一种沙海蜇水母多肽在制备减肥药物中的应用

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种沙海蜇水母多肽在制备减肥药物中的应用。


背景技术：

2.随着人们的饮食模式发生重大变化，动物源食品、精制谷物和高度加工、高糖和高脂食品的消费量增加，肥胖已成为一个主要公共卫生问题。超重和肥胖的人群数量在过去四十年中迅速增加。根据2015-2019全国患肥胖率的统计结果：6岁以下儿童超重约为6.8％，肥胖占3.6％；6-17岁儿童和青少年超重约为11.1％，肥胖占7.9％；成人超重率约为34.3％，肥胖率为16.4％(≥18岁)。研究人员预测，直到2030年，超重和肥胖的患病率和人数及相关的医疗费用会继续增加，这将给医疗体系带来了巨大的经济负担。
3.此外，重度肥胖患者还会伴随着明显的健康问题，比如心血管疾病、糖尿病、心脏病、慢性肾病和癌症等，导致预期寿命缩短。目前，适合人群的有效生活方式的干预措施很少，监管机构批准的减肥药物不足，医疗机构和公众对非生活方式干预(比如手术)的接受度较低。在一部分患者中，减肥手术与心理健康的不良影响有关，包括自杀或自残的风险增加，以及出现抑郁症和药物使用障碍。目前，寻找安全高效的药物是应对肥胖症挑战的关键。
4.水母多肽是近年来兴起的天然生物材料，具有潜在的社会经济价值。目前还没有人研究其在减肥药物中的应用。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种沙海蜇水母多肽在制备减肥药物中的应用，以达到提供一种安全有效的减肥新组分的目的。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种沙海蜇水母多肽在制备减肥药物中的应用。
8.上述方案中，所述沙海蜇水母多肽的分子量小于5000da。
9.进一步的技术方案中，所述沙海蜇水母多肽的分子量小于3000da的比例大于80％。
10.更进一步的技术方案中，所述沙海蜇水母多肽的分子量小于1000da的比例大于40％。
11.更进一步的技术方案中，所述沙海蜇水母多肽的分子量小于1000da的比例为49.77％，分子量在1000-2000da的比例为29.17％，分子量在2000-3000da的比例为8.31％，分子量在3000-4000da的比例为6.78％，分子量在4000-5000da的比例为5.97％。
12.上述方案中，所述沙海蜇水母多肽为脱盐水母伞部或口腕部的酶解物。
13.上述方案中，所述沙海蜇水母多肽由木瓜蛋白酶酶解获得，木瓜蛋白酶的使用单位为2621u/g，液固比为6:1，在60℃、ph为6条件下酶解4个小时。
14.上述方案中，所述沙海蜇水母多肽在浓度《800μg/ml时，对3t3-l1脂肪细胞没有毒性。
15.上述方案中，所述沙海蜇水母多肽在浓度为200-600μg/ml时，对3t3-l1高脂细胞模型具有降低脂质积累的作用。
16.通过上述技术方案，本发明提供的一种沙海蜇水母多肽在制备减肥药物中的应用具有如下有益效果：
17.本发明以天然可食用的沙海蜇伞部或口腕部为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，筛选出一种具有强降低脂质积累的活性的沙海蜇水母混合多肽，沙海蜇水母多肽对胰岛素诱导后的3t3-l1高脂细胞模型具有明显的降低脂质积累的作用，对于开发高效低毒的海洋减肥创新药物具有重要意义。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
19.图1为沙海蜇水母多肽对3t3-l1细胞内脂质积累的影响。其中上标a和b代表差异性，a与b有差异，a与ab没有差异，b与ab没有差异。
20.图2为沙海蜇水母多肽对3t3-l1前脂肪细胞活性的影响。其中将pbs对照组的细胞活性设为1，上标a和b代表差异性，a与b有差异。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
22.一、沙海蜇水母多肽的制备如下：
23.取沙海蜇的伞部或口腕部，清洗干净后匀浆，按液固比6:1的比例加入去离子水，按照每克沙海蜇匀浆物加入2621u木瓜蛋白酶加入木瓜蛋白酶后，搅拌均匀，调节ph至6，在60℃下酶解4小时。酶解结束后，取酶解液100℃加热10min钝化灭酶，离心，取上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至初始体积的1/4后，冷冻干燥即得沙海蜇水母多肽。
24.上述实施例中，对离心、浓缩、冻干条件不做限制，根据本领域常规的方法即可。
25.根据国标gb/t 22492(大豆肽粉)中的方法对沙海蜇水母多肽蛋白含量、多肽含量及分子量分布进行测定，结果见表1。
26.表1沙海蜇水母多肽的分子量分布情况
[0027][0028]
二、沙海蜇水母多肽对3t3-l1脂肪细胞的降低脂质积累的效果
[0029]
将3t3-l1前脂肪细胞用含10％胎牛血清的高糖dmem在37
°
、5％co2条件下培养，细胞状态良好时以2
×
104细胞/ml的密度接种于24孔板，细胞长至融合2天后，培养基换为含1
μm地塞米松(dex)、0.5mm异丁基-3-甲基黄嘌呤(ibmx)、10μg/ml胰岛素(ins)和10％胎牛血清的高糖dmem诱导培养基，培养72小时，之后换以含10μg/ml胰岛素和10％胎牛血清的高糖dmem继续培养6天，每隔两天更换一次培养基。诱导期间分别将100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽加入培养基。pbs组作为胰岛素诱导实验的阴性对照组。待胰岛素诱导组(mdi)细胞产生90％以上油滴时进行实验。
[0030]
弃去皿中培养液，用pbs洗涤细胞3次后，用10％中性甲醛固定30min。弃去固定液，pbs洗涤3次，稍微晾干后加入油红o染色液于烘箱60℃染色15min，注意保鲜膜封口避免溶剂挥发。染色完毕，清水洗涤3次后晾干，用于显微镜观察拍照。拍照结果使用image j软件量化。control组为未经胰岛素诱导的对照组，脂质积累为0。
[0031]
当用胰岛素刺激3t3-l1前脂肪细胞时，细胞内油红o染色量在9天后显著升高(图1)。从图1中可以看到，100μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽组中未观察到显著的降低脂质积累的活性，200μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽组中观察到轻微的降低脂质积累的活性，400μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽组中观察到显著的降低脂质积累的活性，600μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽组中观察到轻微的降低脂质积累的活性，800μg/ml浓度的沙海蜇水母多肽没有降低脂质积累的活性，说明随着多肽浓度增大，降低脂质积累的效果反而会下降，即沙海蜇水母多肽的降低脂质积累的效果随着浓度增加呈先下降后上升的趋势。
[0032]
三、沙海蜇水母多肽对3t3-l1脂肪细胞的活性影响
[0033]
收集对数期3t3-l1脂肪细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个细胞/孔。置37℃、5％co2温箱培养使细胞贴壁，培养6小时。分别加入终浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml的沙海蜇水母多肽，每个剂量设3个平行实验，继续培养24小时，吸去上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10μl mtt溶液，继续培养4小时。然后吸掉上清，每孔加入110μl formazan溶解液，置摇床上低速振荡10min后测量490nm处的吸光值。pbs作为实验阳性对照组，3％dmso作为毒性对照组。用不同浓度沙海蜇水母多肽处理细胞24小时，如图2所示，沙海蜇水母多肽在浓度800μg/ml以下时，与pbs对照组相比细胞活性没有显著差异，说明800μg/ml浓度以下的沙海蜇水母多肽对细胞活性的影响没有显著差异，沙海蜇水母多肽在高剂量下对细胞依然温和无毒。
[0034]
结合沙海蜇水母多肽对3t3-l1脂肪细胞的降低脂质积累的效果，可知沙海蜇水母多肽可降低细胞脂肪含量，其中400μg/ml浓度下的沙海蜇水母多肽具有显著的抗脂肪生成活性(图1)，且800μg/ml高浓度的沙海蜇水母多肽依然对细胞活性无明显毒性(图2)。结合图1和图2的结果，说明沙海蜇水母多肽具有降低诱导后3t3-l1脂肪细胞胞内脂肪含量的活性，可作为一种安全有效的预防肥胖的候选药物。
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对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。