用于治疗性处理代谢综合征的姜黄素类组合物的制作方法

用于治疗性处理代谢综合征的姜黄素类组合物
1.相关申请的交叉引用
2.这是一份要求于2019年10月15日提交的美国临时申请号62915068的优先权的pct申请，其主题通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及姜黄素类组合物及其治疗应用。更具体地，本发明涉及包含四氢姜黄素类(thc)、六氢姜黄素类(hhc)和八氢姜黄素类(ohc)的组合物及其缓解代谢综合征症状的潜力。


背景技术：

4.现有技术的描述
5.代谢综合征是代谢紊乱的群集或组合，会增加人患心脏病、糖尿病和中风的风险。术语代谢是指体内发生的生化过程。根据美国国立卫生研究院(nih)的数据，这是一项严重的全球健康挑战，23％的成年人面临心血管疾病、糖尿病和中风的风险增加。如果一个人同时出现这些疾病，那么他/她患心血管疾病的风险将高于单独出现任何一种因素(metabolic syndrome,national heart,lung and blood institute,u.s.dept of health and human services,nhlbi.nih.gov/health-topics/metabolic-syndrome)。在涉及代谢综合征发展的危险因素中，肥胖被认为是主要的致病因素。它引起慢性病的发展，从心血管疾病、高血压、ii型糖尿病、代谢综合征和中风到骨关节炎和癌症。以下现有技术文献回顾了导致代谢综合征发展的不同病理特征：
6.i)marjani a,a review on metabolic syndrome,journal of endocrinology and metabolism,2012；2(4-5):166-170.
7.ii)schindler c,the metabolic syndrome as an endocrine disease:is there an effective pharmacotherapeutic strategy optimally targeting the pathogenesis？ther adv cardiovasc dis,2007；1(1):7-26.
8.iii)srikanthan et al.,systematic review of metabolic syndrome biomarkers:a panel for early detection,management,and risk stratification in the west virginian population,int j med sci 2016；13(1):25-38.
9.iv)rochlani et al.,metabolic syndrome:pathophysiology,management,and modulation by natural compounds,ther adv cardiovasc dis 2017；11(8):215
–
225.
10.生活方式改变，包括饮食和运动干预是处理代谢综合征的推荐治疗方式(castro-barquero等人,dietary strategies for metabolic syndrome:a review,j obes ther 1:2；al-qawasmeh et al.,dietary and lifestyle risk factors and metabolic syndrome:literature review,curr res nutr food sci 2018；6(3))。但是，如果干预措施对bmi≥30的肥胖个体无效，或对诊断出合并症(如高血压或ii型糖尿病)的bmi≥27的个体无效，则可以考虑药物治疗。通常用于治疗代谢综合征的药物公开于marvasti等人,
pharmacological management of metabolic syndrome and its lipid complications；daru.2010；18(3):146
–
154。然而，能够有效降低所有代谢风险因素的药物容易引起不良副作用(anti-obesity drugs:a review about their effects and safety,jun goo kang1 and cheol-young park,diabetes metab j.2012feb；36(1):13
–
25；drug therapy of the metabolic syndrome:minimizing the emerging crisis in polypharmacy,grundy sm,nat rev drug discov.2006apr；5(4):295-309)。有必要采用一种天然、安全、有效和可持续的替代治疗来处理代谢综合征。
11.目前正在评估用于处理代谢综合征的天然化合物(rochlani等人,metabolic syndrome:pathophysiology,management,and modulation by natural compounds,ther adv cardiovasc dis 2017；11(8):215
–
225)。据报道，从姜黄物种分离的姜黄素，非常有效用于减轻代谢综合征的症状。最近，姜黄素类的代谢物因其与姜黄素相似且优越的功效而备受关注(majeed等人,reductive metabolites of curcuminoids,nutriscience publishers llc,2019)。姜黄素的还原代谢物如以str#1表示的四氢姜黄素、以str#2表示的六氢姜黄素和以str#3表示的八氢姜黄素的药理活性尚待证实和开发用于工业应用。还原代谢物还包括四氢-去甲氧基姜黄素(str#4)、四氢双-去甲氧基姜黄素(str#5)、六氢-去甲氧基姜黄素(str#6)、六氢双-去甲氧基姜黄素(str#7)、八氢-去甲氧基姜黄素(str#8)和八氢双-去甲氧基姜黄素(str#9)。
12.[0013][0014]
姜黄素的这些还原代谢物通常被还原酶生物转化(mimura等人，美国专利号us 5266344；pan等人，biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice,drug metab dispos,1999,27(1):486-494)。它们也在自然界中被鉴定并从不同的植物来源中分离出来(majeed等人，reductive metabolites of curcuminoids,nutriscience publishers llc,2019)。本发明公开了一种组合物，其包含姜黄素类的代谢物，特别是四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素，及其在处理代谢综合征中的治疗潜力。
[0015]
本发明的主要目的是公开用于处理代谢综合征的包含四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的组合物。
[0016]
本发明的另一个目的是公开包含四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的组合物在治疗血脂障碍中的用途。
[0017]
本发明的另一个目的是公开包含四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的组合物在肝功能障碍的治疗性处理中的用途。
[0018]
本发明的另一个目的是公开包含四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的组合物在糖尿病和相关高血糖症的治疗性处理中的用途。
[0019]
本发明的另一个目的是公开包含四氢姜黄素、六氢姜黄素和八氢姜黄素的组合物在抑制脂肪生成中的用途。
[0020]
本发明实现了上述目的并提供了进一步的相关优点。


技术实现要素：

[0021]
在最优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理代谢综合征的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类.
[0022]
在另一优选实施方案中，本发明公开了包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类的组合物在哺乳动物中治疗性处理代谢综合征的用途。
[0023]
在另一最优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理高脂血症的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类以在所述哺乳动物中带来以下效果：减少a)总胆固醇、b)ldl和c)甘油三酯的水平和增加hdl的水平。
[0024]
在另一优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理糖尿病和相关高血糖的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类。
[0025]
在另一实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理肝功能障碍的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类，以减少肝酶升高的水平。
[0026]
在另一优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物细胞中抑制脂肪生成的方法，所述方法包括将哺乳动物脂肪细胞与组合物接触的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类，以抑制脂肪生成。
[0027]
本发明的其他特征和优点将从以下更详细的描述中变得显而易见，这些描述通过示例的方式说明了本发明的原理。
[0028]
附图简述
[0029]
图1是显示给予包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物的试验动物血清胰岛素减少的图示。**,p《0.01
[0030]
图2是显示给予包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物的试验动物中葡萄糖水平降低的图示。**,p《0.01
[0031]
图3是显示给予包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物的试验动物体重减轻的图示。**,p《0.01
[0032]
图4是显示用包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物孵育的3t3细胞中脂质积累减少的图示。
[0033]
图5是小鼠3t3细胞的油红o(oro)染色，显示了包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物对脂肪生成的抑制。
[0034]
优选实施方案的详述
[0035]
在最优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理代谢综合征的方
法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述处理代谢综合征的治疗效果通过以下带来：使升高的脂质水平正常，使升高的肝酶正常，减少升高的葡萄糖水平和抑制脂肪生成。在相关实施方案中，代谢综合征通过高脂肪果糖饮食诱导。在另一相关实施方案中，组合物的有效剂量为25-50mg/kg体重。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0036]
在另一优选实施方案中，本发明公开了包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类的组合物在哺乳动物中治疗性处理代谢综合征的用途。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述处理代谢综合征的治疗效果通过以下带来：使升高的脂质水平正常，使升高的肝酶正常，减少升高的葡萄糖水平和抑制脂肪生成。在相关实施方案中，所述代谢综合征通过高脂肪果糖饮食诱导。在另一相关实施方案中，组合物的有效剂量为25-50mg/kg体重。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0037]
在另一最优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理高脂血症的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类以在所述哺乳动物中带来以下效果：减少a)总胆固醇、b)ldl和c)甘油三酯的水平和增加hdl的水平。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在相关实施方案中，高脂血症与高脂肪果糖饮食诱导的代谢综合征相关。在另一相关实施方案中，组合物的有效剂量为25-50mg/kg体重。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0038]
在一个优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理糖尿病和相关高血糖的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进
一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在相关实施方案中，糖尿病和高血糖与高脂肪果糖饮食诱导的代谢综合征相关。在另一相关方面，所述处理糖尿病的治疗效果通过降低升高的葡萄糖和胰岛素水平带来。在另一相关实施方案中，组合物的有效剂量为25-50mg/kg体重。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0039]
在另一实施方案中，本发明公开了在哺乳动物中治疗性处理肝功能障碍的方法，所述方法包括向需要该治疗性处理的哺乳动物基于所述哺乳动物的体重施用有效剂量的组合物的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类，以减少肝酶升高的水平。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在相关实施方案中，肝功能障碍与高脂肪果糖饮食诱导的代谢综合征相关。在另一相关方面，所述肝酶选自丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶。在另一相关实施方案中，组合物的有效剂量为25-50mg/kg体重。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0040]
在另一优选实施方案中，本发明公开了在哺乳动物细胞中抑制脂肪生成的方法，所述方法包括将哺乳动物脂肪细胞与组合物接触的步骤，该组合物包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六氢姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类，以抑制脂肪生成。在相关方面，所述四氢姜黄素类包括四氢姜黄素、四氢-去甲氧基姜黄素和四氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述六氢姜黄素类进一步包括六氢姜黄素、六氢-去甲氧基姜黄素和六氢双-去甲氧基姜黄素。在另一优选实施方案中，八氢姜黄素类进一步包括八氢姜黄素、八氢-去甲氧基姜黄素和八氢双-去甲氧基姜黄素。在另一相关方面，所述组合物进一步包含稳定剂、生物利用度增强剂和抗氧化剂、药物或营养学或化妆品可接受的赋形剂和增强剂。在一个优选实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0041]
在另一相关实施方案中所述生物利用度增强剂选自，但不限于，胡椒碱、槲皮素、大蒜萃取物、生姜提取物和柚皮苷。
[0042]
在另一相关方面，一种或多种抗氧化剂和抗炎剂选自，但不限于，维生素a、d、e、k、c、b复合物、迷迭香酸、α硫辛酸、柔花酸、甘草酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、植物多酚、光甘草定、辣木油、齐墩果酸、橄榄苦甙、鼠尾草酸、尿刊酸、八氢番茄红素、硫辛酸、硫辛酰胺、铁蛋白、得斯芬、胆红素、胆绿素、黑色素、泛醌、泛醇、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸乙酸酯、生育酚和衍生物如维生素e乙酸酯、尿酸、α-葡萄基芸香苷、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、硒化合物、丁基羟基苯甲醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、偏亚硫酸氢钠(smb)、没食子酸丙酯(pg)和氨基酸半胱氨酸。
[0043]
阐述最优选实施方案的具体说明性示例包括在下文中。
实施例
[0044]
实施例1：组合物
[0045]
姜黄素的还原代谢物即四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类通常通过还原酶和氢化进行生物转化(mimura等人，美国专利号us 5266344；pan等人，biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice,drug metab dispos,1999,27(1):486-494)。它们也在自然界中被鉴定并从不同的植物来源中分离出来(majeed等人，reductive metabolites of curcuminoids,nutriscience publishers llc,2019)。四氢姜黄素及其类似物四氢去甲氧基姜黄素、四氢双去甲氧基姜黄素已从姜属物种和姜黄属物种分离出来(peng等人，chemical constituents of zingiber officinale(zingeberaceae)。yunnan zhiwu yanjiu，2007；29(1):125-128)。据报道，四氢去甲氧基姜黄素和四氢双去甲氧基姜黄素存在于thai zeodary(curcuma zedoaria)的根茎中(matsuda等人,anti-allergic principles from thai zedoary:structural requirements of curcuminoids for inhibition of degranulation and effect on the release of tnf-alpha and il-4 in rbl-2h3 cells.bioorg med hem,2004；12(22):5891-5898)。四氢姜黄素也通过thc的生物转化获得(shimoda等人，formation of tetrahydrocurcumin by reduction of curcumin withcultured plant cells of marchantia polymmrpha,nat prod commun,2012,7(4):529-530)。
[0046]
六氢姜黄素类也是一种天然存在的植物代谢物，存在于姜黄、姜和alpina的根和根茎中。六氢姜黄素类已从新鲜生姜的根茎中分离出来(peng等人，cytotoxic，cytoprotective and andoxidant effects of isolated phenolic compounds from fresh ginger，fitoterapia，2012，83(3):568-585)。据报道，六氢姜黄素类以两种对映体形式(s&r)中的任何一种形式存在，也以外消旋混合物的形式存在(majeed等人，reductive metabolites of curcuminoids,nutriscience publishers llc,2019)。
[0047]
类似地，八氢姜黄素类也从印尼莪术(c.xanthorrhiza)的根茎中分离出来(uehara等人，diarylheptanoids from the rhizomes of curcuma xanthorrhiza and alpinia officinarum,chem pharm bull,1987,35(8):3298-3304)。八氢姜黄素也是通过氢化形式四氢姜黄素体内和微生物生物转化制备的(majeed等人，reductive metabolites of curcuminoids,nutriscience publishers llc,2019)
[0048]
本发明中要求保护的组合物是使用以下氢化方法配制的：
[0049]
将姜黄素类在溶剂丙酮中在氢气压力下在钯/碳存在下在室温下还原，直到起始材料不存在消失。产物分离为灰白色粉末，其包含四氢姜黄素、四氢去甲氧基姜黄素和四氢双去甲氧基姜黄素。此外，在钯/碳存在下，在特定温度和氢气压力下，在溶剂乙醇中将四氢姜黄素类选择性还原为六氢姜黄素类，直至起始材料不存在消失。产物分离为灰白色粉末，其包含六氢姜黄素类和《5％的八氢姜黄素类。为了制备八氢姜黄素类，在钯/碳的存在下，在高温和氢气压力下，在溶剂乙醇中将四氢姜黄素类还原为八氢姜黄素类，直到原料完全转化。该产物被分离为灰白色粉末，主要是八氢姜黄素类和微量六氢姜黄素类。
[0050]
四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类以以下比例混合:
[0051]
表1：组合物
[0052][0053][0054]
该组合物也可作为c3special从sami labs limited商购。
[0055]
实施例2：包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物的治疗潜力
[0056]
与姜黄素类、四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类本身相比，通过评估其orac和ros&dpph清除潜力来测试包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物的治疗潜力。
[0057]
氧自由基吸收能力测定(orac)：
[0058]
将不同浓度的标准品(trolox)(t5至t1)或测试样品(s3至s1)、apph(2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷二盐酸盐)和荧光素二钠染料添加到96孔暗板。在485/520nm(fluostar optima microplate reader)(f1
……
f35)下每1分钟记录荧光读数达35分钟。曲线下面积(auc)计算如下：
[0059]
auc＝(1 f1/f0 f2/f0
……
f35/f0)
[0060]
净auc是通过从样品的auc中减去空白的auc获得的。最终的orac值表示为每升或每克样品的微摩尔trolox当量(μmol te/g或μmol te/l)。
[0061]
dpph(2,2-二苯基-1-苦基-肼基-水合物)自由基测定
[0062]
将测试样品溶解在dmso中并在50％甲醇中稀释以用于测定。在96孔板中将不同浓度的紫檀芪与甲醇中的dpph溶液混合。将板在黑暗中孵育15分钟，并使用微板读取器(tecan ltd，switzerland)在540nm处测量吸光度。同时记录空白(dmso、甲醇)和标准品(dmso中的trolox溶液)。
[0063]
自由基清除活性计算如下，
[0064]
％清除活性＝(b-c)-(s-c)/(b-c)*100
[0065]
其中，b是参比溶液的吸光度，c是参比溶液空白的吸光度(仅甲醇)，s是测试溶液的吸光度，c是测试溶液空白的吸光度。用不同浓度筛选样品以确定抑制浓度(ic50，将dpph吸光度降低50％的浓度)。结果列于表2：
[0066]
表2：包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物(tho组合物)的orac和dpph清除潜力
[0067][0068]
结果显示，与姜黄素类和组合物的单独的活性物质相比，包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物显示出更好的orac和dpph清除，表明组合物具有更高的治疗功效。评估了该组合物的进一步治疗活性。
[0069]
实施例3：代谢综合征疾病的体内研究
[0070]
动物实验遵循的协议由机构动物伦理委员会根据印度的动物实验控制和监督委员会(cpcsea)批准，符合印度政府的指导方针并符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物的护理和使用指南》(nih出版物，第8版，2011年)。将总共40只c57/bl6小鼠(6-8周龄)随机分为5组(平均体重20-22g)，每组8只小鼠。动物饲养在标准实验室条件下(温度23.5℃，湿度＝58
–
64％)，光照12小时且黑暗12小时的循环。
[0071]
以正常饮食(10kcal)喂养的动物作为对照。代谢综合征是由含有(60kcal，含10％果糖和50％脂肪饮食)高脂肪果糖饮食(hffd)诱导12周。将不同剂量的测试样品与hffd一起口服给予小鼠组。在实验期结束时，将动物人道处死，收集器官、组织和血液用于进一步分析。记录所有动物的体重和器官重量。
[0072]
方法
[0073]
脂质分析
[0074]
血液tc胆固醇水平通过trinder chod/pod终点法在tc的酶促测定原理下使用以下反应进行测定：胆固醇酯在胆固醇酯酶存在下转化为胆固醇和脂肪酸。胆固醇在胆固醇氧化酶的存在下被氧化产生过氧化氢。在过氧化物酶的存在下，过氧化氢与苯酚和4-氨基安替比林反应生成醌和水分子以产生红色。相对于空白在500nm处读取光密度。
[0075]
tgl采用gpo/pod法测定。tgl被脂肪酶水解成甘油和游离脂肪酸。在甘油激酶存在的情况下，甘油被atp磷酸化为3-磷酸甘油，后者被3-磷酸甘油氧化酶氧化，产生过氧化氢。如此形成的过氧化氢在酶过氧化物酶的存在下与4-氨基安替比林和4-氯苯酚反应生成红色醌亚胺。显色强度与tgl浓度成比例。
[0076]
使用direct reagent kit(beacon)测量hdl和ldl参数。
[0077]
肝脏参数：通过标准动力学方法测定丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、肌酸酐磷酸酶的酶水平。酶的催化活性是通过使用特定测量程序确定催化化学反应的转化速率来测量的。它表示为单位时间内转换的物质量，以国际单位(iu)为单位。催化浓度是一定体积样品中所含的催化活性，以u/l表示。
[0078]
通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(god/pod方法)评估血糖水平。葡萄糖氧化酶(god)催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸。形成的过氧化氢(h2o2)在存在过氧化物酶(pod)的情况下由显色氧受体苯酚-氨基比林检测。形成的颜色强度与样品中的葡萄糖浓度成比例。
[0079]
血清胰岛素水平：通过加入150l试剂和磷酸盐缓冲盐水加0.05％tween-20制备血清或血浆样品。样品进一步稀释1:100稀释剂。还制备了样品、胰岛素对照溶液和校准品以及足够的微孔板孔以容纳一式两份的校准品和样品。每个孔中加入正好350l的洗液，弃去洗液，用吸水纸轻轻拍打数次以除去多余的液体。将混合物在室温下孵育2小时，同时以300-1000g剧烈摇动。将板放在振荡器上大约5秒以确保混合。在30分钟内在450nm处测量上清液的吸光度，胰岛素值以ng/ml表示(clark和hales，1994)。禁食6小时后的胰岛素耐量试验(itt)，从试验动物身上采集血样。然后给动物腹膜内注射悬浮在生理盐水中的1.2u/kg bw的胰岛素*。在注射胰岛素后30分钟和60分钟收集血样以评估葡萄糖。正如gandhi等人所提及的那样，在注射胰岛素之前给予葡萄糖负荷(2g/kgbw)以防止低血糖症，没食子酸通过部分激动pparγ在实验2型糖尿病大鼠中减弱高脂饮食喂养的链脲佐菌素诱导的胰岛素抵抗并通过pi3k/p-akt信号通路中glut4的易位和激活增强葡萄糖摄取，european journal of pharmacol,2014,745:201-216和matthews等人，homeostasis model assessment:insulin resistance andβ-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man.diabetologia 1985；28:412
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41)
[0080]
体外脂肪生成抑制试验：将3t3-l1小鼠胚胎成纤维细胞(美国典型培养物保藏中心(atcc，rockville，md，usa)在含有10％新生小牛血清和40μg/ml庆大霉素的dmem中于37℃培养在具有5％co2的湿润气氛中。细胞以3*10^4的密度接种在48孔板中并培养形成单层。通过补充dmem培养基诱导细胞在达到100％融合两天后分化，该培养基具有10％胎牛血清、0.25μm地塞米松、0.5mm甲基异丁基黄嘌呤和胰岛素(1μg/ml)以及加入或不加入不同浓度的样品。分化48小时后，隔天将培养基更换为含有10％胎牛血清、胰岛素(1μg/ml)和样品的dmem，直到第6天收获细胞。
[0081]
脂肪细胞中的脂质含量是通过用油红o(oro)染料(oro)染色来确定的。简而言之，将细胞用10％福尔马林固定30分钟，并在室温下用oro工作溶液[0.3％]染色60分钟，并通过倒置相差显微镜(olympus，tokyo，japan)观察。使用4％triton x-100的异丙醇溶液从细胞中提取oro染色的脂质，并在520nm波长下进行定量。
[0082]
结果
[0083]
脂质分析
[0084]
结果列于表3。
[0085]
表3:脂质分析
[0086][0087][0088]
高脂肪果糖饮食增加了总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平。该组合物以剂量依赖的方式降低了总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的水平。类似地，该组合物还增加了测试动物中降低的hdl水平，表明该组合物在处理代谢综合征中的高脂血症方面非常有效。
[0089]
肝参数和葡萄糖水平
[0090]
葡萄糖和肝酶水平因施用高脂果糖饮食而升高。包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物使代谢综合征中改变的升高的肝酶正常化并防止肝功能障碍(表4)。类似地，该组合物还降低了血清中升高的葡萄糖和胰岛素水平，表明该组合物具有用作抗糖尿病剂的潜力(表4，图1)
[0091]
胰岛素耐量试验表明，hfd小鼠对葡萄糖的耐受能力降低(显示出更高的血糖浓度)。在该测定中，胰岛素给药后血糖浓度下降的程度代表了全身胰岛素作用的效率。与对照组动物相比，在itt期间的所有时间点，喂食hfd的小鼠的血糖水平降低减弱，因此表明存在胰岛素抵抗。与hfd一起补充该组合物显示血糖降低，表明该组合物可以降低胰岛素抵抗(图2)。
[0092]
体重减轻
[0093]
在补充了该组合物的动物中观察到体重适度减轻。在25、50和100mg/kg时观察到体重减轻11.8％、16.1％和14.4％(图3)
[0094]
脂肪生成的抑制
[0095]
测试了包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物抑制脂肪生成的潜力。结果表明该组合物在减少3t3前脂肪细胞中的脂肪生成方面是有效的，(图4和图5)，表明该组合物用作抗肥胖剂的潜力。
[0096]
总体而言，包含四氢姜黄素类、六氢姜黄素类和八氢姜黄素类的组合物通过使血液中的脂质水平、葡萄糖和胰岛素水平正常化、降低升高的肝酶和抑制脂肪生成来有效处理代谢综合征。该组合物非常适合用作处理饮食诱发的代谢综合征的补充剂。
[0097]
虽然已经参考优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚地理解本发明不限于此。相反，本发明的范围将仅结合所附权利要求来解释。