一种钙基生物材料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种钙基生物材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.由创伤、肿瘤或感染等原因引起的骨缺损是临床中常见的疾病，为患者和社会造成了巨大的负担，因此良好的人工骨修复材料有望成为自体骨移植或异体骨移植的替代方案。此外，体外物理热疗是一种传统的治疗手段，常用于皮肤和软组织等表浅组织的修复治疗，制备新型的光热骨修复材料，有望将这种非侵入性的治疗手段延伸至深部骨组织的治疗，为骨再生修复提供一种新的治疗方法和思路。
3.目前应用于骨缺损修复的人工骨修复生物材料种类繁多，而在如此众多的骨修复材料中，钙基生物材料，例如磷酸钙，生物玻璃等因与天然骨组织的主要成分和化学结构相似，且具有良好的生物相容性、骨传导和骨诱导性能而占有不可或缺的一席地位。科学家通过对钙基生物材料的表面改性可以赋予材料更多的理化性质，例如：有机物改性，无机物改性，聚合物改性，等离子处理和辐照等。
4.现有技术大多是选择一定的表面活性剂，对钙基生物材料的表面进行包覆处理。从而成为各种功能的生物材料。而通过表面化学改性，使钙基生物材料具有对近红外光良好的光热响应性能的报道极为少见。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够简单、快速、高效的对不同维度的钙基物质的表面进行改性从而制备得到具有良好光热效应的钙基生物材料。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种钙基生物材料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将钙基物质添加进含有没食子酸的氢氧化钠溶液中，搅拌均匀后加热反应，反应结束后过滤、洗涤、干燥，得钙基生物材料
7.本发明提供的钙基生物材料的制备方法通过将钙基物质浸泡于没食子酸溶液中，再经加热处理，能够使钙基物质表面的钙与没食子酸配位结合，从而使得制备得到的钙基生物材料具有良好的光热响应性能和光热稳定性；本发明提供的制备方法简单、操作简便，能够有利于实际生产。
8.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述钙基物质包括一维羟基磷灰石纳米颗粒(hanp)、二维羟基磷灰石纳米线(hanw)、磷酸钙、生物玻璃中的任意一种。
9.由于本发明提供的钙基材料的制备方法中是将钙基物质浸泡于含有没食子酸的溶液中，因此，对钙基物质的形态没有特殊的需求，可以适用于颗粒状的、线状的、块状的或者形状不规则的钙基物质，即本发明提供的制备方法对原料具有广泛的适用性。
10.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述钙基物质与没食子酸的质量比为
1：(0.2-10)。
11.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述钙基物质与没食子酸的质量比为1：(4-6)。
12.在本发明中，由于没食子酸是与钙基物质的表面上的钙进行配位结合，因此，加入的没食子酸相较于钙基物质表面的钙是大大过量的，但是由于加入的钙基物质表面的钙是一定的，结合考虑加入原料的合理份数问题，最终优选钙基物质与没食子酸的质量比为1：(4-6)；当优选的两者质量比在上述范围内时，得到的钙基生物材料具有良好的光热升温效应，在同一近红外波段的照射下，相同的时间里面，钙基生物材料的升温速率更为显著。
13.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述没食子酸与氢氧化钠溶液的质量体积比为(0.2-10)mg：1ml。
14.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述氢氧化钠溶液中的氢氧化钠的摩尔浓度为(0.01-2)mol/l。
15.合适氢氧化钠溶液的摩尔浓度以及适宜的没食子酸与氢氧化钠溶液的质量体积比能够提升没食子酸在氢氧化钠溶液中的溶解度，使得加入的没食子酸能够以溶质的形式存在于溶液中，从而有利于后续与钙基物质表面上的钙进行配位结合。
16.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述加热反应的反应温度为 50-120℃，反应时间为10-240分钟。
17.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述加热反应的反应温度为 80-100℃，反应时间为50-60分钟。
18.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述加热采用的方式是微波加热。
19.在50-120℃的温度下进行微波加热反应，能够促进没食子酸与钙基物质的配位反应，提升配位效率，避免温度过低导致的配位时间过长或者配位时间不够的情况下表面结合没食子酸的钙的比例减少，从而降低后续制备得到的钙基生物材料的光热效应，也能够避免温度过高导致的没食子酸炭化的问题；进一步优选反应温度为80-100℃，反应时间为50-60分钟，能够很好的平衡温度和时间的关系，从而提升反应效率。
20.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述洗涤是采用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次。
21.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述干燥是在55-65℃的烘箱中干燥。
22.另外，本发明还提供了一种钙基生物材料，所述钙基生物材料采用本技术提供的制备方法制备得到。
23.作为本发明所述钙基生物材料的优选实施方式，所述钙基生物材料在近红外光照射下具有光热效应。
24.作为本发明所述钙基生物材料的优选实施方式，所述近红外光的波段为 808nm。
25.另外，本发明还提供了所述钙基生物材料在制备骨缺损修复材料上的应用。
26.另外，本发明还提供了所述钙基生物材料在制备骨肿瘤药物上的应用。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
28.第一：本发明提供的钙基生物材料具有优异的光热升温效应，在近红外光的照射下具有光吸收和光热转化性能；同时，本发明提供的钙基生物材料是将具有良好生物相容性的没食子酸与同样具有良好生物相容性的钙基物质进行配位结合，进一步结合其优异的
光吸收和光热转化性能，从而能够应用于骨缺损修复材料的制备和骨肿瘤药物的制备上；
29.第二：本发明提供的钙基生物材料的制备方法简单、制备过程操作方便、重现性好，且有利于各种维度、各种形状的钙基物质与没食子酸进行配位结合，即本发明提供的制备方法适用性广，有利于实际生产。
附图说明
[0030][0031]
图1为效果例1中实施例1-4中制备得到的钙基生物材料与相应的未经修饰的钙基物质的光学拍照谱图；
[0032]
图2为效果例1中实施例5制备得到的钙基生物材料与相应的未经修饰的钙基物质的光学拍照谱图；
[0033]
图3为效果例2中实施例3-4制备得到的钙基生物材料的光热曲线图；
[0034]
图4为效果例3中试验组11制备得到的钙基生物材料在不同浓度、不同光照功率下的光热曲线图；a为不同浓度下的光热曲线图、b为不同光照功率下的光热曲线图；
[0035]
图5为效果例4中试验组11制备得到的钙基生物材料在不同条件下的光热曲线图；a为空气状态下、b为经pbs处理后的状态；
[0036]
图6为效果例5中试验组11制备得到的钙基生物材料对骨修复的实验结果图。
具体实施方式
[0037]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0038]
实施例1
[0039]
本实施例的一种钙基生物材料，其钙基物质是自制的羟基磷灰石纳米颗粒 (hanp)，具体制备过程如下：
[0040]
(1)羟基磷灰石纳米颗粒(hanp)的制备：将24ml摩尔浓度为0.1mol/l 的cacl2溶液、24ml摩尔浓度为0.05mol/l的nah2po4·
2h2o溶液、50ml去离子水和50ml乙二醇溶液依次倒入200ml烧杯中，磁力搅拌混匀，然后使用 0.5mol/l的naoh溶液调ph值至6.7，然后将混合液转移至聚四氟乙烯微波反应釜中，放入微波化学工作站中，110℃中反应30分钟。反应完成后自然冷却至室温，离心收集反应产物，无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，干燥，得hanp；
[0041]
(2)钙基生物材料的制备：称量100mg naoh溶于50ml去离子水中，配制为0.05mol/l的naoh溶液，然后称取10mg没食子酸(gallic acid，ga) 溶于naoh溶液中(即没食子酸在naoh溶液中的浓度为0.2mg/ml)，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，然后将50mg上述所制备的羟基磷灰石纳米颗粒放入没食子酸溶液中(hanp与没食子酸的质量比为1:0.2)，磁力搅拌5分钟后转移至聚四氟乙烯反应釜中，80℃反应60分钟，所获产物使用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次，60℃烘箱烘干，得钙基生物材料。
[0042]
实施例2
[0043]
本实施例的一种钙基生物材料，其钙基物质是自制的羟基磷灰石纳米颗粒 (hanp)，与实施例1中的制备方法一致；
[0044]
本实施例与实施例1的不同在于称取的没食子酸的质量不一样，具体根据浓度的不同分为7个试验组，试验组的设置如表1所示；
[0045]
表1：试验组1-7中添加的没食子酸的质量以及在naoh溶液中的浓度表
[0046] ga(mg)ga浓度(mg/ml)hanp:ga试验组1200.41:0.4试验组25011:1试验组310021:2试验组420041:4试验组530061:6试验组640081:8试验组7500101:10
[0047]
实施例3
[0048]
本实施例的一种钙基生物材料，其钙基物质是自制的羟基磷灰石纳米线 (hanw)，具体制备过程如下：
[0049]
(1)羟基磷灰石纳米线(hanw)的制备：将8mmol油酸钠溶于70℃的 25ml去离子水中，充分溶解并自然冷却至室温。在剧烈磁力搅拌下滴加25ml 含有2mmol氯化钙的水溶液。连续搅拌30分钟，然后将所获悬浮液与25ml 含有1.8mmol二水合磷酸二氢钠的水溶液混合，随即将反应混合物转移到100 ml聚四氟乙烯不锈钢高压釜中密封，200℃的烘箱加热36小时。所获水热产物使用去离子水和无水乙醇洗涤三次，干燥，得hanw；
[0050]
(2)钙基生物材料的制备：称量100mg naoh溶于50ml去离子水中，配制为0.05mol/l的naoh溶液，然后称取10mg没食子酸(gallic acid，ga) 溶于naoh溶液中(即没食子酸在naoh溶液中的浓度为0.2mg/ml)，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，然后将50mg上述所制备的羟基磷灰石纳米线放入没食子酸溶液中(hanw与没食子酸的质量比为1:0.2)，磁力搅拌5分钟后转移至聚四氟乙烯反应釜中，80℃反应60分钟，所获产物使用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次，60℃烘箱烘干，得钙基生物材料。
[0051]
实施例4
[0052]
本实施例的一种钙基生物材料，其钙基物质是自制的羟基磷灰石纳米颗粒 (hanp)，与实施例3中的制备方法一致；
[0053]
本实施例与实施例3的不同在于称取的没食子酸的质量不一样，具体根据浓度的不同分为7个试验组，试验组的设置如表2所示；
[0054]
表2：试验组8-14中添加的没食子酸的质量以及在naoh溶液中的浓度表
[0055] ga(mg)ga浓度(mg/ml)hanw:ga试验组8200.41:0.4试验组95011:1试验组1010021:2试验组1120041:4试验组1230061:6试验组1340081:8试验组14500101:10
[0056]
实施例5
[0057]
本实施例的一种钙基生物材料，其钙基物质是医用诱导骨基质(bonematrix，bm)，具体制备过程如下：
[0058]
称量100mgnaoh溶于50ml去离子水中，配制为0.05mol/l的naoh溶液，然后称取10mg没食子酸(gallicacid，ga)溶于naoh溶液中(即没食子酸在naoh溶液中的浓度为0.2mg/ml)，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，然后将50mg医用诱导骨基质放入没食子酸溶液中(bm与没食子酸的质量比为1:0.2)，磁力搅拌5分钟后转移至聚四氟乙烯反应釜中，80℃反应60分钟，所获产物使用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次，60℃烘箱烘干，得钙基生物材料。
[0059]
实施例6
[0060]
本实施例与实施例1的唯一差别在于在聚四氟乙烯反应釜中，100℃反应50分钟。
[0061]
实施例7
[0062]
本实施例与实施例1的唯一差别在于在聚四氟乙烯反应釜中，120℃反应20分钟。
[0063]
实施例8
[0064]
本实施例与实施例1的唯一差别在于在聚四氟乙烯反应釜中，50℃反应200分钟。
[0065]
对比例1
[0066]
本对比例与实施例1的唯一差别在于在聚四氟乙烯反应釜中，30℃反应300分钟。
[0067]
对比例2
[0068]
本对比例与实施例1的唯一差别在于称取5mg没食子酸(gallicacid，ga)溶于naoh溶液中(即没食子酸在naoh溶液中的浓度为0.1mg/ml)，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，然后将50mg上述所制备的羟基磷灰石纳米颗粒放入没食子酸溶液中(hanp与没食子酸的质量比为1:0.1)。
[0069]
对比例3
[0070]
本对比例与实施例1的唯一差别在于称取1000mg没食子酸(gallicacid，ga)溶于naoh溶液中(即没食子酸在naoh溶液中的浓度为20mg/ml)，磁力搅拌10分钟使其充分溶解，然后将50mg上述所制备的羟基磷灰石纳米颗粒放入没食子酸溶液中(hanp与没食子酸的质量比为1:20)。
[0071]
效果例1
[0072]
本效果例将实施例1、实施例2中的试验组1-7、实验例3、实施例4中的试验组8-14中制备得到的钙基生物材料的干燥样品进行光学拍照比较，具体如图1所示，其中，gnp代表的是以羟基磷灰石纳米颗粒为钙基物质得到的表面修饰产物，gnw代表的是以羟基磷灰石纳米线为钙基物质得到的表面修饰产物，上面的数字代表没食子酸在naoh溶液中的浓度数值；从图1中可以看出来，无论是gnp还是gnw，在浓度值为0-4mg/ml的ga修饰后，其颜色均逐渐变深，gnp尤其明显；然而当ga浓度达到4mg/ml以上时，gnw的颜色则开始慢慢变浅，10mg/ml时的gnw呈淡灰色，相反gnp则是自ga浓度为4mg/ml时就基本为黑色，不再加深；这也说明了ga与不同的材料进行表面修饰时，由于不同的材料的表面的尺寸相貌不同，暴露出来的钙就不同，本效果例中，hanp相较于hanw的尺寸更小，其表面暴露的能够与ga分子结合的钙离子更多，因此，在颜色表现上呈现更深的色泽；
[0073]
同时，本效果例将实施例5中采用医用诱导骨基质为钙基物质制备得到的钙基生
物材料进行光学谱图研究，具体如图2所示，其中gbm代表经ga修饰后的bm，从图2中a1和a2可以看出，经修饰后的bm的颜色加深，说明bm 表面的钙离子已经和ga成功的形成了配位键，这点从图2中的b1和b2、c1 和c2的对比中也可以看出。
[0074]
效果例2
[0075]
本效果例将试验组8-14和实施例3制备得到的钙基生物材料进行光热效应的测定，具体方法为将100μl浓度为2mg/ml的钙基生物材料溶液加至96孔板中，固定光热成像仪并调整焦距，然后将808nm激光器放置在含材料的孔洞上方，调整功率为1.5w/cm2照射钙基生物材料，开始照射时通过光热成像仪记录其温度情况，记录照射10分钟时其温度情况，得到的温度数据绘制成曲线图，如图3所示；从图3中可以看出，采用本发明提供的制备方法制备得到的钙基生物材料具有显著的光热效应，尤其是当加入的ga与钙基物质的质量比为 (4-6)：1时，在10分钟时温度可以升高至40℃。
[0076]
效果例3
[0077]
本效果例探究试验组11制备得到的钙基生物材料在不同添加浓度和不同的光照功率下的光热效应；
[0078]
探究不同的添加浓度：将浓度分别为0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml的钙基生物材料溶液加至96孔板中，固定光热成像仪并调整焦距，然后将808nm激光器放置在含材料的孔洞上方，调整功率为1.5w/cm2照射钙基生物材料，开始照射时通过光热成像仪记录其温度情况，并记录照射时其温度情况，得到的结果如图4中a 所示；
[0079]
探究不同的光照功率：将浓度为2mg/ml的钙基生物材料溶液加至96孔板中，固定光热成像仪并调整焦距，然后将808nm激光器放置在含材料的孔洞上方，分别用功率为0.5w/cm2、1.5w/cm2、2w/cm2、2.5w/cm2照射钙基生物材料，开始照射时通过光热成像仪记录其温度情况，并记录照射时其温度情况，得到的结果如图4中b所示；
[0080]
从图4中a可以看出，钙基生物材料的浓度也会对光热效应产生影响，当钙基生物材料的浓度增加至2000μg/ml时，其光热效应有一个明显提高的现象；
[0081]
从图4中b可以看出，照射的光的功率也会对钙基生物材料的光热效应带来影响，当功率增加至1.5w/cm2时，光热效应有一个明显的提升，后续继续增加功率，光热效应提升不明显。
[0082]
效果例4
[0083]
本效果例探究实施例5制备得到钙基生物材料在不同状态下的光热效应；具体操作为：将直径约0.5cm，厚约0.2cm的bm或gbm放置于96孔板中，参照上述方法检测其在不同功率下的光热性能；gbm的光热性能检测分为湿润和干燥两种状态，湿润状态则在检测前使用pbs浸泡30分钟，然后进行检测。干燥状态为检测前将材料放入60℃烘箱中烘干1小时，然后检测；具体检测结果如图5所示；
[0084]
单独从图5中a或b中可以看出，经ga表面修饰的gbm相较于bm具有显著的光热效应；从a和b中共同来看，gbm在空气中的升温效应要强于经pbs 浸泡后的升温效应。
[0085]
效果例5
[0086]
本效果例探究实施例5制备得到钙基生物材料对实验鼠的促骨再生作用，分为六组，空白组、对照组和实验组；其中每组又加用nir处理(组1)或不处理(组2)。空白组是造模
后的大鼠不做任何处理，对照组植入bm进行处理，实验组植入实施例5制备得到的钙基生物材料(gbm)；具体操作如下：
[0087]
(1)分组：所用实验大鼠共计54只，造模前随机将其分为6组，每组9 只；
[0088]
(2)麻醉：称重并记录每只大鼠的体重，然后使用1％的戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，计量为0.4ml/100g；
[0089]
(3)备皮及消毒：待大鼠充分麻醉后，判断标准为呼吸平缓均匀，巩膜反射阴性即可，使用剃毛器进行备皮，充分暴露手术区域。手术区域备皮完成后，将大鼠俯卧位放置在操作台上，然后使用安尔碘和75％的乙醇进行操作区域的消毒、铺一次性无菌洞巾，遵循外科无菌原则进行；
[0090]
(4)颅骨暴露：沿大鼠头颅中线做长约1-1.5cm的纵行皮肤切口，钝性分离皮下软组织，充分显露颅骨，然后于颅骨表面骨膜做“十”字切口，钝性分离骨膜以保护骨膜，显露矢状缝、双侧顶骨、额骨后缘及部分枕骨；
[0091]
(5)钻孔：使用5mm的取骨环钻于双侧顶骨靠近枕骨侧，钻两个圆形的全层骨缺损，以矢状缝为中线，左右对称，骨缺损直径为5mm，在钻孔的过程中需要持续滴注生理盐水，以防止局部过热从而损伤骨缺损周边组织和细胞；
[0092]
(6)植入支架材料：将上述制备的gbm和bm分别放至缺损区域。由于每只大鼠可钻取左右两个骨缺损区域，左右两侧缺损区域使用不同处理组以做自身对照；
[0093]
(7)关闭切口及术后管理：使用无菌丝线全层缝合皮下组织和皮肤，切口区域使用75％乙醇进行再次消毒，待大鼠苏醒后放回饲养笼饲养，正常提供饮食饮水。术后连续3天腹腔注射10万u/只青霉素以防感染；
[0094]
(8)光热处理：实验组植入gbm，然后每只老鼠的左右两边孔洞作为自身对照，左边不使用近红外光(nir)照射，右边使用nir照射，照射功率为 1w/cm2，每次持续10分钟，每三天照射一次，共计10次；
[0095]
对测试得到的结果进行micro-ct扫描，其中骨体积分数是新生骨与总缺损体积的比，能够科学的评价促骨再生的效果；具体结果见表3；
[0096]
表3：效果例5中验证产物对骨缺损的修复情况表
[0097][0098]
从表格中可以看出，首先，将空白组1和实验组1进行比较，发现新生骨体积(bv)在第4周时，gbm nir组(实验组1)为空白组1的1.57倍，第 12周时则达到了1.96倍，而相较于
无低热刺激的gbm组(实验组2)，gbm nir (实验组1)则升高了0.51倍；单纯空白组1在第4周时，骨体积分数为20.6％，到第12周时增长到32.3％，增长了11.7％。而gbm nir的低热刺激组(实验组1)，在第4周时便达到了40.1％，是空白组1的1.95倍，到第12周时则为 60.3％，增长了20.2％；将实验组1和对照组1进行比较，可以发现，在第四周的时候，实验组1相较于对照组1的骨体积份数增加了0.13倍，到第12周的时候增加了0.45倍；上述数据说明一方面本发明提供的制备方法制备得到的表面经修饰的bm相较于没有经修饰的bm具有显著的骨缺损修复能力，另一方面本发明提供的表面经没食子酸修饰的钙基物质在近红外照射下相较于无近红外照射具有更强的骨缺损修复能力；
[0099]
进一步将空白组、对照组和实验组得到的扫描结果放在附图中，如图6所示，从图6中也可以直观的看出来，经过表面修饰得到的bm相较于没有经表面修饰的bm具有更强的对缺损骨的修复再生能力。
[0100]
最后应当说明的是，以上实施例以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。