一种藻菌共培养去除苯酚和促进小球藻生长的方法

1.本发明涉及生物环境及污水处理领域，具体涉及一种藻菌共培养去除苯酚和促进小球藻生长的方法。


背景技术：

2.随着经济的快速发展，人口增长和社会现代化程度的不断提高，各种污水排放量剧增。据统计，中国2018年的化工废水排放总量达2.35亿吨，而石化废水中含有石油类、苯系物、多环芳烃类、腈类、有机氯等多种有毒有害物质，属于典型的难降解工业废水，单一的处理工艺很难实现达标排放。
3.苯酚是一种对环境有污染的芳香族有机化合物，广泛存在于石油炼制、木材防腐、焦化等行业的废水中。苯酚属于高毒物质，可以通过皮肤、黏膜、口腔进入人体内，低浓度苯酚可使细胞蛋白变性，高浓度可使蛋白质沉淀。此外，苯酚被证明有致癌、致突变、致畸性等危害，被世界各国列为重点处理的有机污染物之一。含酚废水的处理方法可分为物化法和生物法。其中，物化法具有成本高、容易造成二次污染等缺点。相比之下，生物法具有环境友好、成本低、不产生二次污染等优点。微生物能利用酚类化合物作为碳源或能源，并将其代谢转化，因此，藻类、细菌、真菌等去除酚类化合物得到了广泛研究。
4.微藻具有生长速率快、光合效率高、成本低、无二次污染等特点，常用于苯酚废水处理。但其对苯酚耐受性低是制约微藻处理含酚废水技术应用的瓶颈之一。藻菌共培养技术利用微藻与真菌两类生物功能之间的协同作用，使二者达到共生状态来降解污水中的氮、磷、有机质、营养盐以及毒素等，对苯酚废水的去除更加有效，且具有以下优势：真菌可以代谢生成二氧化碳供藻细胞光合利用，同时释放维生素、糖肽类等生长刺激因子促进小球藻生长；微藻通过光合作用产生真菌降解有机物所需的o2，同时降低了co2的排放量；获得的微藻生物质可进一步加工制备高附加值产品，提高经济效益。
5.藻菌共培养处理苯酚废水较微藻具有一定优势，同时大多研究关注藻菌共培养对含酚废水的处理效果，而对处理过程中微藻生长的变化关注较少，但微藻生物质的获得对提高该技术的经济性具有重要作用。因此，对这方面的研究具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种通过藻菌共培养去除苯酚和促进小球藻生长的方法，该方法将小球藻与热带假丝酵母菌按照一定比例进行共培养，藻菌共培养能够在bg11 cm007混合培养基中实现小球藻正常生长和高效去除苯酚，显著提高了藻菌细胞的生物量和苯酚去除效率，为藻菌共培养处理含酚废水的的规模化应用提供理论基础。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.将小球藻(chlorella vulgaris)与热带假丝酵母菌(candida tropicalis)按照一定初始比例进行共培养。在藻菌共培养体系中，微藻能够为微生物的生长提供所需氧气和养分，而微生物可以消耗藻类光合作用释放的氧气并产生co2供微藻利用，同时能够消耗
胞外多聚物中的多糖等物质来减少其对藻细胞生长的抑制作用。另外，热带假丝酵母菌高浓度苯酚环境的耐受性和去除能力很高，这样既可以保证小球藻的正常生长，还可以实现废水中高浓度苯酚的去除，具体培养方法如下：
9.(1)首先将小球藻在bg11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机8000
×
g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量bg11 cm0077混合培养基进行悬浮且将od750调至为1；
10.(2)同时将热带假丝酵母菌株在cm007培养基中培养至对数生长期，随后菌细胞用离心机6000
×
g离心10min去掉上清，菌细胞沉淀加入适量bg11 cm0077混合培养基进行悬浮且将od600调至为1；
11.(3)将上述准备好的藻液和菌液分别按照藻菌初始比例5:1、3:1、1:1、1:3和1:5的体积比例接种至锥形瓶中，分别加入一定量的苯酚溶液调至苯酚浓度为700mg/l,最后用bg11 cm0077混合培养基定容至100ml；
12.(4)最后将混合的藻菌细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度28
±
1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx，以纯小球藻和纯热带假丝酵母菌的培养体系作为对照。
13.本发明方法具有如下优点：
14.本发明在混合培养基条件下将小球藻与热带假丝酵母菌按照一定比例进行共培养，利用小球藻与热带假丝酵母菌之间的互利共生关系对共培养体系中营养物质的调控以及热带假丝酵母菌对苯酚的高耐受性，在促进小球藻和热带假丝酵母菌正常生长的同时，又可以实现高效去除苯酚，从而解决了藻类处理苯酚废水优势与其对苯酚耐受性低之间的矛盾。
附图说明
15.图1是纯藻在不同苯酚浓度下培养7d后苯酚去除情况的变化；
16.图2是纯藻和藻菌共培养体系在700mg/l苯酚浓度下培养7d后苯酚浓度的变化；
17.图3是纯藻和藻菌共培养体系在700mg/l苯酚浓度下培养7d后小球藻叶绿素的变化；
18.图4是纯藻和藻菌共培养体系在700mg/l苯酚浓度下培养7d后小球藻总叶绿素和苯酚去除速率的变化；
19.图5是纯藻和藻菌共培养体系在700mg/l苯酚浓度下培养7d后小球藻细胞数量的变化；
20.图6是纯菌和藻菌共培养体系在700mg/l苯酚浓度下培养7d后热带假丝酵母菌细胞数量的变化；
21.图7是微观显微镜下藻菌共生生态生理图；
具体实施方式
22.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
23.实施例
24.一、小球藻的培养
25.a、小球藻的选取：藻种购于中国科学院淡水藻种库(fachb)；
26.b、小球藻的纯化：无菌小球藻经含有抗生素的bg11平板(配方如表1所示)筛选获得。先将50μl小球藻藻液均匀涂布至含有100mg/l氨苄青霉素、50mg/l壮观霉素和50mg/l硫酸卡那霉素的bg11固体平板上，平板放入光照培养箱中培养，培养7d后挑取小球藻单藻落，划线至新鲜的含有抗生素的bg11平板上，重复三次并通过显微镜鉴定以获得无菌小球藻；
27.c、小球藻的培养：采用bg11液体培养基进行培养，培养温度25
±
1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx。
28.表1 bg11培养基配方
[0029][0030]
(说明：培养基总体积为1000ml，固体培养基添加1.5％的琼脂)
[0031]
二、热带假丝酵母菌的培养
[0032]
a、热带假丝酵母菌的选取：菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)；
[0033]
b、热带假丝酵母菌的培养：菌株培养所用cm007培养基组成如下：5
°bé
麦芽汁1.0l，自然ph值。培养基121℃高温高压灭菌30min使用，菌株在摇床中培养，培养条件：29℃，200rpm。
[0034]
三、构建小球藻与菌株的共培养体系
[0035]
将小球藻在bg11培养基中培养至对数生长期，用离心机8000
×
g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量bg11 cm0077混合培养基进行悬浮且将od750调至为1。取培养至对数生长期得热带假丝酵母菌，用离心机6000
×
g离心10min去掉上清，用bg11 cm0077混合培养基将od600调至为1。将上述准备好的藻液和菌液分别按照藻菌初始比例5:1、3:1、1:1、1:3和1:5的体积比例接种至锥形瓶中，分别加入一定量的苯酚溶液调至苯酚浓度为700mg/l,最后用bg11 cm0077混合培养基定容至100ml。将混合的藻菌细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度28
±
1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx，以纯小球藻和纯热带假丝酵母菌的培养体系作为对照。
[0036]
四、结果分析
[0037]
a、纯小球藻对不同苯酚浓度去除率的变化
[0038]
苯酚的生物降解过程往往依靠微藻或微生物释放的降解酶，在酶的作用下，苯酚经过一步步代谢为小分子的脂肪酸，最终进入tca循环，被微生物继续代谢利用。苯酚含量采用4
–
氨基安替比林法进行测定，利用酚类物质在ph＝10.0
±
0.2的介质中，在铁氰化钾存在下，与4
–
氨基安替比林反应生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，其水溶液在510nm波长处
有最大吸收峰的特性，使用分光光度计测定其不同浓度下的吸光值，绘制出苯酚含量与吸光度的标准曲线，并得到拟合的计算公式，从而计算苯酚的含量。步骤如下：取适量藻液8000
×
g离心15min后，取上清液0.5ml加入比色管中，再加入0.5ml氯化铵-氨水缓冲溶液，混匀，此时ph为10
±
0.2，然后加入1.0ml4-氨基安替比林溶液，再加1.0ml铁氰化钾溶液，充分混匀，放置10min后立即于510nm波长处，测定其吸光度，根据标准曲线换算成苯酚浓度。
[0039]
按照上述步骤得到的图1结果表明：当体系中苯酚浓度为150mg/l和300mg/l时，小球藻在分别培养5d和6d后，苯酚去除率均达到100％；而当苯酚浓度提高至500mg/l和700mg/l时，小球藻在培养7d后，苯酚去除率较低，分别为21％和13.1％。
[0040]
以上结果表明，纯小球藻对苯酚的最高耐受浓度为300mg/l，小球藻对苯酚的耐受性较低。
[0041]
b、藻菌初始接种比例对苯酚去除效果的影响
[0042]
通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中苯酚的含量来表征体系中苯酚浓度的变化。苯酚含量采用4-氨基安替比林法进行测定，步骤同上a所述。
[0043]
按照上述步骤得到的图2结果表明：培养3d后，小球藻与热带假丝酵母菌-1:3共培养体系中，苯酚浓度从700mg/l降到0mg/l，苯酚去除率为100％；初始接种比例为1:5、1:1、3:1和5:1共培养体系的苯酚去除率是在培养4d后达到了100％；纯热带假丝酵母菌的苯酚去除率也是在培养4d后达到了100％；而纯小球藻的苯酚去除率在培养7d才是13.1％。
[0044]
以上结果表明，小球藻与热带假丝酵母菌共培养体系对苯酚的去除效果明显高于纯小球藻。当初始接种比例为1:3时，小球藻与热带假丝酵母菌共培养体系对去除苯酚的促进效果最佳。对于小球藻初始接种比例较高的共培养体系，小球藻对苯酚的去除发挥主要作用，由于小球藻对苯酚的耐受性不高，因此不利于苯酚的去除；而对于热带假丝酵母菌初始接种比例较高的共培养体系中，其接种比例越高越接近于纯热带假丝酵母菌，因此会导致共培养体系对去除苯酚的促进效果较纯热带假丝酵母菌来说不明显。
[0045]
c、藻菌初始接种比例对小球藻叶绿素积累的影响
[0046]
通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中叶绿素的含量来表征小球藻叶绿素的变化。小球藻叶绿素含量采用99.5％甲醇提取法进行测定，步骤如下：取适量藻液8000
×
g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次后加入10ml99.5％甲醇，涡旋混匀3min后超声浸提40min，期间避光加冰防止叶绿素受热见光分解。待藻体颜色变白离心取上清液，测od
665.2
和od
652.4
。微藻的叶绿素浓度根据以下公式进行计算：
[0047]
chla(mg/l)＝16.72
×
od
665.2-9.16
×
od
652.4
；chlb(mg/l)＝34.09
×
od
652.4-15.28
×
od
665.2
；
[0048]
chla b(mg/l)＝1.44
×
od
665..2
24.93
×
od
652.4
。
[0049]
按照上述步骤得到的图3结果表明：培养7d后，小球藻与热带假丝酵母菌-1:3共培养体系中藻细胞的叶绿素积累最高，其中总叶绿素最大浓度为24.6mg/l，较纯藻培养体系的3.967mg/l提高了5.2倍；初始接种比例为1:1、3:1和5:1共培养体系的总叶绿素浓度较纯藻培养体系也分别提高了1.97倍、0.88倍和0.92倍。叶绿素a和叶绿素b的规律也是如此。
[0050]
以上结果表明，藻菌初始接种比例对微藻的生长具有重要影响，当初始接种比例为1:3时，热带假丝酵母菌株对小球藻叶绿素积累的促进效果最佳。
[0051]
d、藻菌初始接种比例对小球藻总叶绿素积累和苯酚去除速率的影响
[0052]
通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中总叶绿素含量来表征小球藻总叶绿素的变化，具体步骤同上c所述。苯酚含量采用4
–
氨基安替比林法进行测定，具体步骤同上a所述。测量不同体系中苯酚去除前后的浓度，分别为c1和c2，苯酚去除时间为n(对于7d内苯酚未全部去除的体系，n＝7)。不同体系的苯酚去除速率根据以下公式进行计算：phenol removal rate(mg/l/d)＝(c
1-c2)/n。
[0053]
按照上述步骤得到的图4结果表明：小球藻与热带假丝酵母菌-1:3共培养体系的单位时间苯酚去除量(苯酚去除速率)最高为233mg/l/d，初始接种比例为1:5、1:1、3:1和5:1共培养体系的苯酚去除速率均为175mg/l/d，而纯小球藻体系的苯酚去除速率仅为30mg/l/d。同时，培养7d后，小球藻与热带假丝酵母菌-1:3共培养体系的总叶绿素积累最高，浓度为24.6mg/l，较纯藻培养体系的3.967mg/l提高了5.2倍；初始接种比例为1:1、3:1和5:1共培养体系的总叶绿素浓度较纯藻培养体系也分别提高了1.97倍、0.88倍和0.92倍。
[0054]
以上结果表明，共培养体系在促进小球藻总叶绿素积累的同时，又提高了苯酚去除速率，且藻菌初始接种比例对微藻的生长具有重要影响，当初始接种比例为1:3时，热带假丝酵母菌株对小球藻总叶绿素积累的促进效果最佳。
[0055]
e、藻菌初始接种比例对小球藻细胞数量的影响
[0056]
为进一步准确分析不同藻菌初始接种比例对小球藻细胞数量的影响，通过流式细胞仪对不同初始接种比例共培养体系下的小球藻细胞进行fl2和ssc的检测，从而对小球藻细胞数量进行统计。步骤如下：取适量藻液用鞘液稀释至5
×
10
5-1
×
108个细胞/ml，然后通过40μm的网筛过滤，所得小球藻细胞于流式细胞仪中检测，各共培养体系均在20ul/min的流速下获取10秒的藻细胞进行测定，最后做计数统计。
[0057]
不同藻菌初始接种比例体系的小球藻培养7d后，检测藻细胞数量的变化(图5)。在小球藻与热带假丝酵母菌共培养体系中，初始接种比例为1:3、1:5、1:1、3:1和5:1体系小球藻的细胞数量分别为2.46
×
107个、1.8
×
107个、2.4
×
107个、2.1
×
107个和2.37
×
107个，较纯培养体系的0.72
×
107个分别提高了2.7倍、1.5倍、2.3倍、1.9倍和2.2倍。
[0058]
以上结果表明，藻菌共培养对小球藻的生长有明显的促进作用，共培养体系中的小球藻均比纯小球藻的数量多，同时藻菌初始接种比例对小球藻细胞数量的积累有较大的影响。其中小球藻与热带假丝酵母菌初始接种比例为1:3时，小球藻细胞数量最多，热带假丝酵母菌对小球藻生长的促进作用最明显。
[0059]
f、藻菌初始接种比例对热带假丝酵母菌细胞数量的影响
[0060]
为进一步准确分析不同藻菌初始接种比例对热带假丝酵母菌细胞数量的影响，通过流式细胞仪对不同初始接种比例共培养体系下的热带假丝酵母菌细胞进行fsc和ssc的检测，从而对热带假丝酵母菌细胞数量进行统计。具体步骤同上e所述。
[0061]
不同藻菌初始接种比例体系的热带假丝酵母菌培养7d后，检测菌细胞数量的变化(图6)。在小球藻与热带假丝酵母菌共培养体系中，初始接种比例为1:3、1:5、1:1、3:1和5:1体系热带假丝酵母菌的细胞数量分别为1.95
×
108个、1.29
×
108个、1.02
×
108个、8.36
×
107个和7.8
×
107个，较纯培养体系的5.1
×
107个分别提高了1.1倍、1.5倍、1.0倍、0.6倍和0.5倍。
[0062]
以上结果表明：藻菌共培养体系的构建对热带假丝酵母菌的生长有明显的促进作用，同时保持共培养初始接种时热带假丝酵母菌的数目优势是促进菌细胞生长的一个重要
因素。
[0063]
g、光学显微镜下藻菌共生生态生理图
[0064]
用移液器吸取10μl样品滴到载坡片的中央，将盖玻片的一侧先接触载玻片上的样品，然后缓慢放下盖玻片，使盖玻片完全盖在载玻片上，在盖玻片上滴几滴松柏油，将做好的封片倒置放在光学显微镜下观察，先用低倍镜观察然后再用高倍镜观察。
[0065]
用显微镜观察藻菌共生的形式，得到的结果如图7所示。从图中可以看出，藻菌可以较好的共同生长，没有很明显的生长抑制作用。
[0066]
五、实验总结
[0067]
a、藻菌共培养体系对苯酚的去除效果明显高于纯小球藻。当小球藻与热带假丝酵母菌初始接种比例为1:3时，培养3d后苯酚去除率达到100％，对去除苯酚的促进效果最佳。热带假丝酵母菌的加入提高了体系对苯酚的耐受性，共培养促进了苯酚的去除，这对于微生物处理含酚废水具有重要意义；
[0068]
b、藻菌初始接种比例对共培养体系中小球藻的生长和叶绿素积累有显著影响。在小球藻与热带假丝酵母菌-1:3共培养体系中，小球藻的叶绿素含量(24.6mg/l)、藻细胞数量(2.46
×
107个)均为最高，且叶绿素含量、藻细胞数量较纯藻培养体系分别提高了5.2倍和2.7倍。热带假丝酵母菌的加入促进了小球藻的生长和叶绿素的积累，同时小球藻也促进了热带假丝酵母菌的生长，二者共生关系较好。
[0069]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。