一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法。


背景技术：

2.青蒿素是从中国传统药用草本植物青蒿中提取得到的倍半萜类化合物。双氢青蒿素(dihydroartemisinin，dha)是青蒿素的主要活性代谢产物，其分子式为c
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o5，分子量为284.35。双氢青蒿素相比青蒿素具有高效、安全、剂量小、研制简便及毒性低等优点，成为当前青蒿素类药物之优选药。随着对双氢青蒿素药理作用的研究不断深入，其抗炎、抗肝纤维化及抗肿瘤等多种药理作用不断被揭示，尤其是抗肿瘤作用得到广泛关注。但dha却存在水溶性差，体内代谢快，作用靶点不明确等问题。因此，研制双氢青蒿素新剂型一直是研究者关注的热点。
3.纳米载药系统是一种新型的药物递送系统，不仅可以提高药物药效、降低化疗的毒副作用，还能够实现药物可控释放、体内靶点有效蓄积、强药物半衰期及延长血液循环时间。因此，纳米药物载药系统在医药领域的极具应用前景。但是，不论何种纳米载药系统都会附带将其他的离子输送至细胞或其他组织中，给细胞和组织带来一定毒性及其他影响。故寻求无毒、绿色的纳米粒制备方法极为重要。自组装纳米药物递送系统具有高载药量，避免了传统纳米载体自身因素导致的系统毒性，在药物递送系统中更具应用价值。另一方面，市场上还没有纳米双氢青蒿素口服乳液上市，大致原因是因为纳米双氢青蒿素由于粒径较小，容易沉积团聚，导致货架期放置过程容易分层，最终导致含量均匀性较差，同时，纳米双氢青蒿素还具有相较于普通双氢青蒿素更大的比表面积，产品制备过程同光、热的接触面积更大，使得制备过程杂质增加较大，含量下降明显。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法。
5.本发明目的通过如下技术方案实现：
6.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，其特征在于，它包括双氢青蒿素自组装纳米粒的制备、负载基质的制备、分散、均质、罐装等步骤；其中所述双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将双氢青蒿素和二氧化硅进行研磨混合，得双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末，然后将双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末、泊洛沙姆加入n,n
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二甲基甲酰胺中，超声溶解，取出，置于搅拌器中，在搅拌条件下滴加去离子水，滴加完毕，继续搅拌12～15小时，取出，置于离心机中，离心，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析24～28小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。
7.进一步，所述双氢青蒿素和二氧化硅于研磨混合时间为30～60分钟，所述超声溶解得超声频率为20～40hz，超声时间20～30分钟，所述搅拌转速为80～100转/min，所述离心时间为5～8min，离心转速为5000～8000转/min，所述液态双氢青蒿素自组装纳米粒固含
量为20％～30％。
8.进一步，所述双氢青蒿素、二氧化硅、泊洛沙姆、n,n
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二甲基甲酰胺、去离子水的质量比为3：1～3：13～17：4.5～5.5：8～12，所述二氧化硅粒径为0.8～20微米。
9.进一步，上述负载基质的制备是取药剂学可以接受的油相基质与水相基质，分别加热至80～100℃，在保证油相基质与水相基质相同温度的条件下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，搅拌转速为80～120转/min，油相基质加入完毕，继续搅拌3～5分钟，然后自然冷却至60～65℃，加入防腐剂和二氧化硅，继续搅拌并自然降温至40～45℃，保温，备用，即得负载基质。
10.进一步，所述油相是由以下重量份得物料组成，单硬脂酸甘油酯8～12份、十六醇3～7份、白凡士林10～12份、液体石蜡6～9份、棕榈油3～7份、三乙醇胺2～5份；所述水相是由以下重量份得物料组成，甘油12～16份、去离子水300～400份；所述防腐剂为羟苯甲脂，重量份数为3～6份，所述二氧化硅用量为8～10份；所述二氧化硅粒径为60～120微米。
11.进一步，所述分散，是将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为80～120转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌30～50分钟，并自然冷却至15～25℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：100～150。
12.进一步，所述均质，是将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力15～20mpa，流量10～12l/h,连续均质2～3次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
13.双氢青蒿素自组装纳米粒制备过程，当双氢青蒿素溶于n,n
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二甲基甲酰胺中，在搅拌条件下，双氢青蒿素会在静电吸附与π健作用下形成纳米粒子，溶于水中从而完成自组装纳米粒，而这种由于静电吸附形成得纳米粒子，特别不易控制，很容易发生团聚现象，而本发明中泊洛沙姆会给双氢青蒿素纳米颗粒提供一个分散骨架，可分散过多的双氢青蒿素纳米粒接触的机会，同时也让双氢青蒿素纳米粒可以在泊洛沙姆提供的骨架上顺利成型，而特定粒径和用量的二氧化硅，先经研磨附着于双氢青蒿素的表面，可作为抗粘剂，具有抗静电作用，保证双氢青蒿素纳米粒不会过度吸附而团聚，另一方面，二氧化硅加入基质中，又具有助悬性能，配合同时具有自乳化性和碱性的三乙醇胺，为整个体系提供了适宜的ph值和适宜乳化环境，使得整个乳液体系稳定，保证货架期过程，基质不会油水分层，双氢青蒿素纳米粒子也不会由于静电作用而发生团聚现象，最终提高了本发明产品稳定性。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明制备的自组装双氢青蒿素纳米粒粒径最大约为103.52nm，呈正态分布，形貌均匀规则，分散性良好，无团聚现象，自组装双氢青蒿素纳米粒载药量高达90.1％，在酸性条件下相应释放；本发明制得的口服乳液稳定性好，经高温24月、高湿24月、离心30分钟等极端条件均无油水分层、团聚现象，含量稳定不下降，产品稳定性好，货架期长。本发明自组装双氢青蒿素纳米粒口服乳液，可显著提高双氢青蒿素的生物利用度，增加双氢青蒿素在肿瘤的靶向蓄积，并显著提高双氢青蒿素的抗肿瘤作用。
附图说明
16.图1本发明制得的一种双氢青蒿素自组装纳米粒粒径分布图。
17.图2本发明制得的一种双氢青蒿素自组装纳米粒tem形貌图。
18.图3对比例1制得的一种双氢青蒿素自组装纳米粒粒径分布图。
具体实施方式
19.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
20.实施例1：
21.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，按如下步骤制得：
22.1.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备：
23.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将3份双氢青蒿素和2份粒径为0.8～20微米的二氧化硅进行研磨混合50分钟，得双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末，然后将双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末、15份泊洛沙姆加入5份n,n
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二甲基甲酰胺中，设定超声频率30hz，超声时间为25分钟，超声溶解，取出，置于搅拌器中，设定搅拌转速90转/min，在搅拌条件下滴加10份去离子水，滴加完毕，继续搅拌13小时，取出，置于离心机中，以离心转速为7000转/min，离心7min，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析26小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。将双氢青蒿素自组装纳米粒进行粒径测定，纳米粒径约为103.52nm，具体如图1所述，由图可知，本品粒径小，更易被吸收。
24.2.负载基质的制备：
25.(1)取单硬脂酸甘油酯10份、十六醇5份、白凡士林11份、液体石蜡8份、棕榈油5份、三乙醇胺4份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得油相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
26.(2)取甘油15份、去离子水360份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得水相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
27.(3)在保温于90℃下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，水相基质加入完毕，继续搅拌4分钟，然后自然冷却至62℃，加入羟苯甲脂4份和粒径为60～120微米二氧化硅9份，继续搅拌并自然降温至42℃，保温，备用，即得负载基质，所述用量均为质量份。
28.3.分散：
29.将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为100转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌40分钟，并自然冷却至20℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：130。
30.4.均质：
31.将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力18mpa，流量11l/h,连续均质2次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
32.5.灌装：灌装成100ml一瓶，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
33.试验一：一种双氢青蒿素自组装纳米粒形貌
34.取实施例1制得的氢青蒿素自组装纳米粒，置于电镜中观察，具体如图2，由图可知，微观条件下，本发明氢青蒿素自组装纳米粒分散好，未发现团聚现象。
35.试验二：一种双氢青蒿素自组装纳米粒中双氢青蒿素载药量测定
36.取实施例1制得的氢青蒿素自组装纳米粒，用乙醇洗涤双氢青蒿素纳米粒纳米悬浮液，然后通过uv-vis吸收光谱技术收集上清液用于测定药物的负载量。通过与质量分数为0.2％naoh溶液在50℃下孵育30分钟，可以将dha转化为紫外吸收化合物，并检测290nm处的特征紫外吸收光谱，结果表明，其载药量高达90.1％
37.实施例2：
38.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，按如下步骤制得：
39.1.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备：
40.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将3份双氢青蒿素和1份粒径为0.8～20微米的二氧化硅进行研磨混合30分钟，得双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末，然后将双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末、13份泊洛沙姆加入4.5份n,n
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二甲基甲酰胺中，设定超声频率20hz，超声时间为20分钟，超声溶解，取出，置于搅拌器中，设定搅拌转速80转/min，在搅拌条件下滴加8份去离子水，滴加完毕，继续搅拌12小时，取出，置于离心机中，以离心转速为5000转/min，离心5min，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析24小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。将双氢青蒿素自组装纳米粒进行粒径测定，纳米粒径约为101.31nm，符合纳米级别要求。
41.2.负载基质的制备：
42.(1)取单硬脂酸甘油酯8份、十六醇3份、白凡士林10份、液体石蜡6份、棕榈油3份、三乙醇胺2份，置于适宜容器中，加热至80℃，即得油相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
43.(2)取甘油12份、去离子水300份，置于适宜容器中，加热至80℃，即得水相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
44.(3)在保温于80℃下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，水相基质加入完毕，继续搅拌3分钟，然后自然冷却至60℃，加入羟苯甲脂3份和粒径为60～120微米二氧化硅8份，继续搅拌并自然降温至40℃，保温，备用，即得负载基质，所述用量均为质量份。
45.3.分散：
46.将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为80转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌30分钟，并自然冷却至15℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：100。
47.4.均质：
48.将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力15mpa，流量10l/h,连续均质2次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
49.5.灌装：灌装成100ml一瓶，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
50.按实施例1的方法，分别进行双氢青蒿素自组装纳米粒形貌和双氢青蒿素载药量测定，结果表明，本发明氢青蒿素自组装纳米粒分散好，未发现团聚现象，而双氢青蒿素自组装纳米粒载药量高达90.8％。
51.实施例3：
52.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，按如下步骤制得：
53.1.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备：
54.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将3份双氢青蒿素和3份粒径为0.8～20微米的二氧化硅进行研磨混合60分钟，得双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末，然后将双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末、17份泊洛沙姆加入5.5份n,n
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二甲基甲酰胺中，设定超声频率40hz，超声时间为30分钟，超声溶解，取出，置于搅拌器中，设定搅拌转速100转/min，在搅拌条件下滴加12份去离子水，滴加完毕，继续搅拌15小时，取出，置于离心机中，以离心转速为8000转/min，离心8min，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析28小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。将双氢青蒿素自组装纳米粒进行粒径测定，纳米粒径约为100.58nm，符合纳米级别要求。
55.2.负载基质的制备：
56.(1)取单硬脂酸甘油酯12份、十六醇7份、白凡士林12份、液体石蜡9份、棕榈油7份、三乙醇胺5份，置于适宜容器中，加热至100℃，即得油相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
57.(2)取甘油16份、去离子水400份，置于适宜容器中，加热至100℃，即得水相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
58.(3)在保温于100℃下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，水相基质加入完毕，继续搅拌5分钟，然后自然冷却至65℃，加入羟苯甲脂6份和粒径为60～120微米二氧化硅10份，继续搅拌并自然降温至45℃，保温，备用，即得负载基质，所述用量均为质量份。
59.3.分散：
60.将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为120转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌50分钟，并自然冷却至25℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：150。
61.4.均质：
62.将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力20mpa，流量12l/h,连续均质3次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
63.5.灌装：灌装成100ml一瓶，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
64.按实施例1的方法，分别进行双氢青蒿素自组装纳米粒形貌和双氢青蒿素载药量测定，结果表明，本发明氢青蒿素自组装纳米粒分散好，未发现团聚现象，而双氢青蒿素自组装纳米粒载药量高达91.2％。
65.对比例1(为双氢青蒿素自组装纳米粒制备过程中未加二氧化硅和泊洛沙姆制得的产品)：
66.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，按如下步骤制得：
67.1.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备：
68.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将3份双氢青蒿素加入5份n,n
’‑
二甲基甲酰胺中，设定超声频率30hz，超声时间为25分钟，超声溶解，取出，置于搅拌器中，设定搅拌转速90转/min，在搅拌条件下滴加10份去离子水，滴加完毕，继续搅拌13小时，取出，置于离心机中，以离心转速为7000转/min，离心7min，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析26小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。将实施例4制得的双
氢青蒿素自组装纳米粒进行粒径测定，纳米粒径约为264.7nm，具体如图3所述，由图可知，本品粒径较大，粒径分布范围较宽，相较于本发明产品不易被吸收。
69.2.负载基质的制备：
70.(1)取单硬脂酸甘油酯10份、十六醇5份、白凡士林11份、液体石蜡8份、棕榈油5份、三乙醇胺4份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得油相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
71.(2)取甘油15份、去离子水360份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得水相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
72.(3)在保温于90℃下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，水相基质加入完毕，继续搅拌4分钟，然后自然冷却至62℃，加入羟苯甲脂4份和粒径为60～120微米二氧化硅9份，继续搅拌并自然降温至42℃，保温，备用，即得负载基质，所述用量均为质量份。
73.3.分散：
74.将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为100转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌40分钟，并自然冷却至20℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：130。
75.4.均质：
76.将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力18mpa，流量11l/h,连续均质2次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
77.5.灌装：灌装成100ml一瓶，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
78.对比例2(负载基质制备过程中，不添加二氧化硅所制得的产品)：
79.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液的制备方法，按如下步骤制得：
80.1.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备：
81.双氢青蒿素自组装纳米粒的制备是先将3份双氢青蒿素和2份粒径为0.8～20微米的二氧化硅进行研磨混合50分钟，得双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末，然后将双氢青蒿素和二氧化硅混合粉末、15份泊洛沙姆加入5份n,n
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二甲基甲酰胺中，设定超声频率30hz，超声时间为25分钟，超声溶解，取出，置于搅拌器中，设定搅拌转速90转/min，在搅拌条件下滴加10份去离子水，滴加完毕，继续搅拌13小时，取出，置于离心机中，以离心转速为7000转/min，离心7min，取上清液置于截留分子量为3.5～3.8kda的透析袋中，以去离子水透析26小时，即得液态双氢青蒿素自组装纳米粒。
82.2.负载基质的制备：
83.(1)取单硬脂酸甘油酯10份、十六醇5份、白凡士林11份、液体石蜡8份、棕榈油5份、三乙醇胺4份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得油相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
84.(2)取甘油15份、去离子水360份，置于适宜容器中，加热至90℃，即得水相基质，保温备用，所述用量均为质量份；
85.(3)在保温于90℃下，将油相基质缓慢加入水相基质中，边加边搅拌，水相基质加入完毕，继续搅拌4分钟，然后自然冷却至62℃，加入羟苯甲脂4份，继续搅拌并自然降温至42℃，保温，备用，即得负载基质，所述用量均为质量份。
86.3.分散：
87.将上述制得负载基质置于搅拌机中，设定搅拌转速为100转/min进行搅拌，在搅拌条件下，缓慢的将双氢青蒿素自组装纳米粒加入负载基质中，加入完毕，继续搅拌40分钟，并自然冷却至20℃，即得分散乳液，所述双氢青蒿素自组装纳米粒与负载基质的质量比为1：130。
88.4.均质：
89.将上述分散乳液，置于高压均质机中，设定压力18mpa，流量11l/h,连续均质2次，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
90.5.灌装：灌装成100ml一瓶，即得双氢青蒿素自组装纳米口服乳液。
91.实施例4
92.一种双氢青蒿素自组装纳米口服乳液模拟稳定性试验：
93.取实施例1、2、3、4、5制得的双氢青蒿素自组装纳米口服乳液，分别置于40℃条件下放置24月，离心10000转/min(离心30分钟)、高湿(相对湿度92.5％)放置24月，观察乳液性状、是否分层团聚，含量，结果如下表：
[0094][0095]
由上表可知，对比例1(纳米粒制备过程不添加二氧化硅和泊洛沙姆的情况下)开始制备产品，0天就出现了团聚，分层现象，经过极端稳定性考察后，乳液中还有固体析出，并且在乳液3个不同位置取样测定含量，含量均匀性极差，无法满足药用需求；而对比例2在乳化过程，未添加二氧化硅，制得的产品开始同实施例1、2、3制得的产品质量相当，但经极
端稳定性考察后，产品也出现了团聚，分层的情况，而分层后，从3个不同位置取样检测含量，含量均匀性较差，无法满足用药需求。而本发明实施例1、2、3制得的产品，经过极端稳定性考察结束，产品质量依旧稳定，未出现团聚，分层现象，含量也满足药用需求，表明本发明产品不会出现分层，团聚现象，稳定性好。