罗姆布茨菌MY01及其应用的制作方法

罗姆布茨菌my01及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种提高罗非鱼生长性能的罗姆布茨菌my01 及其应用。


背景技术：

2.水产益生菌是活菌和灭活菌或菌细胞某些组分，通过饵料投喂或投入到养殖水体中， 提高水产动物疾病抵抗力，改善健康状况，促进生长性能和饲料利用率，提高动物应激抵 抗力和总体活力。益生菌以其环境友好、安全有效等优点在水产养殖行业中引起广泛关注。 目前，鱼类养殖中常用益生菌有芽孢杆菌属(bacillus)、乳酸杆菌属(lactobacillus)、乳 球菌属(lactococcus)和酵母菌属(saccharomyces)细菌等。但水产益生菌的应用还存 在一定的盲目性。很多水产益生菌产品的使用效果并不稳定，其中一个很重要的原因可能 是益生菌的选择和使用不当。许多益生菌株并非分离自鱼类消化道，而是来自于环境或恒 温动物。且同一种益生菌在不同的鱼种上也有可能表现出不同功效。由于水产养殖业的益 生菌制剂定植肠道的条件不同，在使用时应该具有针对性，分离筛选针对性强的益生菌。
3.鱼类肠道内定植着大量微生物，肠道微生物与宿主之间存在一种营养共生关系。肠道 微生物能降解食糜，利用肠道营养物质进行生长繁殖，同时细菌在代谢过程中分泌生理活 性物质，如氨基酸、维生素、脂肪酸、消化酶等，有利于鱼类的生长和健康。鱼类肠道有 益微生物的筛选的研究，将为水产行业提供更高效的益生菌产品。


技术实现要素：

4.本发明提供一种提高罗非鱼生长性能的罗姆布茨菌及其应用。该菌株于2021年4月 13日保存于广东省微生物菌株保藏中心，命名为罗姆布茨菌(romboutsia lituseburensis) my01，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏 编号：gdmcc no:61558。
5.采用苛养厌氧培养基从健康罗非鱼肠道中分离获得一株罗姆布茨菌my01，37℃培 养48h，菌落白色光滑半透明、圆形，直径0.5-1.0mm，为厌氧革兰氏阳性菌。使用通用 引物27f/1492r pcr扩增16s rrna基因，测序获得目的序列进行ncbi blast比对分析， 获得的菌株与已公布的romboutsia lituseburensis具有最高的同源性。该菌安全性能良好。
6.罗姆布茨菌my01能促进罗非鱼的生长，显著提高罗非鱼的体重，提高罗非鱼血清 赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸等的含量。通过在饲料中添加罗姆布茨菌my01，可 以提高肠道菌群在蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸等的合成代谢等功能。全基因组测序结果表明，该菌中12个基因参与赖氨 酸合成代谢通路，9个基因参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成代谢通路，对应的表达产 物分别为赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。本发明的罗姆布茨菌在开发产氨基酸类产品或促进 鱼类，特别是罗非鱼的生长与健康的产品中具有重要的应用价值。
附图说明
7.图1为romboutsia my01在苛性厌氧培养基培养的菌落形态；
8.图2为romboutsia my01的透射电镜观察图；
9.图3为romboutsia my01基于16s rrna基因序列的nj系统进化树；
10.图4为romboutsia my01赖氨酸合成代谢通路；
11.图5为romboutsia my01苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成代谢通路；
12.图6为romboutsia my01对罗非鱼生长的影响图；
13.图7为不同组罗非鱼血清中氨基酸成分及含量图；
14.图8为不同组罗非鱼肠道菌群tax4fun基因功能预测图。
具体实施方式
15.为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进 一步的说明。
16.一材料与方法
17.1.菌种的分离与纯化
18.将尼罗罗非鱼肠道内容物至于苛养厌氧液体培养基，37℃，厌氧培养48h。获得的培 养液进行梯度稀释将其稀释至10-3
、10-4
、10-5
，取稀释液各150μl，涂布至苛养厌氧固体 培养基，置于37℃恒温培养箱中培养48h。选取菌落形态为单个、不规则的菌落进行反复 纯化培养，直至获得纯种菌株。选择获得纯种菌株的单菌落进行16s rrna基因序列分析、 形态学及革兰氏染色观察。
19.苛养厌氧液体培养基配方：混合蛋白胨23.0g，氯化钠5.0g，可溶性淀粉1.0g，碳酸 氢钠0.4g，葡萄糖1.0g，丙酮酸钠1.0g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，氯化血红素0.01g，维生 素k 0.001g，l-精氨酸1.0g，可溶性焦磷酸0.25g，琥珀酸钠0.5g，ph7.2
±
0.2，双蒸水 1000ml，混合均匀后，灭菌备用。
20.2.菌种鉴定
21.2.1形态学观察及染色
22.将筛选出的菌株划线接种于苛养厌氧固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中厌氧培 养24h，观察其菌落形态。挑选单菌落置于滴有生理盐水的载玻片上，涂布均匀后通过革 兰氏染色法在光学显微镜下观察菌体形态。投射电镜观察菌体形态。
23.2.2生理生化鉴定
24.将纯化培养的待测菌株用梅里埃厌氧菌鉴定试剂盒进行生理生化指标检测，具体操作 见试剂盒说明书。
25.2.3 16s rrna基因序列分析
26.用北京天根生物细菌基因组dna提取试剂盒提取待测菌株的细菌基因组dna，具 体操作步骤参照说明书。将提取的细菌基因组dna作为模板，用通过引物27f： 5
′–
gtttgatcctggctcag
–3′
和1492r：5
′–
tacggctaccttgttacgactt
–3′
来扩增 细菌的16s rrna基因。反应体系(25μl)为：模板dna 1μl，正反向引物各0.5μl， mix 12.5μl，灭菌蒸馏水10.5μl，pcr扩增的反应条件：94℃3min；94℃30s， 56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。pcr产物送至生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。获得目的系列之后，登
录ncbi网站，通过genbank中的blast 程序进行同源性分析，同时下载相关细菌的16s rrna基因序列，再通过bioedit软件进 行多重比对，用mega7.0软件中邻接法(neighbor joining，nj)构建分子系统进化树并 通过自建分析(boostrap)进行置信度检测，自检数据集为1000次。
27.2.4安全性实验
28.实验设置待测菌株注射组和阴性对照组，每组3个平行，以尼罗罗非鱼为实验用鱼(均 重22.5
±
1.3g)，每个平行随机选取罗非鱼15尾。将待测菌株设置三个浓度，分别为1.5
ꢀ×
107cfu/ml、1.5
×
108cfu/ml和1.5
×
109cfu/ml，采取腹腔注射的方式对实验组和对 照组中每尾鱼进行注射，实验组每尾鱼注射100μl，对照组注射等体积的0.85％生理盐水， 实验观察周期为7d，期间按常规方法喂养，每天观察记录鱼的死亡数量。
29.2.5全基因组测序分析
30.将romboutsia my01单菌落接种至苛养厌氧液体培养基，37℃，厌氧培养24h，4℃， 6000r/min离心5min收集菌体。用基因组提取试剂盒提取高质量的dna并构建dna 文库，利用基于第三代测序技术oxford nanopore technology的测序仪promethion对 dna 进行单分子测序，同时使用mgiseq-2000系统在pe150读长模式下对菌株的全基 因组进行双末端测序。
31.2.6 romboutsia my01拌料投喂对罗非鱼生长及生理的影响
32.实验在中国水产科学研究院珠江水产研究所池塘进行。实验选取质量约50g的罗非 鱼鱼苗150尾，随机分配到6个方形网箱中，25尾/网箱，每个网箱实际水体积为3m
3 (l
×w×
h＝1m
×
2m
×
1.5m)。设对照组1个，my01益生菌组(1.0
×
107cfu/g)，每组设3 个重复。每天收集新鲜的菌落，拌料投喂。每天两次投饵，日投饵量为体质量的4％。实 验时间为4周。
33.表1饲料配方
[0034][0035]
将罗非鱼冰浴麻醉后，用无菌生理盐水冲洗罗非鱼体表两遍，除去表面污物。解剖罗 非鱼称重后抽血，收集血清，采集肠道内容物样品，液氮速冻后于-80度冰箱保存。基于 液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)对血清进行氨基酸含量检测，对肠道内容物进行菌群的 16s rrna测序分析。
[0036]
二结果与分析
[0037]
1.菌株的分类与鉴定
[0038]
1.1菌株
[0039]
romboutsia my01在苛养厌氧固体培养基上的菌落形态为菌落白色光滑半透明、圆 形，直径0.5-1.0mm，为厌氧革兰氏阳性菌。透射电镜下观察，菌体为杆状(图1；图2)。 革兰氏染色结果表明，该菌为革兰氏阳性菌。
[0040]
1.2生理生化鉴定
[0041]
romboutsia my01的生理生化鉴定结果表明(表2)，该菌的明胶酶、葡萄糖苷酶反 应为阳性，尿素酶反应为阳性，产吲哚试验阴性，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖， 不能利用甘露醇、乳糖、木糖、阿拉伯糖、丙三醇、纤维二糖、松三糖、棉子糖、山梨醇、 鼠李糖、水杨苷、甘露醇，过氧化氢酶反应为阴性。
[0042]
表2 romboutsia my01的生理生化特征
[0043]
[0044][0045]
：阳性；-：阴性。
[0046]
1.3 16s rrna基因序列分析
[0047]
romboutsia my01经pcr扩增，16s rrna测序后获得目的序列，经blast与数据 库中的基因序列进行比较(图3)，结合菌株的生理生化特性，可以基本确定my01为 romboutsia属细菌。
[0048]
2.安全性试验
[0049]
通过腹腔注射法来检测romboutsia my01对罗非鱼的安全性。注射实验结果表明， 在给体重为(22.5
±
1.3)g罗非鱼注射100μl浓度分别为1.5
×
107cfu/ml、1.5
×
10
8 cfu/ml和1.5
×
109cfu/ml的菌液的条件下，并没有出现死亡及其他异常情况。以上实 验结果表明，romboutsia my01是一株安全性能好的菌株。
[0050]
3.全基因组测序
[0051]
通过比对kegg库，romboutsia my01中该菌中12个基因(粗线框表示)参与赖氨 酸合成代谢通路(图4)，9个基因(粗线框表示)参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成代 谢通路(图5)，对应的表达产物分别为赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0052]
将my01和ncbi上最大相似度的romboutsia lituseburensis参考基因组进行比较， 平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ani)均低于95％，因为一般同物种间 的ani值在95％以上，因此my01可能为romboutsia属的一个新物种。
[0053]
表2 romboutsia my01与ncbi上的romboutsia lituseburensis基因组平均核苷酸相似 度比较
[0054][0055]
4.投喂romboutsia my01饲料对罗非鱼生长和生理的影响
[0056]
romboutsia my01能促进罗非鱼的生长(图6)，益生菌喂养4周后，显著提高罗非 鱼体重和去内脏后体重，显著提高罗非鱼血清中赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸的含 量(图7；表3)。
[0057]
表3 my01对罗非鱼血清氨基酸成分的影响
[0058][0059]
通过在饲料中添加romboutsia my01，可以提高肠道菌群在蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、 苯丙氨酸、胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等的合成代谢等功能(图8)。
[0060]
本发明中，romboutsia my01的序列：
[0061]
cttcttcggaagagagcggcggacgggtgagtaacgcgtgggtaacctgccct gtacacacggataacataccgaaaggtatgctaatacgggataacatacttttatcgc atggtagaagtatcaaagctccggcggtacaggatggacccgcgtctgattagctag ttggtaaggtaacggcttaccaaggcgacgatcagtagccgacctgagagggtgat cggccacattggaactgagacacggtccaaactcctacgggaggcagcagtgggg aatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcaacgccgcgtgagcgatgaaggc cttcgggtcgtaaagctctgtcctcaaggaagataatgacggtacttgaggaggaa gccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggctagcgttatcc ggaattactgggcgtaaagggtgcgtaggtggtttcttaagtcagaagtgaaaggc tacggctcaaccgtagtaagcttttgaaactaagagacttgagtgcaggagaggag agtagaattcctagtgtagcggtgaaatgcgtagatattaggaggaataccagttgc gaaggcggctctctggactgtaactgacactgaggcacgaaagcgtggggagcaa acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtactagctgtcgggg gttacccccctcggtggcgcagctaacgcattaagtactccgcctgggaagtacgct cgcaagagtgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagtagcggagcatg tggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctaagcttgacatccttttgacct ctccctaatcggagatttcccttcggggacagaagtgacaggtggtgcatggttgtc gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgcc tttagttgccagcattaagttgggcactctagagggactgccagggataacctggag gaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgcttagggctacacacgtgc tacaatgggtggtacagagggcggccaagtcgtgaggcggagctaatcccttaaag ccattctcagttcggattgtaggctgaaactcgcctacatgaagctggagttactag taatcgcagatcagaatgctgcgg
tgaatgcgttcccgggtcttgtacacaccgccc gtcacaccacgggagttggaggcgcccgaagccggatagctaacctttggaagc