葫芦素B在制备治疗多发性硬化药物中的应用的制作方法

葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用。


背景技术：

2.神经免疫性疾病是一类以免疫细胞浸润为特征，机体免疫系统对自体神经系统发生异常免疫应答而造成的神经炎症性损伤。在神经免疫性疾病中，炎性细胞大量浸润活化，导致炎症因子如il-1β、il-6、tnf-α、ros等过量释放，从而造成神经元及轴索的炎症性损伤。大量临床研究和动物实验表明，神经免疫性疾病与多种急慢性神经疾病如多发性硬化、视神经脊髓炎和自身免疫性脑病、阿尔兹海默病和帕金森病等的发生发展有密切联系。
3.多发性硬化症(multiple sclerosis，ms)是一种影响中枢神经系统的慢性自身免疫性、炎症性和神经退行性疾病。ms的特点是免疫失调，导致免疫细胞浸润中枢神经系统，引发脱髓鞘、轴突损伤和神经变性。ms是一种获得性致残的年轻人神经系统疾病，多发于中青年，影响全球约230万人，且在我国的发病率逐年提高。自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)是目前国际公认的神经自身免疫性疾病的理想动物模型。eae的病理生理学是基于免疫系统对脑特异性抗原的反应，该反应诱导抗原携带结构的炎症和破坏，导致神经和病理学特征与在ms患者中观察到的特征相当。目前对ms治疗手段的研究主要是基于疾病的自身免疫性及eae动物模型的实验来进行的。
4.在ms的急性发作期，一线治疗方法通常为糖皮质激素冲击，对激素类药物不敏感的患者常采取二线的血浆置换及干细胞移植疗法，然而激素类药物副作用大，且目前急性期患者应用激素是否能减轻疾病的远期功能障碍尚不明确，干细胞移植也存在复发率高及移植死亡率高的弊端；目前fda批准用于治疗ms的药品或试剂有芬戈莫德、特立氟胺、干扰素β-1a、干扰素β-1、格拉莫醋酸盐和那他珠单抗等，但这些治疗方法存在价格高昂，长期使用疗效降低、在许多情况下有明显副作用，常常导致感染等缺陷；因此，现有的ms治疗方法远未达到现实所需。
5.因此，急需一种价格低廉、无副作用，不易导致感染的制备治疗多发性硬化的药物。


技术实现要素：

6.葫芦素b(cucurbitacin b)是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有广泛的药理活性。过去对葫芦素b的研究主要集中在其抗肿瘤活性上，最近有研究发现，葫芦素b还具有抗炎活性，然而，葫芦素b的免疫调节和抗炎作用尚未得到很好的表征。因此，本发明的目的是提供葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用。
7.本发明针对现有技术中的不足，提供葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用。
10.进一步地，所述葫芦素b通过抑制细胞焦亡并减少免疫细胞的死亡和延性因子的释放以实现治疗效果。
11.实验表明，葫芦素b对eae有较强的治疗作用，与对照组相比，葫芦素b给药组可推迟eae模型小鼠发病时间并降低临床评分；上述结果证明葫芦素b可以治疗多发性硬化症。
12.本发明的有益效果是：本发明提供了葫芦素b在制备治疗多发性硬化药物中的应用，通过药效试验评价了葫芦素b对人、鼠巨噬细胞死亡率和il-1β炎症因子分泌量的影响以及对小鼠eae模型的防治作用。实验结果表明，葫芦素b可显著降低人、鼠巨噬细胞的死亡率，并减少il-1β炎症因子的分泌。对eae模型小鼠给药处理后，显著降低了小鼠临床评分推迟发病时间，说明葫芦素b可缓解ms的症状，在调控ms病理中具有关键的作用，可以作为治疗ms的药物，为今后ms治疗提供一种新的药物选择，具有广阔的开发应用价值。
附图说明
13.图1是本发明实施例1的永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(ibmdms)乳酸脱氢酶(ldh)释放统计图；
14.图2为本发明实施例1的ibmdms上清中il-1β含量结果图，横坐标un、lps、lps nigericin、50μm组、100μm和200μm分别指代un组、lps组、lps nigericin组、葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组和葫芦素b 200μm组，****p《0.0001；
15.图3是实施例2的人单核巨噬细胞系(thp-1)ldh释放统计图，其中：横坐标un、lps、lps nigericin、50μm组、50μm和200μm分别指代un组、lps组、lps nigericin组、葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组和葫芦素b 200μm组，****p《0.0001；
16.图4是实施例3的葫芦素b对小鼠eae的防治作用分析结果图，小鼠eae模型后，在免疫后第1天开始给药，对照组(control)与葫芦素b给药组(cucurbitacin b)小鼠的临床评分统计图。
具体实施方式
17.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
18.一、实验材料
19.1.1、实验所用细胞来源
20.永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(ibmdms)由华中科技大学王晨辉课题组提供，培养条件为：使用含10％fbs(gibco)的dmem培养基(biochannel)，在37℃下5％co2孵箱(thermo)培养；
21.人外周血单核巨噬细胞系(thp-1)来自american type culture collection，培养条件为：使用含10％fbs(gibco)的rpmi(biochannel)培养基，在37℃下5％co2孵箱(thermo)培养。
22.1.2、主要试剂
23.葫芦素b(cucurbitacin b)，购自slleck公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
24.细菌脂多糖(lps)，购自invivogen公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
25.尼日利亚菌素(nigericin)，购自invitrogen公司，形状：干粉，保存条件：-20℃；
26.完全弗氏佐剂购自sigma-aldrich，灭活结核杆菌(h37ra，5mg/ml)购自bd diagnostics，mog
35-55
(mevgwyrspfsrvvhlyrngk)购自南京肽业生物科技有限公司；
27.百日咳毒素(pt)购自sigma-aldrich公司，保存条件：-20℃；
28.细菌脂多糖(lps)购自invitrogen公司；
29.胎牛血清(fbs)购自gibco公司；
30.dmem培养基、rmpi培养基均购自biochannel公司；
31.细胞毒性检测试剂盒(cytotoxicity detection kit(ldh))，购自roche公司；
32.小鼠il-1βelisa试剂盒购自福麦斯公司；
33.佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，pma)购自sigma-aldrich公司，形状：粉状，保存条件：-20℃。
34.1.3、主要仪器及设备
35.酶标仪tecan spark。
36.1.4、实验动物
37.c57bl/6小鼠8-10周龄20只，体重：18-20g，由集萃药康提供，饲养于南京鼓楼医院动物实验中心spf级实验室，小鼠饲养温度20-25℃，相对湿度50％-60％，可自由索食和饮水。
38.二、实验内容及结果
39.实施例1：葫芦素b降低永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞的细胞毒性及il-1β分泌
40.1.1)细胞培养
41.使用含有10％fbs的dmem培养基培养永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(ibmdms)。
42.1.2)ibmdms分组及处理
43.第一天，将细胞分种到96孔板上，每孔5
×
104个细胞；
44.第二天，将96孔板的ibmdms随机分为un组(对照组)、lps组、lps nigericin组、葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组及葫芦素b 200μm组，每组3个复孔，每孔5
×
104个细胞，吸去各孔的ibmdms的上清，然后对un组加入不含lps的含有10％fbs的dmem培养基，其余五组加入含lps(100ng/ml)的含有10％fbs的dmem培养基，在5％co2孵箱中37℃下培养3小时后，对各组ibmdms进行如下处理：
45.un组：每孔加入20μl的含10％fbs的dmem培养基，在5％co2孵箱中37℃下培养1.5小时；
46.lps组：每孔加入20μl的含10％fbs的dmem培养基，在5％co2孵箱中37℃下培养1.5小时；
47.lps nigericin组：每孔加入20μl的含10％fbs的dmem培养基，在5％co2孵箱中37℃下培养半小时后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)，再继续培养1小时；
48.葫芦素b 50μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为50μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin
在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时；
49.葫芦素b 100μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为100μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时；
50.葫芦素b 200μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为200μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时。
51.1.3.1)检测各组ibmdms细胞毒性
52.收集1.2)处理后的ibmdms细胞上清液(ibmdms-sn)50μl，然后将各孔ibmdms-sn分别加入新的96孔板对应的孔中，使用cytotoxicity detection kit试剂盒按照说明书对各孔ibmdms-sn进行乳酸脱氢酶(ldh)含量检测，使用软件graphpad prism 7.0对检测数据统计分析。
53.1.3.2)检测各组ibmdms il-1β分泌量
54.收集1.2)处理后的ibmdms细胞上清液(ibmdms-sn)，采用小鼠il-1βelisa试剂盒按照说明书进行il-1β含量检测，使用软件graphpad prism 7.0对检测数据统计分析。
55.1.4)实验结果
56.图1为各组ibmdms细胞毒性检测结果，如图1所示，葫芦素b给药组(葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组、葫芦素b 200μm组)呈剂量依赖性降低小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞ldh释放量，且葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组、葫芦素b 200μm组与lps nigericin组均有统计学差异；图2为il-1β分泌量检测结果，如图2所示，葫芦素b给药组(葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组、葫芦素b 200μm组)呈剂量依赖性显著降低小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞il-1β分泌量。
57.实施例2：葫芦素b降低人单核巨噬细胞系细胞毒性
58.2.1)细胞培养
59.使用含有10％fbs的rpmi培养基(gibco公司)培养人单核巨噬细胞系(thp-1)。
60.2.2)thp-1分组及处理
61.第一天，将细胞分到96孔板上，每孔5
×
104个细胞；
62.第二天，将96孔板的thp-1随机分为un组(对照组)、lps组、lps nigericin组、葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组及葫芦素b 200μm组，每组6个复孔，每孔5
×
104个细胞，对每孔加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，pma)至pma终浓度为100nm，以刺激各孔细胞分化贴壁，在分化处理4小时后吸去上清，然后对un组加入不含lps的含10％fbs的rpmi培养基，其余五组加入含lps(100ng/ml)的含10％fbs的rpmi培养基，在5％co2孵箱中37℃下培养3小时后，对各组thp-1进行如下处理：
63.un组：每孔加入20μl的含10％fbs的rpmi培养基，在37℃的5％co2孵箱中培养1.5小时；
64.lps组：每孔加入20μl的含10％fbs的rpmi培养基，在37℃的5％co2孵箱中培养1.5小时；
65.lps nigericin组：每孔加入20μl的含10％fbs的rpmi培养基，在37℃的5％co2孵箱中培养半小时后加入nigericin至nigericin终浓度为20μm，再处理1小时；
66.葫芦素b 50μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为50μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时；
67.葫芦素b 100μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为50μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时；
68.葫芦素b 200μm组：每孔加入含葫芦素b的含10％fbs的dmem培养基(葫芦素b在培养基中的终浓度为200μm)在5％co2孵箱中37℃下培养半小时，然后加入nigericin(nigericin在培养基中的终浓度为20μm)继续培养1小时。
69.2.3)各组thp-1细胞毒性检测
70.对2.2)处理后的thp-1细胞离心并收集细胞上清液(thp-1-sn)，然后将各孔thp-1-sn分别加入新的96孔板对应的孔中，对各孔thp-1-sn分别采用cytotoxicity detection kit试剂盒按照说明书进行乳酸脱氢酶(ldh)含量检测，使用软件graphpad prism 7.0对检测数据统计分析。
71.2.4)实验结果
72.图3为thp-1细胞毒性检测结果，葫芦素b给药组(葫芦素b 50μm组、葫芦素b 100μm组、葫芦素b 200μm组)呈剂量依赖性降低人外周血单核细胞系ldh释放量，且葫芦素b50μm组、葫芦素b 100μm组、葫芦素b 200μm组与lps nigericin组均有显著统计学差异(****p《0.0001)。
73.实施例3：葫芦素b对eae的防治作用
74.3.1)c57bl/6小鼠eae诱导
75.对c57bl/6小鼠(8-10周龄)皮下注射100μl抗原/cfa乳剂(注射于小鼠背部后侧的四个不同部位)，确保在乳剂整个实验过程中持续存在于小鼠皮下(每只小鼠注射的乳剂中包含400μg灭活结核杆菌(h37ra，5mg/ml，bd diagnostics)250μg mog
35-55
(mevgwyrspfsrvvhlyrngk)，完全弗氏佐剂和pbs体积比1:1制备成成白色、坚硬、粘稠的，没有相分离的乳剂)。分别于免疫第0h及第48h向小鼠腹腔注射500ng/只的百日咳毒素(sigma-aldrich)。
76.3.2)eae模型小鼠分组及药物治疗处理
77.3.2.1)eae模型小鼠分组：将步骤3.1)构建的eae小鼠模型随机分为对照组(control)、葫芦素b给药组(cucurbitacin b)，每组10只。
78.3.2.2)临床评分标准如下：
79.0分，无临床症状(步态正常，尾巴移动并且可以抬起，如果抓住小鼠尾巴根部，尾巴会缠绕在圆形物体上)；
80.0.5分，尾部轻度瘫痪(步态正常，尾尖下垂)；
81.1分，尾部完全瘫痪(步态正常，尾巴下垂)；
82.2分，双侧后肢不完全瘫痪(步态不协调，捏后肢有反应)；
83.2.5分，截瘫(步态不协调，双侧后肢完全瘫痪，捏双后肢无反应)；
84.3分，截瘫并前肢无力(步态不协调，前肢难以拉动身体，捏前肢有反应)；
85.3.5分，截瘫并一侧前肢瘫痪(小鼠不能移动，一侧前肢捏脚趾有反应)；
86.4分，四肢完全瘫痪(小鼠不能移动，捏双前肢的脚趾没有反应)；
87.4.5分，垂死(没有运动，呼吸改变)；
88.5分，死亡。
89.3.2.3)药物治疗处理：将葫芦素b溶于无菌pbs中并按照1mg/kg剂量对各组eae模型小鼠给药，具体给药方案如下：
90.葫芦素b给药组及对照组：葫芦素b给药组从小鼠eae模型免疫后第1天起开始灌胃给药(每只小鼠200μl)，一天一次；对照组对小鼠eae模型灌胃相同体积无菌pbs。
91.3.3)实验结果
92.ms是一种常见的神经免疫性疾病，主要的机制是炎性细胞的浸润以及神经髓鞘的损伤，因此我们评估了葫芦素b是否对ms具有治疗作用；如图4所示，葫芦素b给药组与对照组相比，eae小鼠发病时间推迟、临床评分降低；可见葫芦素b对小鼠eae症状具有治疗的作用。
93.综上所述，葫芦素b可显著降低人、鼠巨噬细胞的死亡率，并减少il-1β炎症因子的分泌；葫芦素b治疗组小鼠eae症状明显缓解，包括临床评分显著降低，说明葫芦素b抑制了细胞焦亡并减少了免疫细胞的死亡和炎性因子的释放，从而缓解eae的症状。葫芦素b在调控ms病理中具有关键的作用，可以作为治疗ms的药物，对今后ms的治疗具有重要意义。
94.以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。