一种大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

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1.本发明属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及到一种具有免疫保护性的大口黑鲈虹彩病毒重组蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.大口黑鲈是一种经济价值高的淡水鱼类,近年来大口黑鲈养殖规模扩大,中国年产量已经超过50万吨，产值超过100亿元。但随着养殖环境日益恶化，各种病害特别是病毒性疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。大口黑鲈虹彩病毒(large mouth bass virus,lmbv)是大口黑鲈的重要致病病原，它造成大口黑鲈的死亡率高。这种病毒极易感染大口黑鲈，且流行广泛，致使苗期大口黑鲈成活率低，成鱼养殖在高温期容易爆发该虹彩病毒病，造成严重经济损失。因此，如何防治虹彩病毒病已成为当今大口黑鲈养殖业急需解决的重要问题。
3.众所周知，疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。疫苗接种是防治病毒曼延的有效手段，包括灭活疫苗、dna核酸疫苗、减毒疫苗和重组蛋白亚单位疫苗等。针对大口黑鲈虹彩病毒lmbv，已经有研究报导全病毒灭活疫苗、dna核酸疫苗。制备全病毒灭活疫苗需要进行细胞培养、病毒扩增，对细胞培养技术、设备使用及培养基、材料如血清等消耗要求较高；由于在制备全病毒灭活疫苗过程中可能存在病毒抗原丢失、抗原结构被破坏而造成免疫效果不稳定。dna核酸疫苗虽然制备比较简单，且可产生持久免疫应答，但核酸dna可能诱导产生自身免疫反应，持续表达外源抗原，可能导致机体对该抗原产生免疫耐受。重组蛋白亚单位疫苗绝对不含活毒成分，生产和使用过程无散毒可能，消除了污染的可能性，且免疫特异性强、重复性较好，可以通过发酵大规模生产，成本较低，是值得积极推广使用的安全疫苗。随着分子生物学技术的发展，对病毒基因结构与功能的研究深入，研制基因工程重组蛋白亚单位疫苗日趋成熟，是国内外发展的主要方向，已经广泛应用于多种人和动物疫苗的生产。目前没有针对大口黑鲈虹彩病毒lmbv的重组亚单位疫苗报道。因此研发该病毒的重组亚单位疫苗产品，能够在低成本条件下大规模生产应用，快速、安全、有效预防控制该病毒的传播，从而保障大口黑鲈养殖业的健康发展。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种疫苗稳定，保护率高的大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗。
5.本发明的大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗，其特征在于，所述的大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗是seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白。
6.进一步优选，所述的seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白与佐剂montanide
tm isa 763a vg混合形成大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗。
7.本发明的第二个目的是提供一种大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，将seq id no.1所示的核苷酸序列转入到表达载体中，再将此表达载体转入宿主
菌中，表达seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白，然后纯化收集此蛋白，即得大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗。
8.优选，所述的表达载体为质粒pet-21a。
9.优选，所述的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。
10.进一步优先，所述的大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗是通过以下方法制备的：
11.1)质粒pet-21a-lmbv的构建：将质粒pet-21a用bamhi/xhoi酶切，回收5.4kb片段；以大口黑鲈虹彩病毒lmbv基因组dna为模板，用引物lmbv-f和lmbv-r进行pcr扩增，产物纯化后用bamhi/xhoi酶切，回收1.4kb片段，将其与上述5.4kb片段连接，连接液转化大肠杆菌dh5α后在含氨苄青霉素的lb固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒pet21a-lmbv；
12.所述引物lmbv-f为5
’‑
taaggatccatgtcttctgttacgggttc-3’，引物lmbv-r为5
’‑
aatctcgagttacaggatggggaaaccc-3’；
13.2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pet-21a-lmbv转化大肠杆菌bl21(de3)，得转化子bl21/pet21a-lmbv；将bl21/pet21a-lmbv于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的lb液体培养基中，于37℃培养至od600为0.6，加入终浓度为0.8mm的iptg并于16℃继续培养6h，然后在离心后菌液中加入pbs缓冲液，采用超声波破碎菌体1-2小时，将菌体破碎液离心，回收上清；将上清液采用蛋白沉淀结合amylose树脂纯化方法,即得seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白rmcp，即为大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗。
14.进一步优先，所述的步骤2)中的将菌体破碎液离心，回收上清，将上清液采用蛋白沉淀结合amylose树脂纯化方法是先采用质量分数30％的硫酸铵溶液沉淀杂蛋白，然后将菌体破碎液的上清用质量分数40％的硫酸铵溶液沉淀目的蛋白，将沉淀的目的蛋白与amylose柱结合2h后，用20个柱体积的过柱缓冲液洗脱杂蛋白，然后用10mm麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，收集初次和二次10mm麦芽糖溶液洗脱的蛋白，即得seq id no.1核苷酸序列编码的蛋白，即为大口黑鲈虹彩病毒的亚单位疫苗。
15.本发明的第三个目的是提供seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白在制备大口黑鲈虹彩病毒的疫苗中的应用。
16.所述的虹彩病毒的疫苗为大口黑鲈虹彩病毒的疫苗。
17.本发明的免疫保护性重组蛋白rmcp(seq id no.1所示的核苷酸序列编码的蛋白)，或重组蛋白rmcp与佐剂混合，所得为疫苗混合液，具有对大口黑鲈虹彩病毒lmbv免疫保护的作用。将所述疫苗注射于大口黑鲈的体内，28天后，注射lmbv病毒，观察、统计大口黑鲈死亡率，并计算疫苗的相对保护率。结果表明，rmcp的相对保护率为83.3％，rmcp蛋白与佐剂montanide
tm isa 763a vg混合配伍后的相对保护率可达到100％。
18.所述每毫升疫苗或疫苗混合液中含免疫保护性亚单位疫苗蛋白(免疫保护性重组蛋白rmcp)100μg；所述注射大口黑鲈体内的亚单位疫苗或疫苗混合液为100μl。
19.本发明具有如下优点：
20.1.所述的bl21/pet-lmbv重组菌可规模发酵培养，发酵菌体生物量可达湿重20g/l，经过细胞破碎、纯化，得到rmcp重组蛋白200mg/l以上，纯度90％以上。所述生产疫苗简单方便、成本较低，产品安全，无毒、无污染、无扩散，且方便保存。
thiogalactopyranoside(iptg)，16℃继续以转速180rpm摇动培养6h，而后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，用pbs缓冲液重悬，超声波破碎1-2h，再次离心(5000g，4℃，10min)，收集上清液。将上清液先采用低浓度的硫酸铵(质量分数30％)溶液沉淀杂蛋白，收集上清，然后将菌体破碎液的上清用质量分数40％的硫酸铵溶液沉淀目的蛋白，收集沉淀。将沉淀的目的蛋白与amylose柱结合2h后，用20个柱体积的过柱缓冲液洗脱杂蛋白，然后用10mm麦芽糖溶液洗脱目的蛋白。通过sds-page电泳检测蛋白纯化情况，结果见图1。收集初次和二次10mm麦芽糖溶液洗脱的蛋白，即得序列表seq id no.1中的碱基序列所编码的免疫保护性亚单位疫苗蛋白，命名为亚单位疫苗蛋白rmcp。
38.实施例2
39.重组亚单位疫苗的免疫应用
40.步骤1)亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液的制备。
41.亚单位疫苗蛋白混合液：将实施例1纯化的亚单位疫苗蛋白rmcp(200mg/l，纯度90％以上)用pbs缓冲液调整为每升缓冲液中含100mg序列表seq id no1中的碱基序列编码的疫苗蛋白溶液(即含100mg亚单位疫苗蛋白rmcp/l)，得到亚单位疫苗蛋白混合液。
42.亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液：将实施例1纯化的亚单位疫苗蛋白rmcp(200mg/l，纯度90％以上)与佐剂montanide
tm isa 763a vg以体积比1：1混合均匀，使每升混合液中含100mg序列表seq id no.1中的碱基序列编码的疫苗蛋白(亚单位疫苗蛋白rmcp)，得到亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液。
43.步骤2)重组亚单位疫苗的免疫应用。
44.将180条大口黑鲈(每条重约5g)随机分为3组，每组60条。将这3组分别命名为a(rmcp亚单位疫苗组)、b(rmcp 763a佐剂组)和c(pbs对照)组。将a组每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1)的含疫苗蛋白(100mg/l)的溶液[即步骤1)的亚单位疫苗蛋白混合液]，b组每条鱼分别腹腔注射100μl疫苗蛋白(100mg/l)与佐剂的混合液[即步骤1)的亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液]。c组每条鱼分别腹腔注射100μl pbs缓冲溶液。a、b组为试验组，c组为对照组。
[0045]
步骤3)重组亚单位疫苗针对大口黑鲈虹彩病毒lmbv的免疫保护效果检测。
[0046]
上述步骤2)疫苗免疫大口黑鲈28天后，将a、b、c三组的每条鱼分别腹腔注射100μl大口黑鲈虹彩病毒lmbv(tcid
50
＝1.25
×
10
2.8
)；24天内，观察a、b、c三组大口黑鲈的死亡情况，统计疫苗保护率(见图2)。结果表明，亚单位疫苗免疫大口黑鲈后对lmbv攻毒产生了很好的保护效果，攻毒24天时，c组(pbs对照组)累计死亡率为60％，a组(rmcp，亚单位疫苗组)的累计死亡率为10％，b组(rmcp 763a，亚单位疫苗加佐剂组)未发生死亡。由公式rps＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]
×
100％计算得出(见图3)，亚单位疫苗蛋白rmcp的相对保护率为83.3％，而rmcp与佐剂配伍后的相对保护率达到100％。