一种用于治疗宫颈癌的药物组合物及其应用

1.本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种用于治疗宫颈癌的药物组合物及其应用。


背景技术：

2.肿瘤可形成一系列免疫逃逸与免疫抑制机制使机体的免疫系统无法发挥正常的免疫监视与免疫清除作用。肿瘤免疫治疗旨在打破肿瘤免疫抑制机制、激活和增强机体抗肿瘤免疫应答，依靠自身机能有效杀伤和清除肿瘤细胞。目前肿瘤临床免疫治疗尤其是疫苗免疫疗法面临的主要挑战包括了肿瘤细胞的低免疫原性、肿瘤异质性和免疫抑制性的肿瘤微环境（tumor microenvironment, tme）等。
3.免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, icd）可以通过提供广谱的肿瘤抗原、暴露“危险信号”、并释放免疫调控介质赋予肿瘤细胞高免疫原性，从而刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫应答，为肿瘤治疗和疫苗研究提供了新的思路。目前，有多种方法可以诱导肿瘤细胞发生icd。就临床上常用的化学药物疗法而言，尽管多种化疗药物被发现都能诱导肿瘤细胞发生icd，但是体内诱导肿瘤细胞发生icd需要较高剂量的化疗药物，因药物严重的毒副作用难以实现，而且诱导的效果也不尽如人意。因此，如何能够改善诱导肿瘤细胞发生icd的临床应用安全性，是一个需要解决的问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，基于发生icd的肿瘤细胞可激发机体产生抗肿瘤免疫这一机制，本发明的目的在于提供一种用于治疗宫颈癌的药物组合物及其应用，利用药物组合物的协同作用，优化诱导条件及免疫效应结果，同时减轻药物的毒副作用，为基于icd细胞的肿瘤疫苗研究与临床应用提供新的策略。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于治疗宫颈癌的药物组合物，药物组合物由姜黄素和米托蒽醌组成。
6.本发明的另一方面：上述药物组合物在制备肿瘤细胞疫苗中的应用，取生长良好的肿瘤细胞，采用姜黄素和米托蒽醌联合进行处理，使肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，处于“濒死”状态，即得到所述肿瘤细胞疫苗。
7.进一步的，所述肿瘤包括宫颈癌。
8.进一步的，采用40~60μmol/l姜黄素、2~5μmol/l米托蒽醌对肿瘤细胞联合进行处理12~24h。
9.本发明的另一方面：一种具有预防或治疗作用的肿瘤细胞疫苗，所述肿瘤细胞疫苗由姜黄素和米托蒽醌联合处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，处于“濒死”状态。
10.进一步的，所述肿瘤包括宫颈癌；采用40~60μmol/l姜黄素、2~5μmol/l米托蒽醌对肿瘤细胞联合进行处理12~24h。
11.本发明的另一方面：上述肿瘤细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
12.本发明相比现有技术的有益效果为：针对临床使用化疗药物诱导肿瘤细胞发生icd的高剂量毒性问题，本发明利用临床使用的经典化疗药物mtx和新兴抗肿瘤药物cur，探索出了诱导肿瘤细胞发生icd的理想低剂量的药物组合物；所述药物组合物联合作用，可在低剂量条件下，显著增强抗肿瘤免疫应答的同时减轻药物的毒副作用，这为相关肿瘤中进行的成功探索为实体瘤的疫苗设计、研究与开发提供新的策略。
附图说明
13.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：图1为实施例1药物处理对tc-1细胞的毒性结果图；其中，a为显微镜下观察mtx、cur单独和联合处理后对tc-1细胞的毒性（
×
200），b为mtx与cur联合处理不同时间对tc-1细胞ldh释放的影响；图2为实施例1所述mtx与cur联合处理促进atp的释放结果图；图3为实施例1所述mtx与cur联合处理促进hmgb1的分泌结果图；其中，a、c:不同时间点上清中的hmgb1含量、b:不同药物处理24h后细胞中的hmgb1含量、d:不同时间点细胞中的hmgb1含量；图4为实施例1所述mtx与cur联合处理促进calr的质膜转移共聚焦荧光显微镜结果图；图5为实施例1所述撤去诱导物后对tc-1细胞的毒性结果图；其中，a为显微镜下撤去诱导物后对tc-1细胞的毒性（
×
200）；b为撤去诱导物后对tc-1细胞ldh释放的影响；图6为实施例1所述撤去诱导物后对atp释放的影响结果图；图7为实施例1所述撤去诱导物后对hmgb1分泌的影响结果图；其中，a:不同时间点上清中的hmgb1含量、b:不同时间点细胞中的hmgb1含量；图8为实施例1发生icd的细胞上清对bmdc迁移的影响结果图；其中，a:显微镜下观察迁移到下室的bmdc（
×
200）、b:不同时间点的transwell细胞迁移统计；图9为实施例2所述mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞显著抑制肿瘤生长结果图；其中，a:免疫程序; b:肿瘤体积曲线; c:代表性的肿瘤组织照片; d:肿瘤组织重量统图; e:脾脏组织重量统计图；图10-1、图10-2为实施例2所述mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1细胞激发了有效的抗肿瘤免疫应答结果图；其中，a、c:脾脏和肿瘤中ctl的代表性流式图; b、d:脾脏和肿瘤中ctl的统计图; e、g:脾脏和肿瘤中nk的代表性流式图; f、h:脾脏和肿瘤中nk的统计图; i、k:脾脏和肿瘤中mdsc的代表性流式图; j、l:脾脏和肿瘤中mdsc的统计图；图11为实施例3所述mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1细胞预防性免疫显著抑制肿瘤生长结果图；其中，a:免疫程序; b:肿瘤体积曲线; c:代表性的肿瘤组织照片; d:小鼠无瘤率; e:小鼠体重增长曲线; f:肿瘤组织重量统图; g:脾脏组织重量统计图；图12为实施例3所述流式细胞术检测小鼠脾脏中的免疫细胞水平结果图；其中，a、c:脾脏中ctl和mdsc的代表性流式图; b、d:脾脏中ctl和mdsc数量的统计图；图13为实施例4所述mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1细胞治疗性免疫显著抑制
肿瘤生长结果图；其中，a:免疫程序; b:肿瘤体积曲线; c:代表性的肿瘤组织照片; d:小鼠体重增长曲线; e:肿瘤组织重量统图; f:脾脏组织重量统计图；图14为实施例4所述流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞水平结果图；其中，a：脾脏和肿瘤组织中ctl的代表性流式图；b、c：脾脏和肿瘤组织中ctl数量的统计图；d：脾脏和肿瘤组织中mdsc的代表性流式图；e、f：脾脏和肿瘤组织中mdsc数量的统计图；图15为实施例5所述mtx与cur联合处理诱导hela细胞发生icd结果图；其中，a:显微镜下观察mtx、cur单独和联合处理后对hela细胞的毒性（
×
200）、b:mtx与cur联合处理对hela细胞ldh释放的影响、c:mtx与cur联合处理促进atp的释放；图16为实施例5所述mtx与cur联合处理hela细胞后促进calr的质膜转移共聚焦荧光显微镜结果图；图17为实施例5所述mtx与cur联合处理诱导siha细胞发生icd结果图；其中，a:显微镜下观察mtx、cur单独和联合处理后对siha细胞的毒性（
×
200）、b:mtx与cur联合处理对siha细胞ldh释放的影响、c:mtx与cur联合处理促进atp的释放；图18为实施例5所述mtx与cur联合处理siha细胞促进calr的质膜转移共聚焦荧光显微镜结果图；注：与对照组比较，ns表示p＞0.05; *表示p＜0.05; **表示p＜0.01; ***表示p＜0.001; ****表示p＜0.0001。
具体实施方式
14.实施例1——诱导tc-1细胞发生icd的药物筛选及体外实验本实施例以tc-1肿瘤细胞为对象，探索诱导tc-1肿瘤细胞发生icd的理想化疗药物配方，体内外考察配方诱导icd的优势所在。
15.生长良好的tc-1细胞，消化后，以每孔1
×
105个/ml的密度接种于12孔板，置于37℃ co2恒温培养箱中过夜培养后，分别用不同浓度的米托蒽醌（mtx）、姜黄素（cur）或联合进行处理，以不进行任何处理的细胞作为对照，继续置于培养箱中培养，期间用显微镜观察细胞生长情况和形态的变化。
16.进行细胞毒性以及相关免疫指标的检测：1、乳酸脱氢酶（ldh）细胞毒性检测：tc-1细胞铺板以及药物处理操作同前。在进行检测前1h，在设置的细胞最大酶活性孔中加入10%培养基体积（100μl）的ldh释放剂。到检测的时间点时，收集上清，400
×
g，4℃离心5min。按照乳酸溶液，1
×
int溶液，酶溶液体积比1∶1∶1的比例配制ldh检测工作液，充分混匀，注意适当避光。取120μl上清加入96孔板中，每个样品三个重复，再在其中加入60μl的ldh检测工作液，用移液器反复抽吸混匀，在室温下避光反应10~20min。用酶标仪测定490nm处的吸光度值，并按下式计算细胞死亡率。
17.细胞死亡率（%）=（处理样品孔吸光度－样品对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性孔吸光度－样品对照孔吸光度）
×
1002、atp检测：tc-1细胞铺板培养以及药物处理同前。到检测时间点收集上清，12000
×
g，4℃离心5min后置于冰浴中。配制不同浓度的atp标准液（10μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l、0.01μmol/l、1nmol/l和0.1nmol/l）。在不透光的96孔板中加入100μl稀释好的atp检测工作液，避光室温放置5min以消除背景。再加入20μl样品和标准液，每个样品三个重复，待其
反应2min后用化学发光仪测定荧光值。以atp的浓度为横坐标，荧光值为纵坐标绘制atp标准曲线，求得样品中的atp含量。
18.3、hmgb1的检测：
①
细胞培养上清液：tc-1细胞以没孔1
×
106个/2ml的密度接种于6孔板中，置于37℃过夜培养后，药物处理同前。到检测时间点收集上清，采用western blot的实验方法进行检测。取相同体积的上清液，加入loading buffer进行蛋白变性，进行12% sds-page电泳分离蛋白后，采用半干快速转膜法使蛋白转移至孔径为0.2μm的pvdf膜上。配制1
×
tbst溶液（1l tbs 500μl吐温20），加入50ml 5%的脱脂奶粉溶液（1
×
tbst配制）至完全覆盖膜，放置于室温封闭2h。加入用5%的脱脂奶粉溶液稀释的hmgb1（1:5000稀释）抗体，置于4℃孵育过夜。第二天用1
×
tbst溶液放置于水平摇床上清洗3次，每次10min。加入hrp标记的山羊抗兔igg（1:3000稀释）抗体，置于室温孵育2h，清洗过程同前。配制ecl化学发光显色液（a液∶b液按体积比1∶1充分混匀），滴加在膜上进行显色，用凝胶成像仪成像并拍照，实验重复三次。
19.②
细胞蛋白：到检测时间点弃去培养基上清后，消化润洗细胞操作同前。用80μl含蛋白酶抑制剂（pmsf）的ripa细胞裂解液，用移液器反复吹打细胞沉淀，置于冰浴中10min，重复三次，使细胞在此过程中充分裂解释放蛋白。12000rpm，4℃，离心15min，收集上清蛋白。对蛋白浓度进行测定，方法同前。孵育抗体时加上一抗β-actin（1:5000稀释）抗体以及二抗hrp标记的山羊抗鼠igg（1:8000稀释）抗体，后续的操作同前。
20.4、calr的检测：tc-1细胞以5
×
105个/2ml的密度接种于直径为15mm的玻底皿中，式细胞均匀分散在皿底凹陷处，而后将皿放入6孔板中，置于培养箱中式细胞继续培养贴壁培养24h。进行药物处理，操作同前。到检测时间点取出玻底皿，用1ml预热pbs缓冲液润洗3次，每次5min。吸出pbs，加入1ml 4%的多聚甲醛，置于室温固定1h，pbs润洗5次，每次5min。加入1ml 5%bsa溶液（0.5gbsa 10ml pbs溶液）放置于室温封闭2h，pbs润洗5次，每次5min。加入1100μl用1%bsa溶液稀释的calr抗体（1:250稀释），放入湿盒中置于4℃孵育过夜，pbs润洗5次，每次5min。加入100μl山羊抗小鼠igg h＆l(alexa flour
®
r488)抗体（1:500稀释），放入湿盒中置于室温避光孵育1h，pbs润洗5次，每次5min。注意此全过程都要轻柔操作。最后滴加10μl左右的dapi染色液，盖上盖玻片，用共聚焦荧光显微镜在24h内进行观察并拍照。
21.根据大量摸索结果，发现3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理24h后的tc-1细胞呈现出细胞变圆、死亡漂浮细胞少以及有明显细胞形态改变等较为理想的死亡状态，见图1a（a:对照; b:3μmol/l mtx; c:50μmol/l cur; d:3μmol/l mtx 50μmol/l cur; e:3μmol/l mtx 50μmol/l cur处理后细胞的死亡特征代表性放大图）。此外，本实施例也评价了mtx和cur联合处理不同时间点上清ldh的释放量，发现ldh释放量呈现时间依赖的趋势，并且比单独用药更多（p＜0.05），见图1b。两者的联合处理在降低了各自的药物使用剂量的同时也呈现出了比高浓度单独处理更好的细胞死亡状态。
22.cur协同mtx诱导tc-1细胞发生icd：经3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理tc-1细胞不同时间后，收集上清以及细胞，通过对上清中atp的检测，结果显示，随着处理时间的延长，tc-1细胞释放了比单独处理更多的atp（p＜0.05），且呈现出时间依赖性，见图2。通过western blot的方法检测细胞hmgb1的表达以及释放情况，结果显示联合处理后上清中释放和细胞中表达的hmgb1也较单独处理明显增多，且呈现出时间依赖的关系，见图3。此外，
通过免疫荧光对细胞calr的质膜翻转情况进行了检测，结果显示联合处理后，重新翻转定位到细胞膜的calr明显较单独处理要多，且呈现出早期的时间依赖性，见图4。上述结果均表明mtx和cur能够协同诱导tc-1细胞发生icd，其中处理24h后时的tc-1细胞呈现出持续较为理想的免疫原性介质表达与释放，此时的细胞处于一种“将死未死”的状态。
23.使用化疗药物在体内诱导肿瘤细胞发生icd，可以确保此过程中的免疫介质表达和释放，可引起机体的抗肿瘤免疫，但因药物使用剂量较大产生的毒副作用往往无法实现。体外诱导发生icd的细胞要作为细胞疫苗，取决于一方面细胞自身提供较为全面的肿瘤抗原，另一方面其在体内免疫后仍能表达和释放可观的免疫原性介质。因此本实施例还探索了tc-1细胞在体外用3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理24h后撤去药物，换上正常的完全培养基，动态观察和监测细胞最终的状态以及没有诱导物存在的期间是否还能继续维持和释放免疫原性介质。结果显示，撤去诱导物后的细胞状态仍然随着时间的推移而逐渐变差、死亡和漂浮，并在撤去诱导物60h后最终走向了全部死亡，ldh释放量的趋势具有时间依赖性（p＜0.05），见图5（图5a中a:对照; b-l:撤去后4h、6h、8h、10h、12h、24h、27h、30h、33h、36h、60h）。上清中atp的释放量前期也逐渐增多，后期可能因为细胞数死亡过多且随着时间耗竭的原因，反而呈现略微下降趋势（p＜0.05），见图6。随时间的延长，上清中释放和细胞中表达的hmgb1也呈现出逐渐增多的趋势，见图7。以上结果说明在撤去诱导物后tc-1细胞仍能维持较长时间的免疫原性介质的表达和释放，这对抗肿瘤免疫来说是至关重要的。
24.以下进行诱导tc-1细胞发生icd后的免疫学特性检测：1、c57bl/6小鼠骨髓前体细胞的获取及成熟树突状细胞（dc）的培养（1）5~6周龄的小鼠进行颈椎脱臼处死，用剪刀和镊子无菌剥离小鼠股骨和胫骨，置于4℃的rpmi-1640培养基中；（2）将两端骨骺端剪去，用1ml注射器多次吸取rpmi-1640培养基多次冲洗骨髓腔，直至骨头变白，以获得足够数量的骨髓前体细胞；（3）将获得的骨髓前体细胞通过70μm的细胞筛网去除颗粒及残余，收集于离心管内，室温300g离心5min，弃去上清；（4）加入3~6ml的红细胞裂解液混匀后裂解红细胞，静置于室温3min后，加入等体积的pbs溶液终止裂解，室温300g离心5min，弃去上清；（5）用rpmi-1640培养基洗涤细胞2次，室温300g离心10min，弃去上清；（6）用适量rpmi-1640完全培养基重悬细胞，进行活细胞计数，用完全培养基调整细胞浓度至2
×
106个/ml；（7）加入小鼠重组gm-csf至终浓度为15ng/ml，将细胞悬液以10ml/皿接种于直径为100mm的细胞培养皿中，置于37℃ co2恒温培养箱中培养；（8）培养3天后，可观察到皿底长出细胞集落。轻轻晃动培养皿，使未贴壁的细胞悬浮于培养基中，倾斜培养皿，吸出培养基，将3ml rpmi-1640完全培养基轻轻沿皿壁加入进行洗涤，轻轻晃动培养皿后吸出洗涤液，每皿加入10ml含15ng/ml重组gm-csf的rpmi-1640完全培养基；（9）培养至第5至8天期间，每2天半量换液一次，倾斜培养皿，移出5ml培养基，每皿沿皿壁轻轻地加入5ml含15ng/ml重组gm-csf的rpmi-1640完全培养基，置于培养箱中培养；（10）在第八天后，收集脱离的细胞，于室温300g离心10min，弃去上清，用含15ng/
ml重组gm-csf的rpmi-1640完全培养基重悬细胞，即为骨髓来源的成熟树突状细胞（bmdc）。
25.2、tc-1细胞发生icd后的培养基上清对bmdc的趋化作用（1）将获得的bmdc重悬计数后，在孔径为8μm的24孔transwell板上室中以每孔1
×
105个/200μl的密度接种；（2）tc-1接种于12孔板以及药物处理的操作同前。药物处理24h后收集培养基上清，12000rpm，室温离心10min后收集上清，取500μl添加至transwell板下室中，放置于含5%co2的37℃培养箱中；到观察时间点，通过光学显微镜拍摄下室中细胞迁移的视野，拍摄5个不同的随机视野，随机选择3个视野进行细胞计数和统计分析。
26.发生icd的细胞上清对bmdc迁移的影响：发生icd的细胞上清中中含有较多不同的免疫原性物质。atp作为icd发生中的“发现我”信号，可募集和激活apcs。hmgb1在质膜严重受损时引发，具有促进dc迁移和成熟的功能。因此分离了小鼠骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cell, bmdc），并用发生icd的细胞上清对其进行刺激，通过transwell细胞迁移实验探索上清对bmdc的影响。以正常培养细胞的上清和含有诱导物的正常培养基作为对照，将不同的上清添加到24孔transwell板的下室中，bmdc加至上室中，通过显微镜观察及统计不同时间点下室中细胞的数量。结果显示，含有诱导物的正常培养基对bmdc的迁移无作用，正常培养细胞的上清有轻微地促进作用，而发生icd的细胞上清则呈现出显著地促进作用，且具有时间依赖性（p＜0.05）见图8（图8b中a:12h; b:24h; c:36h; d:不同时间点汇总统计）。
27.通过以上体外实验数据可以确定，mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1细胞呈现出比单药诱导更理想的免疫原性。
28.实施例3——mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞对小鼠肿瘤的治疗性免疫干预本实施例通过建立c57bl/6小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型，从而探究mtx与cur联合诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞对小鼠肿瘤的治疗性免疫。
29.c57bl/6小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型的构建方法为：基质胶提前一晚放置在冰浴中而后置于4℃中慢慢融化，用剃须刀将小鼠右侧背部皮下的毛发剔除。在计划建立肿瘤模型的前三天从液氮中复苏tc-1细胞，传代培养至细胞活力较好和细胞数量增势较快的阶段，按照前面叙述的细胞消化过程收集细胞。用pbs重悬细胞沉淀润洗细胞，600rpm，室温离心5min，收集细胞，重复1次。用少量pbs重悬细胞，进行细胞计数，而后将细胞悬液和基质胶按比例为1:1制备成浓度为1
×
106个/ml的细胞悬液。于小鼠右侧剃毛的位置轻柔地接种100μl的细胞悬液，即每只小鼠接种1
×
105个tc-1肿瘤细胞。
30.所有疫苗的免疫方式均采取皮下免疫。待小鼠的肿瘤生长至直径为2~3mm时，将实验小鼠随机分为pbs组（pbs组注射100μl pbs溶液；）、mtx 3μm组、cur 50 μm组和mtx cur组4个组，每组10只，并同时给每只小鼠进行打耳标编号以进行区分。当75mm2培养瓶中的tc-1细胞密度生长至80%~90%时，在生物安全柜中，取每瓶中的20ml rpmi-1640培养基，剩余的弃去，加入对应的药物使终浓度达到所需要求，用涡旋振荡器以及10ml移液管充分混匀后，用移液管轻轻加至培养瓶的底部，放置于5%co
2 、37℃恒温培养箱中诱导24h。第二天轻轻倾倒培养基，吸出剩余的培养基，加入3ml的胰蛋白酶溶液进行消化，看到细胞微微脱落时加
入5ml的新鲜的rpmi-1640完全培养基终止消化，1000rpm，室温离心5min，弃去上清。细胞沉淀加入5ml pbs进行重悬洗涤，1000rpm，室温离心5min弃除上清。加入1ml pbs重悬细胞进行计数，将细胞浓度调整至1
×
107个/ml备用。在小鼠左侧背部皮下免疫不同药物及浓度诱导发生icd的tc-1细胞，剂量为100μl。每隔7天进行一次免疫，共免疫4次，期间使用游标卡尺每隔3天就测量肿瘤体积以密切监测记录小鼠肿瘤的生长情况。待免疫程序完成及最大的肿瘤达到伦理要求之前就牺牲小鼠，取其脾脏和肿瘤进行后续相关指标的检测分析。肿瘤体积的计算公式如下：肿瘤体积（mm3）=肿瘤最长直径
×
肿瘤最短直径2×
1/2各检测的具体方法为：1、小鼠脾脏淋巴细胞的体外分离：（1）小鼠脱颈牺牲后，取出脾脏组织轻柔地放入2ml的离心管中，置于冰浴中；（2）将脾脏移至生物安全柜中操作，放入孔径为70μm的细胞筛网中，将筛网放入50ml离心管口，每个脾脏逐次加入小鼠淋巴细胞分离液，共计加入6ml，用5ml注射器的活塞轻轻研磨脾脏至细胞完全透过细胞筛网；（3）将脾脏细胞悬液转移至15ml离心管中，用1ml移液器在液面之上沿着管壁缓慢地加入700μl rpmi-1640培养基，使两者液面之间的分界线清晰可见；（4）800g，室温离心35min，将升降速都调整至3；（5）离心结束轻柔地取出离心管，此时可见明显的分层，用巴氏管吸取中间白色的细胞层（如果有红细胞也会呈现出的是红色细胞层）至15ml离心管中；（6）加入5~10ml的红细胞裂解液混匀裂解红细胞，室温静置10min，300g，室温离心10min，弃上清；（7）细胞沉淀用10ml pbs重悬，300g，室温离心10min，弃上清；（8）用200~1000μl的rpmi-1640完全培养基重悬细胞至1.5ml的离心管中，进行细胞计数。
31.2、小鼠肿瘤淋巴细胞的体外分离：（1）肿瘤组织剥离出来后，用剪刀剪取部分肿瘤组织放入5ml的离心管中，再次用剪刀将其剪至碎泥状；（2）加入1ml浓度为1mg/ml的胶原酶（collagenase）a溶液，用涡旋振荡器充分混匀；（3）置于37℃，150rpm的摇床中消化1h；（4）在生物安全柜中，将消化好的肿瘤组织放入70μm的筛网中，加入淋巴细胞分离液进行研磨，后续操作同脾脏淋巴细胞的分离。
32.3、小鼠脾脏和肿瘤淋巴细胞的流式细胞术（fcm）检测：fcm检测ctl细胞：（1）每个样品分离出的淋巴细胞按2
×
107个/100μl接种于96孔u型板，同时设置空白孔以及单染孔作为补偿。每孔加入5μl原始浓度为5mg/ml的刺激肽（e7
49-57
肽；icd细胞和纳米颗粒以及纤维联合的动物实验加上e7
67-75
肽、e7
11-20
肽、e6
49-58
肽、e6
29-38
肽及e6
127-135
肽的混合）至每孔终浓度为5ug/ml，轻轻混匀后放置于细胞培养箱；（2）2h后每孔加入1μl 100
×
brefeldina，轻柔地混匀；
（3）5h后室温600g离心5min，轻轻将板反扣在吸水纸上，弃去上清；（4）用多通道移液器加入200μl 预冷的cell staining buffer重悬洗涤细胞，室温600g离心5min，重复2次，弃去上清；（5）用100μl cell staining buffer重悬细胞，加入1.25μl cd8α-apc抗体，放置于4℃避光孵育30min，cd8α-apc单染管加抗体，空白管和ifn-γ-pe单染管加100μl cell staining buffer；（6）200μl cell staining buffer洗涤3次，600g室温离心5min，弃上清；（7）200μl fixation buffer重悬细胞，室温避光进行固定30min；（8）200μl cell staining buffer洗涤3次，室温600g离心5min，弃上清；（9）用ddh2o稀释10
×
permeabilization wash buffer，每孔加入200μl 1
×
permeabilization wash buffer重悬细胞，室温600g离心5min，弃上清，重复此操作2次；（10）100μl 1
×
permeabilization wash buffer重悬细胞，加入1.25μl ifn-γ-pe抗体，室温避光孵育30min，ifn-γ-pe单染管加抗体，空白管和cd8α-apc单染管加100ul cell staining buffer；（11）200μl 1
×
permeabilization wash buffer重悬洗涤2次，室温600g离心5min，弃上清；（12）200μl cell staining buffer重悬细胞转移至带筛网的流式管中，将细胞过滤后上流式细胞仪检测。
33.fcm检测mdsc：（1）淋巴细胞按1
×
107个/100μl接种于96孔u型板，同时设置空白孔以及单染孔作为补偿，600g室温离心5min，弃上清；（2）200μl cell staining buffer重悬洗涤2次，600g室温离心5min，弃上清；（3）加入100μl cell staining buffer重悬细胞，每孔分别加入1.25μl cd11b-apc和1.25μl gr-1-pe抗体，置于4℃避光孵育30min；（4）200μl cell staining buffer重悬洗涤3次，600g室温离心5min，弃上清；（5）200μl cell staining buffer重悬细胞，过流式筛网，上机检测。
34.fcm检测nk细胞：淋巴细胞铺板和洗涤操作同mdsc的检测。加入1.25μl nk1.1-apc抗体和1.25μl cd49b抗体，4℃避光孵育30min，后续洗涤以及上机流程同前。以下为体内评价mtx与cur单独或联合诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞的抗肿瘤潜力结果：1、对小鼠宫颈癌肿瘤生长的影响待小鼠肿瘤模型建立且生长至2~3mm时，小鼠随机分为pbs组、mtx 3μm组、cur 50μm和mtx cur组4个组，开始免疫通过不同药物及其组合后诱导发生icd的细胞疫苗，计为0天，以及分别在第7天、第14天和第21进行共计4针的免疫，实验免疫程序见图9a。期间通过对小鼠肿瘤体积的持续监测来掌握肿瘤的生长情况，结果显示，mtx与cur单独诱导的icd细胞均显示出延缓肿瘤生长的趋势，联合诱导的tc-1细胞相较于单药诱导的呈现出更理想的抑制肿瘤生长的作用（p＜0.05），见图9b。在第41天时牺牲小鼠，取出肿瘤组织和脾脏组织进行称重，并取具有代表性的肿瘤组织进行拍照，见图9c。结果表明，拍照显示的肿瘤实际大小、肿瘤重量与肿瘤生长曲线趋势一致，联合诱导的细胞组肿瘤和脾脏重量也显著低于
各对照组，见图9d-e。
35.2、对小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞水平的影响ctl细胞作为适应性免疫效应细胞，可以通过分泌ifn-γ和颗粒酶b等物质表现出理想的杀伤和清除肿瘤细胞的作用，特别是肿瘤组织中浸润的ctl细胞。nk细胞作为固有免疫效应细胞，对于肿瘤也起到一定程度的杀伤作用。mdsc作为经典的免疫抑制细胞，可以抑制ctl的杀伤作用，进而帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。到实验终点取出小鼠脾脏和肿瘤组织，分离提取出其中的淋巴细胞并进行ctl、nk和mdsc细胞的流式细胞术检测，结果显示，无论是脾脏组织还是肿瘤组织，与各对照组相比，mtx与cur联合诱导制备的细胞疫苗组的ctl和nk细胞的数量百分比都会更高（p《0.05），见图10a-h。相反，mdsc的数量百分比则都会更低（p《0.05），见图10i-l。
36.通过以上的结果，证明了mtx和cur联合诱导tc-1小鼠宫颈癌细胞发生icd的优势所在。
37.实施例3——mtx与cur协同诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞对小鼠肿瘤模型的预防性免疫干预肿瘤接种操作同实例1，小鼠随机分为pbs组、冻融（ft）组、icd组3个组，诱导tc-1细胞发生icd的操作同实施例1。免疫方式为皮下免疫，pbs组注射100μl pbs溶液；冻融（ft）组注射经液氮和37℃水浴锅反复冻融的肿瘤细胞，为1
×
106个/100μl；icd组注射经联合药物处理的肿瘤细胞为1
×
106个/100μl；所有重悬肿瘤细胞的溶液均为pbs溶液。每隔7天免疫一次，共免疫3次。在第3次免疫后的7天后，对小鼠右侧背部皮下进行tc-1肿瘤细胞接种挑战，进行肿瘤生长监测以及相关后续检测，检测方法参见实施例2。
38.以下为获得的测定结果：1、对小鼠宫颈癌肿瘤生长的影响：实验小鼠进行为期21天共计3次免疫，每隔7天免疫一次以在液氮和37℃中反复来回冻融裂解的细胞作为非icd的细胞对照，在最后一次免疫后的第7天接种肿瘤，免疫程序如图11a。期间定期密切监测各组肿瘤的生长情况，结果数据显示，相较于pbs组和ft组，联合诱导发生icd的tc-1细胞疫苗组小鼠在接种肿瘤进行挑战后，只有两只小鼠在接种肿瘤后的第54天长出了极小的肿瘤，而其他的小鼠一直到第60天均没有肿瘤的发生，见图11b。到接近肿瘤生长伦理时，牺牲小鼠，取其肿瘤和脾脏进行称重拍照，肿瘤实际大小与生长趋势一致，且icd细胞疫苗组的肿瘤重量和脾脏重量均低于各对照组（p＜0.05），同时在此期间各组小鼠的体重并没有差异（p＞0.05），见图11c-g。说明联合诱导制备的icd细胞疫苗显著预防和抑制了肿瘤的生长，具有理想的肿瘤预防保护效果。
39.2、对小鼠脾脏中免疫细胞水平的影响：接下来进一步评估小鼠脾脏中主要免疫细胞的水平，对分离出的脾脏淋巴细胞进行流式细胞术分析，结果显示，与对照组相比，icd细胞疫苗组的ctl细胞水平明显升高，而mdsc的数量则显著降低（p＜0.05），见图12。
40.实施例4——mtx与cur协同诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞对小鼠肿瘤模型的治疗性免疫干预本实施例进一步探究所述细胞疫苗是否可在肿瘤已经建立的情况下调动机体的适应性免疫应答的同时克服肿瘤免疫抑制性微环境，达到肿瘤抑制的效果。
41.小鼠肿瘤接种、监测、细胞的制备、免疫方式以及剂量同前各实施例。小鼠肿瘤生长至直径为2~3mm时，随机分为pbs组、冻融（ft）组、icd组3个组，其中：pbs组注射100μl pbs溶液；冻融（ft）组注射经液氮和37℃水浴锅反复冻融的肿瘤细胞，为1
×
106个/100μl；icd组注射经联合药物处理的肿瘤细胞为1
×
106个/100μl；所有重悬肿瘤细胞的溶液均为pbs溶液。每隔7天免疫一次，共免疫3次，肿瘤生长监测以及相关后续检测操作同前各实施例。
42.以下为获得的测定结果：1、对小鼠宫颈癌肿瘤生长的影响小鼠在皮下建立tc-1移植肿瘤模型且待肿瘤生长至直径为2~3mm后随机分组，对小鼠进行5次icd细胞疫苗免疫治疗，第一周每隔两天免疫一次，共计3次，后2次每隔7天免疫一次，同时设置pbs组和非icd细胞组作为对照，免疫程序如图13a。结果显示，与pbs组和ft细胞组相比，icd细胞组可以显著抑制并延迟了肿瘤的生长（p＜0.05），见图13b。在第52天牺牲小鼠，分离肿瘤和脾脏组织进行称重并取代表性的肿瘤组织进行拍照，见图13c-f。各组拍照显示的肿瘤大小、重量与小鼠肿瘤生长体积曲线一致，其中icd细胞组的肿瘤和脾脏重量都显著低于pbs组和ft细胞组（p＜0.05）。
43.2、对小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞水平的影响接下来具体分析icd细胞疫苗免疫后激发的抗肿瘤免疫应答。分离小鼠的肿瘤组织和脾脏组织的淋巴细胞，利用流式细胞术进行效应细胞ctl水平和抑制性细胞mdsc水平的检测。结果表明，与对照组比较，icd细胞疫苗免疫治疗后在显著增加了脾脏组织和肿瘤组织中ctl水平的同时也显著抑制了mdsc细胞的水平（p＜0.05），见图14。说明icd细胞在2~3mm荷瘤小鼠内可以诱导显著的抗肿瘤免疫应答。
44.实施例5——mtx和cur联合处理对人宫颈癌细胞的影响本实施例将mtx和cur联合诱导策略进一步应用在不同的人宫颈癌细胞系中，探讨此联合药物诱导策略的临床普适性以及有效性。
45.1、mtx和cur联合诱导hela细胞发生icd结果显示，3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理24h后的hela细胞呈现出细胞变圆、死亡漂浮细胞少以及有明显细胞形态改变等较为理想的死亡状态，见图15a。此外，我们也评价了mtx和cur联合处理24h后上清ldh的释放量，发现联合药物处理后的ldh释放量比单独用药更多（p＜0.05），见图15b（a:对照; b:3μmol/l mtx; c:50μmol/l cur; d:3μmol/l mtx 50μmol/l cur）。此外，经3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理hela细胞24h后收集上清，通过对上清中atp的检测，结果显示，联合药物处理的hela细胞释放了比单独处理更多的atp（p＜0.05），见图15c。通过免疫荧光对细胞calr的质膜翻转情况进行了检测，结果显示联合药物处理hela细胞12h后，重新翻转定位到细胞膜的calr明显较单独处理要多，见图16。上述结果均表明mtx和cur能够协同诱导人宫颈癌hela细胞发生icd。
46.2、mtx和cur联合诱导siha细胞发生icd结果显示，3μmol/l mtx与50μmol/l cur联合处理24h后的siha细胞的形态、ldh和atp的释放量均较单独药物处理的多（p＜0.05），见图17a-c。此外，联合药物处理12h后的calr质膜转移也较单独处理的较多，见图18。上述结果均表明mtx和cur能够协同诱导人宫颈癌siha细胞发生icd。
47.由本发明上述实施例的实验可以确定，包括tc-1肿瘤细胞、hela细胞以及的siha
细胞在内的宫颈癌细胞，经过mtx和cur联合处理后，不仅在显微镜下呈现出“将死要死”的状态，而且免疫相关介质的释放和表达也较同时段单独处理的要更多，同时其上清促进dc迁移的能力也更强。除此之外，撤去诱导物后细胞并没有立即死亡，而是仍然在释放和表达damps，且比诱导24h的时候更多，最终细胞走向了死亡。接下来进一步在利用小鼠体内预防性和治疗性肿瘤模型评估mtx与cur协同诱导发生icd的tc-1肿瘤细胞的抗肿瘤免疫效应中显示出有效抑制了肿瘤的生长，表明mtx与cur协同诱导tc-1肿瘤发生icd确实有其独特优势所在。提示临床使用不同低剂量化疗药物的组合或许可在增强抗肿瘤免疫应答的同时减轻药物的毒副作用。
48.脾脏淋巴细胞和肿瘤组织浸润的关键效应细胞ctl/nk对肿瘤的清除至关重要，而免疫抑制细胞mdsc及其产生的免疫抑制分子会阻碍效应细胞的功能发挥，促进肿瘤的生长及免疫逃逸。在本研究中，联合药物诱导发生icd的细胞在增加了脾脏组织和肿瘤组织cd8

ifn-γ
ctl/nk1.1

cd49b
nk细胞数目同时降低了cd11b

gr-1
mdsc的数目。
49.概言之，联合诱导发生icd的肿瘤细胞疫苗可以激发荷瘤小鼠显著的抗肿瘤免疫效应，此策略在hpv相关肿瘤中进行的成功探索为实体瘤的疫苗设计、研究与开发提供新的策略。
50.最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。