一种口服胰岛素脂质体水凝胶及其应用

1.本发明属于胰岛素制药技术领域，具体涉及一种口服胰岛素脂质体水凝胶及其应用。


背景技术：

2.目前，胰岛素是降低血糖含量最有效的方法，最普遍的给药途径的是注射，但同时也带来了注射的疼痛和伤口溃烂、脂肪萎缩等副作用。口服胰岛素给药的方式要优于注射给药，因为口服给药更容易被接受，避免了严重的副作用和并发症。虽然口服给药是胰岛素体内递送的较好途径，但仍需面对胃内酸性环境、胃肠道消化酶、黏液层渗透、上皮细胞吸收等挑战。胃肠道ph值变化，各种消化酶，包括胃中的酸性环境(ph 1.2-2.0)和肠中的胃蛋白酶和胰蛋白酶，使胰岛素难以维持其生物活性。此外，ph条件的变化使各种给药载体的药物渗漏，最终导致较低的口服生物利用度。
3.水凝胶作为一种在水中溶胀的聚合物网络，包含大量的水，由于其物理或化学交联而保持其结构。这类似于细胞外基质，具有较高的生物相容性和广阔的生物医学应用前景。但水凝胶由于溶胀，常出现药物渗漏现象，缓释效果差，生物利用度低等问题，通过添加内部载体制备复合凝胶是一个有效的解决途径。近几十年来，海藻酸钠等天然多糖因其生物相容性、可修饰性和易于获取的特性，被广泛用作构建口服递送载体的原料。海藻酸钠是一种从海藻中提取的阴离子多糖，能够与各种金属阳离子(如ca
2
、al
3
或ba
2
)形成“蛋盒”结构的强水凝胶。然而，作为口服给药载体，单独的海藻酸钠水凝胶作为口服递送载体往往会面临许多问题，导致其有效载荷的生物功效较低。例如，海藻酸钠水凝胶的多孔结构导致其有效载荷的早期快速释放和肠道吸收不良。此外，海藻酸钠水凝胶对肠粘膜的粘附能力较弱，在小肠表面停留时间短，导致药物吸收较低。脂质体是一种由双分子层自组装而成的球体，被广泛应用于各种药物的包封。脂质体被认为是一种理想的药物载体，可以降低全身毒性，提高治疗的耐受剂量。因此，将脂质体与水凝胶结合可减少药物泄漏和促进吸收。
4.因此，本发明提供了一种口服胰岛素脂质体水凝胶，包括载药脂质体与水凝胶结合形成，减少胰岛素的泄露，以及促进胰岛素的吸收。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种口服胰岛素脂质体水凝胶以及制备方法，用以解决口服胰岛素易被降解，吸收差，生物利用度低的技术问题。且本发明提供的制备方法为离子凝胶法和电荷吸附法，制备过程简单，无有毒有害试剂材料，具有ph响应性特点，在酸性条件下能够避免胰岛素的大量释放，促进小肠的渗透吸收，控制血糖时间长，应用前景广阔。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种口服胰岛素脂质体水凝胶，包括载胰岛素脂质体与改性海藻酸钠形成的具有核壳结构的水凝胶，所述核为载胰岛素脂质体，所述壳为改性海藻酸钠形成水凝胶框架。
8.进一步地，所述载胰岛素脂质体为胰岛素复合物、磷脂酰乙醇胺和胆固醇在有机
溶剂中经混合形成。
9.进一步地，所述胰岛素复合物为胰岛素和结合体通过静电吸附作用结合形成，且未对胰岛素进行偶联或其他化学修饰，以最大程度地保持胰岛素的功能，降低生产成本。
10.进一步地，所述结合体为带正电的氨基酸的一种，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸,优选为精氨酸。带正电的氨基酸与胰岛素通过静电吸附作用形成胰岛素复合物，不改变胰岛素的药物活性，而且可以增强细胞膜对胰岛素的吸收。
11.进一步地，所述有机溶剂为能够溶解磷脂酰乙醇胺的有机溶剂，如氯仿、乙醇、四氢呋喃、乙醚等，优选为氯仿。
12.进一步地，所述载胰岛素脂质体包括以下步骤制成：
13.a1、将胰岛素和盐酸溶液混合后，并调节溶液的ph至7.4，得溶液a；将带正电的氨基酸和去离子水混合均匀，并调节溶液的ph至7.4，得溶液b；将溶液a和溶液b按照体积比为1:1混合，得胰岛素复合物；
14.a2、将磷脂酰乙醇胺、胆固醇和有机溶剂混合均匀后，得溶液c；将胰岛素复合物和有机溶剂混合均匀，得溶液d，将溶液c和溶液d按照体积比1:1混合均匀后，在30-37℃下减压旋蒸，去除有机溶剂，所得溶液超声，得载胰岛素脂质体。
15.进一步地，溶液a中胰岛素浓度为0.1-2mg/ml，溶液b中带正电的氨基酸的浓度为1-6mg/ml。
16.进一步地，溶液c中磷脂酰乙醇胺浓度为0.1-2mg/ml,溶液c中胆固醇浓度为0.02-2mg/ml，溶液d中胰岛素的浓度为0.1-2mg/ml。
17.进一步地，所述载胰岛素脂质体的粒径为100-200nm，pdi值为0.1-0.4。
18.进一步地，所述改性海藻酸钠包括含巯基的氨基酸和海藻酸钠反应获得。
19.进一步地，所述改性海藻酸钠为含巯基的氨基酸和海藻酸钠反应获得，含巯基的氨基酸优选地为精氨酸。该改性海藻酸钠通过含巯基的氨基酸中的氨基与海藻酸钠中的羧基反应，使得海藻酸钠的分子结构中引入巯基，赋予改性海藻酸钠具有硫代聚合物的特征，利用了硫代聚合物与黏液层中富含半胱氨酸的结构域之间可以形成共价键(二硫键)，提高了改性海藻酸钠肠粘膜上的粘附性，延长了水凝胶在小肠表面停留时间，促进了肠粘膜对胰岛素的吸收。
20.进一步地，所述改性海藻酸钠包括以下步骤制成：
21.将nhs和edc加入海藻酸钠水溶液中，室温下搅拌活化10min，然后加入含巯基的氨基酸盐酸盐，搅拌反应1-48h，停止反应，然后将反应物装入透析袋中，依次用5mm hcl溶液、含有0.9wt％nacl的5mm hcl溶液、1mm hcl溶液避光0-4℃透析，最后所得溶液ph调至4.0，冷冻干燥，即得。
22.进一步地，所述含巯基的氨基酸与海藻酸钠的质量比为0.1-1:4。
23.进一步地，所述口服胰岛素脂质体水凝胶包括以下步骤制成：
24.将改性海藻酸钠溶解于载胰岛素脂质体中，然后滴加二价阳离子氯化物溶液，并搅拌形成凝胶，即可。
25.进一步地，所述水凝胶中改性海藻酸钠的浓度为3-30mg/ml。
26.进一步地，所述二价阳离子溶液的浓度为2-10mg/ml，且二价阳离子溶液与改性海藻酸钠溶液的体积比为2-7:1。
27.进一步地，所述二价阳离子为钙离子、镁离子、锌离子中的一种。
28.本发明的有益效果：
29.1.本发明首先采用带正电的氨基酸对胰岛素进行复合，获得胰岛素复合物，该复合物制备过程中未对胰岛素进行偶联或其他化学修饰，以最大程度地保持胰岛素的功能，同时具有低成本的特征，再利用胰岛素复合物、磷脂酰乙醇胺和胆固醇在有机溶剂中经混合制成载胰岛素脂质体，该脂质体对胰岛素具有较好的保护作用，显著的是，氨基酸可以在不改变药物活性的前提下，在肠道中促进胰岛素的释放，稳定发挥降血糖生物活性；最后，采用改性海藻酸钠为水凝胶的框架，实现对载胰岛素脂质体的包埋，一方面，进一步提高对胰岛素的保护作用，赋予胰岛素高稳定性，使最终获得的水凝胶可以顺利通过胃消化液，另一方面选择对胶质体进行负载，改善了水凝胶早期快速释放的缺点，显著的是，通过含巯基的氨基酸中的氨基与海藻酸钠中的羧基反应，使得海藻酸钠的分子结构中引入巯基，赋予改性海藻酸钠具有硫代聚合物的特征，利用了硫代聚合物与黏液层中富含半胱氨酸的结构域之间可以形成共价键(二硫键)，提高了改性海藻酸钠肠粘膜上的粘附性，延长了水凝胶在小肠表面停留时间，促进了肠粘膜对胰岛素的吸收；此外，水凝胶的ph敏感特性还能在酸性环境下保护胰岛素；
30.当口服胰岛素脂质体水凝胶到达肠道后发生溶胀时，带负电荷的载胰岛素脂质体水凝胶便于更好地渗透粘液从而被小肠上皮细胞吸收，进而使得胰岛素的口服生物利用度得到明显提高；
31.2.本发明采用原料为生物相容性材料，生物相容性高，采用制备方法温和；不涉及大型精密仪器，对于仪器设备的要求较低；
32.3.包括本发明制备的口服胰岛素脂质体水凝胶的制剂，患者可口服给药，与注射相比，患者的痛苦小，不需要多次给药，血糖控制平稳；且降糖效果好，降糖持续时间长，效果显著，胰岛素生物利用度高。
附图说明
33.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
34.图1：实施例4中的傅立叶红外光谱；
35.图2：实施例4中的核磁共振分析结果；
36.图3：实施例4中空白脂质体(lip)和载胰岛素脂质体(ins-lip)的分散系数，图3a为空白脂质体(lip)与载胰岛素脂质体(ins-lip)的粒径；图3b为空白脂质体(lip)与载胰岛素脂质体(ins-lip)的电位；
37.图4：实施例4中空白脂质体(lip)和载胰岛素脂质体(ins-lip)的透射电镜图像；图4a为空白脂质体(lip)，标尺为200nm；图4b为载胰岛素脂质体(ins-lip)，标尺为200nm；
38.图5：实施例5中扫描电镜结果，图5中a-c为不同放大比例下水凝胶内部载胰岛素脂质体形貌；图5中d-f从左到右为1.2,4.0和6.8ph条件下水凝胶内部；图5中g-i从左到右为1.2,4.0和6.8ph条件下水凝胶内部的磷元素定位；
39.图6：实施例7中在ph为1.2、6.8条件下，载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶中胰岛素的释放曲线：图6a为ph 1.2、4.0及6.8条件下脂质体的粒径变化；图6b在ph 1.2与6.8条件下载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶的胰岛素释放曲线；
40.图7：实施例8中载胰岛素脂质体水凝胶的细胞毒性结果；
41.图8：实施例9中载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶的细胞吸收共聚焦图像以及宏观外形图；图8a为载胰岛素脂质体水凝胶在细胞培养基中的宏观外形图；图8b为胰岛素、载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶的细胞吸收共聚焦图像；
42.图9：实施例10改性海藻酸钠(cys-alg)和未修饰海藻酸钠(alg)水凝胶的肠粘膜粘附性能测试图；图9a-图9b为特定确定时间间隔洗涤速度为2min/ml(图9a)和10min/ml(图9b)的水凝胶样品荧光显微镜照片，用image j软件分析不同照片的平均荧光强度(average fluorescence intensity)(n＝3)所得的结果图；
43.图10：实施例11在体内小肠回环共孵育1小时后，标记胰岛素(fitc-ins)、标记胰岛素复合物(fitc-ains)、标记载胰岛素脂质体(fitc-ains-lip)在回肠绒毛中的定位；绿色荧光表示细胞核，绿色荧光表示fitc；
44.图11：实施例12中胰岛素复合物(ains)、载胰岛素脂质体(ains-lip)和载胰岛素脂水凝胶(ains-lip-gel)中fitc标记胰岛素的离体小肠吸收以及改性藻酸钠(cys-alg)中巯基的还原测试图；图11a为不同配方在不同时间点的fitc-胰岛素转运量；图11b为不同配方的渗透系数；图11c为改性海藻酸钠中巯基含量在ph6.8，37℃条件下随时间的变化图；
45.图12：实施例13中口服载胰岛素脂质体、水凝胶动物降血糖的降血糖作用结果；图12a为口服载胰岛素脂质体后血液中的血糖曲线图；图12b为口服水凝胶后血液中的血糖曲线图。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例1
48.改性海藻酸钠的制备
49.将1g海藻酸钠(alg)以20mg/ml的浓度溶解于去离子水中，按照表1中的比例分别加入nhs和edc进行活化羧基10min，再加入半胱氨酸盐酸盐，并搅拌反应5小时，反应完毕后将胰岛素复合物放入透析袋中，分别用5mm hcl溶液、含0.9wt％nacl的5mm hcl溶液、1mm hcl避光4℃透析两次，然后将ph调至4.5后进行冷冻干燥，即得改性海藻酸钠(半胱氨酸-海藻酸钠修饰物)(简写cys-alg)。
50.表1
[0051][0052]
实施例2：
[0053]
对实施例1获得改性海藻酸钠(cys-alg)进行傅立叶红外光谱、核磁共振氢谱、元素分析和巯基含量测定：
[0054]
傅立叶红外光谱：将海藻酸钠(alg)、半胱氨酸(cys)和改性海藻酸钠(cys-alg)分别冻干后用进行atr-ftir分析(waltham，ma，usa)。atr-ftir的频率范围为4000cm-1-600cm-1
，分辨率为4cm-1
，共16次扫描，结果如图1所示。
[0055]
核磁共振氢谱：在氧化氘(d2o)中溶解alg、cys-alg修饰物和cys，用agilent vnmrs600 600hz 1h nmr仪测定1h核磁共振谱，扫描次数为256次，其结构如图1所示。
[0056]
由图1与2可知，海藻酸钠在被半胱氨酸修饰后，在3284cm-1
处峰强度减弱，并在1631.1cm-1
和1563.2cm-1
处出现了新峰，分别为n-h键的伸缩振动、酰胺中的c＝o键的伸缩振动、ch2-nh-ch-中c-n键的伸缩振动和nh键的摆动振动。1724cm-1
处的新峰为半胱氨酸中未反应-cooh的伸缩振动，1248cm-1
处的新峰为酰胺中c-n键的伸缩振动和n-h键的弯曲振动。此外，在核磁氢谱中3.4-4.0ppm处对应于海藻酸钠的糖环结构而2.8-3.0ppm处出现的新峰对应于半胱氨酸。以上结果表明，半胱氨酸被成功修饰到海藻酸钠上。
[0057]
修饰度测定：用元素分析仪(vario el,elementar，germany)测定了cys-alg和alg中碳、氢、氧、氮和硫的含量，根据cys-alg和alg的原子组成来计算半胱氨酸的修饰度，所得结果如表2所示，根据cys-alg与alg聚合物分子链的元素组成，特别是氮和硫的含量，推算出修饰率。cys-alg-1、cys-alg-2和cys-alg-3的交联度分别为5.0％、5.5％和6.2％(表2)。
[0058]
巯基含量测定：用5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)试剂测定cys-alg偶联物上巯基的浓度。将4mg的cys-alg修饰物溶于1ml的去离子水水中，加入0.1m的hcl溶液调节ph值4.0。然后将不同配方分别与dtnb溶液混合，室温避光保存15min。然后用紫外分光光度计记录412nm处的吸收。测定不同浓度的半胱氨酸溶液，得到标准曲线。所得结果如表2所示。
[0059]
表2
[0060]
[0061][0062]
从表2中的数据可以看出，实施例1成功将巯基接入海藻酸钠的分子结构中，赋予了改性海藻酸钠的硫代聚合物的特征，提高了改性海藻酸钠肠粘膜上的粘附性，延长了水凝胶在小肠表面停留时间，促进了肠粘膜对胰岛素的吸收。
[0063]
实施例3-1
[0064]
载胰岛素脂质体水凝胶的制备：
[0065]
步骤一、将胰岛素以2mg/ml浓度溶于10mm hcl中，并调节溶液的ph至7.4，得溶液a；将精氨酸以6mg/ml浓度溶于去离子水中，并调节溶液的ph至7.4，得溶液b；将溶液a和溶液b分别用0.22μm滤膜进行过滤，再将过滤后所得的两种溶液按照体积比为1:1混合，得胰岛素复合物；
[0066]
步骤二、将10mg磷脂酰乙醇胺和3mg胆固醇溶解在10ml氯仿中，得溶液c，取2ml氯仿并加入4ml胰岛素复合物，得溶液d；将溶液c和溶液d按照体积比1:1混合均匀后，进行减压旋蒸，完毕后对脂质体溶液进行超声2min并用0.22μm滤膜挤压3-6轮，得载胰岛素脂质体；
[0067]
步骤三、将实施例1制备改性海藻酸钠(cys-alg-2)以20mg/ml的浓度溶解于载胰岛素脂质体中，然后滴加3mg/ml的cacl2溶液，并搅拌形成凝胶，得载胰岛素脂质体水凝胶。
[0068]
实施例3-2
[0069]
空表脂质体水凝胶的制备：与实施例3-1相比，将胰岛素溶液替换成等质量的去离子水，其余与实施例3-1相同。
[0070]
实施例4
[0071]
对实施例3-2获得的胶质体(lip)和实施例3-1获得的载胰岛素脂质体(ins-lip)进行粒径、pdi值、电位表征以及透射电镜观察：
[0072]
粒径、pdi值、电位表征：采用zetasizer nano(malvern，uk)对载胰岛素脂质体和水凝胶进行动态光散射(dls)测量(尺寸、多分散系数和zeta电位)，在25℃下测量样品，在90
°
下进行散射；
[0073]
透射电镜观察：用透射电子显微镜(tem，1200ex，japan)观察脂载胰岛素脂质体和水凝胶的形态。
[0074]
上述所测结果如图3-图4所示。
[0075]
图3a为空白胶质体(lip)与载胰岛素脂质体(ins-lip)的粒径结果；图3b为空白胶质体(lip)与载胰岛素脂质体(ins-lip)的电位结果；
[0076]
由图4可知，空白胶质体的大小分布主要在80-200nm之间，而载胰岛素脂质体的粒径大小分布在100-300nm之间，zeta电位分别为-40mv和-60mv。其中zeta电位值的上升是因为添加了带正电荷的精氨酸造成的。
[0077]
由图4可知，透射电镜观察所得空白脂质体和载胰岛素脂质体均质且体积小(《200nm)，与dls分析的结果一致。
[0078]
实施例5
[0079]
对实施例3-1中所得的载胰岛素脂质体水凝胶进行透射电镜和扫描电镜形态学观察，载胰岛素脂质体水凝胶首先在不同的ph值(1.2,6.8)下膨胀至平衡，然后利用液氮进行速冻，再放置于-80℃冰箱中储存备用。喷金后，冻干载胰岛素脂质体水凝胶的导电性得到改善，并用场发射扫描电子显微镜(sem，tescanmira3，china)观察载胰岛素脂质体水凝胶的内部形貌，同时对水凝胶中磷元素进行元素分析确定脂质体在水凝胶中的分布。
[0080]
所得结果如图5所示。其中，图5中a-c为不同放大比例下载胰岛素脂质体水凝胶内部脂质体形貌；图5中d-f从左到右为1.2,4.0和6.8ph条件下载胰岛素脂质体水凝胶内部；图5中g-i从左到右为1.2,4.0和6.8ph条件下水凝胶内部的磷元素定位；
[0081]
由图5可知，所有载胰岛素脂质体水凝胶均表现出三维的孔隙结构，然而，载胰岛素脂质体水凝胶的孔径在不同ph条件下有明显的变化。在ph值为4.0时，载胰岛素脂质体水凝胶的结构表现出明显的均一性和多孔性，孔径大小约在30μm左右。当ph值为1.2时，载胰岛素脂质体水凝胶的结构向内塌陷，平均孔径减小(5-20μm)，孔隙度降低，这主要与海藻酸盐质子化程度和渗漏交联度有关。在ph值为6.8时，聚合物骨架可能发生部分质子化，孔径尺寸范围从50-100μm不等。在这种情况下，脂质体或释放的胰岛素更有可能脱离水凝胶。sem结果表明，这种载胰岛素脂质体水凝胶具有ph响应的性质，在酸性环境(ph 1.2)时交联网络收缩，在ph 6.8时膨胀成较大的孔径。此外，还观察到水凝胶中脂质体的形态如图5中a-c所示。脂质体呈近似球形，这与透射电镜结果一致。另一方面，为了研究脂质体在水凝胶中的分布，采用bruker x flash 60定位磷元素。如图5中g-i所示，红色广泛分布在载胰岛素脂质体水凝胶的三维结构表面，说明脂质体在载胰岛素脂质体水凝胶中存在且均匀分布。上述结果表明，脂质体被包裹在水凝胶的交联结构中，在不同的ph条件下，其交联程度、孔径和孔隙率都能得到调节。
[0082]
实施例6
[0083]
对实施例3-1所得的载胰岛素脂质体水凝胶进行包封效率和负载能力
[0084]
采用以下方法测定包封效率和负载能力。载胰岛素脂质体制备完成后过夜稳定，再将载胰岛素脂质体的ph值调整为7.4，用离心机以18000g离心力离心30min去除未包封的胰岛素，取上清液采用反相高效液相色谱法(rp-hplc，e2695，waters，usa)测定，色谱柱为c18 column(5μm，4.6
×
250mm)配置waters 2998uv/visible detector在25℃、1.0ml/min流速下工作。ee和lc计算公式如下：ee：包封效率％＝(胰岛素总含量-上清液胰岛素含量)/胰岛素总含量
×
100％；lc：负载能力％＝(胰岛素总含量-上清液胰岛素含量)/胶质体总质量
×
100％；
[0085]
由于反相蒸发法是将亲水药物(如胰岛素)装入脂质体的最佳方法，它可以被动地包封亲水药物，可达到高达30-50％的包封率。我们测试了载胰岛素脂质体的关联效率和负载能力，分别为75.9％和20.2％。对于亲水型胰岛素，内部的水核是唯一可以装载胰岛素的区域。因此，有机溶剂蒸发后，脂质体在形成过程中可以捕获大量的水，因此具有较高的包封效率。
[0086]
实施例7：
[0087]
对实施例3-1所得的载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶进行体外模拟缓释：
[0088]
将载胰岛素脂质体在37℃下孵育，调节ph值分别为1.2和6.8，模拟在胃肠道中的释放情况。每样样品以相同时间间隔取500μl样品,18000g离心20min。采用反相高效液相色谱法(rp-hplc，e2695，waters，usa)测定胰岛素释放量，其结果如图6a-图6b所示，其中，图6a为ph1.2、4.0及6.8条件下载胰岛素脂质体的粒径变化；图6b为在ph 1.2与6.8条件下载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体的胰岛素释放曲线；
[0089]
由图6可知，在ph 1.2的条件下，脂质体释放3h后，胰岛素释放量的百分比约为40％，而ains-lip-gel的胰岛素释放量的百分比仅为10％。结果表明，水凝胶能有效地保护载胰岛素脂质体在酸性环境下的破裂释放，防止胰岛素的渗漏。dls结果显示，载胰岛素脂质体的平均粒径大小从120nm改变到1600nm，导致胰岛素大量释放。水凝胶在ph为1.2时的sem观察和宏观形貌表明，水凝胶的交联结构缩小，孔径变小，说明水凝胶内部的交联程度更强，为胰岛素的保留提供了一个紧密的载体。此外，胰岛素在ph值1.2时带正电荷，这意味着释放的胰岛素可以与带负电荷的海藻酸钠连接，导致水凝胶结构更紧密。而在ph为6.8时，载胰岛素脂质体(ains-lip)和载胰岛素脂质体水凝胶(ains-lip-ge)的胰岛素释放量分别为22.3％和25.0％，无统计学差异。载胰岛素脂质体的粒径大小也没有显著性变化。当ph为6.8时，载胰岛素脂质体在水凝胶内部不断释放，水凝胶结构溶胀，因此水凝胶不再为脂质体提供严密的保护。同时，负电荷脂质体也可能会随着结构的膨胀而脱离水凝胶。释放6h后，载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶的胰岛素释放率分别为59.4％和35.8％。总的来说，水凝胶避免了脂质体在酸性条件下的快速性释放。
[0090]
实施例8
[0091]
对实施例3-1所得的载胰岛素脂质体水凝胶进行细胞毒性测试：
[0092]
caco-2细胞在含1％非必需氨基酸、1％l-谷氨酰胺、1％链霉素(100mg/ml)、青霉素(100iu/ml)和10％胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中培养，并在5％co2的细胞培养箱中培养。由于生物相容性是长期口服的关键特征，载胰岛素脂质体水凝胶的细胞毒性通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h溴化四唑(mtt)试验。caco-2细胞以3*104/ml的细胞密度接种于96孔板，孵育24h后贴壁。然后，更新dmem培养基，每孔加入不同浓度的脂质体水凝胶(0-4mg/ml)后孵育48h，pbs溶液作为对照。然后，除去dmem培养基，每孔用pbs溶液洗涤三次。分别将mtt滴入孔中形成甲醛晶体，5h后用dmso溶解，用酶标仪测定570nm处的吸光度来测定细胞存活率。
[0093]
所得测试数据如图7所示，对于caco-2细胞，所有浓度(0-4mg/ml)的水凝胶的细胞存活率均为》90％，这意味着载胰岛素脂质体(ains-lip-gel)对caco-2细胞没有细胞毒性。虽然在体内使用的ains-lip-gel的浓度比在这里使用的要高，但在任何时候，局部浓度都不会超过在这里使用的浓度。因此，细胞相容性数据表明ains-lip-gel具有较高的生物安全性。
[0094]
实施例9
[0095]
对实施例3-1所得的胰岛素复合物、载胰岛素脂质体、载胰岛素脂质体水凝胶进行细胞摄取试验：
[0096]
通过caco-2细胞摄取研究，研究caco-2细胞对胰岛素复合物、载胰岛素脂质体和
载胰岛素脂质体水凝胶的摄取。首先，细胞以1*104细胞/孔的密度在24孔板上生长24h。然后，移去dmem培养基，caco-2细胞分别与载胰岛素脂质体(fitc-ains-lip(fitc标记胰岛素))和载胰岛素脂质体水凝胶(fitc-ains-lip-gel)以40μg/ml的浓度孵育。孵育3h后，取出样品，用hoechest 33342染色细胞核。样品采用激光共聚焦扫描显微镜(clsm，蔡司，德国)成像。另外，在不同的时间间隔记录dmem培养基中fitc-ains-lip-gel的宏观形貌。
[0097]
所得结果如图8所示，由于水凝胶是一种缓释制剂，会导致内部脂质体的延迟释放，特别是半胱氨酸修饰-海藻酸钠的粘度较高。在本发明中，首先希望水凝胶能够保护脂质体在酸性条件下防止胰岛素的快速释放，而在小肠内较容易地释放内部脂质体。为了避免静电作用，采用带负电荷的脂质体包埋在带负电荷的半胱氨酸-海藻酸钠水凝胶内部。因此，当载胰岛素脂质体水凝胶到达肠道时，载胰岛素脂质体水凝胶逐渐溶胀不再为脂质体提供严密的保护，因此脂质体能够脱离水凝胶，来促进细胞摄取，而不是被包埋在海藻酸钠水凝胶内。因此，载胰岛素脂质体与载胰岛素脂质体水凝胶的吸收性能可能存在差异。分别从载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶中研究了胰岛素的细胞摄取。研究内部载胰岛素脂质能否被caco-2细胞吸收以及与caco-2细胞共孵育后的细胞吸收情况。载胰岛素脂质体的宏观外观如图8a所示，黄色代表fitc标记的胰岛素(fitc-ins)，可以反映出载胰岛素脂质体水凝胶的结构轮廓。可以观察到，黄色载胰岛素脂质体水凝胶在开始时完全浸泡在培养基中，呈现出完整的结构轮廓。随后4h内载胰岛素脂质体水凝胶结构逐渐扩散，在接下来的几个小时逐渐变模糊。在5h之后，培养基中几乎看不到凝胶的整体轮廓，说明水凝胶结构完全溶胀。然后，载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶别与caco-2细胞共孵育3h，clsm检测caco-2细胞对载胰岛素脂质体和载胰岛素脂质体水凝胶中firc-ins的细胞摄取情况。如图8b所示，载胰岛素脂质组绿色荧光(fitc-ins)与蓝色荧光(细胞核)叠加合并信号，表明载胰岛素脂质体被内化到caco-2细胞中。同时，与载胰岛素脂质体组相比，载胰岛素脂质体水凝胶组的绿色荧光信号较弱，说明从载胰岛素脂质体水凝胶中释放出的胰岛素较少，但仍能观察到与载胰岛素脂质体组相似的叠加合并信号。结果表明，由于载胰岛素脂质体水凝胶具有较高的黏度和溶胀性，胰岛素较缓慢地从水凝胶中释放出来。脱离水凝胶的胰岛素可能存在两部分，一部分是游离的胰岛素，另一部分是胰岛素负载的脂质体。
[0098]
实施例10
[0099]
对实施例1所得的改性海藻酸钠和海藻酸钠进行肠粘膜粘附性能测试：
[0100]
cys-alg和alg水凝胶的肠粘膜黏附能力通过之前的方法略微修改后进行测定。首先将等量的cys-alg和alg分别溶解于载胰岛素脂质体(fitc-ains-lip)中，加入cacl2形成凝胶。取雄性sd大鼠新鲜小肠组织，用预热的pbs溶液(ph＝6.8，37℃)将内容物洗涤两次。在切下所需组织时，保存小肠组织的粘膜侧，将其背面朝下放置在75mm
×
25mm玻璃载玻片上，空白组织用同样的方法冲洗。将100μl含fitc-ains-lip的cys-alg和alg水凝胶样品分别滴加到组织粘膜侧，以特定流速的预热pbs溶液冲洗不同组织样品，并通过荧光显微镜(帝肯，上海)观察。
[0101]
所示测试结果如图9所示，用10ml的pbs的冲洗后，cys-alg和alg水凝胶的afi值分别为24.3和14.6。为了进一步研究其肠粘膜粘附能力，以更高的速度用pbs溶液冲洗。cys-alg组在50ml pbs溶液洗涤一个周期后，afi值较高，为109.3，而alg组仅为13.7。尽管如此，cys-alg组和alg组的afi值在另一个洗涤周期后趋于没有明显差距。结果表明，cys-alg水
凝胶的肠粘膜粘附能力明显强于alg水凝胶。黏液/聚合物界面的黏度与聚合物的黏液粘附性能直接相关，cys-alg水凝胶较高的黏液粘附能力是由于cys中巯基的存在，巯基的存在促进了cys-alg聚合物与黏液之间额外二硫键的形成。黏液糖蛋白含有丰富的正电荷基团，这些正电荷基团来自于氨基酸，包括精氨酸和赖氨酸，它们位于半胱氨酸附近。此外，黏液与cys-alg带负电荷的-cooh相邻，有利于与巯基形成二硫键。因此，黏液更容易与硫代聚合物cys-alg形成加成二硫键，导致肠黏膜粘附能力明显增强。
[0102]
实施例11
[0103]
对实施例3-1所得的胰岛素复合物、载胰岛素脂质体、载胰岛素脂质体水凝胶进行小肠原位吸收测试：
[0104]
为了定性测定不同样品的小肠吸收，用小肠原位结扎法进行实验。将sd大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，再将大鼠腹腔沿两边纵向切开。在小肠回肠组织中选出3cm长的部分，用37℃预热的pbs溶液冲洗内容物两次后，将两端进行结扎形成小肠回环。将胰岛素(fitc-ins)、载胰岛素复合物(fitc-ains)、载胰岛素脂质体(fitc-ains-lip)溶液分别注入到小肠回环中，保持fitc-ins的浓度一致。用clsm观察不同组中fitc标记的胰岛素在大鼠小肠绒毛中的吸收情况。在30min后切断小肠回环，用37℃预热的pbs溶液冲洗2次，洗去环内的样品溶液。实验完毕后将大鼠颈椎脱位处死。然后制作5μm的回肠冰冻切片，并用dapi对小肠上皮细胞核染色，置于载玻片上。
[0105]
所得结果如图10所示，载胰岛素复合物(ains)组上皮细胞吸收的同时高于胰岛素(ins)组，说明ains可以促进回肠组织对胰岛素的摄取。载胰岛素脂质体(ains-lip)在各组小肠回环组织中荧光强度最强，表明ains-lip促进了回肠组织对ains的吸收。一般情况下，小肠会持续分泌的高粘度黏液、带负电荷的粘蛋白和各种酶，这些可以对外源物质或病原体形成较强的屏障，导致药物在肠道吸收缓慢或受限。因此，具有黏液渗透特性纳米载体，具有更好的肠道吸收潜力。由于带负电荷的ains-lip可以避免与黏液的静电结合，减少黏液的捕获，因此可以促进黏液的渗透。
[0106]
实施例12
[0107]
对实施例3-1所得的胰岛素复合物、载胰岛素脂质体、载胰岛素脂质体水凝胶进行小肠原位吸收测试进行体外小肠组织吸收测试：
[0108]
为了进一步定量测定不同配方的小肠渗透能力，首先将处死大鼠麻醉后脱颈后处死，将大鼠腹腔沿两边纵向切开，剪下回肠组织制备小肠结扎回环，每根小肠回环的长度为3cm。随后，将0.4ml胰岛素(fitc-ins)、胰岛素复合物(fitc-ains)，载胰岛素脂质体(fitc-ains-lip)和载胰岛素脂质体水凝胶(fitc
–
ains-lip-gel)注入环中，保持每组样品fitc-ins浓度一致。将小肠组织回环与10ml kreb
’‑
ringer缓冲液在37℃下低速搅拌孵育，整个过程避光。在不同的时间间隔(0.5、1、2、3h)，取出200μl体积的kreb'-ringer缓冲液待测，并加入等量的kreb'-ringer缓冲液中更新。用荧光酶标仪测定fitc-ins的转运量，所有样品均重复测定三次。巯基的量按例4中方法测定。巯基含量变化按照占初始总量的百分比表示。在pbs溶液(ph6.8，含0.9％nacl)中，37℃下检测cys-alg修饰物巯基含量的减少。将40mg cys-alg修饰物与10ml pbs溶液在37℃振荡下孵育。在预定的时间间隔内，立即取50μl样品作进一步分析，加入等量的pbs溶液，所有样品均重复测定三次。
[0109]
所得结果所图11a-图11c所示，不同组胰岛素吸收量表现出时间依赖性。fitc-ins
lip-gel。综上所述，口服ains-lip-gel和ains-lip均有明显的降糖作用。口服载胰岛素脂质体水凝后，降血糖作用从4h开始，持续到10h。
[0114]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0115]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。