特罗司他马尿酸盐在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及特罗司他马尿酸盐(telotristat etiprate)在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中的应用。


背景技术：

2.特罗司他马尿酸盐(telotristat etiprate)是一种口服有效的色氨酸羟化酶抑制剂，临床用于治疗类癌瘤综合征。
3.蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,tbev)又称森林脑炎病毒，为黄病毒科黄病毒属。蜱传脑炎(tbe)是由tbev引起的以中枢神经系统病变为主要特征的自然疫源性疾病。人感染病毒的主要途径是被携带tbev的蜱虫叮咬，还可因摄入tbev污染的奶制品而感染。tbe的分布具有明显的地域性，与传播媒介密切相关。近年来，在中国东北、俄罗斯东部及日本北部tbe的发病呈现上升趋势，疫区范围也在不断扩大。目前用于预防tbev感染的灭活疫苗的免疫原性较低，诱导中和抗体的维持时间较短，且在林区职业人群以外可能暴露人群的接种率较低。目前无tbe特异治疗药物。
4.西尼罗病毒(west nile virus,wnv)属黄病毒科黄病毒属，为单股正链rna病毒，可引起人和动物发生西尼罗河热和西尼罗病毒脑膜脑炎，库蚊是其主要的传播媒介，鸟类是该病毒的中间宿主，而人和马则是终端宿主。wnv病广泛分布于非洲、中东、欧洲的部分地区。1999年夏季，wnv首次登陆美国，随后几年内在北美和中美洲迅速传播，导致美国和加拿大等国家历史上虫媒病毒感染的最大流行。目前尚无针对wnv感染的人用疫苗以及治疗药物。虽然我国至今没有wnv感染疫情发生，但有输入性传播的可能。
5.黄热病毒(yellow fever virus,yfv)与寨卡病毒(zikv)、西尼罗河病毒(wnv)和登革热病毒(denv)等同属黄病毒科黄病毒属，是以伊蚊为传播媒介，当前主要流行于非洲和南美洲的热带、亚热带地区。黄热病毒可引起严重危害人类健康的黄热病，表现为黄疸，出血、甚至多系统的器官衰竭。虽有减毒疫苗，但疫苗在流行区的接种覆盖率有限，每年均有疫情发生。我国近年来曾有多例输入性感染者。目前尚无针对yfv感染的特异治疗药物。
6.基孔肯雅热病毒(chikungunya fever virus,chikv)属于披膜病毒科甲病毒属，主要由埃及伊蚊和白蚊伊蚊为传播媒介，基因组为单股正链rna，可致基孔肯雅热，虽致死率不高，但被感染人群丧失劳动力，导致严重的社会影响与经济损失。chikv于1952-1953年在坦桑尼亚首次分离，随后在非洲和亚洲地区暴发流行。2005年后chikv再次在全球多地数次暴发，并在法国、意大利、中国出现散在的输入性病例，特别是chikv东中南非型e1蛋白发生突变(e1-a226v)使其可有效通过白蚊伊蚊传播，不仅对热带和亚热带地区，还对白蚊伊蚊广泛存在的温带地区的民众构成了潜在威胁。目前尚无针对chikv感染的疫苗以及特异治疗药物。


技术实现要素：

7.本发明旨在提供特罗司他马尿酸盐的一种新用途。
8.本发明提供了特罗司他马尿酸盐在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中的应用。
9.所述特罗司他马尿酸盐的化学结构式如下：
[0010][0011]
本发明所述的应用，其特征在于：所述抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物是以特罗司他马尿酸盐为唯一的活性成份，或包含特罗司他马尿酸盐的药物组合物。
[0012]
本发明所述的应用，其特征在于：所述包含特罗司他马尿酸盐的药物组合物是指特罗司他马尿酸盐与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
[0013]
本发明所述的应用，其特征在于：所述药物用于预防或治疗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒的感染。
[0014]
本发明利用tbev感染易感细胞的实验操作体系，从临床批准的药物小分子库中筛选可抑制tbev感染的候选小分子药物，筛选出特罗司他马尿酸盐能有效抑制tbev对人肝癌细胞huh7感染，其细胞毒性低，并且对wnv、yfv、chikv均具有抑制作用，可作为潜在的抗tbev、wnv、yfv、chikv药物，具有应用前景。
附图说明
[0015]
图1.特罗司他马尿酸盐保护bhk细胞抵抗蜱传脑炎病毒感染的效果；
[0016]
即bhk细胞以蜱传脑炎病毒感染，同时加入特罗司他马尿酸盐(终浓度10μm)或溶剂dmso(终浓度0.12％)，或不以蜱传脑炎病毒感染(未加病毒)，72小时后加入cck8试剂，检测450nm吸光值。
[0017]
图2.特罗司他马尿酸盐对huh7细胞的毒性；
[0018]
即特罗司他马尿酸盐(终浓度20μm)以及溶剂dmso(终浓度0.5％)分别处理huh7细胞，72小时后加入cck8试剂，检测450nm吸光值。
[0019]
图3.特罗司他马尿酸盐(终浓度10μm)在huh7细胞感染模型中对蜱传脑炎病毒的抑制作用。
[0020]
图4.特罗司他马尿酸盐抑制蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染的效果。
具体实施方式
[0021]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本
发明的保护范围。
[0022]
本发明实施例所用的特罗司他马尿酸盐可以通过市售方式购买获得。
[0023]
一、病毒、药物、试剂及其他材料
[0024]
1.病毒：蜱传脑炎病毒、黄热病毒由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室分离和扩增培养，西尼罗病毒、基孔肯雅热病毒利用反向遗传学技术合成，由幼仓鼠肾bhk细胞扩增培养。所有涉及病毒感染的实验操作均在海军军医大学p3实验室中进行。
[0025]
2.化合物：fda批准的2580种临床小分子药物分子库，购自美国selleck公司。
[0026]
3.人肝癌细胞系huh7和幼仓鼠肾bhk细胞，购自中国科学院上海细胞所，由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室保存。
[0027]
4.dmem细胞培养液为美国hyclone公司产品，用时添加10％胎牛血清、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素(各100u/ml)，培养液添加剂均为美国thermo fisher公司产品。
[0028]
5.细胞消化液，含0.25％胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液配制。
[0029]
6.cck8细胞活性和增殖检测试剂盒为美国medchemexpress公司产品。
[0030]
7.小鼠蜱传脑炎病毒多克隆抗体、西尼罗病毒多克隆抗体、黄热病毒多克隆抗体、基孔肯雅热病毒多克隆抗体由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室用甲醛灭活的病毒免疫小鼠而制备。
[0031]
8.荧光素alexafluor488-标记的抗小鼠igg为美国thermo fisher公司产品。
[0032]
二、实验方法：
[0033]
(一)从含2580种小分子化合物的fda药物分子库中筛选抗蜱传脑炎病毒药物
[0034]
用完全dmem培养液在t75细胞培养瓶内传代培养幼仓鼠肾bhk细胞，接种于96孔板，每孔10000个细胞，dmem培养液100μl，培养12小时。随后每孔加入50μl含1000pfu(空斑形成单位)蜱传脑炎病毒的完全dmem培养液；同时加入50μl含fda小分子化学药物的完全dmem培养液，药物终浓度为10μm，每个浓度重复3孔，以加等体积溶剂dmso作为不加药物的对照。置于37℃、5％co2孵箱内培养。72小时后显微镜下可见加dmso孔的全部细胞均变圆或脱落。每孔加入cck8细胞活性和增殖检测试剂10μl，置于37℃、5％co2孵箱内，30分钟后用多功能酶标仪检测每孔在450nm波长的吸光值，计算药物对细胞的保护率＝(加药细胞450nm吸光值—dmso孔细胞450nm吸光值)/未加病毒加dmso的细胞450nm吸光值*100％，得到每种药物在10μm浓度时对蜱传脑炎病毒感染细胞的保护率。结果显示，特罗司他马尿酸盐对细胞具有显著的保护效果，特罗司他马尿酸盐与dsmo对照处理细胞的450nm吸光值如图1所示，计算得到特罗司他马尿酸盐的细胞保护率为98.6％。
[0035]
(二)特罗司他马尿酸盐对细胞的毒性
[0036]
分别将培养的人肝癌细胞系huh7和幼仓鼠肾bhk细胞接种于96孔板，每孔10000个细胞，培养液100μl，12小时后，吸除原培养液，每孔内加入浓度梯度稀释的特罗司他马尿酸盐的完全dmem培养液100μl，特罗司他马尿酸盐终浓度分别为2.5、5、10、20、40和80μm，每个浓度重复3孔，以80μm药物的溶剂dmso含量作为不加药物的对照。置于37℃、5％co2孵箱内培养。48小时后，每孔加入cck8细胞活性和增殖检测检测试剂10μl，置于37℃、5％co2孵箱内，30分钟后用多功能酶标仪检测每孔对450nm波长的吸光值，根据不同浓度药物处理孔与溶剂孔450nm吸光值的差异评价药物的细胞毒性。
[0037]
结果显示，当浓度等于或低于20μm时，特罗司他马尿酸盐处理的两种细胞与dmso
溶剂处理的细胞均无明显差异。图2显示20μm时，特罗司他马尿酸盐处理的huh7细胞与dmso溶剂处理细胞的450nm吸光值。
[0038]
(三)特罗司他马尿酸盐在细胞感染模型中对蜱传脑炎病毒的抑制作用
[0039]
将传代培养的人肝癌细胞系huh7接种于96孔板，每孔10000个细胞，培养液100μl，培养12小时。随后每孔加入50μl含1000pfu蜱传脑炎病毒的完全dmem培养液；同时加入50μl含特罗司他马尿酸盐的完全dmem培养液，药物终浓度为5μm，每个浓度重复3孔，以加等体积溶剂dmso作为不加药物的对照，置于37℃、5％co2孵箱内培养。
[0040]
20小时后，用免疫荧光技术检测病毒对细胞的感染情况，具体操作如下：吸除培养板中的培养液，每孔加100μl甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每孔以磷酸盐缓冲液(pbs)洗孔一次，随后加入100μl含3％牛血清白蛋白(bsa)的pbs(以下简称3％bsa-pbs)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％bsa-pbs，每孔加100μl含抗蜱传脑炎病毒多克隆抗体的1％bsa-pbs(抗体500倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的抗蜱传脑炎病毒多克隆抗体工作液，每孔以pbs洗3次，随后加入100μl含荧光素alexa fluor 488-标记的抗小鼠igg的1％bsa-pbs(荧光素抗体1500倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入dapi细胞核染色液100μl，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的dapi细胞核染色液，每孔以pbs洗3次，用细胞成像及分析系统(biotek cytation 5imaging reader)对每孔细胞的荧光分布进行拍照。每孔拍照四个视野，分析、计算绿色荧光阳性细胞的百分率，即病毒感染率。
[0041]
结果如图3所示，与作为对照的dmso溶剂处理孔相比，特罗司他马尿酸盐处理病毒感染率明显降低。结果证明，在5μm浓度时，特罗司他马尿酸盐能显著抑制蜱传脑炎病毒对huh7细胞的感染。
[0042]
(四)特罗司他马尿酸盐抑制蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染活性的定量测定
[0043]
为了观察特罗司他马尿酸盐对蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒是否具有抗抑制活性，我们进一步对特罗司他马尿酸盐进行了抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒活性的量化检测，即通过检测不同浓度时的抗病毒活性，计算药物对病毒的半数抑制浓度(ic50)。药物设置了连续二倍稀释的七个浓度梯度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μm。检测方法中，除了药物处理设置浓度梯度外，其他与(三)中所述相同。病毒感染的细胞经病毒抗体和荧光抗体结合以及细胞核染色以后，用细胞成像及分析系统进行细胞拍照，每孔拍照四个视野，分析、计算绿色荧光阳性细胞的百分率，即病毒感染率(图4)。根据各浓度梯度药物处理孔的阳性细胞百分率，计算出特罗司他马尿酸盐对蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒的ic50；蜱传脑炎病毒ic50：0.1323μm；西尼罗病毒ic50：0.2548μm；黄热病毒ic50：0.4981μm；基孔肯雅热病毒ic50：0.5545μm。
[0044]
上述体外和体内实验结果均表明，特罗司他马尿酸盐具有显著的蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染的活性，可用于制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染的药物。
[0045]
以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，
在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。