复方制剂的制作方法

1.本发明涉及一种抗寄生虫药物，具体涉及一种注射在动物体内用于防治成虫及/或幼虫的寄生虫的复方制剂。


背景技术：

2.血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病，全球累计约2亿人感染血吸虫病，大部分集中在非洲，7.8亿人存在血吸虫病感染风险，每年就有 20万人死于该病。在我国流行的是日本血吸虫病，其中牛是主要传染源，对日本血吸虫感染的贡献率高达90％，为此阻断传染源-牛感染血吸虫病，则可有效防止血吸虫病。目前执行的“以机代牛”政策取得了很好的防控效果，但从成本-效益分析以及现场的实施来看，还存在可改进之处。
3.目前现场用于防治血吸虫的一线药物只有吡喹酮，对成虫具有很好的治疗效果,但由于其代谢很快，无法应用于长期预防。氯硝柳胺对尾蚴具有很强的杀灭作用。本课题组应用新的缓释技术，制备氯硝柳胺长效注射剂，应用对象为牛等家畜，直接作用于传染源，只需一次给药，操作简便，节省药物使用量和人力物力；采用皮下注射，不见光，药物稳定不易分解；制备工艺简单，只需将处方中物质混匀即可，有利于现场防治工作的进行。现场试验表明，一次给药，可以预防牛感染血吸虫病4-6个月。但氯硝柳胺长效注射剂只能预防，但对血吸虫成虫效果很差。为此，本项目结合两种抗血吸虫药物的优势，制备复方缓释剂型，用于现场血吸虫病防控。
4.包虫病(棘球蚴病)是一种严重危害人类健康和畜牧业发展的人兽共患病。囊型包虫病广泛分布于除南极洲以外的各大洲。据估计，包虫病的全球疾病负担(global burden of disease，gbd)为2
×
107至5
×
107伤残调整生命年(disability-adjusted life year，daly)，而囊型棘球蚴病相关的治疗费用及牲畜业损失每年约为20亿美元。所以，防治包虫病药物在国际市场的需求十分可观。据报道，抗绦虫、吸虫药物的需求超过1/3的市场，而开发新的犬用吡喹酮剂型以及包虫病诊断用试剂可达到每年8亿元的销售额，1.2亿元的利润，保障流行区0.66亿人的安全和5000万头以上的家畜，挽回经济损失约30亿元。
5.吡喹酮对控制包虫病具有里程碑意义，不但疗效理想，而且至今未在犬和猫中有抗药性报道。犬作为包虫病的传染源，降低其对棘球蚴原头节的感染可以有效地预防和控制棘球绦虫在疫区的传播。因此，目前采取“犬犬投药，月月驱虫”的方法，给犬每月喂食吡喹酮片剂是整个疫区控制包虫病的重要措施之一。但是，在实施过程中，由于当地人游牧的生活习性，无法做到对每只犬每个月都给药，野犬的给药就更难以实施，这样控制传染源降低疫区包虫病的传播水平难以实现。亟待发明新的缓释技术，起到给药1次可维持数月的防控效果，这样不需月月投药即可以对犬只达到数月的保护效果。
6.吡喹酮无论对成熟或未成熟的细粒棘球绦虫均作用显着，但研究发现吡喹酮对棘球绦虫的包囊期作用有限或完全没有作用，而且对其虫卵也无杀灭作用。奥芬达唑是一种新型的高效、广谱、低毒的苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物。治疗小鼠实验性泡球蚴病有较好的治疗效果,尤其是轻、中度感染小鼠泡球蚴病效果更隹,可使囊泡缩小,症状减轻,治
疗小鼠泡球蚴病效果明显优于阿苯达唑。


技术实现要素：

7.根据现有技术的缺陷，本发明主要的目的在于提供一种复方制剂，该复方制剂为缓释剂型，可以对多种抗血吸虫的成虫及/或幼虫有良好的治疗效果。
8.本发明的另一目的在于提供一种复方制剂，透过缓释剂型的复方制剂给药一次就能维持长期的防控及治疗效果，能够保护动物在感染季节甚至更长的时间不受病原侵染，进一步的可以控制寄生虫病传播，阻断动物传播寄生虫的传播链。
9.根据上述目的，本发明披露一种复方制剂，包括有第一活性成分、第二活性成分，其中以抗寄生虫复方制剂的重量组分为100，第一活性成分占复方制剂的重量组分为5～95及第二活性成分占复方制剂的重量组分为5～95。
10.在本发明较优选的实施例中，第一活性成分为吡喹酮。
11.在本发明较优选的实施例中，第二活性成分为氯硝柳胺或奥芬达唑。
12.在本发明较优选的实施例中，复方制剂进一步还包括生物可降解高分子材料、分散介质及增溶剂，且生物可降解高分子材料占复方制剂的重量组分为14.7～45.5、分散介质占复方制剂的重量组分为0～79.4及增溶剂占复方制剂的重量组分为0～45.5。
13.在本发明较优选的实施例中，生物可降解高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯或是泊洛沙姆407。
14.在本发明较优选的实施例中,分散介质可以是n-甲基吡咯烷酮或聚乙二醇400。
15.在本发明较优选的实施例中,增溶剂可以是聚维酮(聚乙烯吡咯烷酮 (pvp))、吐温80或聚乙二醇6000。
16.在本发明较优选的实施例中,复方制剂进一步还包含去离子水，且去离子水占复方制剂的重量组分为58.8～69.0。
17.本发明还披露复方制剂在制备用于抗寄生虫的药物中的用途；其中，所述寄生虫包括寄生虫的成虫和/或幼虫。
18.因此本发明的复方制剂可充分发挥两种抗血吸虫药物的优势，只给药1 次，可维持数月的防控效果，本发明的复方制剂可制备长效注射剂，应用对象为牛等家畜，操作简便，节省药物使用量和人力物力。
附图说明：
19.图1为本发明复方制剂14的奥芬达唑及吡喹酮的体外累计溶出度图。
具体实施方式
20.为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举较佳实施例进一步说明。而关于本案实施方式的说明中涉及本领域技术人员所熟知的技术内容，亦不再加以陈述。
21.本发明披露了一种复方制剂，特别是一种具有缓释剂型的复方制剂，此复方制剂可以同时预防寄生虫的成虫及幼虫，且由于缓释的功能，此复方制剂可以只给药一次，但就可在体外缓释1天或数月，具有长时间的治疗且可以不受病原侵染的潜力。其中复方制剂包
括有第一活性成分、第二活性成分，其中以复方制剂的重量组分为100，第一活性成分占复方制剂的重量组分为 5～95及第二活性成分占复方制剂的重量组分为5～95。在本发明的一实施例中，第一活性成份为吡喹酮、第二活性成分可以是氯硝柳胺或奥芬达唑。另外，在复方制剂中还包含有生物可降解高分子材料、分散介质及增溶剂，其中生物可降解高分子材料占复方制剂的重量组分为14.7～45.5、分散介质占复方制剂的重量组分为0～79.4及增溶剂占复方制剂的重量组分为0-45.5，其中生物可降解高分子材料可以是聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、泊洛沙姆407、壳聚糖、聚三亚甲基碳酸酯、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基丁酸羟基戊酸共聚物、聚羟基丁酸酯、聚原酸酯和聚酸酐类化合物中的一种或多种及其衍生物，生物可降解高分子材料的重量平均分子量较佳地为10,000～150,000。生物可降解高分子材料的重量平均分子量可以根据不同的缓释时间进行选择，当需要药物缓释时间较长时，倾向于选择分子量较高的生物可降解高分子材料，如重量平均分子量为100,000～150,000；当药物缓释时间无需很长时，倾向于选择分子量较低的生物可降解高分子材料，如重量平均分子量为16,000。
22.分散介质可以是n-甲基吡咯烷酮或聚乙二醇400，当采用聚乙二醇作为分散剂时，通常选择分子量较低的聚乙二醇，如聚乙二醇200或聚乙二醇400。
23.增溶剂可以是聚维酮(聚乙烯吡咯烷酮(pvp))、吐温80或聚乙二醇6000。另外，本发明的复方制剂还包含有去离子水，其中去离子水占复方制剂的重量组分为58.8～69.0。
24.以下是本发明针对具有缓释剂型的复方制剂的制备实施例的具体说明。
25.制备例一(复方制剂1)：
26.将0.1g吡喹酮、0.1g氯硝柳胺、0.5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物、0.2g 吐温80，溶于2ml n-甲基吡咯烷酮中，即得复方制剂1。
27.制备例二(复方制剂2)：
28.将0.1g吡喹酮、0.1g氯硝柳胺、0.5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物、0.2g 聚乙二醇400，溶于2ml n-甲基吡咯烷酮中，即得复方制剂2。
29.制备例三(复方制剂3)：
30.将0.5g泊洛沙姆407和0.2g吐温80低温(冰水浴)溶于2ml去离子水中以形成混合溶液，再将0.1g吡喹酮及0.1g氯硝柳胺加入上述混合溶液中并均匀混合，即得复方制剂3。
31.制备例四(复方制剂4)：
32.将0.5g泊洛沙姆407和0.2g聚乙二醇400低温(冰水浴)溶于2ml去离子水中以形成混合溶液，再将0.1g吡喹酮及0.1g氯硝柳胺加入上述混合溶液中并均匀混合，即得复方制剂4。
33.制备例五(复方制剂5)：
34.将1g泊洛沙姆407溶于4ml去离子水中，低温(冰水浴)搅拌溶解，再加入重量百分比14.2％的氯硝柳胺热溶液1.4ml(溶剂为n-甲基吡咯烷酮)，继续加入0.2g吡喹酮均匀混合，即得复方制剂5。
35.制备例六(复方制剂6)：
36.将0.1g吡喹酮、0.1g奥芬达唑、0.5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物、0.2g 聚乙二醇400溶于2ml n-甲基吡咯烷酮中，即得复方制剂6。
37.制备例七(复方制剂7)：
38.将1g泊洛沙姆407溶于4ml去离子水中，搅拌中加入重量百分比16.6％的奥芬达唑溶液1.2ml(溶剂为n-甲基吡咯烷酮，于n-甲基吡咯烷酮溶剂内含有0.1g聚维酮)，继续加入0.2g吡喹酮均匀混合，即得复方制剂7。
39.制备例八(复方制剂8)：
40.将1g泊洛沙姆407溶于4ml去离子水中，搅拌中加入重量百分比16.6％的奥芬达唑溶液1.2ml(溶剂为n-甲基吡咯烷酮，于n-甲基吡咯烷酮溶剂内含有0.05g聚维酮)，继续加入0.2g吡喹酮均匀混合，即得复方制剂8。
41.制备例九(复方制剂9)：
42.将1g泊洛沙姆407溶于4ml去离子水中，搅拌中加入重量百分比16.6％的奥芬达唑溶液1.2ml(溶剂为n-甲基吡咯烷酮)，继续加入0.2g吡喹酮均匀混合，即得复方制剂9。
43.制备例十(复方制剂10)：
44.将0.1g吡喹酮与1g聚己内酯加热熔融混匀，置于-80度冰箱冷却30分钟后，再置于干燥器中干燥至少24小时以得到第一中间物。将此第一中间物，颗粒较大的固体分散体经过研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第一粉末。另外，将0.1g氯硝柳胺与1g聚乙二醇6000加热熔融混匀，置于-80℃冰箱冷却30分钟后，再置于干燥器中干燥至少24小时以得到第二中间物，将此第二中间物经由研钵研磨，并且过60目筛将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第二粉末。将第一粉末与第二粉末以重量比1：1的比例混合均匀，即得复方制剂10。
45.制备例十一(复方制剂11)：
46.将0.1g吡喹酮与1g泊洛沙姆407加热熔融混匀，置于-80度冰箱冷却 30分钟后，再置于干燥器中干燥至少24小时以得到第一中间物。将此第一中间物，颗粒较大的固体分散体经过研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第一粉末。另外，将0.1g氯硝柳胺与1g聚乙二醇6000 加热熔融混匀，置于-80℃冰箱冷却30分钟后，再置于干燥器中干燥至少24 小时以得到第二中间物，将此第二中间物经由研钵研磨，并且过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第二粉末。将第一粉末与第二粉末以重量比1：1混合均匀，即得复方制剂11。
47.制备例十二(复方制剂12)：
48.将0.1g吡喹酮与1g聚己内酯加热熔融混匀，置于-80度冰箱冷却30分钟后，置于干燥器中干燥至少24小时以得到第一中间物，将此第一中间物，颗粒较大的固体分散体经过研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第一粉末。另外，将0.1g奥芬达唑与1g聚乙二醇6000加热熔融混匀，置于-80℃冰箱冷却30分钟后，再置于干燥器中干燥至少24小时以得到第二中间物，将此第二中间物经由研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第二粉末。将第一粉末与第二粉末以重量比1：1比例混合均匀，即得复方制剂12。
49.制备例十三(复方制剂13)：
50.将0.1g吡喹酮与1g泊洛沙姆407加热熔融混匀，置于-80度冰箱冷却 30分钟后，置于干燥器中干燥至少24小时以得到第一中间物，将此第一中间物，颗粒较大的固体分散体经过研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第一粉末。另外，将0.1g奥芬达唑与1g聚乙二醇6000 加热熔融混匀，置于-80℃冰箱冷却30分钟后，置于干燥器中干
燥至少24 小时以得到第二中间物，将此第二中间物经由研钵研磨，过60目筛，将过筛后通过筛子的粉末收集以得到第二粉末。将第一粉末及第二粉末1：1比例混合均匀，即得复方制剂13。
51.制备例十四(复方制剂14)：
52.将1.0g的吡喹酮、1.0g的奥芬达唑、0.5g的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(济南岱罡生物工程有限公司，分子量1.6万，plga 75：25)，分散于2ml的 n-甲基吡咯烷酮中，即得复方制剂14。
53.以上复方制剂1-14配比整理后列于表1。
54.表1
[0055][0056][0057]
用上述复方制剂进行体外释放度研究。首先需制备体外释放度研究所需两种缓冲液，分别为0.5％吐温磷酸盐缓冲液(ph7.4)及0.5％sds磷酸盐缓冲液(ph7.4)，其制备方法步骤如下：
[0058]
取磷酸二氢钾1.36g，加入0.1mol/l氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至 200ml，加入1g吐温80混匀，即得0.5％吐温磷酸盐缓冲液(ph7.4)。
[0059]
取磷酸二氢钠二水合物1.56g，加入0.1mol/l氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，加入1g sds混匀，即得0.5％sds磷酸盐缓冲液(ph7.4)。
[0060]
在完成体外释放度研究所需缓冲液的制备后，以制备例进行体外释放度研究的步骤方法如下：
[0061]
复方制剂1至复方制剂5，每份取制剂0.2ml，加入50ml带塞ep管中，加入30ml0.5％吐温磷酸盐缓冲液(复方制剂3至复方制剂5置37℃放置5min 后再加入)。于37
±
1℃的恒温振荡仪中以150r/min的转速震荡，定时取样，取释放介质经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别于270nm和340nm 处测定od值；按标准曲线计算计算释放介质中药物浓度，根据式(1)计算累积释放度。
[0062]
式(1)如下所示，其中，rn表示第n天的累积释放度，r
n-1
表示第n-1 天的累积释放度，cn表示第n天的释放介质浓度。
[0063][0064]
复方制剂6至复方制剂9及复方制剂14，每份取制剂0.2ml，加入50ml 带塞ep管中，加入30ml0.5％sds磷酸盐缓冲液(复方制剂7至复方制剂9 置37℃放置5分钟后再加入)。在37
±
1℃的恒温振荡仪中以150r/min的转速震荡，定时取样，取释放介质经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别于270nm和296nm处测定od值；按标准曲线计算计算释放介质中药物浓度，根据式(1)计算累积释放度。复方制剂14的奥芬达唑及吡喹酮的体外累计溶出度参见图1所示。
[0065]
复方制剂10及复方制剂11，每份取制剂0.1g，加入50ml带塞ep管中，加入30ml0.5％吐温磷酸盐缓冲液。于37
±
1℃的恒温振荡仪中以150 r/min的转速震荡，定时取样，取释放介质经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别于270nm和340nm处测定od值；按标准曲线计算计算释放介质中药物浓度，根据式(1)计算累积释放度。
[0066]
复方制剂12及复方制剂13，每份取制剂0.1g，加入50ml带塞ep管中，加入30ml0.5％sds磷酸盐缓冲液。于37
±
1℃的恒温振荡仪中以150r/min 的转速震荡，定时取样，取释放介质经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，分别于270nm和296nm处测定od值；按标准曲线计算计算释放介质中药物浓度，根据式(1)计算累积释放度。
[0067]
氯硝柳胺进行体外释放度研究的结果如表2所示，复方制剂10，氯硝柳胺4小时累积释放度为64.8％，吡喹酮4小时仅释放17.6％；复方制剂11，氯硝柳胺4小时累积释放度为75.3％，吡喹酮4小时仅释放45.6％。复方制剂 10和复方制剂11，氯硝柳胺释放速度比吡喹酮快。复方制剂5中，药物释放三周左右，氯硝柳胺释放速度与吡喹酮无显着差异。复方制剂3及复方制剂 4中，药物释放2个月左右。复方制剂1及复方制剂2，药物释放两个月以上，其中复方制剂1中氯硝柳胺78天仅释放47.4％，吡喹酮78天释放了100.0％，吡喹酮释放速度比氯硝柳胺快。
[0068]
以上复方制剂吡喹酮、氯硝柳胺体外释放溶出度整理后列于表2。
[0069]
表2
[0070][0071][0072]
奥芬达唑进行体外释放度研究的结果如表3所示，复方制剂7、复方制剂8及复方制剂9和复方制剂13，1-6天即释放完全。复方制剂6释放时间最长，其中奥芬达唑23天仅释放了77.5％，吡喹酮9天释放99.7％，吡喹酮释放速度比奥芬达唑快。复方制剂12中，奥芬达唑1天释放了97.2％，吡喹酮11天仅释放61.8％，奥芬达唑释放速度比吡喹酮快。
[0073]
以上复方制剂吡喹酮、奥芬达唑体外释放溶出度整理后列于表3。
[0074]
表3
[0075][0076]
综上，本发明制备了不同的复方制剂，达到了1天-数个月的缓释效果。同时采用不同的处方工艺，可以调节复方中药物释放速度的快慢，为后期的现场应用提供了更多的用药方案，具有广阔的应用前景。
[0077]
应用例：泡型包虫病药效试验
[0078]
采用本发明上述复方制剂14对预防小鼠感染多房棘球蚴进行药效实验，实验过程具体如下：
[0079]
1、实验材料：空白制剂(区别在于不含有复方制剂14的第一活性成分和第二活性成分，用量等同复方制剂14)及本发明复方制剂14。
[0080]
2、动物：
[0081]
来源和种属品系：昆明系小鼠；
[0082]
提供单位：上海中国科学院实验动物中心；
[0083]
小鼠性别：雌性。
[0084]
3、分组与动物数：
[0085]
随机分组，每组观察鼠为10只。
[0086]
4、实验方法步骤：
[0087]
(1)虫源
[0088]
多房棘球蚴原头节及组织：由多房棘球蚴保种的实验室提供保种动物(小鼠、大鼠或长爪沙鼠等)。用碘酒和75％乙醇对种鼠的皮肤进行消毒，剖开腹腔后，用无菌法剥离多房棘球蚴囊。若有干酪样团块或呈无菌性囊肿者应剔除。将采集的多房棘球蚴囊称重，并放置在培养皿内，用眼科弯头剪刀将囊组织尽量剪得细碎，然后用抗生素(含青霉素、链霉素
50万u/l和两性霉素b 0.25mg/l)的hbss洗涤囊组织，每次10min、共5～8次，然后再用含抗生素的hbss稀释至含囊组织80～100mg/ml备用。
[0089]
(2)接种
[0090]
在盛有多房棘球蚴囊组织悬液的烧杯内加入磁搅拌子，置于磁力搅拌器上，调节转速以保持原头节和囊组织混悬。用1ml注射器吸取多房棘球蚴囊组织0.3ml(约40～50mg囊组织)，再用75％酒精擦涂小鼠皮肤，然后将囊组织注入小鼠腹腔内。
[0091]
(3)药物筛选和实验治疗
[0092]
治疗开始时间：20只小鼠，随机分组，每组10只。阴性对照组接种空白制剂0.1ml/只，给药组接种复方制剂0.1ml/只。接种后1小时，20只小鼠再接种多房棘球蚴。
[0093]
小鼠接种5个月后剖检。用断颈法处死，剖开腹腔，仔细剥离和摘取多房棘球蚴组织，并称取每只小鼠的囊重。
[0094]
疗效计算：计算药物组与对照组的平均囊重，按下式计算囊重抑制率。
[0095]
囊重抑制率＝(阴性对照组囊重-给药组囊重)/对照组囊重*100
[0096]
实验结果参见下述表4所示。
[0097]
表4、感染多房棘球蚴小鼠用阿苯达唑大豆油-司盘混悬液治疗的效果 (重量单位：克)
[0098][0099][0100]
由表4的结果可见，早期感染多房棘球蚴的小鼠用本发明的复方制剂具有显著的囊重抑制效果，囊重抑制率为67.4％。复方制剂达到了较好的抑制囊重发展的效果，复方制剂组10例小鼠的平均“囊重：体重”为0.07943，且有6例的“囊重：体重”数值低于平均。说明本发明提供的复方制剂由于其具有的缓释效应，从而具备良好的预防血吸虫病发展的效
果，可以延缓动物感染血吸虫之后的症状发展趋势，并且为后续的治疗争取时间。
[0101]
以上仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明之权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域之专门人士应可明了及实施，因此其他未脱离本发明所揭示之精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在申请专利范围中。