DSC2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用

dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用。


背景技术：

2.1905年osler首次描述以右心室肌受累为主的疾病以来，先后报道了羊皮纸心脏、uhls畸形、右室发育不良和心律失常源性右室发育不良。由于这些疾病均以右室心肌受累为主，病因和发生机制不清楚，1988年thiene把它们统称为右心室心肌病(rvc)。
3.右心室心肌病临床表现差异较大，部分患者无任何临床表现，心脏也不扩大，仅在尸检或手术时才被发现，但绝大多数患者可出现心悸、易疲劳、胸闷、头晕及晕厥，甚至突发猝死。少数患者可发生右心衰竭，低血压休克，该类患者缺乏特异性体征，常有心界扩大，胸骨左下缘可闻及1-2级收缩期杂音，出现病理性第三、第四心音，第二音宽分裂及心动过速等，也无任何心脏体征。
4.超声心动图、心脏核素与心血管造影检查是确诊本病的可靠方法。主要改变为右室扩大，游离壁运动减弱或消失，室间隔与左室后壁同向运动，心尖部，膈面及漏斗部前壁可见憩室状或瘤样膨出，肌小梁消失。左室正常或被压后方而致心腔缩小，偶可见左室轻度增大，三尖瓣位置正常或伴反流。
5.根据病理尸检所见，病变可呈灶性或弥漫性，主要累及右心室前壁漏斗部(肺动脉圆锥)，心尖部及后下壁，三者构成了所谓的“发育不良三角”，右心室常呈球形增大，心腔扩张，可有室壁瘤形成，切面心室肌壁层不同程度变薄。镜下：以右心室心肌不同程度地被脂肪组织或纤维组织替代为特征，病变以右心室游离壁和心尖部较为明显，残存的心肌纤维萎缩，呈不规则索团状。部分病例可见灶性心肌坏死，炎症的反应及纤维化改变。
6.研究发现，右心室心肌病的心肌细胞坏死可能是一种由遗传决定的程序性细胞凋亡，持续性凋亡可导致心肌细胞进行性丧失而被纤维脂肪组织替代，这一学说很引人注意，因为它对典型的右心室受累做出了合理的解释。
7.桥粒是细胞间连接的主要方式，对维持上皮组织的正常形态和功能具有重要意义。桥粒胶蛋白(dsc)为钙粘蛋白超家族成员之一，与桥粒芯糖蛋白(dsg)合称为桥粒钙粘素(dc)，是组成桥粒的重要蛋白成分。人类桥粒钙黏素基因位于18号染色体长臂1区2带，表达dsc1-3与dsg1-4两组蛋白。与传统的钙黏素相似，dc具有完整的跨膜糖蛋白结构，其胞外部分包含氨基酸识别序列，以异二聚体的形式完成细胞间桥粒连接；而胞内区与胞浆内的附着板相连，进而连接细胞骨架的角蛋白成分。
8.dsc2蛋白是一种钙黏蛋白，属于跨膜蛋白，是桥粒的重要成分，在心肌、骨骼肌和消化道上皮中高表达，而桥粒是心肌细胞之间的重要连接，是闰盘的关键组成部分，桥粒不但可维持心肌组织结构和功能的完整性，增强心肌细胞承受机械应力时的黏附作用，还广泛参与到调控心肌细胞内外的信号转导途径。通过对dsc2蛋白晶体结构解析发现，dsc2可形成二聚体结构，早期桥粒的装配过程中，dsc2蛋白形成同源二聚体，而成熟桥粒的装配过
程中dsc2蛋白和dsg2蛋白形成异源二聚体。其他桥粒相关蛋白(pkp2，dsp，dsg2和jup)等突变已经证实和心肌病特别是arvc等发病机制有关，主要是影响心肌细胞的桥粒以及闰盘结构从而引起心肌病变有关。既往已有报道相关桥粒蛋白(pkp2、dsp、dsg2和jup)移码突变或无意突变造成的小鼠胚胎致死。
9.右心室心肌病是一类以右心室受累为主，起初表现为右心室扩大，左心室功能正常，后期主要表现为顽固性右心衰竭的心肌病，相比较于其他心肌病，临床上对于此类心肌病的关注远远不够。基于目前研究右心室心肌病的小鼠模型较为少见，且右心衰竭的小鼠模型通常采用肺动脉缩窄术或肺栓塞模型，其构建模型过程较为繁琐且模型诱导成功干扰因素较多。
10.在who的心肌病分类中往往将一部分无显著心率失常的心肌病也归致于心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,arvc)，但实际上其病理机制和治疗方案可能完全不同，由于目前对于arvc小鼠模型各具特色，但也存在多种缺陷和问题，且对于单纯右心室扩张、不合并心律失常的右心室心肌病小鼠模型目前尚未有报道。因此，这种精准复制动物模型的建立对提高右心室心肌病病理进程的认识，并探索特异性治疗的最佳策略至关重要。


技术实现要素：

11.针对现有技术中的不足，本发明提供了一种dsc2缺失介导的右心室心肌病的小鼠模型，此小鼠模型为研究右心室心肌病、分子机制研究以及右心室心肌病药物筛选方面提供了理想的模型，还可在制备调控心肌凋亡、纤维化等相关通路分子机制及药物和试剂中应用。
12.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
13.第一方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型在制备预防和制备治疗右心病中的应用。即该dsc2缺失的小鼠模型，可用于后续对右心室心肌病及右心室心功能异常等相关疾病提供一种便捷的，不需要其他手术或药物诱导的小鼠模型。具体地，在不做任何药物和手术处理下，单纯地敲除小鼠的dsc2片段，便可有效地诱导右心室心肌病。
14.在编辑位点设计两个grna(grna2：5
’‑
acgttgccatgcaagagcccagg-3’；grna4:5
’‑
gataggagcccatcttctcttgg-3’)，使基因产生两个缺口，通过片段删除和移码突变产生的截断片段，致使小鼠dsc2基因不表达。
15.进一步地，右心病包括右心室心肌病和右心衰竭等相关右心疾病。
16.第二方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型在小动物彩色超声监测右心室舒张和收缩中的应用。即监测右心室功能指标的模型，该小鼠在六周龄逐渐开始出现右心室的室壁变薄，心脏收缩功能下降，右心室心腔变大等现象，此小鼠出现的右心室变化可用于心脏超声测量右心室收缩和舒张功能的小鼠模型。
17.第三方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型在制备凋亡通路调控试剂和药物中的应用。dsc2缺失的小鼠通过实验检测发现，其凋亡相关指标(bax，cleaved-capase3等)的上调，tunel实验检测到其小鼠随着周龄的增长，凋亡明显得增多，由此认为，该小鼠可以自发地随着周龄的增长参与凋亡相关通路。即可用于对于凋亡相关通路及分子机制的研究，且作为开发凋亡通路调控试剂和药物研究的有效动物模型。
18.第四方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型在制备纤维化通路调控试剂和药物中的应用。dsc2缺失的小鼠在六周龄开始，逐渐会出现心肌的纤维化甚至钙化，钙盐沉积的发生，此小鼠由于不用任何药物或者手术干预即可自发出现心肌的纤维增生，此小鼠可有效且不用做任何外在干预的情况下研究纤维化相关通路，可用于对纤维化相关通路及分子机制的研究，且作为开发纤维化通路调控试剂和药物研究的有效动物模型。
19.第五方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法，其包括：
20.(1)、利用crispr/cas9技术，设计并体外转录特异性靶位点grna2和grna4，grna2和grna4的基因序列分别为seq id no.1和seq id no.2所示；
21.(2)、将cas9、grna2和grna4的mrna同时注射到小鼠的受精卵中，并将受精卵移植入母鼠孕育，获得f0代小鼠；
22.(3)、将f0代小鼠和野生型小鼠杂交，获得f1代的dsc2基因敲除小鼠模型。
23.其中，在步骤(1)中，grna序列如下：
24.grna2：5
’‑
acgttgccatgcaagagcccagg-3’(seq id no.1)；
25.grna4:5
’‑
gataggagcccatcttctcttgg-3’(seq id no.2)。
26.在步骤(2)和步骤(3)中，cas9蛋白在grna引导下结合到靶位点进而造成dna双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，最终实现基因敲除。dsc2蛋白功能几乎完全丧失，致使小鼠出现了右心室扩大，心肌纤维化等右心室心肌病的表现。
27.第六方面，本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型，该模型是被敲除了dsc2基因的小鼠。
28.进一步地，该小鼠为c57bl/6j品系小鼠。
29.总之，本发明以移码突变造成的dsc2缺失小鼠诱导的右心室心肌病模型为实验疾病对象，在不做任何药物和手术处理下，单纯的敲除小鼠dsc2片段，便可有效地诱导右心室心肌病。
30.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
31.本发明的小鼠模型在尚未有任何外界干预处理的基础上，通过crispr-cas9技术在c57bl/6j小鼠基础上的构建dsc2缺失突变型(dsc2-/-)小鼠，dsc2敲除的小鼠能有效地诱导出右心室心肌病，可用于右心室心肌病研究的小鼠模型；且dsc2的缺失与心肌纤维化，凋亡等病理改变密切相关，可用于相关的分子机制及相关药物研究中。单纯地敲除dsc2基因便可随着小鼠年龄的增长，小鼠自身出现右心室扩大，右心室心肌纤维化，以及中晚期右心室心力衰竭等右心室心肌病的表现，故该小鼠模型可以作为后续对右心室心肌病的分子机制研究中一种有效的模型。
附图说明
32.图1为本发明的dsc2基因敲除小鼠模型的构建过程示意图。
33.图2为本发明的野生型小鼠和纯合子小鼠的右心室变化示意图。
34.图3为本发明的野生型小鼠和纯合子小鼠的心肌纤维变化示意图。
35.图4为本发明的野生型小鼠和纯合子小鼠的电镜示意图。
36.图5为本发明的野生型小鼠和纯合子小鼠的心肌凋亡过程示意图。
具体实施方式
37.本发明提供了一种dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用。
38.通过野生型小鼠(wt/wt)、杂合子小鼠(dsc2-/-/wt)和纯合子小鼠(dsc2-/-/dsc2-/-)三种小鼠重复多次试验发现，与dsc2-/-/wt杂合子小鼠相比较，dsc2纯合子敲除小鼠能成功地诱导出右心室心肌病模型，而dsc2杂合子却没有心脏扩大等相关的表现，进一步证明，只有当dsc2纯合子敲除能有效地诱导出右心室心肌病。
39.dsc2敲除小鼠在右心室心肌病中的表现：采用crispr/cas9技术，成功构建全身敲除dsc2-/-小鼠，从小鼠4周龄开始，每隔一周通过小鼠心脏彩色超声观察小鼠右心室(收缩期面积、长径、横径、基底段；舒张期面积、长径、横径、基底段；右心室面积变化率)的变化情况。发现8周龄的dsc2-/-小鼠在心超下右心室面积开始明显增大，故选取右心室变大前后的两个时间点(6周龄和12周龄)，通过masson染色观察对心肌纤维化的作用；通过tunel染色观察心肌细胞凋亡的情况；通过电镜检测其相关心肌闰盘及线粒体嵴结构的改变。
40.具体地，本发明的dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法包括：
41.(1)、利用crispr/cas9技术，设计并体外转录特异性靶位点grna2和grna4，grna2和grna4的基因序列分别为seq id no.1和seq id no.2所示；
42.(2)、将cas9、grna2和grna4的mrna同时注射到小鼠的受精卵中，并将受精卵移植入母鼠孕育，获得f0代小鼠；
43.(3)、提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物送测序；
44.(4)、将f0代小鼠和野生型小鼠杂交，获得f1代的dsc2基因敲除小鼠模型。
45.其中，在步骤(1)中，使用麻省理工学院的crispr design工具(http://crispr.mit.edu/)，依据score的高低及序列特异性设计了一对长度为20bp的针对靶标dna的寡聚核苷酸链序列用于制备grna。grna序列如下：
46.grna2：5
’‑
acgttgccatgcaagagcccagg-3’(seq id no.1)；
47.grna4:5
’‑
gataggagcccatcttctcttgg-3’(seq id no.2)。
48.在步骤(3)中，pcr扩增的引物信息如下所示。
49.表1 pcr的引物信息
50.引物序号引物名称序列(5
’‑3’
)序列表a114500002155-dsc2-ko-tf1gcataccctctgtcattagcatgseq id no.3a114600002155-dsc2-ko-tr1gagtaggtgggagtgaatttggtcseq id no.4
51.表2 pcr反应体系
52.reaction componentsvolume(μl)gdna template2.010
×
taq buffer(mg
2
plus)2.0dntp mixture(10mm)0.5primer mix(10μm)0.5taq dna polymerase(5u/μl)0.5milli-q h2oto 20μl
53.表3 pcr程序
54.seg.temp.timecycle195℃5min 295℃30s 358℃30s 472℃30s2-4，40572℃3min 625℃hold 55.在步骤(2)至步骤(4)中，cas9蛋白在grna引导下结合到靶位点进而造成dna双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，最终实现基因敲除。dsc2蛋白功能几乎完全丧失，致使小鼠出现了右心室扩大，心肌纤维化等右心室心肌病的表现
56.如图1所示，通过crispr-cas9技术构建dsc2缺失突变型(dsc2-/-)小鼠：在第18号染色体的desmocollin-2(dsc2)的第4外显子通过片段删除引起移码突变，终止密码子提前出现并产生截断的蛋白，从而导致了dsc2蛋白不能正常表达，致使dsc2-/-的缺失。
57.如图2所示，分别选取6周龄和12周龄的dsc2-/-小鼠，发现小鼠从6周开始，dsc2-/-小鼠心脏开始变大，与野生型小鼠相比较，在12周出现明显的心脏大小差异。小鼠心脏彩色超声显示，小鼠从6周龄开始右心室出现扩大，且12周龄时，dsc2-/-小鼠右心室扩张明显。大体标本显示，小鼠在12周龄时，右心室扩大且心室壁变薄明显。这一结果表明，dsc2-/-小鼠随着周龄的增长可以自发地出现右心室的扩大，右心室室壁的变薄，与临床上右心室心肌病中右心室受累的表型相一致。
58.如图3所示，通过masson染色和he染色，发现小鼠从六周龄开始出现纤维化，在12周龄出现明显的纤维化。dsc2-/-在未做任何手术或干预的条件下，自发地出现心肌的纤维化，这一表现与临床上右心室心肌病中由心脏的纤维化取代正常心肌细胞的结果相一致。
59.如图4所示，通过电镜分析，透射电镜下6周和12周心肌闰盘结构包括桥粒结构未见明显受损，而线粒体大小不一，肿胀，可见空泡样变，结构不完整，部分线粒体嵴溶解断裂，肌纤维水肿，排列紊乱，甚者断裂，肌浆网明显地变大变亮。由于右心室心肌病与ca
2
相关联，ca
2
的异常会致使肌浆网和线粒体异常，这证明dsc2-/-的小鼠与右心室心肌病的发生原理相一致。
60.如图5所示，发现dsc2-/-小鼠会随着年龄的增长出现心肌细胞的凋亡，这种不用做任何手术或干预处理就可以成功诱导凋亡的模型，可用于后续凋亡动物实验的研究。
61.综上可知，本发明为先天的小鼠基因缺陷致使的自发性右心室心肌病模型，且随着小鼠的年龄增长，晚期会出现自发性的右心衰竭。该小鼠可以随着周龄的增加，在不做任何药物干预和手术干预的情况下，自发右心室心肌病，且由于小鼠在六周龄就开始逐渐出现右心室心肌病表型，晚期表现出右心衰的症状。由于小鼠诱导时间相对较短(出生六周即可出现)，诱导成功几率为百分之百，该动物模型可以为深入了解右心室心肌病及右心衰竭的病理生理机制的研究提供有力的工具，在对右心室心肌病和右心衰竭药物研发及临床防治的科研动物实验中发挥重要作用。
62.上述对具体实施方式的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对具体实施方式做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述
具体实施方式。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
63.