针对CEACAM5和CD3的双特异性抗体的制作方法

clinical oncology 35,no.15_suppl(2017年5月20日)2549-2549)。暴露的损失使实际治疗难以控制，并显著降低成功的可能性。为了尽量减少ada的形成，赛必妥单抗和赛必妥单抗和阿特珠单抗的组合分别在用抗cd20抗体奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)预处理后进行组合临床测试(参见clinicaltrials.gov试验nct03866239)。给予预处理以消耗转移性结直肠癌患者的b细胞。b细胞的消耗导致患者免疫球蛋白的下降，从而导致潜在的ada的下降，但同时其导致免疫系统的削弱。
6.medi-565(amg211)(另一种双特异性ceaxcd3抗体，一种单链抗体)已进入临床开发，结果已发表(参见例如m.pishvaian等人clin colorectal cancer.2016dec；15(4)345-351)。据报道，nct01284231(clinicaltrials.gov)研究已完成，过去几年没有开始新的试验。这种单链双特异性抗体(通过aa接头连接的两个scfv)具有在2.2和6.5小时之间的极低的消除半衰期(pishvaian等人；clin.colorectal cancer,2016dec；15(4)345-351)(在此通过引用并入)。
7.本发明提供了一种免疫原性较低且具有高功效的ceaxcd3双特异性抗体。这种抗体包含共同重链和在一个实施方案中在cea结合部分中的κ轻链和在cd3结合部分中的λ轻链。
8.fischer等人,nature communications 6(2015):6113.https://doi.org/10.1038/ncomms7113和magistrelli g.等人,mabs 9(2017)231-239中提到了使用共同重链用于获得双特异性抗体的概念。κλ双特异性抗体描述于例如wo2014087248(通过引用整体并入本文)。它们的结构与天然igg的结构几乎没有区别，其结果是没有或极少形成ada，并因此暴露损失低或极少。发明的共同重链可变区vh的序列和序列hucd3 vl 1a4描述于wo2019175658(us2019/0284297)(通过引用整体并入本文)。
9.如上所述，wo2017055389描述了具有2 1形式但结合与赛必妥单抗不同的结构域的双特异性ceaxcd3抗体。其中一种抗体(ro7172508或rg 6123)已在局部晚期和/或转移性cea阳性实体瘤患者的临床试验中进行了测试(clinicaltrials.gov；搜索ro7172508)，还与奥滨尤妥珠单抗预处理和联合使用阿特珠单抗进行了测试。根据clinicaltrials.gov中的对一些队列的临床试验的描述，在待治疗的患者中需要低于某个阈值的血清cea(脱落的可溶性ceacam5，scea)水平以使他们有资格接受治疗，这提示更高水平的脱落的可溶性ceacam5可降低这种ceaxcd3双特异性抗体的功效。本发明的抗体显示脱落的可溶性cea对其肿瘤细胞杀伤效力的最小影响。
10.脱落的可溶性ceacam5是一种已建立的肿瘤标志物。癌症患者血浆中的scea水平可超过1000ng/ml，而健康个体的血浆浓度低于10ng/ml(例如sandler b.等人anticancer res 1999,19(5b),4229-33)。因此，脱落的可溶性ceacam5可以与肿瘤细胞上存在的膜结合cea竞争结合治疗性抗cea抗体和抗cea双特异性抗体，可能导致抗cea抗体或ceaxcd3抗体的功效降低。tcb2017和tcb2014(见上文)已由发明人在体外在可溶性cea的存在下在针对t细胞介导的cea阳性肿瘤细胞裂解的测试中进行了测试。发现向测试中添加scea使裂解曲线移动，因此tcb2014和tcb2017的ec50值移动到更高的浓度，这表明tcb2014和tcb2017都与scea显著结合。
11.人类cea家族包含29个基因，其中18个被表达：7个属于cea亚组，11个属于妊娠特异性糖蛋白亚组。几个cea亚组成员被认为具有细胞粘附特性。ceacam5不仅在结直肠癌细
胞中表达，在胰腺癌、胃癌、肺癌和其他癌症类型中也有表达。ceacam5被认为在先天免疫中起作用(s.,semin.cancer biol.9(2):67-81(1999))。癌胚抗原5(cea、ceacam5或cd66e；uniprotkb-p06731)是癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam家族)的成员并且是肿瘤相关抗原(gold和freedman,j exp.med.,121:439-462,1965；berinstein n.l.,j clin oncol.,20:2197-2207,2002)。出于研究目的(作为诊断工具)和出于治疗目的，已经产生了针对ceacam5的多种单克隆抗体(参见例如wo2012117002)。癌胚抗原家族(ceacam)的成员广泛表达，并且取决于组织，能够调节多种功能，包括肿瘤促进、肿瘤抑制、血管生成和中性粒细胞活化。该家族的四个成员ceacam1、ceacam3、ceacam6和ceacam8在人类中性粒细胞上表达和富集(http：//www.proteinatlas.org)。鉴于ceaxcd3双特异性抗体的作用机制，与其他ceacam的交叉反应可能导致重要的循环健康细胞群的消耗。例如，与由中性粒细胞或造血干细胞表达的ceacam8的交叉反应可能导致此类细胞群的消耗。本发明提供与ceacam家族成员ceacam1、ceacam3、ceacam4、ceacam6、ceacam7、ceacam8、ceacam16、ceacam18、ceacam19、ceacam20和ceacam21中的一个或多个成员具有低交叉反应性的ceaxcd3双特异性抗体。
12.通过将ns1(p3/ns1/i-ag-4-1)骨髓瘤细胞与来自用正常结直肠上皮免疫的小鼠的脾细胞融合来产生小鼠单克隆抗ceacam5抗体pr1a3。richman p.i.和bodmer w.f.,int.j.cancer,39:317-328,1987描述了小鼠单克隆抗体pr1a3。pr1 a3的表位作图显示抗体靶向cea分子的b3结构域和gpi锚(durbin h.等人,proc.natl.acad.sci.usa,91:4313-4317,1994)。pr1 a3结合的表位是构象表位，而不是线性表位(stewart等人,cancer immunol.immunother.,47(1999)299-06)。人源化pr1a3(hpr1a3)抗体描述于例如conaghhan p.j.等人,br.j.cancer,98(2008)1217-1225和wo2012117002。tcb2014中使用的cea结合剂(命名为ch1a1a)是源自pr1a3抗体的人源化、亲和力成熟和稳定性工程化的形式。m.bacac等人,clin.cancer research 22(13)；3286-97(2016),conaghan p等人,br j cancer 2008；98:1217
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25,和durbin h等人proc natl acad sci u s a 1994；91:4313
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7)。
13.wo2017118657中提到了通过人pd-1轴拮抗剂和双特异性抗ceaxcd3抗体联合治疗癌症的方法，临床结果已在2017年asco会议上发表(tabernero等人,j clin oncol 35,2017(suppl.abstr.3002))。wo2015112534中提到了通过施用结合免疫检查点途径的两个或更多个不同靶标的免疫检查点拮抗剂和结合cea和t细胞表面抗原的t细胞重定向剂来治疗肿瘤的方法。由单结构域抗ceacam6抗体和脲酶组成的缀合物目前处于临床试验(nct02309892；wo2016116907)中。在us20110064653中提到了与ceacam5、ceacam6和粒细胞结合的i类抗体。在wo2018053328中提到了包含彼此共价结合的第一多肽链和第二多肽链的双特异性抗体。
14.现有技术中描述的抗cd3ε抗体是sp34(yang sj,the journal of immunology(1986)137；1097-1100)。sp34与灵长类动物和人类cd3都发生反应。sp34可从bd biosciences获得。现有技术中描述的另一种抗cd3抗体是ucht-1(参见wo2000041474)。现有技术中描述的另一种抗cd3抗体是bc-3(fred hutchinson cancer research institute；用于gvhd的i/ii期试验，anasetti等人,transplantation54:844(1992))。sp34与ucht-1和bc-3的不同之处在于sp-34识别仅存在于cd3的ε链上的表位(参见salmeron等
人,(1991)j.immunol.147:3047)，而ucht-1和bc-3识别由ε和γ链促成的表位。抗cd3抗体也描述于wo2007042261、wo2008119565、wo2008119566、wo2008119567、wo2010037836、wo2010037837、wo2010037838和us8236308。包含对cea特异的结合部分和对cd3ε特异的结合部分的双特异性抗体例如在us20140242079、wo2007071426、wo2013012414、wo2015112534、wo2017118675和wo2017055389中进行了描述。包含根据本发明的抗体的第二结合部分的序列的抗cd3抗体在us62/643,095和pct/us2019/000232中提及，通过引用将其整体并入本文。us2012321626提到了一种多特异性fab融合蛋白，其包含与cd3ε的n末端结合的fab片段。wo2018199593提到了与her3和cd3结合的双特异性抗体。
15.如上所述，t细胞双特异性抗体taa x cd3(taa＝肿瘤相关抗原)在晚期实体瘤患者中的首次临床试验结果令人失望，但最近已公布了ceaxcd3双特异性抗体赛必妥单抗的初步1期结果(ro6958688,参见例如bacac等人clin.cancer res.,22(13),3286-97(2016)；和us20140242079)，其在晚期结直肠癌患者中在单一疗法和与pd-l1抑制的组合中显示部分反应和稳定疾病(j.tabernero等人,j.clin.oncol.35,2017(suppl.abstr.3002))。获得更好结果的另一种方法可能是向t细胞双特异性抗体不仅添加pd-1检查点轴的抑制剂，而且添加更多的检查点抑制剂或激动剂。但到目前为止，据信这种组合方法尚无有希望的临床数据。
16.晚期实体瘤中t细胞的有限可用性无疑是限制t细胞双特异性抗体加pd-1轴抑制剂可实现的功效的重要机制。
17.代替向t细胞双特异性抗体和pd-1轴抑制剂的组合添加另一种旨在重新引导t细胞对抗晚期实体瘤的肿瘤细胞的治疗剂，可能更成功的是将重定向到肿瘤细胞的治疗剂添加到其他免疫细胞，尤其是巨噬细胞或巨噬细胞和天然杀伤(nk)细胞。
18.本发明提供了新的ceaxcd3双特异性抗体，其设计方式使得它们可以与重定向巨噬细胞以及nk细胞的ceaxcd47双特异性抗体平行施用以对抗表达cea的实体瘤。靶向至表达cea的肿瘤的t细胞和巨噬细胞和nk细胞的联合攻击为卓越功效/表达cea的肿瘤细胞的杀伤和吞噬作用提供了相当大的机会。
19.迄今为止，实体瘤中car t细胞的令人失望的结果可能有一个简单的解释-穿透实体瘤并分布在其中的car t细胞数量还不够。这在大多数血液系统恶性肿瘤中肯定是不同的；car t细胞可以很好地接近肿瘤细胞，这解释了在这些恶性肿瘤中的高功效与在实体瘤中令人失望的功效相比较的差异。此外，实体瘤的肿瘤微环境(tme)(其主要是强烈免疫抑制性的)可能会严重抑制car t细胞。
20.本发明提供了新型双特异性抗-ceaxcd3抗体，其具有高功效、scea对功效的低影响、与除ceacam5(＝cea)之外的其他ceacam的低交叉反应性或无交叉反应性和因此降低的毒性、低免疫原性、与ceaxcd47抗体平行联合治疗的机会和有价值的药代动力学特性。


技术实现要素：

21.在一个实施方案中，本发明涉及双特异性抗体(也称为“bsab ceaxcd3”或“ceaxcd3双特异性抗体”)，其包含特异性结合人ceacam5(也称为“cea”)的第一结合部分和特异性结合人cd3ε(也称为“cd3”)的第二结合部分。
22.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于所述抗体对于第一结合部分是单价
的并且对于第二结合部分是单价的。
23.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于恒定和可变框架区序列是人的。
24.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于第一和第二结合部分各自包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
25.在一个实施方案中，双特异性抗体具有包含重链的第一结合部分和包含重链的第二结合部分，其中每个结合部分中的重链是相同的(即共同重链)。在一个实施方案中，共同重链可变区包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3作为cdr。在一个实施方案中，共同重链可变区是seq id no：1。在一个实施方案中，共同恒定重链是seq id no：30。在一个实施方案中，共同重链是seq id no：43。在一个实施方案中，共同重链是seq id no：44。在一个实施方案中，共同重链是seq id no：45。
26.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于在第一结合部分和第二结合部分中包含作为重链的共同重链，在第一结合部分中包含作为轻链的κ轻链，并且在第二结合部分中包含作为轻链的λ轻链。在一个实施方案中，第二结合部分的轻链是seq id no：28，并且第二结合部分的重链是seq id no：45(例如ab1和ab-1l3-1/n衍生的双特异性抗体，如ab13l3-1/n、ab14l3-1/n、ab15l3-1/n、ab17l3-1/n、ab20l3-1/n、ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n；cdr和vl序列见序列表)。
27.ab13、14、15等表示本发明的双特异性抗体的第一结合部分(抗ceacam5抗体臂)，以及l3-1表示本发明的双特异性抗体的第二结合部分(抗cd3抗体臂，也称为1a4)。任何abxx抗cea臂可与l3-1抗cd3臂组合形成双特异性抗体：例如abxxl3-1表示根据本发明的ceaxcd3双特异性抗体，其包含wt higg1 fc部分；abxxl3-1/d表示根据本发明的ceaxcd3双特异性抗体，其包含携带l234a l235a突变的higg1 fc部分；abxxl3-1/n表示根据本发明的ceaxcd3双特异性抗体，其包含携带l234a l235a p329a突变的higg1 fc部分。
28.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于在第一结合部分和第二结合部分中包含作为重链的共同重链，在第一结合部分中包含作为轻链可变区的λ型区和作为轻链恒定区的κ型区(“杂合形式轻链”)，并且在第二结合部分中包含作为轻链的λ轻链(例如l3-1ab8 h-ck5/d参见图2和图2的描述)。
29.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于在第一结合部分和第二结合部分中包含作为重链的共同重链，在第一结合部分中包含作为轻链可变区的λ型区和作为轻链恒定区的λ型区，并且在第二结合部分中包含作为轻链可变区的λ型区和作为轻链恒定区的κ型区(“杂合形式轻链”)；例如ab8l3-1 h-ck5/d。
30.本发明的双特异性抗体对除ceacam5之外的ceacam家族成员显示出低结合/交叉反应性。在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于与在相同实验条件下结合wt peak细胞(即未转染的peak细胞)的mfi值相比，结合表达选自ceacam1、ceacam3、ceacam4、ceacam6、ceacam7、ceacam8、ceacam16、ceacam18、ceacam19、ceacam20和ceacam21的ceacam的peakrapid细胞(crl-2828
tm
)的mfi值不超过2倍。在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于与在相同实验条件下结合wt peak细胞的mfi值相比，结合表达选自ceacam1、ceacam3、ceacam4、ceacam6和ceacam8的ceacam的peakrapid细胞的mfi值不超过2倍。在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于与在相同实验条件下结合wt peak细胞的mfi值相比，结合表达ceacam8的peakrapid细胞的mfi值不超过2倍。用于转染peak细胞和测
量抗体与这些peak细胞结合的实验程序在实施例1和5中进行了描述。
31.在一个实施方案中，双特异性抗体以0.5nm至50nm的ec50值结合mkn-45细胞(dsmz no：acc 409)。在一个实施方案中，双特异性抗体以0.5nm至30nm的ec50值结合mkn-45细胞。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于在200nm、1000nm和5000nm下与mkn-45细胞结合的mfi值是用tcb2014获得的mfi值的至少两倍。结合测定描述于实施例7a中。在一个实施方案中，在含有人pbmc的测定中测量的杀伤肿瘤细胞系mkn-45的本发明的双特异性抗体的ec50比针对tcb2014测量的ec50低40％或更多。在一个实施方案中，在含有人pbmc的测定中测量的杀伤肿瘤细胞系ls-174t的本发明的双特异性抗体的ec50比针对tcb2014测量的ec50低40％或更多。
32.在一个实施方案中，在含有人pbmc的测定中双特异性抗体以浓度依赖性方式杀伤ls174t细胞，ec50值为0.01至10nm。在一个实施方案中，在含有人pbmc的测定中双特异性抗体以浓度依赖性方式杀伤ls174t细胞，ec50值为0.01至1nm。
33.用于测量cea阳性细胞的t细胞重新靶向的裂解/杀伤的测定法描述于实施例8中。
34.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，与在相同实验条件下没有可溶性ceacam5的裂解的ec50值相比，在5μg/ml可溶性ceacam5存在下在同一测定中(杀伤cea阳性ls174t肿瘤细胞)的ec50值增加不超过20倍，在一个实施方案中不超过15倍，并且在一个实施方案中不超过10倍。
35.在另一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，与在相同实验条件下没有可溶性ceacam5的裂解的ec50值相比，在1μg/ml可溶性ceacam5存在下在同一测定中的ec50值增加不超过10倍，在一个实施方案中不超过5倍。
36.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，与相同实验条件下媒介物组中的肿瘤体积生长相比，所述双特异性抗体在hpaf-ii模型中直到第18天将肿瘤体积生长抑制25％或更多。在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于，与相同实验条件下的tcb2014相比，所述双特异性抗体在hpaf-ii模型中直到第18天对肿瘤体积生长的抑制相似且无统计学差异。实施例9a中描述了小鼠肿瘤模型。
37.在一个实施方案中，双特异性抗体在fc结构域的每个亚基中包含减少与活化fc受体的结合和/或减少效应功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是l234a和l235a和/或选自p329a、p329g和p329r(kabat eu索引编号)的p329的取代。在一个实施方案中，双特异性抗体在fc结构域的每个亚基中包含氨基酸取代l234a和l235a和p329a(kabat eu索引编号)。l234a和l235a(lala)是指第234/235位的氨基酸亮氨酸被丙氨酸取代。p329a(pa)是指第329位的氨基酸脯氨酸被丙氨酸取代。
38.在一个实施方案中，双特异性抗体包含共同重链。在一个实施方案中，双特异性抗体包含共同重链，其包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3作为cdr。在一个实施方案中，双特异性抗体在第二结合部分中包含含有seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3作为cdr的轻链区。
39.在一个实施方案中，双特异性抗体在第一结合部分中包含seq id no：39的区域作为轻链恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体在第一结合部分中包含seq id no：41的区域作为轻链恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体在第一结合部分中包含seq id no：58的区域作为轻链恒定区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含seq id no：43的共同
重链或seq id no：44的共同重链或seq id no：45的共同重链。在一个实施方案中，双特异性抗体在第一结合部分中包含作为轻链恒定区的seq id no：39的区域和seq id no：45的共同重链。
40.在一个实施方案中，双特异性抗体在第二结合部分中包含作为轻链的选自seq id no：25、26、27、28和29或选自seq id no：67、68、69、70和71的杂合形式轻链(lc)组的轻链。
41.在一个实施方案中，双特异性抗体在第一结合部分包含作为轻链恒定区的seq id no：39的区域、seq id no：45的共同重链合以及在第二结合部分中包含seq id no：28的轻链。
42.在一个实施方案中，双特异性抗体与抗cea抗体竞争，所述抗cea抗体选自：抗cea抗体，其包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：48和49的vl和vh(抗cea抗体medi)，包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：46和47的vl和vh(抗体sm3e)，包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：56和57的vl和vh(拉贝妥珠单抗(labetuzumab)(lab))，包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：50和51的vl和vh(sar)，包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：54和55的vl和vh(t86.66)，并且包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：52和53的vl和vh(ch1a1a)。还参见图1和实施例5c)。
43.可用作根据本发明的双特异性抗体中的cea vl或cl区并与medi竞争结合重组cea的抗体的实例是抗cea抗体ab1和通过ab1的前导优化获得的抗体(实验方法参见实施例11)。抗cea抗体ab13、14、15、17、20、54、60、66、71、72、73和相应的双特异性抗ceaxcd3抗体ab13l3-1、ab14l3-1、ab15l3-1、ab17l3-1、ab20l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1和ab73l3-1以与抗体ab1 rsp.ab1l3-1相同的方式竞争。可用作根据本发明的双特异性抗体中的cea vl或cl区并与sm3e竞争结合重组cea的抗体的实例是抗cea抗体ab8和使用简并寡核苷酸通过ab8的寡核苷酸定向诱变获得的抗体。可用作根据本发明的双特异性抗体中的cea vl或cl区并与t84.66竞争结合重组cea的抗体的实例是抗cea抗体1b4和使用简并寡核苷酸通过1b4的寡核苷酸定向诱变获得的抗体。
44.可用作根据本发明的双特异性抗体中的cea vl或cl区但不与任何参考抗体竞争结合重组cea的抗体的实例是抗cea抗体c11和使用简并寡核苷酸通过c11的寡核苷酸定向诱变获得的抗体。
45.ab1是具有hc seq id no：43和κlc seq id no：40的抗cea抗体，分别由seq id no：80和78中所示的核酸序列编码。
46.ab8是具有hc seq id no：43和λlc seq id no：42的抗cea抗体，分别由seq id no：80和79中所示的核酸序列编码。
47.1b4是具有hc seq id no：43和λlc seq id no：74的抗cea抗体，分别由seq id no：80和77中所示的核酸序列编码。
48.c11是具有hc seq id no：43和κlc seq id no：73的抗cea抗体，分别由seq id no：80和76中所示的核酸序列编码。
49.可用作κ轻链的cea轻链是seq id no：40。可用作κ轻链的cea轻链是seq id no：73。可用作λ轻链的cea轻链是seq id no：74，可用作杂合κ轻链的cea轻链是seq id no：75。
50.在一个实施方案中，双特异性抗体在fc结构域的每个亚基中包含最多三个氨基酸取代，其降低与活化fc受体的结合和/或效应功能，其中所述氨基酸取代是l234a、l235a和
选自p329a、p329g和p329r(kabat eu索引编号)的p329的取代。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的共同重链是seq id no：43、44或45。在一个实施方案中，根据本发明的抗体的共同重链是seq id no：45(l234a、l235a和p329a)。
51.在一个实施方案中，双特异性抗体显示出一种或多种选自以下的特性：a)以0.5nm至50nm的ec50值结合mkn-45细胞，b1)与抗cea抗体竞争，该抗cea抗体包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：48和49的vl和vh(medi)，或b2)与抗cea抗体竞争，该抗cea抗体包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：46和47的vl和vh(sm3e)，或b3)与抗cea抗体竞争，该抗cea抗体包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：54和55的vl和ch(t84.66)，或b4)不与任何工具抗体(对于工具抗体参见实施例5c)竞争，c)在fc结构域的每个亚基中包含降低与活化fc受体的结合和/或效应功能的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是l234a和l235a和选自p329a、p329g和p329r(kabat eu索引编号)的p329的取代，d)在含有人pbmc的测定中以浓度依赖性方式杀伤mkn-45、hpaf-ii和/或ls174t细胞，ec50值为0.01至10nm。
52.在一个实施方案中，双特异性抗体显示一种或多种选自以下的特性：
53.a)与mkn-45细胞结合，ec50值为0.5nm至50nm，
54.b)在含有人pbmc的测定中以浓度依赖性方式杀伤mkn-45、hpaf-ii或ls174t细胞，ec50值为0.01至10nm，
55.c)与表达ceacam5的peak细胞结合，但不与表达ceacam8的peak细胞交叉反应，
56.d)当ls174t肿瘤细胞用作靶细胞时，tdcc测定(实施例8)中的杀伤ec50在1μg/ml的scea的存在下增加不超过5倍，
57.e)与对照组(仅媒介物)相比，hpaf-ii模型中的肿瘤生长抑制25％或更多，
58.f)与包含作为vl和vh结构域的序列seq id no：48和49的vl和vh(medi)的抗cea抗体竞争，和
59.g)在fc结构域的每个亚基中包含氨基酸取代l234a、l235a和p329a(kabat eu索引编号)。
60.在一个实施方案中，双特异性抗体显示出a)至d)的特性。在一个实施方案中，双特异性抗体显示出a)至f)的所有特性。在一个实施方案中，双特异性抗体显示出a)至d)和g)的特性。在一个实施方案中，双特异性抗体显示出a)至d)和f)和g)的特性。在一个实施方案中，双特异性抗体显示a)至g)的所有特性。
61.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
62.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链(chc)并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
63.b)第一结合部分包括
64.i)κ轻链恒定区(cl)和轻链可变区(vl)，包括seq id no：32的cdrl1、seq id no：33的cdrl2和seq id no：34的cdrl3作为cdrl1、cdrl2和cdrl3，或通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：31的轻链可变区，
65.c)第二结合部分包含轻链可变区，其包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
66.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
67.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
68.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
69.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
70.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
71.d)第二结合部分包含λ轻链恒定区。
72.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：25、26、27、28和29的轻链。
73.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
74.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的重链，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
75.b)第一结合部分包含轻链可变区(vl)，其包含作为cdr的通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：32并且包含最多四个氨基酸取代的cdrl1，通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：33并包含最多四个氨基酸取代的cdrl2，通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：34并包含最多四个氨基酸取代的cdrl3，
76.c)第二结合部分包含轻链可变区，其包含seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3作为cdrl1、cdrl2和cdrl3。
77.此类双特异性抗体是但不限于双特异性抗ceaxcd3抗体ab13l3-1、ab14l3-1、ab15l3-1、ab17l3-1、ab20l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1和ab73l3-1。
78.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于：
79.a)第一结合部分包含重链可变区vh，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
80.b)第一结合部分包含作为轻链可变区的轻链可变区，其包含选自以下的cdrl组
81.b1)seq id no：32的cdrl1、seq id no：33的cdrl2和seq id no：34的cdrl3，
82.b2)seq id no：81的cdrl1、seq id no：82的cdrl2和seq id no：83的cdrl3，
83.b3)seq id no：84的cdrl1、seq id no：85的cdrl2和seq id no：86的cdrl3，
84.b4)seq id no：87的cdrl1、seq id no：88的cdrl2和seq id no：89的cdrl3，
85.b5)seq id no：90的cdrl1、seq id no：91的cdrl2和seq id no：92的cdrl3，
86.b6)seq id no：93的cdrl1、seq id no：94的cdrl2和seq id no：95的cdrl3，
87.b7)seq id no：96的cdrl1、seq id no：97的cdrl2和seq id no：98的cdrl3，
88.b8)seq id no：99的cdrl1、seq id no：100的cdrl2和seq id no：101的cdrl3，
89.b9)seq id no：102的cdrl1、seq id no：103的cdrl2和seq id no：104的cdrl3，
90.b10)seq id no：105的cdrl1、seq id no：106的cdrl2和seq id no：107的cdrl3，
91.b11)seq id no：108的cdrl1、seq id no：109的cdrl2和seq id no：110的cdrl3，和
92.b12)seq id no：111的cdrl1、seq id no：112的cdrl2和seq id no：113的cdrl3，和
93.c)第二结合部分包含重链可变区vh，其包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，和轻链可变区vl，其包含seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3。
94.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于：
95.a)第一结合部分包含重链可变区vh，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
96.b)第一结合部分包含作为轻链可变区的轻链可变区，其包含选自以下的cdrl组
97.b1)seq id no：90的cdrl1、seq id no：91的cdrl2和seq id no：92的cdrl3，
98.b2)seq id no：96的cdrl1、seq id no：97的cdrl2和seq id no：98的cdrl3，
99.b3)seq id no：99的cdrl1、seq id no：100的cdrl2和seq id no：101的cdrl3，
100.b4)seq id no：102的cdrl1、seq id no：103的cdrl2和seq id no：104的cdrl3，
101.b5)seq id no：105的cdrl1、seq id no：106的cdrl2和seq id no：107的cdrl3，和
102.b6)seq id no：111的cdrl1、seq id no：112的cdrl2和seq id no：113的cdrl3，和
103.c)第二结合部分包含重链可变区vh，其包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，和轻链可变区vl，其包含seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3。
104.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于：
105.a)第一结合部分包含重链可变区vh，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
106.b)第一结合部分包含作为轻链可变区的轻链可变区，其包含选自以下的cdrl组
107.b1)seq id no：90的cdrl1、seq id no：91的cdrl2和seq id no：92的cdrl3，
108.b2)seq id no：105的cdrl1、seq id no：106的cdrl2和seq id no：107的cdrl3，和
109.b3)seq id no：111的cdrl1、seq id no：112的cdrl2和seq id no：113的cdrl3，和
110.c)第二结合部分包含重链可变区vh，其包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，和轻链可变区vl，其包含seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3。
111.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于包含
112.a)在第一结合部分中的与seq id no：1具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性的重链可变区vh，其包含seq id no：2的cdr1、seq id no：3的cdr2和seq id no：4的cdr3，和
113.b)轻链可变区vl，其选自
114.b1)与seq id no：31具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：32的cdrl1、seq id no：33的cdrl2和seq id no：34的cdrl3的轻链可变区vl，
115.b2)与seq id no：114具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：81的cdrl1、seq id no：82的cdrl2和seq id no：83的cdrl3的轻链可变区vl，
116.b3)与seq id no：115具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：84的cdrl1、seq id no：85的cdrl2和seq id no：86的cdrl3的轻链可变区vl，
117.b4)与seq id no：116具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：87的cdrl1、seq id no：88的cdrl2和seq id no：89的cdrl3的轻链可变区vl，
118.b5)与seq id no：117具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：90的cdrl1、seq id no：91的cdrl2和seq id no：92的cdrl3的轻链可变区vl，
119.b6)与seq id no：118具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：93的cdrl1、seq id no：94的cdrl2和seq id no：95的cdrl3的轻链可变区vl，
120.b7)与seq id no：119具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：96的cdrl1、seq id no：97的cdrl2和seq id no：98的cdrl3的轻链可变区vl，
121.b8)与seq id no：120具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：99的cdrl1、seq id no：100的cdrl2和seq id no：101的cdrl3的轻链可变区vl，
122.b9)与seq id no：121具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：102的cdrl1、seq id no：103的cdrl2和seq id no：104的cdrl3的轻链可变区vl，
123.b10)与seq id no：122具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：105的cdrl1、seq id no：106的cdrl2和seq id no：107的cdrl3的轻链可变区vl，和
124.b11)与seq id no：123具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：108的cdrl1、seq id no：109的cdrl2和seq id no：110的cdrl3的轻链可变区vl，和
125.b12)与seq id no：124具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：111的cdrl1、seq id no：112的cdrl2和seq id no：113的cdrl3的轻链可变区vl，
126.c)第二结合部分的与seq id no：1具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：2的cdr1、seq id no：3的cdr2和seq id no：4的cdr3的重链可变区vh，以及与seq id no：17具有97％、98％、99％或100％的氨基酸同一性并包含seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3的轻链可变区vl。
127.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于包含
128.a)在第一结合部分中的重链可变区vh seq id no：1，和
129.b)轻链可变区vl，其选自
130.b1)seq id no：31的轻链可变区vl，
131.b2)seq id no：114的轻链可变区vl，
132.b3)seq id no：115的轻链可变区vl，
133.b4)seq id no：116的轻链可变区vl，
134.b5)seq id no：117的轻链可变区vl，
135.b6)seq id no：118的轻链可变区vl，
136.b7)seq id no：119的轻链可变区vl，
137.b8)seq id no：120的轻链可变区vl，
138.b9)seq id no：121的轻链可变区vl，
139.b10)seq id no：122的轻链可变区vl，
140.b11)seq id no：123的轻链可变区vl，和
141.b12)seq id no：124的轻链可变区vl，和
142.c)在第二结合部分中的seq id no：1的重链可变区vh和seq id no：17的轻链可变区vl。
143.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于包含
144.a)在第一结合部分中的重链可变区vh seq id no：1，和
145.b)轻链可变区vl，其选自
146.b1)seq id no：117的轻链可变区vl，
147.b2)seq id no：119的轻链可变区vl，
148.b3)seq id no：120的轻链可变区vl，
149.b4)seq id no：121的轻链可变区vl，
150.b5)seq id no：122的轻链可变区vl，和
151.b6)seq id no：124的轻链可变区vl，和
152.c)在第二结合部分中的seq id no：1的重链可变区vh和seq id no：17的轻链可变区vl。
153.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于包含
154.a)在第一结合部分中的重链可变区vh seq id no：1，和
155.b)轻链可变区vl，其选自
156.b1)seq id no：117的轻链可变区vl，
157.b2)seq id no：122的轻链可变区vl，和
158.b3)seq id no：124的轻链可变区vl，和
159.c)在第二结合部分中的seq id no：1的重链可变区vh和seq id no：17的轻链可变区vl。
160.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于在第一结合部分中包含
161.a)重链可变区vh seq id no：1，和
162.b)轻链，其选自：
163.b1)seq id no：40的轻链
164.b2)seq id no：125的轻链，
165.b3)seq id no：126的轻链，
166.b4)seq id no：127的轻链，
167.b5)seq id no：128的轻链，
168.b6)seq id no：129的轻链，
169.b7)seq id no：130的轻链，
170.b8)seq id no：131的轻链，
171.b9)seq id no：132的轻链，
172.b10)seq id no：133的轻链，和
173.b11)seq id no：134的轻链，和
174.b12)seq id no：135的轻链，和
175.c)在第二结合部分中的seq id no：1的重链可变区vh和seq id no：28的轻链。
176.在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其特征在于在第一
结合部分中包含
177.a)共同重链，其选自：
178.a1)seq id no：43的重链，
179.a2)seq id no：44的重链，或
180.a3)seq id no：45的重链，和
181.b)轻链，其选自：
182.b1)seq id no：40的轻链，
183.b2)seq id no：125的轻链，
184.b3)seq id no：126的轻链，
185.b4)seq id no：127的轻链，
186.b5)seq id no：128的轻链，
187.b6)seq id no：129的轻链，
188.b7)seq id no：130的轻链，
189.b8)seq id no：131的轻链，
190.b9)seq id no：132的轻链，
191.b10)seq id no：133的轻链，
192.b11)seq id no：134的轻链，或
193.b12)seq id no：135的轻链，和
194.c)在第二结合部分中的seq id no：28的轻链。
195.在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体(ab17l3-1/n)包含seq id no：45的共同重链(/n)和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链(1a4 lc，分别为l3-1)，和在第一结合部分中作为轻链的seq id no：128的轻链(ab17)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体(ab71l3-1/n)包含seq id no：45的共同重链(/n)和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链(l3-1)和在第一结合部分中的作为轻链的seq id no：133的轻链(ab71)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体(ab73l3-1/n)包含seq id no：45的共同重链(/n)和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链(l3-1)和在第一结合部分中的作为轻链的seq id no：135的轻链(ab73)。
196.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
197.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
198.b)第一结合部分包括
199.i)λ轻链恒定区(cl)和
200.ii)轻链可变区(vl)，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的seq id no：36的cdrl1、seq id no：37的cdrl2和seq id no：38的cdrl3或通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：35的轻链可变区，
201.c)第二结合部分包含轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
202.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
203.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
204.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
205.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
206.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
207.d)第二结合部分包含杂合κ链恒定区。
208.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：67、68、69、70和71的轻链
209.在一个实施方案中，第二结合部分可以包含seq id no：41的λ轻链恒定区作为轻链恒定区；在这种情况下，第一结合部分在一个实施方案中包含seq id no：58的杂合κ轻链区作为轻链恒定区。在一个实施方案中，携带杂合轻链恒定区的臂基于bsab的整体性质，包括但不限于稳定性和生产力。
210.在一个实施方案中，第一结合部分的轻链可变区通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：35，共同重链是seq id no：45，并且共同重链的可变区是seq id no：1。
211.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
212.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
213.b)第一结合部分包括
214.i)κ轻链恒定区(cl)，和
215.ii)轻链可变区(vl)，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的seq id no：64的cdrl1、seq id no：65的cdrl2和seq id no：66的cdrl3或通过寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：63的轻链可变区，
216.c)第二结合部分包含轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
217.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
218.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
219.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
220.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
221.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
222.d)第二结合部分包含λ轻链恒定区。
223.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：25、26、27、28和29的轻链。
224.在本发明的一个实施方案中，第一结合部分的轻链可变区通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：63，共同重链是seq id no：45。
225.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
226.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
227.b)第一结合部分包含λ轻链恒定区(cl)和轻链可变区(vl)，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的seq id no：60的cdrl1、seq id no：61的cdrl2和seq id no：62的cdrl3或通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：59的轻链可变区，
228.c)第二结合部分包含轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
229.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
230.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
231.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
232.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
233.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
234.d)第二结合部分包含杂合κ链恒定区。
235.在本发明的另一个实施方案中，第二结合部分包含seq id no：41的λ轻链恒定区作为轻链恒定区；在该情况下，第一结合部分在一个实施方案中包含seq id no：58的杂合κ轻链恒定区作为轻链恒定区。携带杂合轻链恒定区的臂的选择基于最终的bsab的总体性质，包括但不限于稳定性和生产力。
236.在一个实施方案中，第一结合部分的轻链可变区通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变衍生自seq id no：59。
237.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
238.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链)并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
239.b)第一结合部分包含人κ型轻链恒定区和人κ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的具有0、1、2、3或4个氨基酸的取代的seq id no：32的cdrl1、具有0、1、2、3或4个氨基酸的取代的seq id no：33的cdrl2以及具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：34的cdrl3，
240.c)第二结合部分包含人λ型轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
241.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
242.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
243.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
244.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
245.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
246.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：25、26、27、28和29的轻链。
247.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一
结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
248.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
249.b)第一结合部分包含人λ型轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的cdrl组，其选自具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：36的cdrl1，具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：37的cdrl2，以及具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：38的cdrl3，
250.c)第二结合部分包含杂合κ轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
251.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
252.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
253.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
254.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
255.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
256.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：67、68、69、70和71的轻链。
257.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
258.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
259.b)第一结合部分包含人λ型轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的cdrl组，其选自具有0、1、2、3或4个氨基酸的取代的seq id no：60的cdrl1，具有0、1、2、3或4个氨基酸的取代的seq id no：61的cdrl2，以及具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：62的cdrl3，和
260.c)第二结合部分包含人κ型轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自：
261.i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
262.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
263.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
264.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
265.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
266.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：67、68、69、70和71的轻链。
267.在一个实施方案中，双特异性抗体的特征在于包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其特征在于
268.a)第一结合部分和第二结合部分各自包含作为重链的共同重链并且包含作为可变区的可变区，其包含作为cdrh1、cdrh2和cdrh3的seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的
cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
269.b)第一结合部分包含人κ型轻链恒定区和人κ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的cdrl组，其选自具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：64的cdrl1，具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：65的cdrl2，以及具有0、1、2、3、4或5个氨基酸的取代的seq id no：66的cdrl3
270.c)第二结合部分包含人λ型轻链恒定区和人λ型轻链可变区，包含作为cdrl1、cdrl2和cdrl3的一组cdr，其选自i)seq id no：6的cdrl1、seq id no：7的cdrl2和seq id no：8的cdrl3，
271.ii)seq id no：10的cdrl1、seq id no：11的cdrl2和seq id no：12的cdrl3，
272.iii)seq id no：14的cdrl1、seq id no：15的cdrl2和seq id no：16的cdrl3，
273.iv)seq id no：18的cdrl1、seq id no：19的cdrl2和seq id no：20的cdrl3，和
274.v)seq id no：22的cdrl1、seq id no：23的cdrl2和seq id no：24的cdrl3。
275.在一个实施方案中，c)中的第二结合部分包含选自seq id no：25、26、27、28和29的轻链。
276.在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3ε的第二结合部分，其中：
277.a)第一结合部分包含重链可变区(vh)，其包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3，
278.b)第一结合部分包含轻链可变区(vl)，其包含cdrl组，其中cdrl1具有seq id no：136的共有序列，cdrl2具有seq id no：137的共有序列，以及cdrl3具有seq id no：138的共有序列，并且
279.c)第二结合部分包含vh，该vh包含seq id no：2的cdrh1、seq id no：3的cdrh2和seq id no：4的cdrh3。
280.在一个实施方案中，第一结合部分包含作为可变轻链框架序列的seq id no：31的框架序列。在一个实施方案中，第一结合部分包含作为可变轻链框架序列的seq id no：35的框架序列。在一个实施方案中，第一结合部分包含作为可变轻链框架序列的seq id no：59的框架序列。在一个实施方案中，第一结合部分包含作为可变轻链框架序列的seq id no：63的框架序列。
281.在一个实施方案中，与cea特异性结合的第一结合部分包含作为重链可变区的氨基酸序列seq id no：1的重链可变区和作为轻链可变区的与选自seq id no：31或seq id no：35、seq id no：59或seq id no：63的氨基酸序列具有98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和与cd3特异性结合的第二结合部分包含作为重链可变区的氨基酸序列seq id no：1的重链可变区和作为轻链可变区的选自seq id no：5、seq id no：9、seq id no：13、seq id no：17和seq id no：21的氨基酸序列的轻链可变区。
282.在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含对cea特异的第一结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域，以及对cd3ε特异的第二结合部分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域。
283.在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含对cea特异的第一结合部分，其包含λ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域，以及对cd3ε特异的第二结合部
分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域。
284.在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于包含对cea特异的第一结合部分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域，以及对cd3ε特异的第二结合部分，其包含λ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
285.在一个具体实施方案中，与天然/野生型igg1 fc结构域相比，fc结构域表现出对fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应功能。在某些实施方案中，fc结构域被工程化以与非工程化的fc结构域相比具有对fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应功能。在一个实施方案中，fc结构域包含减少与一种或多种fc受体的结合和/或减少效应功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，这样的一个或多个取代选自pro238、asp265、asp270、asn297(失去fc碳水化合物)、pro329、leu234、leu235、gly236、gly237、ile253、ser254、lys288、thr307、gln311、asn434和his435(shields,r.l.等人,j.biol.chem.276(2001)6591-6604；lund,j.等人,faseb j.9(1995)115-119；morgan,a.等人,immunology 86(1995)319-324；ep 0 307 434)。在一个实施方案中，关于fcr结合，抗体是具有s228、l234、l235和/或d265突变的igg4亚类或igg1或igg2亚类，和/或包含pva236突变。在一个实施方案中，fc结构域中的突变是s228p、l234a、l235a、l235e和/或pva236。在另一个实施方案中，fc结构域中的突变在igg4 s228p中和在igg1 l234a和l235a中。在一个实施方案中，减少与一种或多种fc受体的结合和/或减少效应功能的fc结构域中的一个或多个氨基酸取代位于选自l234、l235和p329(kabat eu索引编号)的一个或多个位置。在特定实施方案中，fc结构域的每个亚基包含两个氨基酸取代，其减少与fc受体的结合和/或减少效应功能，其中所述氨基酸取代是l234a和l235a(kabat eu索引编号)。在特定实施方案中，fc结构域的每个亚基包含三个氨基酸取代，其减少与fc受体的结合和/或减少效应功能，其中所述氨基酸取代是l234a、l235a和p329a(kabat eu索引编号)。在一个这样的实施方案中，fc结构域是igg1 fc结构域，特别是人igg1 fc结构域(kabat eu索引编号)。在一个实施方案中，fc结构域是igg4亚类，并且在一个实施方案中是具有突变s228p的igg4亚类。
286.在一个实施方案中，fc受体是fcγ受体。在一个实施方案中，fc受体是人fc受体。在一个实施方案中，fc受体是活化fc受体。在一个具体实施方案中，fc受体是人fcγriiia、fcγri和/或fcγriiia。在一个实施方案中，效应功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，但并非仅限于adcc。
287.本发明的一个实施方案是用于第二结合部分的seq id no：58的κcl区作为构建包含seq id no：43、44或45的共同重链的双特异性抗体中的cl区，以及seq id no：41的λcl区作为第一结合部分中的cl区。
288.本发明的一个实施方案是用于特异性结合cd3的第二结合部分的seq id no：58的κcl区作为构建包含seq id no：43、44或45的共同重链的根据本发明的双特异性抗体中的cl区，以及seq id no：41的λcl区作为与ceacam5特异性结合的第一结合部分中的cl区。
289.本发明的一个实施方案是用于特异性结合cd3的第二结合部分的seq id no：58的κcl区作为构建包含seq id no：43、44或45的共同重链和seq id no：5、9、13、17或21的可变轻链的根据本发明的双特异性抗体中的cl区，以及seq id no：41的λcl区作为与ceacam5特异性结合的第一结合部分中的cl区。
290.本发明的另一个实施方案是寡核苷酸，其选自seq id no：76、77、78和79，用于通
过使用seq id no：31、35、59和63的相应轻链可变区的简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变进行抗体亲和力成熟。
291.在另一个方面，提供了一种产生本发明的双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：a)在适合于表达双特异性抗体的条件下培养本发明的宿主细胞和b)回收双特异性抗体。本发明还包括通过本发明的方法产生的双特异性抗体。
292.本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体和药学上可接受的承载体。本发明还包括使用本发明的双特异性抗体和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供了用作药物的本发明的双特异性抗体或药物组合物。一方面，提供了根据本发明的双特异性抗体或药物组合物，用于治疗有需要的个体的疾病。在一个具体实施方案中，该疾病是癌症。
293.还提供了本发明的双特异性抗体，其用于制备用于治疗有需要的个体的疾病的药物；以及治疗个体疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学上可接受的形式的根据本发明的双特异性抗体。在一个具体实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选地是哺乳动物，特别是人。
294.本发明还提供了一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的方法，其包括在t细胞，特别是细胞毒性t细胞的存在下，使靶细胞与本发明的双特异性抗体接触。
295.本发明的另一个实施方案是根据本发明的双特异性抗体用于制备用于治疗患有表达cea的癌症的受试者的药物。
296.本发明的另一个实施方案是根据本发明的双特异性抗体，其用于制备根据本发明的药物，其特征在于癌症选自结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、食道癌、胃/食道结合部癌、胰腺癌和乳腺癌。
297.本发明的另一个实施方案是根据本发明的双特异性抗体，其用于与抗cd47抗体以同时、单独或顺序组合的方式使用。在一个实施方案中，抗cd47抗体是莫洛利单抗(magrolimab)、alx148或tti-621和/或tti-622。
298.本发明的另一个实施方案是根据本发明的双特异性抗体，用于与包含与人ceacam5特异性结合的第三结合部分和与人cd47特异性结合的第四结合部分的第二双特异性抗体以同时、单独或顺序组合的方式用于治疗患有表达cea的癌症的受试者。
299.此类第二双特异性ceaxcd47抗体描述于pct/ib2019/054559和us16/428,359。
300.本发明的另一个实施方案是根据本发明使用的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于将根据本发明的双特异性抗体和第二双特异性ceaxcd47抗体以6至15天的间隔交替施用至所述受试者，但不限于这样的间隔。
301.本发明的另一个实施方案是根据本发明的第一双特异性抗体(其包含根据本发明的特异性结合人ceacam5的第一结合部分和特异性结合人cd3的第二结合部分)以及第二双特异性抗体ceaxcd47，其用于根据本发明治疗癌症，其特征在于所述癌症为结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌。
302.本发明的另一个实施方案是包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与如上定义的所述第二ceaxcd47双特异性抗体竞争用于治疗患有表达cea的癌症的受试者。
303.本发明的另一个实施方案是用于治疗被诊断患有肿瘤(癌症)，尤其是实体瘤，尤
其是表达cea的实体癌，尤其是结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌的人类患者的方法，其包括向人类患者施用有效量的根据本发明的双特异性抗体和如pct/ib2019/054559和us16/428,359中描述的针对cea和cd47的第二双特异性抗体，该方法随后包括：
304.向患者施用0.1至30mg/kg、在进一步的实施方案中0.5至10mg/kg、在进一步的实施方案中1至10mg/kg剂量的所述第二抗ceaxcd47抗体，例如每周一次，持续4至12周，
305.向患者施用所述第二抗体q1、q2w、q3w或任选地q4w，
306.在这4至12周之后以及在所述抗ceaxcd47抗体的另外2或3或4个消除半衰期之后，向患者施用0.1至10mg/kg剂量的根据本发明的抗体，
307.向患者施用根据本发明的所述抗体q1、q2w、q3w或任选地q4w，
308.等待根据本发明的所述抗体的2或3或4个消除半衰期，然后
309.任选地重复cea x cd47双特异性抗体施用随后cea x cd3双特异性抗体施用的所述循环并且任选地再次重复该循环。
310.如果本发明的抗体和第二双特异性抗体在与cea的结合方面具有竞争性，则应用这种“交替”方法。
311.在所述cea x cd47双特异性抗体和根据本发明的cea x cd3双特异性抗体不具有竞争性的情况下，该两种双特异性抗体也可以以患者经历治疗有效血浆和组织浓度的方式(“同时方式”)平行施用两种双特异性抗体，例如通过在大约同时向患者施用0.1至30mg/kg、在进一步的实施方案中0.5至10mg/kg、在进一步的实施方案中1至10mg/kg的剂量的cea x cd47双特异性抗体和0.1至10mg/kg的本发明的cea x cd3双特异性抗体，随后以q1w或q2w或q3w或任选地q4w的频率进行这些组合施用中的一种或多种。
312.术语“q1w”是指每周施用一次；q2w表示每两周施用一次，等等。
313.本发明的另一个实施方案是包含根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂或承载体的药物组合物。
314.本发明的另一个优选实施方案是用作药物的包含根据本发明的抗体的药物组合物。
315.本发明的另一个优选实施方案是包含根据本发明的抗体的药物组合物，其用作治疗表达cea的实体瘤病症的药物。
316.本发明的另一个优选实施方案是包含根据本发明的抗体的药物组合物，其用作治疗结直肠癌、nsclc(非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、胰腺癌或乳腺癌的药物。
317.本发明的另一个实施方案是根据本发明的组合物，其特征在于癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌或乳腺癌。
318.本发明的另一个实施方案是根据本发明的抗体用于制备药物组合物。
319.本发明的另一个实施方案是根据本发明的抗体和药学上可接受的赋形剂或承载体用于制备药物组合物。
320.本发明的另一个实施方案是根据本发明的抗体用于制备治疗实体瘤病症的药物。
321.本发明的另一个实施方案是根据本发明的抗体用于治疗结直肠癌、nsclc(非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、胰腺癌或乳腺癌。
322.本发明的另一个方面提供了一种诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使肿瘤
细胞与任何上述实施方案的双特异性抗体接触。在一些实施方案中，肿瘤细胞是结直肠癌细胞、nsclc(非小细胞肺癌)、胃癌细胞、食道癌细胞、胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。
323.在一个实施方案中，细胞裂解由t细胞定向的细胞毒性(tdcc)诱导。
324.本发明的另一方面提供治疗患有表达cea的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。
325.本发明的另一个方面提供治疗患有表达cea的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用与结合至人cea和人cd47的双特异性抗体组合的治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。如果ceaxcd47抗体和ceaxcd3抗体竞争，它们将竞争肿瘤细胞表面的cea受体，每个组合伴侣的受体占有率和功效取决于它们的结合亲和力和血浆浓度，因此难以预测并且如果两种药物的浓度具有不同的消除半衰期和从体内的清除率，还会随时间变化。因此，应按顺序(交替)给予竞争性ceaxcd3和ceaxcd47双特异性抗体。如果ceaxcd3和ceaxcd47双特异性抗体不存在竞争或竞争很小，则它们不仅可以顺序施用，而且可以并行(同时)施用，这很可能是一个优势，因为通过ceaxcd3双特异性抗体与t细胞的结合并且在同时通过ceaxcd47双特异性抗体与巨噬细胞的结合来杀伤肿瘤细胞预计会产生相加作用，或甚至可能产生协同作用，这意味着如果两种药物平行施用，功效提高。
326.本发明的另一方面提供了增加患有表达cea的癌症的受试者的无进展生存期和/或总生存期的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。在一个实施方案中，癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、膀胱癌或另一种表达cea的癌症。
327.在这些方法的某些实施方案中，双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用。在一个实施方案中，受试者是患有结直肠癌或肺癌或胃癌、食道癌或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达cea的癌症的患者。
328.在这些方法的某些实施方案中，本发明的双特异性抗体以每天或每周0.1至100mg/kg体重的剂量以单次剂量或分次剂量或通过连续输注施用至患者。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体以1至20mg/kg的剂量施用至患者。
329.本发明的另一个方面提供了治疗患有表达cea的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用与针对人cea和人cd47的双特异性抗体组合的治疗有效量的任何上述实施方案的双特异性抗体。在这些方法的某些实施方案中，该双特异性抗体与双特异性抗ceaxcd47抗体以同时、单独或顺序组合的方式组合施用。在这些方法的某些实施方案中，双特异性抗ceaxcd47抗体与本发明的抗体以交替模式施用，本发明的抗体和双特异性抗ceaxcd47抗体的施用之间的间隔为6至15天。在某些实施方案中，抗ceaxcd47抗体以每天或每周0.1至100mg/kg体重的剂量以单次剂量或分次剂量或通过连续输注施用至患者。
330.在这些方法的某些实施方案中，双特异性抗体与pd-1轴拮抗剂以同时、单独或顺序组合的方式组合施用。在这些方法的某些实施方案中，双特异性抗体与双特异性抗ceaxcd47抗体和pd-1轴拮抗剂以同时、单独或顺序组合的方式组合施用。在某些实施方案中，pd-1轴拮抗剂以每天或每周0.1至100mg/kg体重的剂量以单次或分次剂量或通过连续输注施用至患者。
331.本发明的另一方面提供增加患有异常表达cea的癌症的受试者的无进展生存时间和/或总生存时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何上述实施方
案的双特异性抗体。在一个实施方案中，癌症是结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌或乳腺癌。
332.在这些方法的某些实施方案中，双特异性抗体与化学疗法或放射疗法组合施用。在一个实施方案中，受试者是患有结直肠癌或肺癌或胃癌、食道癌、或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达cea的癌症的癌症患者。
333.本发明的另一个实施方案提供了用于任何上述治疗方法的根据本发明的双特异性抗体。在一个实施方案中，癌症选自结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌。
334.本发明的另一个实施方案提供编码本文公开的双特异性抗体或其免疫特异性结合ceacam5或cd3ε的结构域(例如，可变轻链区和/或可变重链区)的多核苷酸。在某些方面，本文提供的是包含编码本文所述抗体的轻链或重链的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包含编码包含本文所述抗体的vh或重链cdr的重链的核苷酸序列。多核苷酸可包含编码轻链的核苷酸序列，该轻链包含本文所述抗体的vl或轻链cdr。
335.某些实施方案是包含本文公开的分离的多核苷酸的载体。某些其他实施方案是包含编码本文公开的双特异性抗体的分离的多核苷酸或载体的细胞。在一些实施方案中，细胞选自组织培养中的链霉菌属(streptomyces)、酵母菌、cho、yb/20、ns0、per-c6、hek-293t、nih-3t3、hela、bhk、hep g2、sp2/0、r1.1、b-w、l-m、cos 1、cos 7、bsc1、bsc40、bmt10细胞、植物细胞、昆虫细胞和人类细胞。
336.某些实施方案是制备本文公开的抗体的方法。在一些实施方案中，制备抗体的方法包括使用包含编码本文公开的双特异性抗体的分离的多核苷酸或载体的细胞表达抗体。在一些实施方案中，制备抗体的方法包括培养含有编码本文公开的双特异性抗体的分离的多核苷酸或载体的细胞并分离其中表达的抗体。
附图说明
337.图1：κ/λ(kl)ceaxcd3双特异性抗体中使用的新cea结合剂的表位分仓(epitope binning)(细节在实施例5c中)
338.为了表征本发明的新的cea结合抗体，使用竞争性免疫测定。针对均与ceacam5(cea)结合且结合表位已公布的抗体创建了竞争性阻断谱。sm3e、medi(＝medi-565)、sar、t84.66、拉贝妥珠单抗和ch1a1a是这样的抗体，这些抗体和测定的细节参见实施例5c。
339.图2纯化的双特异性抗体的agilent特征谱
340.在实施例6中描述了新的κλ双特异性ceaxcd3抗体的表达、纯化和分析。在变性和还原条件下通过电泳分析纯化的双特异性抗体。使用agilent 2100生物分析仪，该图显示了对于本发明的κλ抗体ab1l3-1/d(kl ceaxcd3双特异性抗体，具有λcd3 lc seq id no：28和κcea lc seq id no：40和共同的hc seq id no：44)和l3-1ab8 h-ck5/d(杂合kl ceaxcd3双特异性抗体，具有杂合-κcd3 lc seq id no：70和λcea lc seq id no：42和共同的hc seq id no：44)获得的典型结果。y4 l3-1/d是一种双特异性抗体，具有与ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，该抗体经常用于药理学测定中作为对照抗体。
341.图3与cd3
pos jurkat细胞(和cd3
neg tib-153细胞)的结合
342.本发明的kl双特异性抗体ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d与表达cd3的jurkat细胞的浓度依赖性结合。两种kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。y4l3-1/d是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合。右图显示即使在100nm浓度的双特异性抗体下也不与cd3阴性细胞系tib-153结合。
343.图4与cea
pos mkn-45细胞(和cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的结合
344.本发明的kl双特异性抗体ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d与表达cea的mkn-45细胞的浓度依赖性结合。两种kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。y4l3-1/d是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，不与mkn-45细胞结合。右图显示即使在100nm浓度下，在敲除ceacam5后，也不会与mkn-45细胞系结合。
345.图5与cea
pos ls174t细胞的结合
346.本发明的kl双特异性抗体ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d与表达cea的ls174t细胞的浓度依赖性结合。两种kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。y4l3-1/d是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，不与ls174t细胞结合。
347.图6cea
pos mkn-45细胞(和cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的杀伤
348.本发明的kl双特异性抗体ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d对mkn-45细胞的浓度依赖性t细胞重新靶向的杀伤/裂解(实施例8a中描述的测定法)。两种kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。两种kl双特异性抗体均显示出相同的杀伤效力。这是令人惊讶/出乎意料的，因为ab1l3-1/d与mkn-45的结合比l3-1ab8 h-ck5/d的结合弱得多(参见图4)。
349.y4l3-1/d是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，其在高约100倍的浓度下仅显示出非常低的杀伤/裂解效力。
350.右图：所有3种双特异性抗体对cea敲除mkn-45细胞的仅非常低的非特异性杀伤/裂解。
351.图7cea
pos ls-174t的杀伤
352.本发明的kl双特异性抗体ab1l3-1/d和l3-1ab8 h-ck5/d对ls-174t细胞的浓度依赖性t细胞重新靶向的杀伤/裂解(实施例8a中描述的测定)。两种kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。l3-1ab8 h-ck5/d显示出比ab1l3-1/d更强的杀伤效力。l3-1ab8 h-ck5/d与ls-174t细胞的结合比ab1l3-1/d的结合更强力(参见图5)。
353.y4l3-1/d是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，其在高100倍的浓度下仅显示非常低的杀伤/裂解效力。
354.图8单克隆抗cea mab 1b4与不同重组蛋白的结合(elisa)。
355.cea ecd＝cea的细胞外结构域；cea a3b3是cea的a3b3结构域。重组间皮素msln用作对照以测量非特异性结合(对cea的ecd和cea的a3b3结构域不具特异性的结合)。
356.图9单克隆抗cea mab c11与不同重组蛋白的结合(elisa)。
357.cea ecd＝cea的细胞外结构域；cea a3b3是cea的a3b3结构域。重组间皮素msln用作对照以测量非特异性结合(对cea的ecd和cea的a3b3结构域不具特异性的结合)。
358.图10前导优化第1波抗体与cd3
pos jurkat细胞(和cd3
neg tib-153细胞)的结合
359.本发明的kl双特异性抗体ab13l3-1/n、ab14l3-1/n、ab15l3-1/n、ab17l3-1/n和ab20l3-1/n与表达cd3的hut-78细胞的浓度依赖性结合。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。ab1l3-1/n是上述bsab通过前导优化衍生自的亲本kl双特异性抗体。y4l3-1/n是
一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。higg1对应于用作同种型对照的非结合人igg1抗体。右图显示即使在100nm浓度的双特异性抗体下也不会与cd3阴性细胞系jktβ-del结合。方法在实施例7b中描述。
360.图11前导优化第1波抗体与cea
pos mkn-45细胞、hpaf-ii细胞和ls174t(cl-188
tm
)细胞(和cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的结合
361.本发明的kl双特异性抗体ab13l3-1/n、ab14l3-1/n、ab15l3-1/n、ab17l3-1/n和ab20l3-1/n与cea阳性mkn-45(a)；hpaf-ii(c)和ls174t(d)或cea阴性mkn-45_hcea
ko
(b)细胞的浓度依赖性结合。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。ab1l3-1/n是上述bsab通过亲和力成熟衍生自的亲本kl双特异性抗体。y4l3-1/n是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。higg1对应于用作同种型对照的非结合人igg1抗体。图10b显示即使在100nm浓度的双特异性抗体下也不与cea阴性细胞系mkn-45_hcea
ko
细胞结合。在100nm浓度下本发明的抗体与mkn-45和/或hpaf-ii细胞的结合比tcb2014的结合高40％或更多。方法描述于实施例7a。
362.图12前导优化第1波抗体对cea
pos mkn-45、hpaf-ii和ls174t细胞(和cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的杀伤
363.本发明的kl双特异性抗体ab13l3-1/n、ab14l3-1/n、ab15l3-1/n、ab17l3-1/n和ab20l3-1/n对cea阳性mkn-45(a)；hpaf-ii(c)和ls174t(d)或cea阴性mkn-45_hcea
ko
(b)细胞的浓度依赖性t细胞重新靶向的杀伤/裂解(在实施例8a中描述的测定法)。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。当使用cea阳性细胞时，所有kl双特异性抗体均显示出与它们通过前导优化衍生自的亲本ab1l3-1/n抗体相比改善的杀伤(a、c、d)，但只有cea敲除mkn-45细胞的非常低的非特异性杀伤/裂解(b)。y4l3-1/n是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，其在最高测试浓度下仅显示非常低的杀伤/裂解效力。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。本发明的双特异性抗体的ec50低于tcb2014的ec50，证明对肿瘤细胞杀伤的改善的效力。方法描述于实施例8a。
364.图13前导优化第2波抗体与cd3
pos
原代t细胞(cd4 和cd8 )和cd3
neg b细胞和单核细胞的结合
365.本发明的kl双特异性抗体ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n与cd3阳性原代cd4 t细胞(a)和原代cd8 t细胞(b)或cd3阴性b细胞(c)和单核细胞(d)的浓度依赖性结合。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂，并与cd3阳性t细胞群相似地结合。y4l3-1/n是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，其与cd3阳性t细胞同样好地结合。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。抗人cd47抗体b6h12(acd47 mab)用作阳性对照(t细胞、b细胞和单核细胞表达cd47)。第二ab仅对应于其中仅将检测抗体添加到细胞中并用于确定背景信号(阴性对照)的条件。即使在200nm浓度下，所有测试的抗体均未显示与cd3阴性细胞群的结合。
366.图14前导优化第2波抗体与cea
pos mkn-45细胞、hpaf-ii细胞和ls174t细胞(和
cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的结合
367.本发明的kl双特异性抗体ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n与cea阳性mkn-45(a)；hpaf-ii(c)和ls174t(d)或cea阴性mkn-45_hcea
ko
(b)细胞的浓度依赖性结合。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。y4l3-1/n是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。图14b显示即使在200nm浓度的双特异性抗体下也不与cea阴性细胞系mkn-45_hcea
ko
细胞结合。对于图14a，ec50值报告在表4中。本发明的双特异性抗体在200nm浓度下的结合比tcb2014的结合高40％或更多。
368.图15前导优化第2波抗体对cea
pos mkn-45、hpaf-ii和ls174t细胞(和cea
neg mkn-45_hcea
ko
细胞)的杀伤
369.本发明的kl双特异性抗体ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n对cea阳性mkn-45(a)；hpaf-ii(c)和ls174t(d)或cea阴性mkn-45_hcea
ko
(b)细胞的浓度依赖性t细胞重新靶向的杀伤/裂解(实施例8a中描述的测定法)。所有kl双特异性抗体都带有相同的cd3臂。y4l3-1/n是一种kl双特异性抗体，具有相同的cd3臂，但第二臂不与cea结合，其在最高测试浓度下仅显示非常低的杀伤/裂解效力。tcb 2014对应于us20140242079中描述的另一种ceaxcd3 t细胞双特异性抗体，其作为参考抗体包括在内。与该参考抗体tcb2014相比，本发明的kl双特异性抗体ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n均显示较低的ec50值，和cea阳性靶细胞的更强力的杀伤(a、c、d)，但cea敲除mkn-45细胞的相当低的非特异性杀伤/裂解(b)。对于图15a、c和d，ec50值报告在表5中。
370.图16mkn45肿瘤细胞的t细胞介导的杀伤后细胞因子的分泌
371.在mkn45肿瘤细胞的t细胞介导的杀伤后本发明的kl双特异性抗体ab17l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n介导的穿孔素(b)；颗粒酶b(c)；ifn-γ(d)；tnf-α(e)；il-2(f)；il-6(g)；il-10(h)的分泌(e:t(人pbmc:肿瘤细胞)＝10:1，孵育48小时，特异性裂解显示于(a)。方法描述于实施例8e。
372.图17mkn-45肿瘤细胞的t细胞介导的杀伤后的t细胞活化
373.在cea阳性mkn-45肿瘤细胞的t细胞介导的杀伤后2天本发明的kl双特异性抗体ab17l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n介导的cd25(a和b)和cd69(c和d)的人cd4 和cd8 t细胞上调(图16a中显示了肿瘤细胞的杀伤/裂解)。
374.尽管在100nm下的肿瘤细胞裂解在统计学上没有不同，但与tcb2014相比，本发明的抗体的较少的t细胞活化表明在相同的肿瘤裂解下副作用较低，方法描述于实施例8c中。
375.图18具有hupbmc转移的nog小鼠中的hpaf-ii模型中的体内抗肿瘤功效
376.本发明的kl双特异性抗体ab17l3-1/n、ab72l3-1/n和ab73l3-1/n和tcb2014(均为10mg/kg单次注射)在具有hupbmc转移的nog小鼠中的hpaf-ii肿瘤细胞系模型中的体内抗肿瘤功效。小鼠在第11天随机分组，此时平均肿瘤体积接近150mm3。结果显示了在不同研究组中通过卡尺测量的8只小鼠肿瘤体积的平均值和sem。ab73l3-1/n和tcb2014之间没有发现统计学差异。方法描述于实施例9a。
377.定义
378.除非下文另有定义，否则此处使用的术语与本领域中通常使用的术语相同。
379.如本文所用，术语“抗原结合部分，结合部分”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇如cea、cd47和cd3的抗体的部分。
380.更具体地，如本文所用，结合膜结合的人癌胚抗原(cea，与ceacam5相同)或结合cd3的结合部分特异性结合cea或cd3，更具体地结合细胞表面或膜结合的cea或cd3。“特异性结合、特异于、结合”是指该结合对抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开来。在一些实施方案中，抗靶抗体与不相关的非靶蛋白的结合程度比抗体与所述靶的结合低约10倍，优选》100倍，如例如通过表面等离子体共振(spr)例如酶联免疫吸附剂(elisa)或流式细胞术(facs)测量的。靶标是本文讨论的蛋白质-例如cea、cd47和cd3ε。
[0381]“特异性结合cea、cd3，结合cea、cd3”在一个实施方案中是指能够结合靶cea、cd3的抗体，其具有足够的亲和力以使得该抗体可用作治疗剂用于通过cd3、cea的结合将t细胞重新靶向至肿瘤细胞。
[0382]
优选地，根据本发明的双特异性抗体结合从不同物种，优选在人和食蟹猴之间保守的cd3表位。
[0383]
如本文所用，术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的抗体。在一个实施方案中，抗体是全长抗体。如本文所用，术语“抗体重链”是指由针对全长抗体定义的可变区(可变结构域)和恒定区(恒定结构域)组成的抗体重链。如本文所用，术语“抗体轻链”是指由针对全长抗体定义的可变区和恒定区组成的抗体轻链。可用于本发明的恒定轻链包含在本发明所公开的轻链中。
[0384]
术语“全长抗体”表示由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是在n-末端至c-末端方向上由抗体重链可变结构域(vh)、抗体恒定重链结构域1(ch1)、抗体铰链区(hr)、抗体重链恒定结构域2(ch2)和抗体重链恒定结构域3(ch3)组成的多肽，缩写为vh-ch1-hr-ch2-ch3。“全长抗体轻链”是在n-末端至c-末端方向上由抗体轻链可变结构域(vl)和抗体轻链恒定结构域(cl)组成的多肽，缩写为vl-cl。抗体轻链恒定结构域(cl)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两个全长抗体结构域通过cl结构域和ch1结构域之间以及全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型全长抗体的例子是天然抗体，如igg(例如igg1和igg2)、igm、iga、igd和ige。根据本发明的全长抗体在一个实施方案中是人igg1型，在另一个实施方案中，在如下定义的fc部分中包含一个或多个氨基酸取代。根据本发明的全长抗体包含两个结合部分，每个结合部分由一对vh和vl形成，一个结合cea，另一个结合cd3。
[0385]
如本文所用，术语“fc区；fc结构域”是指igg重链的c末端区；在igg1抗体的情况下，c末端区域包含
–
ch2-ch3(见上文)。尽管igg重链的fc区的边界可能略有不同，但人igg重链fc区通常定义为从cys226位的氨基酸残基延伸到羧基末端。
[0386]
恒定区在现有技术中是众所周知的，例如描述于kabat,e.a.,(参见例如johnson,g.和wu,t.t.,nucleic acids res.28(2000)214-218；kabat,e.a.,等人,proc.natl.acad.sci.usa 72(1975)2785-2788)。
[0387]
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些
实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体结合的靶标区域。
[0388]
如本文所用，术语“共同重链(chc)”是指在n-末端至c-末端方向上由抗体重链可变结构域(vh)、抗体重链恒定结构域1(ch1)、抗体铰链区(hr)、抗体重链恒定结构域2(ch2)和抗体重链恒定结构域3(ch3)组成的多肽，缩写为vh-ch1-hr-ch2-ch3。适用于根据本发明的双特异性抗体的共同重链是如wo2012023053、wo2013088259、wo2014087248、wo2019175658和wo2016156537(其各自的全部内容通过引用并入本文)中描述的重链。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的chc包含作为重链cdr的seq id no：2的cdrl1、seq id no：3的cdrl2和seq id no：4的cdrl3。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的chc包含seq id no：1的vh区作为重链可变区。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的chc是seq id no：43、44或45。
[0389]
根据本发明且包含共同重链的双特异性抗体的形式允许亲和纯化与标准igg分子无法区分并且具有与标准单克隆抗体无法区分的特征的双特异性抗体(参见例如wo2013088259、wo2012023053)，承诺在患者中没有或有低的免疫原性潜力。
[0390]
如本文所用，“ab1l3-1、ab17l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1、ab73l3-1等”是指根据本发明的双特异性ceaxcd3抗体，其包含共同重链(其包含seq id no：2、3和4的cdr作为重链cdr)和在第二结合部分中的轻链(其包含seq id no：18、19和20的cdr作为轻链cdr)。因此ab1等表示第一结合部分(抗ceacam5结合部分)，和l3-1表示第二结合部分(抗cd3结合部分)。
[0391]
在一个实施方案中，ab1l3-1、ab17l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1、ab73l3-1等包含seq id no：43(wt higg1)的共同重链和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链。本发明的这种双特异性抗体在实施例中也被指定为ab1l3-1、ab17l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1、ab73l3-1。
[0392]
在一个实施方案中，ab1l3-1、ab17l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1、ab73l3-1等包含seq id no：44(具有l234a l235a突变的higg1)的共同重链和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链。本发明的这种双特异性抗体在实施例中被指定为ab1l3-1/d、ab17l3-1/d、ab71l3-1/d、ab72l3-1/d、ab73l3-1/d等。
[0393]
在一个实施方案中，ab1l3-1、ab17l3-1、ab54l3-1、ab60l3-1、ab66l3-1、ab71l3-1、ab72l3-1、ab73l3-1等包含seq id no：45的共同重链(具有l234a l235a p329a突变的igg1)和在第二结合部分中的作为轻链的seq id no：28的轻链。本发明的此类双特异性抗体在实施例中被指定为ab1l3-1/n、ab17l3-1/n，ab54l3-1/n、ab60l3-1/n、ab66l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n、ab73l3-1/n等。
[0394]
本发明的包含共同重链的双特异性抗体可以例如根据wo2012023053制备。wo2012023053中描述的方法产生了与人免疫球蛋白在结构上相同的双特异性抗体。这种类型的分子由独特的重链多肽的两个拷贝、与κ恒定结构域融合的第一轻链可变区和与λ恒定结构域融合的第二轻链可变区组成。
[0395]
在本发明的双特异性抗体中，一个结合位点表现出对cea的特异性，而另一个结合位点表现出对cd3的特异性，其中重链和相应的轻链对每个都有贡献。轻链可变区可以是λ或κ家族并且优选分别融合至λ和κ恒定结构域。这是优选的以避免产生非天然多肽连接。然
而，也有可能通过对于两种特异性中的任何一种将κ轻链可变结构域融合至λ恒定结构域或通过对于两种特异性中的任何一种将λ轻链可变结构域融合至κ恒定结构域来获得可用于产生本发明的双特异性抗体的抗体臂。wo2012023053中描述的双特异性抗体是“κλ体”。这种κλ体形式允许亲和纯化与标准igg分子无法区分并且具有与标准单克隆抗体无法区分的特征的双特异性抗体，因此与以前的形式包括例如氨基酸桥或其他非天然元素相比是有利的。
[0396]
该方法的一个重要步骤是鉴定共有相同重链可变结构域的具有不同抗原特异性的两个抗体fv区(每个由可变轻结构域和可变重结构域组成)。已经描述了许多用于产生单克隆抗体及其片段的方法。(参见，例如，antibodies:a laboratory manual,harlow e,和lane d,1988,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny)。完全人抗体是其中轻链和重链序列(包括cdr 1和2)均来自人基因的抗体分子。cdr3区域可以是人类来源的或通过合成方式设计的。此类抗体被称为“人抗体”或“完全人抗体”。使用trioma技术；人b细胞杂合瘤技术(参见kozbor,等人,1983immunol today 4:72)；以及产生人单克隆抗体的ebv杂合瘤技术(参见cole等人,1985in:monoclonal antibodies and cancer therapy,alan r.liss,inc.,pp.77-96)可以制备人单克隆抗体。可以通过使用人杂交瘤(参见cote等人,1983.proc natl acad sci usa 80:2026-2030)或通过在体外用epstein barr病毒转化人b细胞(参见cole等人，同上)来利用和产生人单克隆抗体。
[0397]
如本文所用，术语“cd3ε或cd3”涉及在uniprot p07766(cd3e_human)下描述的人cd3ε。术语“针对cd3的抗体、抗cd3抗体”涉及结合cd3ε的抗体。
[0398]
如本文所用，术语“cea、ceacam5”是指人类癌胚抗原(cea、ceacam-5或cd66e；uniprotkb-p06731)，它是细胞表面糖蛋白和肿瘤相关抗原(gold和freedman,j exp.med.,121:439-462,1965；berinstein nl,j clin oncol.,20:2197-2207,2002)。如本文所用，术语“ceacam6”是指人ceacam6(cd66c；uniprotkb-p40199)，其也是癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)家族的成员。如本文所用，术语“ceacam1”是指人ceacam1(uniprotkb-p13688(ceam1_human)，其也是癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)家族的成员。如本文所用，术语“ceacam8”是指人ceacam8(uniprotkb-p31997(ceam8_human)，其也是癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)家族的成员。进一步的信息和有关cea家族其他成员的信息可获自http://www.uniprot.org。
[0399]
如本文所用，术语“特异性结合cea、结合cea、cea结合部分”在根据本发明的双特异性抗体的上下文中是指对细胞表面上的ceacam5的特异性。可以用每个细胞包含100.000至400.000个cea拷贝的胃腺癌细胞mkn-45测量与细胞上的cea的结合。根据本发明的抗体的浓度在与如上定义的与mkn-45细胞的结合的所得ec50值有关的适当范围内变化。根据本发明的双特异性抗体与这种细胞膜结合的ceacam5特异性结合。
[0400]
如本文所用，术语“膜结合的人cea”是指与细胞的膜部分或细胞表面，特别是肿瘤细胞表面结合的人癌胚抗原(cea)。术语“膜结合的人cea”在某些情况下可以指不与细胞膜结合的cea，但其已被构建以保存根据本发明的抗体所结合的膜结合的cea表位。
[0401]
如本文所用，术语“对ceacam8没有交叉反应”在根据本发明的双特异性抗体的上下文中是指在表达ceacam8的peak细胞上与与wt peak细胞的结合相比较地测试根据本发明的双特异性抗体的结合(详见实施例1和5)并且没有交叉反应意味着对表达ceacam8的
peak细胞测量的mfi不超过对wt peak细胞测量的mfi的两倍。如本文所用，术语“对某种ceacam没有交叉反应”在根据本发明的双特异性抗体的上下文中是指在与针对ceacam8所描述的相同的实验程序和定义下的所述交叉反应。
[0402]
如本文所用，术语“结合人cea和人cd3的双特异性抗体、ceaxcd3 bsab”是指结合人ceacam5和cd3ε的双特异性抗体。
[0403]
如本文所用，术语“互补决定区”(“cdr”)描述了在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点(也称为抗原结合区)。cdr也被称为“高变区”，并且该术语在本文中可与术语“cdr”互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区部分。该特定区域描述于kabat等人,u.s.dept.of health and human services,"sequences of proteins of immunological interest"(1983)和chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)。kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将这种“kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“kabat编号”是指kabat等人,u.s.dept.of health and human services,"sequence of proteins of immunological interest"(1983)提出的编号系统。除非另有说明，对根据本发明的双特异性抗体中特定氨基酸残基位置的编号(例如cdr序列)的引用是根据kabat编号系统。
[0404]
如本文所用，术语“寡核苷酸定向诱变”涉及使用简并寡核苷酸的此类方法。对于每个cdr的诱变，使用各种简并寡核苷酸的组合。这些包括(但不限于)简并密码子nns、hmt、dmt、nht。
[0405]
如本文所用，术语“表达载体”是指一种或多种载体，其以本领域已知的适当方式包含根据本发明的抗体的重链和轻链。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖任何种类的细胞系统，其可被工程化以产生本发明的双特异性抗体。在一个实施方案中，宿主细胞被工程化以允许产生抗原结合分子。
[0406]
如本文所用，术语“氨基酸取代”是指一种氨基酸被20种蛋白质标准氨基酸组中的另一种氨基酸取代。
[0407]
根据本发明的抗ceaxcd3抗体的治疗应用和使用方法
[0408]
根据本发明的ceacam x cd3双特异性抗体被优化用于治疗实体瘤，无论是在单一疗法中还是在联合疗法中，尤其是与抗cd47抗体、抗ceaxcd47抗体和/或pd-1轴拮抗剂一起的联合疗法。根据本发明的抗体和cd47抗体或ceaxcd47抗体可以如下所述施用。
[0409]
在一个特定的实施方案中，疾病或实体瘤是表达或甚至过表达cea的癌症，包括但不限于结直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、食道癌、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个具体实施方案中，肿瘤是结直肠肿瘤。本文所述的使用、用途、组合等的所有治疗应用方法尤其是用于治疗这些肿瘤/疾病的实施方案。
[0410]
发明人认识到，根据本发明的抗体由于中和ada或效力损失而显示低或没有ada形成潜力或暴露损失。
[0411]
在一个实施方案中，本发明提供了一种在体内治疗癌(癌症、肿瘤，例如人类癌)，尤其是表达cea的肿瘤的方法。该方法包括向受试者施用药学有效量的含有本发明的双特异性抗体的组合物。“受试者”是指人类受试者，在一个实施方案中是患有癌症/肿瘤/癌的患者。
[0412]
cea在各种肿瘤实体中的表达通常非常高，尤其是在结直肠癌、食道癌、胰腺腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌和膀胱癌等中。在胃肠道中的健康、正常的腺上皮细胞中，cea主要以极化模式在细胞的顶端表面表达。这种极化的表达模式限制了全身施用的抗cea单特异性或双特异性抗体的可及性，因此具有潜在的毒性。这种极化的表达模式在胃肠道恶性肿瘤的细胞中丢失了。cea在癌细胞的整个细胞表面上均等地表达，这意味着癌细胞比正常健康细胞更容易被本发明的抗体接近，并且可以通过本发明的ceaxcd3双特异性抗体或上述组合选择性杀伤。
[0413]
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可在单一疗法中用于治疗晚期实体瘤，在一个实施方案中，表达cea的肿瘤。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与ceaxcd47 bsab以同时、单独或顺序组合的方式组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与ceaxcd47 bsab和/或pd-1轴拮抗剂以同时、单独或顺序组合的方式组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与pd-1轴拮抗剂以同时、单独或顺序组合的方式组合使用。此类pd-1轴拮抗剂描述于例如wo2017118675中。这种组合通过巨噬细胞和t细胞攻击实体癌。cd47抗体例如描述于wo2009091601、wo2009091547、wo2011143624、wo2009131453、wo2013119714、wo2015105995、wo2017181033、wo2018026600、wo2019157432和wo2013032948，以及针对cea和cd47的双特异性抗体描述于pct/ib2019/054559和us16/428,539中。
[0414]
如本文所用，术语根据本发明的抗体和结合人cd47或人cea和人cd47的第二抗体的“组合、同时、单独或顺序组合”是指两种抗体(或在本发明的抗体、cd47 mab或ceaxcd47 bsab和pd-1轴拮抗剂的组合的情况下，三种抗体)单独或一起的任何施用，其中两种或三种抗体作为旨在获得联合治疗的益处的适当剂量方案的一部分施用，例如以单独、顺序、同时、并发、按时间顺序交错或交替施用的方式施用。因此，两种或三种抗体可以作为相同药物组合物的一部分或在单独的药物组合物中施用。根据本发明的抗体可以在施用第二双特异性抗体之前、同时或之后施用，或以它们的某种组合施用。当根据本发明的抗体以重复的间隔施用至患者时(例如，在标准治疗过程中)，第二双特异性抗体可以在每次施用本发明的抗体之前、同时或之后施用或以其某种组合施用，或以与使用本发明的抗体的治疗有关的不同间隔施用，或在使用本发明的抗体的治疗过程之前、期间的任何时间或之后以单剂量施用。在一个实施方案中，根据本发明的抗体和第二双特异性抗体以交替施用的方式施用，在一个实施方案中，本发明的抗体和第二抗体的施用之间的间隔为6至15天。在这样的交替施用中，第一剂量可以是本发明的抗体或第二抗体。
[0415]
术语“pd-1轴拮抗剂”是指抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。抗pd-1抗体是例如派姆单抗(pembrolizumab)(mk-3475)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab、lambrolizumab、medi-0680、pdr001和regn2810。抗pd-1抗体描述于例如wo200815671、wo2013173223、wo2015026634、us7521051、us8008449、us8354509、wo20091/14335、wo2015026634、wo2008156712、wo2015026634、wo2003099196、wo2009101611、wo2010/027423、wo2010/027827、wo2010/027828、wo2008/156712和wo2008/156712。抗pd-ll抗体是例如阿特珠单抗、mdx-1 105、德瓦鲁单抗和阿维单抗。抗pd-l1抗体描述于例如wo2015026634、wo2013/019906、wo2010077634、us8383796、wo2010077634、wo2007005874和wo2016007235。
[0416]
关于根据本发明的抗体和第二双特异性抗体的联合施用，两种化合物可以存在于一个单一剂型中或单独的剂型中，例如存在于两种不同或相同的剂型中。
[0417]
如果本发明的抗体和第二抗体在ceacam5方面不竞争，在一个实施方案中，两种抗体同时施用。如果本发明的抗体和第二抗体在ceacam5方面竞争，在一个实施方案中，抗体以交替施用的方式施用。
[0418]
如本领域已知的，本发明的抗体通常以提供最有效治疗患者正在治疗的癌症(从功效和安全性角度)的剂量方案施用至患者。优选地，肿瘤细胞同时被t细胞和巨噬细胞攻击，为了实现这种方法的全部治疗潜力，ceaxcd3和ceaxcd47双特异性抗体在与细胞表面上的cea结合方面应该是非竞争性的。
[0419]
如上所述，本发明的抗体的施用时间和抗体施用量可取决于所治疗患者的类型(例如性别、年龄、体重)和状况、正在接受治疗的疾病或病况的严重程度以及施用途径。例如，本发明的抗体和第二抗体可以以每天或每周0.1至100mg/kg体重的剂量以单次或分次剂量或通过连续输注施用至患者。在一个实施方案中，将本发明的抗体和第二抗体中的每一种以1至20mg/kg的剂量施用至患者。在某些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下，可以使用更大的剂量而不引起任何有害的副作用。
[0420]
如本文所用，术语“抗体的半衰期”是指如在通常的药代动力学测定中测量的所述抗体的半衰期。根据本发明的抗体和针对cea和cd47的第二双特异性抗体具有3-14天的消除半衰期。
[0421]
在另一个方面，本发明还涉及根据本发明的双特异性抗体在治疗疾病(特别是其中表达cea，特别是其中与相同细胞类型的正常组织相比cea异常表达(例如，在细胞表面以不同模式表达或过表达)的细胞增殖病症)中的用途。此类病症包括但不限于结直肠癌、nsclc(非小细胞肺癌)、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌。cea表达水平可以通过本领域已知的方法(例如，通过免疫组织化学测定、免疫荧光测定、免疫酶测定、elisa、流式细胞术、放射免疫测定等)来确定。
[0422]
一方面，本发明的双特异性抗体可用于在体内或体外靶向表达cea的细胞。本发明的双特异性抗体特别适用于通过诱导肿瘤细胞的tdcc来预防肿瘤形成、根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移。本发明的双特异性抗体可用于治疗任何表达cea的肿瘤。可用本发明的双特异性抗体治疗的特定恶性肿瘤包括但不限于结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌。
[0423]
本发明的双特异性抗体以药学上可接受的剂型(例如下文讨论的那些，包括可以作为推注或通过在一段时间内连续输注而静脉内施用至人的那些)通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用至哺乳动物，优选人。本发明的双特异性抗体也适合通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用，以发挥局部和全身治疗效果。
[0424]
对于疾病的治疗，本发明的双特异性抗体的合适剂量将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和进程、既往治疗、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断力。本发明的双特异性抗体适合在一次或在一系列治疗中施用至患者。本发明提供一种选择性杀伤表达cea的肿瘤细胞的方法。
[0425]
该方法包括本发明的双特异性抗体与所述肿瘤细胞的相互作用。这些肿瘤细胞可
以来自人类癌，包括结直肠癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胃癌、食道癌、胰腺癌和乳腺癌。
[0426]
在另一个方面，本发明涉及本发明的双特异性抗体，其用于制备用于治疗与异常cea表达相关的疾病的药物。在一个具体的实施方案中，所述疾病是表达或甚至过表达cea的癌症，包括但不限于结直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、食道癌、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个具体实施方案中，肿瘤是结直肠肿瘤。
[0427]
组合物、制剂、剂量和施用途径
[0428]
一方面，本发明涉及包含本发明的双特异性抗体和药学上可接受的承载体的药物组合物。本发明进一步涉及此类药物组合物用于治疗疾病例如癌症的方法或用于制备治疗疾病例如癌症的药物。具体而言，本发明涉及一种治疗疾病的方法，更具体地，治疗癌症的方法，该方法包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物。
[0429]
一方面，本发明包括如上定义的用于治疗人类癌症、肿瘤的药物组合物、组合和方法。例如，本发明包括用于治疗人类癌症的药物组合物，其包含药学有效量的本发明的抗体和药学上可接受的承载体。
[0430]
本发明的双特异性抗体组合物可以使用常规施用方式施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴管内或直接肿瘤内施用。优选静脉内施用或皮下施用。
[0431]
在本发明的一个方面，通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的承载体、赋形剂或稳定剂混合来制备冻干制剂或液体制剂形式的含有本发明的双特异性抗体的治疗制剂以供储存(remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.ed.(1980))。可接受的承载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过无菌过滤膜过滤来完成。本发明药物组合物的最有效施用方式和剂量方案取决于疾病的严重程度和进程、患者的病况和对治疗的反应以及治疗医师的判断。因此，组合物的剂量可以是固定剂量或可以适应个体患者，例如体重。然而，本发明组合物的有效剂量通常在0.1至20mg/kg的范围内。
[0432]
本发明的双特异性抗体的分子量为150kd/mol。在一个实施方案中，它们携带fc部分。患者的消除半衰期为3至14天。该半衰期允许但不限于每天一次、每周一次或每两周一次施用。
[0433]
本发明的双特异性抗体及其各自的组合物可以是多种剂型，包括但不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、散剂、栓剂、聚合微囊或微泡、脂质体和注射剂或不溶性溶液。优选的形式取决于施用方式和治疗应用。
[0434]
包含本发明的双特异性抗体的组合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在本文中考虑的因素包括正在治疗的特定疾病或病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病或病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排，以及医生已知的其他因素。
[0435]
制品
[0436]
在本发明的另一个方面，提供了包含用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物组合的组合物，并且可以具有无菌接入端口(例如，具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的容器可以是静脉注射溶液袋或小瓶)。组
合物中的一种活性剂是本发明的双特异性抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病况。此外，该制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的双特异性抗体；(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装插页，该插页指示该组合物可用于治疗特定病况。可替代地或另外地，制品还可包含第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度看所需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0437]
表1
[0438]
序列表
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
实施例
[0445]
实施例1：人ceacam家族成员的克隆、表达和纯化
[0446]
克隆
[0447]
合成对应于ceacam5的完整细胞外结构域(ecd)和a3-b3结构域的序列并亚克隆到peak8哺乳动物表达载体(edge biosystems,gaithersburg,md.)。对载体进行修饰以在c末端引入avitag
tm
(avidity,denver colo.)和六组氨酸标签、人fc区或小鼠fc区。通过dna测序验证构建体。通过imac(固定化金属离子亲和色谱)、fcxl或captureselect
tm igg-fc(ms)affinity matrix(thermo fisher scientific)进行重组可溶性蛋白的纯化。
[0448]
还产生了编码人类ceacam 1、3、4、5、6、7、8、18、19、20、21和食蟹猴ceacam5和ceacam6的全长形式的载体，用于在peak和/或cho细胞的细胞表面表达。可溶性全长人ceacam16也被类似地克隆。
[0449]
此外，还产生了编码以下截短形式的人ceacam5的载体，用于在peak和/或cho细胞的细胞表面表达：a1-b1-a2-b2-a3-b3；b1-a2-b2-a3-b3；a2-b2-a3-b3；b2-a3-b3；a3-b3。b3亚结构域以与人类cd86蛋白的前140个氨基酸的融合蛋白的形式表达。
[0450]
表达
[0451]
然后使用基于脂质体的转染试剂如lipofectamine2000(thermo fisher scientific)将上述质粒转染到哺乳动物细胞中。转染步骤仅需要少量dna和细胞，通常每孔4x105个细胞和2μg质粒dna，转染在6孔板中进行。尽管可以使用不同的哺乳动物细胞系，但在下面给出的实施例中，转染了转化的人胚胎肾单层上皮细胞(peak细胞)。这些细胞稳定表达ebna-1基因(进一步支持附加型复制过程)，是半贴壁的，并且可以在标准细胞培养条件下(5％co2；37℃，在补充有10％胎牛血清的dmem培养基中)生长。24小时后，通过添加含有0.5-2μg/ml嘌呤霉素的培养基将细胞置于选择性条件下：含有附加型载体的细胞对这种抗生素具有抗药性。
[0452]
转染后两到三周，将扩增和选择的细胞注射到一次性celline
tm
生物反应器(sigma aldrich)中用于生产步骤。celline
tm
是一种两室生物反应器，其可用于标准细胞培养箱。较小的隔室(15ml)包含细胞，并通过截断尺寸为10kda的半透膜与较大的(1升)含培养基的隔室隔开(bruce等人2002,mcdonald等人2005)。该系统允许营养物质、气体(gazes)和代谢废物的扩散，同时将细胞和分泌的蛋白质保留在较小的隔室中。在收获上清液之前将培养物维持7-10天。由于培养基中含有血清，因此细胞保持良好的活力，并且可以使用相同的细胞和容器进行多次生产运行。
[0453]
纯化
[0454]
收获后，细胞培养上清液通过离心澄清。然后用100mm咪唑补充上清液并加载到ni-nta亲和层析树脂(qiagen)上。相对高浓度的咪唑最大限度地减少了污染物与树脂的结合。洗涤柱后，在akta prime色谱系统(cytiva)上使用30ml咪唑梯度(20-400mm咪唑)以2ml/min的流速洗脱蛋白质。洗脱梯度进一步改善了重组蛋白的纯度，但如果色谱系统不可用，可以用分步洗脱方法代替。洗脱的级分可以通过sds-page或elisa分析以确定它们在重组蛋白中的含量。在用磷酸缓冲盐水或另一种合适的缓冲液平衡的10kda柱(millipore)上汇集感兴趣的级分并脱盐。然后可以使用各种技术对脱盐的蛋白质进行量化，并通过sds-page分析它们的纯度。根据制造商的说明，使用生物素连接酶(avidity,denver colo.)在体外对重组蛋白进行生物素化。脱盐后，生物素化水平通过使用链霉亲和素磁珠的下拉测定和sds-page分析来评估。
[0455]
实施例2：使用含有固定的可变重链结构域的人scfv文库对ceacam5 fvs进行噬菌体展示选择
[0456]
vaughan等人(nat.biotech.1996,14:309-314)描述了构建和处理展示在m13噬菌体上的人scfv文库的一般程序，在此通过引用整体并入。用于选择和筛选的文库编码所有共有相同vh结构域并且在vl结构域中单独多样化的scfv。us2012/0184716和wo2012/023053中描述了产生固定的vh文库的方法及其用于鉴定和组装双特异性抗体的方法，其各
自通过引用整体并入本文。下面描述了鉴定与人ceacam5结合的scfv的程序。
[0457]
蛋白质选择
[0458]
scfv噬菌体文库(10
12
pfu)的等分试样在室温下在旋转混合器上用含有3％(w/v)脱脂牛奶的pbs封闭一小时。封闭的噬菌体在链霉亲和素磁珠(dynabeads
tm m-280)上在室温下在旋转混合器上去选择(deselect)一小时。将去选择的噬菌体与100nm的生物素化的人ceacam5或链霉亲和素磁珠上捕获的a3-b3结构域在室温下在旋转混合器上孵育两小时。使用磁性支架捕获珠子，然后用pbs/0.1％20洗涤五次，然后用pbs洗涤两次。噬菌体在旋转混合器上在室温下用100nm tea洗脱30分钟。洗脱的噬菌体和珠子用1m ph7.4的tris-hcl中和，并直接添加到10ml呈指数生长的tg1细胞(噬菌体展示中常用的大肠杆菌菌株)中，并在37℃下在缓慢摇动(90rpm)下孵育1小时。将一等份受感染的tg1连续稀释以滴定选择输出。剩余的受感染的tg1以3800rpm旋转10分钟，然后重新悬浮于2ml 2xty中，然后铺展在2xtyag(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xty培养基)琼脂生物测定板上。在30℃下孵育过夜后，将10ml 2xty添加到板中，从表面刮下细胞并转移到50ml聚丙烯管中。将50％甘油溶液添加到细胞悬浮液中以获得17％甘油的最终浓度。将选择回合的等分试样保持在-80℃。
[0459]
噬菌体拯救
[0460]
将从前几轮选择中获得的50μl细胞悬浮液添加到50ml 2xtyag中，并在37℃在搅拌(240rpm)下生长，直到od
600
达到0.3至0.5。然后用1.2x10
11 m13k07辅助噬菌体对培养物进行超级感染，并在37℃(90rpm)下孵育一小时。通过以3800rpm离心细胞10分钟来更换培养基，去除培养基并将沉淀重新悬浮于50ml 2xtyak(含有100μg/ml氨苄青霉素；50μg/ml卡那霉素的2xty培养基)中。然后将培养物在30℃(240rpm)培养过夜。第二天，含有噬菌体的上清液用于下一轮选择。
[0461]
细胞表面选择
[0462]
在室温下，在旋转混合器上用含有3％(w/v)脱脂牛奶的pbs封闭含有噬菌体的上清液一小时。然后在不表达人ceacam5的mkn-45 ceacam5
ko
细胞上去选择封闭的噬菌体一小时。将去选择的噬菌体与表达ceacam5的2x107个mkn-45细胞(在pbs、3％bsa 0.1％nan3中封闭)在室温下在轻轻摇动下孵育2小时。将细胞沉淀并用pbs洗涤六次。用76mm柠檬酸洗脱结合的噬菌体并摇动10分钟。用1m ph8的tris-hcl中和后，将细胞直接添加到10ml呈指数生长的tg1中，并在37℃下在缓慢摇动下孵育1小时。将一等份受感染的tg1连续稀释以滴定选择输出。感染的tg1以3800rpm旋转10分钟，然后重新悬浮于2ml 2xty培养基中，然后铺展在2xtyag琼脂生物测定板上。在30℃下孵育过夜后，将10ml 2xty添加到板中，从表面刮下细胞并转移到50ml聚丙烯管中。将50％甘油溶液添加到细胞悬浮液中以获得17％甘油的最终浓度。将选择回合的等分试样保持在-80℃。
[0463]
实施例3：筛选与可溶性ceacam5、ceacam6和ceacam1结合/不结合的scfv
[0464]
用于结合和功能测试的scfv周质制剂
[0465]
将来自选择输出的个体转化的tg1克隆接种到每孔含有0.9ml2xtyag培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素0.1％葡萄糖的2xty培养基)的深孔微量滴定板中，并在37℃下生长5-6小时(240rpm)。然后每孔加入100μl在2xty培养基中的0.2mm iptg以获得0.02mm iptg的最终浓度。将板在30℃下在240rpm摇动下孵育过夜。将深孔板在4℃下以3200rpm离心10分
钟，小心除去上清液。将沉淀重新悬浮于150μl tes缓冲液(50mm tris-hcl(ph8)、1mm edta(ph8)、20％蔗糖，补充有完全蛋白酶抑制剂，roche)中。通过加入150μl稀释的tes缓冲液(1：5tes：水稀释)并在冰上孵育30分钟产生低渗休克。将板在4℃以4000rpm离心10分钟以沉淀细胞和碎片。将上清液小心地转移到另一个微量滴定板中并保持在冰上，以便在功能测定或结合测定中立即进行测试。
[0466]
结合
[0467]
使用cellinsight
tm
技术在同质测定中测试针对与ceacam5的结合的scfv筛选。在384透明底孔板(corning)的每个孔中混合以下试剂：30μl包被有生物素化ceacam5、生物素化结构域a3-b3或生物素化nusa(对照蛋白)的链霉亲和素聚苯乙烯珠悬浮液(polysciences；3000个珠子/孔)；60μl封闭的scfv周质制剂；10μl检测缓冲液(含有5μg/ml小鼠抗c-myc抗体的pbs；按1：200稀释的抗小鼠fc647)。以600rpm混合5分钟后，将384孔板在室温下孵育，2小时后在cellinsight
tm cx5高含量筛选平台(thermo fisher scientific)上读数。选择表达对ceacam5而非nusa给出特定信号的scfv的克隆用于进一步分析或测序。
[0468]
可以以相同的方式测量与ceacam1、ceacam6和其他ceacam的结合。
[0469]
克隆测序
[0470]
将单个克隆接种到每孔含有1ml lbag培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的lb培养基)的96孔深孔微量滴定板中，并在37℃、300rpm下生长过夜。使用zyppy-96 plasmid miniprep试剂盒(zymo research)提取dna并测序。
[0471]
实施例4：固定的vh候选物重新格式化为igg和在哺乳动物细胞中的瞬时表达
[0472]
筛选和测序后，具有所需结合特性的候选scfv被重新格式化为igg，并通过瞬时转染到peak细胞中表达。用特定寡核苷酸扩增所选scfv的vh和vl序列并克隆到含有重链和轻链恒定区的表达载体中，并通过测序验证构建。根据制造商的说明，使用lipofectamine2000(thermo fisher scientific)将表达载体转染到哺乳动物细胞中。简而言之，将4x106个peak细胞培养在t75培养瓶中的25ml含有胎牛血清的培养基中。转染的细胞在37℃下培养5-6天，使用octet red96仪器量化igg的产生。根据制造商的说明，收集上清液用于fcxl亲和树脂(thermo fisher scientific)上的igg纯化。简而言之，将转染细胞的上清液与适量的fcxl树脂在4℃下孵育过夜。用pbs清洗树脂后，将样品加载到amicon pro柱上，然后igg在50mm glycine ph3.5中洗脱。然后用amicon 50kda针对组氨酸nacl ph6.0缓冲液透析洗脱的igg级分，并通过280nm处的吸光度来量化igg含量。根据制造商的说明(agilent technologies,santa clara,calif.,usa)，使用agilent bioanalyzer 2100通过电泳验证纯度和igg完整性。
[0473]
实施例5：ceacam5单克隆抗体的表征
[0474]
a)抗ceacam5臂与用ceacam家族的不同成员转染的细胞的结合
[0475]
通过使用采用ceacam家族的不同成员转染的peak和/或cho细胞的流式细胞术显示抗ceacam5抗体臂(测试为二价mab或单价bsab)的特异性。
[0476]
如实施例1所述，编码全长形式的人ceacam 1、3、4、5、6、7、8、18、19、20和21和20的载体用于在peak和/或cho细胞的表面表达这些蛋白质。类似地，编码全长形式的食蟹猴ceacam5和6的载体也用于在peak和/或cho细胞表面表达这些蛋白质。未转染的peak和/或
cho细胞用作阴性对照。收获细胞，计数，检查活力并以3
×
106个细胞/ml重新悬浮于facs缓冲液(pbs 2％bsa，0.1％nan3)中。将100μl细胞悬浮液分布在v型底96孔板中(3
×
105个细胞/孔)。通过在4℃、1300rpm下离心3分钟去除上清液，并将细胞在4℃与浓度增加的根据本发明的抗体一起孵育15分钟。携带要测试的抗ceacam5臂的抗体在facs缓冲液中稀释，浓度范围为30pm-500nm。细胞用冷的facs缓冲液洗涤两次，并在4℃下与相容的抗人igg二抗再孵育15分钟。用冷的facs缓冲液洗涤细胞两次，并重新悬浮在具有1:1500稀释的topro-3(invitrogen)的300μl facs缓冲液中。使用facscalibur
tm
(bd biosciences)或cytoflex platform(beckman coulter)测量荧光。使用graphpad prism8软件拟合剂量反应结合曲线。以同样的方式，可以表征ceacam1、ceacam6和其他ceacam。
[0477]
通过使用实施例1和5a中描述的实验程序获得的结果显示在表2和3中(10mcg/ml的测试的全尺寸抗体；以等摩尔浓度测试bite medi-565)。对于双特异性抗体ab17l3-1/n、ab71l3-1/n、ab72l3-1/n、ab73l3-1/n，测得的与ceacam5转染细胞结合的mfi介于29000和41000之间(表2)。相比之下，通过使用采用ceacam1、3、4、6、8转染的peak细胞发现的mfi低于1000，唯一的例外是在ceacam8转染细胞上的ab72l3-1/n的强信号。当在表达任何给定ceacam的转染细胞上获得的mfi值除以在wt peak细胞上获得的值时，可以计算“相对peak wt的因子”(表3)。除ab72l3-1/n外，本发明的抗体均对ceacam5具有特异性，因为“相对peak wt的因子”值均低于2.0。相比之下，medi-565bite显示ceacam8的“相对peak wt的因子”高于2，表明此类ceacam家族成员的交叉反应性。这可能导致杀伤例如中性粒细胞，因为如上所述，人类中性粒细胞在表面表达ceacam8。
[0478]
表2与peak细胞上瞬时表达的ceacamx的结合[mfi]
[0479][0480]
表3与peak细胞上瞬时表达的ceacamx的结合[相对peak wt的因子]
[0481][0482]
b)在酶联免疫吸附测定(elisa)中ceacam5单克隆抗体与重组蛋白的结合
[0483]
生物素化的重组人ceacam5蛋白以0.5μg/ml被捕获在链霉亲和素包被的96孔微孔板中。洗涤板并加入本发明的单克隆抗taa二价抗体作为宽浓度范围(例如从5x10-4
至1μg/ml)并孵育1小时。洗涤板并用抗人igg(fc)-hrp(jackson immunoresearch)检测结合的抗体。洗涤后，用amplex试剂(molecular probes)显露板。在synergy ht酶标仪(biotek)上测量荧光信号。
[0484]
可以类似地评估与其他重组ceacam家族成员如ceacam1和ceacam6的结合。图8和图9分别显示了1b4 mab和c11 mab的结合结果。
[0485]
c)通过与参考抗体竞争进行本发明的抗体的表位分仓
[0486]
表位分仓是一种竞争性免疫测定，其例如用于表征新单克隆抗体与靶蛋白的结合。针对也与该靶蛋白结合并且已经建立/公开了结合表位的抗体创建了与靶蛋白结合的新抗体的竞争性阻断谱。与这些参考抗体之一的竞争表明新抗体具有相同或位置接近的表位，并且它们被“分仓”在一起。
[0487]
本发明的ceacam5 mab与ceacam5参考抗体竞争的能力使用重组人ceacam5和以下携带小鼠fc区的参考抗体通过elisa进行测试：sm3e，衍生自专利us20050147614a1中描述的sm3e的mab；medi，衍生自专利wo2016036678a1中描述的medi-565的mab；sar，衍生自专利ep3199552a1中描述的mab2_vlg5vhg2的mab；ch1a1a，衍生自专利us20120251529和klein等人oncoimmunology,2017jan 11；6(3)中描述的ch1a1a-2f1的mab；人源化t84.66，衍生自专利wo2017055389中描述的变体1的mab；lab，衍生自专利us2002/0165360a1中描述的hmn14的mab。
[0488]
sm3e例如更多地结合到cea的n末端，细胞膜远端部分，medi结合到中间部分，ch1a1a结合到靠近膜的位置。
[0489]
生物素化的人ceacam5以0.5μg/ml包被在链霉亲和素包被的96孔板中，并与10μg/ml参考mab或携带小鼠fc区的无关mab一起孵育1小时。在室温下以0.2μg/ml加入本发明的ceacam5 mab(即二价单克隆抗cea抗体)持续1小时。洗涤板并用抗人igg(fc)-hrp(jackson immunoresearch)检测结合的ceacam5 mab。洗涤后，用red试剂显露板。在
synergy ht酶标仪(biotek)上测量荧光信号。
[0490]
基于使用ceacam5 mab发现的结果，如果添加和不添加工具抗体的结果相比与ceacam5的结合减少超过80％，则认为根据本发明的衍生的ceaxcd3 bsab与参考抗体竞争。如果添加和不添加工具抗体的结果相比与ceacam5的结合减少小于20％，则将ceaxcd3抗体鉴定为与工具抗体无竞争性。图1以示意图方式显示了实施例5c中使用的参考抗体的结合区。
[0491]
d)使用截短形式的ceacam5测定由本发明的抗体结合的ceacam5结构域
[0492]
使用缺少一个或多个细胞外亚结构域的截短形式的ceacam5，可以确定本发明的抗体结合的亚结构域。
[0493]
编码全长形式的人ceacam5(包含其所有细胞外结构域，即n-a1-b1-a2-b2-a3-b3)的载体以及仅编码ceacam5的细胞外结构域的子集(a1-b1-a2-b2-a3-b3；b1-a2-b2-a3-b3；a2-b2-a3-b3；b2-a3-b3；a3-b3和b3)的载体用于在peak和/或cho细胞的表面表达这些蛋白质，如实施例1所述。未转染的peak和/或cho细胞用作阴性对照。如实施例5，a)小节所述进行流式细胞术染色和采集。
[0494]
如果通过pe缀合的抗人igg fc二抗检测到结合的抗体，则发现根据本发明的抗体与给定的截短的ceacam5蛋白结合。
[0495]
实施例6：携带λ和κ轻链的双特异性抗体的表达和纯化
[0496]
在同一细胞中同时表达一条重链和两条轻链可导致三种不同抗体的组装。可以通过不同方式实现同时表达，例如转染表达要共表达的链中的一条的多个载体或通过使用驱动多个基因表达的载体。编码不同抗ceacam5抗体的载体与另一个表达抗cd3抗体重链和轻链的载体共转染。可替代地，如us2012/0184716和wo2012/023053(其各自通过引用整体并入本文)中所述，将两条轻链克隆到先前产生的载体pnoviκhλ中以允许共表达一条重链、一条κ轻链和一条λ轻链。这三个基因的表达由人类巨细胞病毒启动子(hcmv)驱动，并且该载体还包含谷氨酰胺合成酶基因(gs)，其使得能够选择和建立稳定的细胞系。将抗ceacam5 igg和抗cd3 igg的共同vh和vl基因克隆到载体pnoviκhλ中，用于在哺乳动物细胞中瞬时表达。expi293细胞在合适的锥形瓶中以合适的细胞数量和培养基体积进行悬浮培养。最后使用pei将质粒dna转染到expi293细胞中。在生产过程中使用octet red96测量转染细胞上清液中的抗体浓度。根据抗体浓度，在转染后5至7天收集上清液并通过在1300g下离心10分钟进行澄清。纯化基于三步纯化过程。首先，captureselect
tm fcxl亲和基质(thermo fisher scientific)用pbs洗涤，然后加入澄清的上清液中。在 4℃和20rpm下孵育过夜后，将上清液以2000g离心10分钟，储存流出液并用pbs洗涤树脂两次。然后，将树脂转移到amicon pro柱上，使用ph 3.0的含有50mm甘氨酸的溶液进行洗脱。产生几个洗脱级分，用tris-hcl ph7.4中和并合并。使用nanodrop分光光度计(nanodrop technologies,wilmington,del.)对含有总人igg(双特异性和两种单特异性抗体)的库进行定量，然后在rt和20rpm下与适当体积的captureselect
tm kappaxl亲和基质(thermo fisher scientific).ge healthcare)孵育30分钟。如前所述进行树脂回收和洗涤、洗脱和中和步骤。最后的亲和纯化步骤是使用captureselect
tm
λfab亲和基质(thermo fisher scientific)进行的，应用与κ纯化步骤相同的过程。汇集所有洗脱级分并使用50kda amicon ultra离心过滤器单元(merck millipore)针对his-nacl ph6配制缓冲液脱盐。使用nanodrop对最终产品进行量化。
[0497]
如制造商(agilent technologies,santa clara,calif.,usa)所述，使用带有protein 80试剂盒的agilent 2100bioanalyzer在变性和还原条件下通过电泳分析纯化的双特异性抗体。将4μl纯化样品与补充有二硫苏糖醇(dtt；sigma aldrich，st.louis，mo.)的样品缓冲液混合。样品在95℃下加热5分钟，然后加载到芯片上。使用鲎变形细胞裂解物测试(lal；charles river laboratories,wilmington,mass.)来测试所有样品的内毒素污染。
[0498]
实施例7：单价和双特异性抗体的体外表征
[0499]
a)单价和双特异性抗体与表达ceacam5的细胞和不表达ceacam5的细胞的结合
[0500]
为了证明cd3 x ceacam5κλ抗体与靶细胞的结合，可以进行一系列基于流式细胞术的实验，将cd3xceacam5κλ抗体的结合与其单价对应物进行比较。可以使用的细胞的实例包括ceacam5阳性细胞系，例如胃腺癌细胞系mkn45(每个细胞表达155’000个ceacam5分子)，或胰腺腺癌细胞系hpaf-ii(每个细胞表达108’000个ceacam5分子)或结直肠腺癌细胞系ls174t(每个细胞表达26’000个ceacam5分子)和ceacam5阴性细胞系，例如通过crispr-cas9方法产生的肺癌细胞系a549和mkn45 ceacam5敲除细胞系。可以如上所述进行细胞染色和结合评估。获得的结合曲线如图4、5、11和14所示。与mkn45细胞的结合的ec50值可以使用graphpad prism8计算；数据显示在表4中。与tcb2014的结合相比，本发明的bsab在200nm、1000nm和5000nm下的结合高40％或更高(参见表4以及图11和14)。
[0501]
表4：与mkn-45细胞的结合ec50。n/a：不适用
[0502] ec50(nm)最高mfi值ab17l3-1/n59.2862’218ab54l3-1/n66.4759’782ab60l3-1/n64.1989’186ab66l3-1/n24.3759’391ab71l3-1/n34.1833’116ab72l3-1/n24.5962’960ab73l3-1/n27.8920’523y4l3-1/nn/an/atcb201411.6327’315
[0503]
b)单价和双特异性抗体与表达cd3的细胞和不表达cd3的细胞的结合
[0504]
为了证明cd3 x ceacam5 κλ抗体与效应t细胞的结合，可以进行一系列基于流式细胞术的实验，将cd3xceacam5 κλ抗体的结合与其单价对应物进行比较。可以使用的细胞的例子包括人原代t细胞以及cd3阳性(jurkat和/或hut78)或cd3阴性(tib-153和/或jkt-beta-del)细胞系。可以如上所述进行细胞染色和结合评估。结果如图3和图10所示。
[0505]
c)通过与参考抗体竞争进行ceacam5抗体的表位分仓
[0506]
表位分仓是一种竞争性免疫测定，用于表征根据本发明的抗体的结合或例如第一结合部分的相关抗cea(靶蛋白)抗体的结合。针对也与该靶蛋白结合并且已经建立/公开了结合表位的抗体创建了与靶蛋白结合的抗体的竞争性阻断谱。与这些参考抗体中的一种的竞争表明抗体具有相同或位置接近的表位，并且它们被“分仓”在一起。作为本发明的双特异性抗体的一部分的抗ceacam5臂与抗ceacam5参考抗体竞争的能力使用重组人ceacam5和
以下携带小鼠fc区的参考抗体通过elisa进行测试：sm3e，衍生自专利us20050147614a1中描述的sm3e的mab的序列，使用标准方法产生的mab；medi，衍生自专利wo2016036678a1中描述的medi-565的mab；ch1a1a，衍生自专利us20120251529和klein等人oncoimmunology,2017jan 11；6(3)中描述的ch1a1a-2f1的mab。sm3e更多地结合到cea的n末端，细胞膜远端部分，medi结合到中间部分，ch1a1a结合到靠近膜的位置。
[0507]
以1μg/ml使用的κλ体被以10μg/ml包被在96孔黑色微孔板上并用封闭缓冲液(pbs 2％bsa,0.05％tween 20)封闭的山羊抗人igg(fcγ)(jackson immunoresearch)捕获。将竞争igg(0.03至20μg/ml)与0.1μg/ml生物素化的人ceacam5在封闭缓冲液中预孵育1小时。洗涤κλ体板并与预孵育的竞争igg/ceacam5混合物孵育1小时。洗涤后，用链霉亲和素-hrp(jackson immunoresearch)检测ceacam5。用amplex
tm red试剂(molecular probes)显露板并在synergy ht酶标仪(biotek)上测量荧光信号。
[0508]
如果相应工具抗体将ceacam5与κλ体的结合降低80％或更多，则可以得出结论，ceaxcd3双特异性抗体被分类为与工具抗体竞争结合。因此，如果添加和不添加工具抗体的结果相比ceacam5与相应κλ体的结合减少20％或更少，则ceaxcd3抗体被鉴定为与工具抗体无竞争性。
[0509]
d)双特异性抗体与人原代血细胞的结合
[0510]
为了证明cd3 x ceacam5κλ抗体与原代t细胞的结合，以及缺乏与原代b细胞和单核细胞(cea阴性群体)的结合，可以进行一系列基于流式细胞术的实验。可以如实施例7a中所述进行细胞染色和结合评估。数据如图13所示。
[0511]
实施例8：双特异性抗体介导的t细胞依赖性细胞毒性(tdcc)
[0512]
a)ceacam5阳性和ceacam5阴性细胞系的tdcc
[0513]
由本发明的ceaxcd3双特异性抗体诱导的不同ceacam5阳性和ceacam5阴性肿瘤细胞系的t细胞依赖性细胞毒性(tdcc)使用人pbmc或纯化的原代t细胞作为效应细胞进行评估。
[0514]
用pbs洗涤两次后，用胰蛋白酶或细胞解离溶液分离靶细胞。在离心步骤之后，将细胞重新悬浮在测定培养基中，调整至所需浓度并铺板在96孔板中。
[0515]
效应细胞可以是人外周血单核细胞(pbmc)或纯化的t细胞。使用带有lymphoprep
tm
缓冲液(stemcell technologies)的sepmate
tm
管(stemcell technologies)从源自健康人类供体的血沉棕黄层中分离pbmc。如果将纯化的t细胞用作效应细胞，则执行额外的纯化步骤，其中使用t细胞免疫磁性阴性选择试剂盒(stemcell technologies)从pbmc中负向分离t细胞。
[0516]
对于tdcc测定，当pbmc用作效应细胞时，这些细胞以10:1的最终e:t比率添加到靶细胞中；当使用纯化的t细胞时，使用5:1的最终e:t比率。然后将本发明的ceaxcd3抗体和相关对照抗体以剂量范围浓度(最多100nm，一式两份)添加到预铺板的靶细胞和效应细胞中。在37℃、5％co2下孵育24小时、48小时或72小时后，通过量化凋亡/坏死细胞释放到培养基中的ldh(cytotoxicity detection kitplus(ldh)，roche)来评估靶细胞杀伤。通过用1％triton x-100孵育靶细胞来获得最大ldh释放(＝100％裂解)。自发ldh释放(＝0％裂解)是指在没有添加任何抗体的情况下与效应细胞共孵育的靶细胞。tdcc曲线(图6、7、12和15)和ec50值(表5)可以使用graphpad prism8计算。对于mkn-45和ls174t细胞系，用表5中所示的
本发明的bsab发现的ec50显著低于用tcb2014测量的ec50，表明本发明的这些bsab的体外肿瘤细胞杀伤的效力更高。
[0517]
表5三种cea 细胞系的杀伤ec50
[0518]
ec50(nm)mkn45hpafiils174tab17l3-1/n0.110.160.25ab54l3-1/n0.110.100.13ab60l3-1/n0.130.280.21ab66l3-1/n0.050.200.22ab71l3-1/n0.090.160.16ab72l3-1/n0.020.120.11ab73l3-1/n0.030.130.06tcb20140.850.451.87y4l3-1/nn/an/an/a
[0519]
b)通过ceaxcd3和ceaxcd47双特异性抗体的组合的杀伤测定
[0520]
本发明的双特异性抗体与抗cd47 mab(例如在us20140140989和wo2017196793中描述)或与ceaxcd47双特异性抗体(在pct/ib2019/054559中描述，通过引用并入本文)的组合可以在上文描述的模型中进行测试。将额外的测试条件添加到实验设计中，其中这种靶向cd47的抗体(单特异性或双特异性)单独地或与本发明的ceaxcd3抗体组合地以不同剂量使用。
[0521]
c)在由ceaxcd3 bsab诱导的表达cea的肿瘤细胞的杀伤后t细胞活化标志物的上调
[0522]
由ceaxcd3 bsab诱导的cea阳性肿瘤细胞的杀伤需要t细胞活化，这可以使用识别特定t细胞活化标志物如cd69(早期活化标志物)或cd25(晚期活化标志物)的抗体通过流式细胞术进行量化。
[0523]
为了在杀伤测定(如上所述，实施例8a)结束时评估t细胞的活化状态，遵循以下程序：将漂浮细胞(包括cd4 和cd8 t细胞)转移到新的v形底96孔板中。通过离心去除上清液(在4℃下3分钟，1300rpm)，细胞用冷的facs缓冲液(pbs 2％bsa，0.1％nan3)洗涤两次，然后在4℃下与fc封闭试剂(bd biosciences)一起孵育15分钟。用facs缓冲液洗涤两次后，将细胞与以下抗体(根据制造商的建议使用)在4℃下孵育15分钟：抗cd45(v500缀合，bd biosciences)、cd69(fitc缀合，biolegend)、cd8(percp-cy5.5-缀合，biolegend)，cd25(pe-缀合，biolegend)，cd4(apc-缀合，thermofisher)，cd3(apc-r700-缀合，bd biosciences)。
[0524]
用冷的facs缓冲液洗涤细胞两次并重新悬浮于200μl facs缓冲液中。使用cytoflex platform(beckman coulter)测量荧光，并使用flowjo
tm v10软件(bd life sciences)分析数据。结果如图17所示。
[0525]
d)ceaxcd3 bsab分子诱导的t细胞增殖
[0526]
分析ceaxcd3 bsab在cea阳性肿瘤靶细胞的存在下交联后诱导t细胞增殖的能力。作为阴性对照，还使用了cea阴性恶性细胞。将新鲜分离的人pbmc在温pbs中调整为每毫升100万个细胞，并在pbs中在37℃下用0.2μm羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse，
thermofisher scientific)染色15分钟，用完全rpmi培养基(含10％fcs、2mm l-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠、10mm hepes、50μm 2-巯基乙醇和25μg/ml庆大霉素)洗涤几次，并以2x106个细胞/ml转移到96孔板中。在平底96孔板的每孔中接种0.02x106个靶细胞，并以指定浓度添加不同的ceaxcd3 bsab。添加cfse标记的pbmc以获得10:1的最终e:t比率，并将测定板在湿润培养箱中在37℃下孵育5天。第5天，收集效应细胞，用facs缓冲液(pbs，2％bsa，0.1％nan3)洗涤两次，然后用bd horizon 620(bd biosciences，564996)染色细胞以排除死细胞，并用抗cd45(v500-缀合，bd biosciences)、抗cd4-apc(thermofischer,17-0049-41)和抗cd8-percp-cy5.5(biolegend,301032)染色。使用cytoflex(beckman coulter)通过流式细胞术分析活cd4 或cd8 细胞的cfse染色，并通过flowjo软件评估结果。
[0527]
e)由ceaxcd3 bsab诱导的表达cea的肿瘤细胞的杀伤后，上清液中释放的细胞因子
[0528]
由ceaxcd3 bsab诱导的cea阳性肿瘤细胞的杀伤需要t细胞活化。活化后，t细胞可以释放多种细胞因子，这些细胞因子可以进一步充当免疫调节剂。本发明的双特异性抗体在杀伤表达cea的肿瘤细胞时诱导t细胞释放细胞因子的能力通过在实施例8a中描述的tdcc测定结束时定量上清液中的选定细胞因子来评估。在cea阳性靶细胞和cd3阳性效应t细胞的共培养2天后，通过离心收集培养上清液并在-80
°
下冷冻保存直至进一步分析。使用mesoscale discovery platform，通过使用多重试剂盒对细胞因子/酶(例如颗粒酶b、il2、il6、il10、tnfα和ifnγ)进行定量，结果如图16所示。
[0529]
f)在脱落的cea的存在下ceacam5阳性细胞的tdcc
[0530]
已知cea阳性肿瘤会脱落cea。这种脱落的cea可能对不优先结合膜结合的cea的cea靶向抗体的抗肿瘤功效产生负面影响。为了评估本发明的双特异性抗体是否受到脱落的cea(scea)的影响，在不同浓度的掺入scea(biorad#php282)的存在下进行实施例8a中描述的t细胞依赖性细胞毒性(tdcc)测定。然后将存在scea时的ec50值与不存在scea时获得的ec50进行比较(表6)。然后将针对给定scea浓度(0.2、1或1μg/ml)计算的ec50与在不存在scea(0μg/ml)时获得的ec50进行比较，并表示为与无脱落cea条件相比的ec50倍数变化。这些值在表7中报告。
[0531]
表6在scea存在下ls174t细胞的杀伤的ec50
[0532]
[0533][0534]
*无最高平台
[0535]
期
[0536]
表7与无脱落cea条件(0μg/ml)相比的ec50倍数变化
[0537][0538]
*无最高平台
[0539]
期
[0540]
在1和5μg/ml scea下，与本发明双特异性抗体相比，如果为tcb2014和tcb2017添加scea，则发现对于肿瘤细胞杀伤的ec50有显著更高的偏移。在cea阳性肿瘤患者中发现1μg/ml及以上浓度的scea。本发明bsab的杀伤曲线由于scea引起的较低偏移表明与tcb2014和tcb2017相比，高scea水平对本发明bsab的功效的抑制作用较小。
[0541]
g)ceacam5阴性原代血细胞群的tdcc。
[0542]
鉴于ceaxcd3双特异性抗体的作用机制，与其他ceacam的交叉反应可能导致重要的循环健康细胞群的消耗。例如，与中性粒细胞表达的ceacam8的交叉反应可能导致此类细胞群的消耗。为了确认不存在结合，并因此不存在杀伤这种cea阴性循环健康细胞群，在实施例8a中描述的实验程序中，使用纯化的原代细胞如中性粒细胞代替cea阳性细胞系作为“靶细胞”。
[0543]
实施例9：在人源化小鼠肿瘤模型中评估ceaxcd3 t细胞重新靶向分子作为单一药剂或与cd47靶向抗体的联合治疗的抗肿瘤活性
[0544]
a)ceaxcd3分子在pbmc人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
[0545]
将8-10周龄的nog小鼠(nod/shi-scid/ol-2rγ
null
小鼠,taconic biosciences)皮下(s.c.)植入1至5x106个cea阳性肿瘤细胞(细胞系来源或患者来源)并随机分为几个治疗组。4到7天后，所有小鼠都被i.p.或i.v.注射10或20x106个人pbmc(外周血单核细胞)用于人源化过程。然后在pbmc注射后3-6天开始每周一次或两次以不同剂量i.v.施用cd3xcea分子或对照。每周3次监测小鼠的肿瘤发展，并通过数显卡尺测量肿瘤，直到实验结束(肿瘤体积＝1500mm3或gvhd症状发作)。使用公式(长x宽2)x0.5计算肿瘤体积。在研究终止时使用单因素anova比较分析进行统计分析。图19显示了将100万个hpaf-ii细胞皮下移植到nog小鼠中并随后注射1000万个人类pbmc的实验结果。
[0546]
b)ceaxcd3分子在cd34 -人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
[0547]
完全人源化的cd34 -hunog小鼠(cd34 移植的nod/shi-scid/ol-2rγ
null
小鼠，taconicbiosciences)，14周龄，血液中含有》25％的人类cd45

细胞，皮下(s.c.)植入1至5x106个cea阳性肿瘤细胞(细胞系来源或患者来源)并随机分为几个治疗组。当平均肿瘤体积达到预定值(范围从100到200mm3)时，每周一次或两次以不同剂量静脉内施用cd3xcea分子或对照。每周3次监测小鼠的肿瘤生长情况，并通过数显卡尺测量肿瘤直至实验结束(肿瘤体积＝1500mm3)。使用公式(长x宽2)x0.5计算肿瘤体积。在研究终止时使用单因素anova比较分析进行统计分析。
[0548]
c)与cd47靶向抗体(单特异性或双特异性)组合的ceaxcd3分子在人源化小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
[0549]
本发明的双特异性抗体与抗cd47 mab(例如在us20140140989和wo2017196793中描述)或与ceaxcd47双特异性抗体(在pct/ib2019/054559中描述，通过引用并入本文)的组合可以在上文描述的模型中进行测试。额外的组被添加到实验设计中，包括每周一次或两次以不同的剂量静脉内施用单独的或与本发明的ceaxcd3抗体组合的cd47靶向抗体(单特异性或双特异性)的治疗组。
[0550]
d)与cd47靶向抗体(单特异性或双特异性)组合的ceaxcd3分子在转基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
[0551]
本发明的双特异性抗体与抗cd47 mab(例如在us20140140989和wo2017196793中描述)或与ceaxcd47双特异性抗体(在pct/ib2019/054559中描述，通过引用并入本文)的组合可以在经工程改造以表达人cd3、人cd47和人sirpα的转基因小鼠中进行测试，该小鼠皮下(s.c.)植入0.5至5x106个经工程改造以表达人cea和人cd47的小鼠肿瘤细胞。当平均肿瘤体积达到预定值(范围从100到200mm3)时，小鼠被随机分配。每周一次或两次以不同剂量静脉内施用治疗。每周3次监测小鼠的肿瘤生长情况，并通过数显卡尺测量肿瘤直至实验结束(肿瘤体积＝1500mm3)。使用公式(长x宽2)x0.5计算肿瘤体积。在研究终止时使用单因素anova比较分析进行统计分析。
[0552]
实施例10：在来自健康人类供体人血的全血和pbmc中测试的细胞因子释放
[0553]
使用全血(wb cra)在水性呈递中通过测试抗体(95％v/v血液)进行最小稀释的情
况下进行体外细胞因子释放测定。这种测定形式被认为密切模拟体内环境，包含可能影响细胞因子释放机制的生理浓度下的因子。然而，这种形式被认为不能很好地预测t细胞介导的细胞因子释放(例如，抗cd28)。
[0554]
可替代地，可以使用来自健康人类供体的外周血单核细胞(pbmc)和水性呈递(水相，ap)中的抗体进行细胞因子释放测定，以评估t细胞介导的细胞因子释放(pbmc ap cra)。这种形式限制了mab的交联，以避免在交联时对抗cd3抗体观察到的高细胞因子释放。
[0555]
与cea x cd3双特异性抗体平行测试每种测定形式的阴性对照(抗egfr mab和pbs)以及特定阳性对照(抗cd52 mab、cea x cd3 bite和/或抗cd28 mab)。wb cra的24小时和pbmc ap cra的48小时后，使用电化学发光作为读出(mesoscale discovery，sector 600)在多重测定中测试上清液的细胞因子。对wb cra测量ifnγ、tnfα和il-6，对pbmc ap cra测量ifnγ、il-2、il-10和tnfα。绘制每个细胞因子的结果，其中每个供体显示为单个数据点。
[0556]
实施例11：通过使用简并寡核苷酸的寡核苷酸定向诱变进行cea抗体亲和力成熟(前导优化；lo)
[0557]
选择在实施例3中描述的筛选过程中鉴定的抗体进行亲和力成熟以增加它们的亲和力和效力。所有这些抗体共有相同的可变重链，但具有不同的可变轻链。ab1和c11含有一条κ轻链(根据imgt命名法，分别为igkv3-11和igkv1-5)，而ab8和1b4含有一条λ轻链(分别为iglv2-14和iglv3-21)。通过在轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3中引入多样性而重链可变区保持未修饰来产生几个展示scfv变体的噬菌体文库。不同的多样化策略用于为每个候选物生成文库，其中cdrl1 cdrl2；或仅cdrl3，或所有三个cdrl通过使用简并寡核苷酸对亲本序列的寡核苷酸定向诱变而多样化(cdrl1 cdrl2 cdrl3)。cdrl1在1到5个氨基酸位置上多样化；cdrl2在1到4个氨基酸位置上多样化，而cdrl3在1到5个氨基酸位置上多样化。为每个候选物生成了总共最多5x109个转化子，部分覆盖了最多10
14
个理论多样性。
[0558]
对于候选物ab1和1b4，产生了在所有cdrl中最多17个氨基酸位置上多样化的额外文库，具有最多5x109个转化子，部分覆盖了最多10
21
个理论多样性。
[0559]
这些文库用于如实施例2中所述的噬菌体展示选择，除了可以通过在不同的选择回合之间将重组hceacam5的浓度从100nm逐渐降低至0.01nm或使用类似于snuc-1细胞系的表达较低水平的hceacam5的细胞在回合之间增加选择严格性。使用实施例3中描述的测定法筛选所选变体与ceacam5结合的能力。将阳性克隆重新格式化为igg并分别如实施例4和5中所述进行表征。
[0560]
在两个连续的前导优化波中优化了抗cea臂ab1(seq id no：31至34)。第1波导致抗cea臂ab13、ab14、ab15、ab17和ab20。第2波导致抗cea臂ab54、ab60、ab66、ab71、ab72和ab73。
[0561]
实施例12：肿瘤来源的类器官的tdcc(t细胞依赖性细胞毒性)和/或tdcc加adcp
[0562]
肿瘤细胞来源的类器官是一种先进的转化模型，用于测试t细胞重新靶向化合物和/或巨噬细胞和nk细胞重新靶向化合物。
[0563]
根据标准程序(sch
ü
tte等人,nature communications 2017；doi:10.1038/ncomms14262)制备类器官，并在pbmc和体外产生的巨噬细胞的共培养物中与化合物一起孵育长达8天。每4天更换一次培养基并更换为新鲜培养基。
[0564]
收集类器官并使用accutase在37℃下5分钟将其酶促解离成单细胞。沉淀细胞，将其重新悬浮于facs缓冲液(pbs、2％fbs、2mm edta)中，并通过400μm细胞过滤器过滤。将等量细胞数的悬浮液与针对cd45、cd4、cd8、cea和cd14的抗体(均来自thermo fisher scientific，dreieich，germany)在冰上孵育30分钟。对于活细胞门控，使用碘化丙啶，使用flowjo软件(flowjo,llc,ashland,or,usa)测量和分析。
[0565]
将来自每个孔的上清液在-80℃冷冻，用于通过使用elisa分析t细胞活性。
[0566]
实施例13：患者来源的肿瘤组织切片的tdcc和/或tdcc加adcp
[0567]
患者来源的新鲜肿瘤组织切片是另一种先进的转化模型，用于测试t细胞和/或巨噬细胞和/或nk细胞重新靶向化合物。
[0568]
新鲜的肿瘤组织样品将根据先前公布的标准程序(等人,clinical colorectal cancer,17(2018)e189-e199)进行切割。简而言之，在手术切除和第一次宏观病理学评估后立即使用组织切碎机(mcilwain tc752；campden instruments,leicestershire,england)将肿瘤样品切成350μm的切片。然后通过使用3-mm取芯工具(kai europe,solingen,germany)标准化组织切片直径。随机汇集三个组织切片，置于膜插入物上，并在6孔板中培养。切片在37℃和5％co2的标准条件下孵育。在处理前在制备后2小时和24小时更换培养基。
[0569]
在标准细胞培养基中预培养24小时后，切片三联体可分别暴露于单独或组合的根据本发明的双特异性抗体长达120小时。如有必要，孵育时间缩短至72小时。培养基将在72小时后更换。
[0570]
化合物暴露后，肿瘤切片使用4％多聚甲醛固定过夜。每个孔的上清液将在-80℃下冷冻，用于使用elisa分析t细胞活性。
[0571]
将多聚甲醛固定的切片嵌入石蜡中并加工成5μm切片。进行苏木精和伊红(he)染色以评估组织病理学方面和肿瘤细胞比例。通过免疫荧光染色分析总细胞计数、肿瘤细胞计数和增殖。简而言之，将石蜡切片脱蜡。抗原修复后，切片用0.3％pbs/tritonx洗涤并用5％正常山羊血清(jackson immunoresearch,suffolk,uk)封闭30分钟。将分别针对细胞角蛋白ki67和切割的parp的一抗稀释在0.5％牛血清白蛋白中，并在4℃下孵育过夜。切片用0.3％磷酸缓冲盐水/tritonx冲洗并用二抗标记。细胞核用hoechst 33342(sigma-aldrich,st.louis,mo)染色。为了进一步分析，取决于肿瘤切片的可用性，包括针对cea(肿瘤细胞)、cd163(巨噬细胞)和cd3、cd4、cd8、pd-l1和foxp3(所有t细胞)的抗体。
[0572]
使用载玻片扫描(pannoramic scan和pannoramic viewer,3d histech,budapest,hungary)在he切片中分析含有肿瘤细胞的区域，以研究不同的肿瘤细胞级分。包含比肿瘤上皮细胞更多的良性上皮细胞的切片被排除在分析之外。不包含肿瘤细胞的切片被排除在增殖的肿瘤细胞级分的分析之外，但包括在每种状况下的肿瘤细胞分析中。为了进一步分析，使用olympus bx51荧光显微镜(olympus deutschland，hamburg，germany)从荧光染色切片中拍摄每个组织切片5张照片(20x)。使用image j的染色特异性分割算法确定hoechst 33342、细胞角蛋白、ki67和切割的parp染色的阳性像素计数。通过分析被细胞角蛋白阳性像素包围的ki67/切割的parp阳性细胞核的像素计算增殖/凋亡肿瘤区域。
[0573]
对于每张照片，计算总细胞计数(hoechst阳性)、肿瘤细胞计数(hoechst和细胞角
蛋白阳性)和增殖的肿瘤细胞计数(hoechst、细胞角蛋白和ki67阳性/切割的parp)。将肿瘤细胞计数标准化至总细胞计数，增殖的肿瘤细胞计数标准化至肿瘤细胞计数，以考虑每张照片的不同肿瘤细胞级分。然后从单个图像值计算平均切片值。使用平均切片值计算状况的平均值。
[0574]
所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和包括本文引用的多核苷酸和多肽序列在内的登录号/数据库序列均以引用方式整体并入本文以用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利相同申请、互联网站点或登录号/数据库序列被具体地和单独地指出以通过引用的方式并入。