系进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
33.实施例1
34.双抗原夹心法免疫胶体金半定量分段检测试纸条的制备
35.1、胶体金制备：
36.将氯金酸(haucl4)配成质量分数1％的氯金酸溶液，取1.0ml氯金酸溶液加入99ml去离子水中，加热至沸腾后立即加入2.0ml质量分数1％的枸掾酸钠溶液，迅速搅拌均匀，继续加热沸腾10分钟，冷却至室温，补充去离子水至100.0ml，得胶体金溶液。
37.2、胶体金标记物的制备：
38.取10ml制备好的胶体金溶液，用0.1mol/l的碳酸钾溶液将ph值调节到5.5～7.0，加入鼠源cd4 t细胞抗体ab150.0～100.0μg，混匀，室温反应10～30分钟，然后加入bsa至终浓度(质量分数)0.5～1.0％，混匀，静置5～10分钟，4℃、2000rpm离心20分钟，弃去沉淀。上清液于4℃、12000rpm 离心60分钟，弃去上清，取沉淀溶于1.0ml的pbs(内含质量分数0.2％ bsa)中，得胶体金标记物。
39.3、金标垫(即铺有胶体金标记物的结合垫)的制备：
40.取胶体金标记物以pbs(内含质量分数0.2％bsa)稀释1～2倍，利用喷涂仪均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为0.1～0.5ml/cm 2
，30％的湿度以下，37～40℃干燥18～24小时，得到金标垫。将金标垫用锡箔袋密封，内装干燥剂，常温保存。打开和使用应在30％的湿度以下。
41.4、3条检测带与质控线的包被
42.将针对cd4 t细胞抗原的另一种抗体ab2用pbs稀释至浓度为 1～4mg/ml，在硝酸纤维素膜(硝酸纤维素膜)上等距离划3条线(或喷于硝酸纤维素膜上)，作为检测带(t1、t2、t3)。在离最远检测带6mm处，用1～4mg/ml的对应与鼠源cd4 t细胞抗体ab1结合的兔抗鼠抗体(二抗) 再划一条线(或喷于硝酸纤维素膜上)，作为质控线。使3条检测带和质控线固化
在硝酸纤维素膜上。
43.5、固化：
44.待硝酸纤维素膜干燥后，浸泡于含1％bsa的ph7.2的pbs中进行封闭 (4℃，1h)。然后取出硝酸纤维素膜用pbs洗涤3次，悬挂，于室温干燥 3小时以上，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时。
45.6、试纸条的组装：
46.6.1试纸条主要包括由样品垫、经以上步骤得到的金标垫、硝酸纤维素膜(3条检测带和质控线)及吸水垫构成的试纸以及固定支撑试纸的基底。其中，基底采用pvc板1(试纸条)或卡壳(试纸卡)；吸水垫可采用吸水滤纸，吸收检测样品中多余液体；样品垫可以采用玻璃纤维膜，接触待检测样品。
47.6.2在pvc板上，沿着层析方向依次布置试纸的各个部分，其中，在下游端为吸水垫，上游端为样品垫，中段以3条检测带(含有针对cd4 t细胞抗原决定簇的另一种抗体ab2)和质控线(对应与鼠源cd4 t细胞抗体 ab1结合的兔抗鼠抗体)的硝酸纤维素膜作为检测反应和分析区，在硝酸纤维素膜与样品垫之间放置吸附有胶体金标记的鼠源cd4 t细胞抗体ab1的金标垫。
48.6.3试纸贴附于pvc板1上，裁切成4mm宽的条形带；其中，先将硝酸纤维素膜贴附在pvc板上，然后将吸水垫和金标垫贴附在pvc板上，并且与硝酸纤维素膜两端分别部分重叠，最后将样品垫贴附在pvc板上，并且与金标垫部分重叠。试纸条密封干燥保存，备用。
49.7、结果判定：
50.将待测的血液用滤血膜过滤红细胞后，垂直滴于金标垫上，液体流动时开始计时，静置反应5min，观察结果。由于与鼠大分子抗原/细胞抗体ab1 结合的兔抗鼠抗体是无色蛋白，故质控c线不显色，但捕获到吸附鼠大分子抗原/细胞抗体的胶体金时，就会显示为红紫色条带。只有质控线c显示红紫色时，结果其对应一阶段浓度；当质控线c与t1同时显示为红紫色其结果对应二阶段浓度；当质控线c与t1、t2时显示为红紫色时，其结果对应三阶段浓度；当质控线c与三条t线同时显示为红紫色其结果对应四阶段浓度。
51.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。