石墨烯电镜载网的制备方法

1.本发明属于结构生物学领域，涉及一种石墨烯电镜载网的制备方法，其利用烃类混合物将石墨烯转移到电镜载网上，以应用于冷冻电镜制样获得高分辨率生物样品结构。


背景技术：

2.近年来，随着直接电子检测相机的发明以及三维重构算法的发展，单颗粒冷冻电镜技术对生物大分子结构的解析已经能够达到原子分辨率，极大地推动了我们从原子尺度上对于生命现象的理解，和药物研发优化进程。然而，样品制备仍然是限制生物样品结构解析进一步发展的主要瓶颈之一。目前常用的样品制备方法是将含有生物大分子的溶液滴加到电镜载网上，然后用滤纸夹吸去除大部分溶液，留下薄薄一层水膜，最后迅速冷冻。电镜载网是金属材质，如铜、金和镍等，上面覆盖有一层多孔碳膜。使用这种载网制备冷冻样品时，生物样品容易吸附到气液界面，从而导致样品变性或者产生严重的优势取向。另外，不可控的冰层厚度以及碳支撑膜的背景噪音使得分子量较小的生物大分子的结构解析困难重重。为了解决这些问题，一些课题组开始尝试使用石墨烯或者石墨烯衍生物来作为样品支撑膜，开发新型石墨烯载网。
3.石墨烯是一种碳原子通过sp2杂化成键连接起来的二维材料，高导电/热，机械强度大。另外，石墨烯膜厚度很薄，单层石墨烯膜仅有0.34nm，电子束通透性很好，背景噪音极低。目前常用的石墨烯是通过化学气相沉积(cvd)方法生长在铜箔表面，然后通过聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)等高分子介质转移到电镜载网上。这种转移方法，操作复杂，并且非常容易引入污染，难以制备高洁净度的石墨烯电镜载网。
4.此外，在其他的领域中，例如半导体设备制造领域中，也提出了如下技术路线：为避免使用pmma等介质转移石墨烯后，石墨烯表面残留介质，导致石墨烯器件的性能降低，因此，引用文献1公开了一种小分子转移石墨烯的方法，其将液态石蜡旋涂到有石墨烯的铜片上，将铜片腐蚀掉，转移到目标基底上，得到石蜡/石墨烯膜/基底复合层，将复合层通过加热到150～250℃保温1～3h的退火处理去除石蜡层。
5.总之，对于适用于冷冻电子显微镜技术的石墨烯电镜载网，仍有待开发更有效的石墨烯电镜载网的转移方法，保证安全性、经济性的同时，还能保证良好的覆盖度和洁净程度，在保持石墨烯所有优良特性的前提下，得到的石墨烯载网为单层覆盖，并可以批量化生成。
6.引用文献
7.引用文献1：cn106477570a


技术实现要素：

8.发明要解决的问题
9.由于石墨烯作为一种二维碳纳米材料，具有优异光学、电学和力学特性，导电性佳、机械性能强、均匀性好并且仅有0.34nm厚度，可以部分甚至完全消除目前电镜载网存在
的背景噪音强、导电性差、大分子分布于气液界面等问题。但是如何将石墨烯成功高效转移到电镜载网上，得到单层、平整且洁净度高的石墨烯载网一直是限制其大规模应用于结构生物学领域的重要因素。pmma是石墨烯转移使用最多的介质，其高分子聚合物的本质导致其去除过程相对较麻烦，在不破坏完整度情况下难以得到高度洁净的石墨烯膜，氧化石墨烯载网制备方法虽相对简便，但氧化石墨烯层与层之间存在较多官能团，层间距较大，会额外增加背景噪音且无法保证石墨烯本身优异的电学性能。
10.另外，引用文献1的方法可以将石墨烯干净地转移到如sio2/si晶片，pet膜以及玻璃等平整、无孔的基底上，其实施例描述了所获得的石墨烯膜具备导电性，且相对平整少缺陷，其制备的石墨烯膜的应用场景对于石墨烯膜的平整度等方面要求相对较低。然而，对于适用于冷冻电子显微镜技术的石墨烯电镜载网，通常其基底采用的是具有阵列孔的金属基底，在150～250℃的高温下，容易导致石墨烯膜从具有阵列孔的金属基底脱落；并且在加热过程中，影响石墨烯膜的平整度和结构；在应用于冷冻电子显微镜技术中时，成像过程中的背景噪音、导电性、生物分子分布在气液界面以及样品在电子束照射下漂移等问题会影响生物分子的最终分辨率。
11.因此，实际上虽然例如引用文献1在石墨烯转移的方法上做出了尝试，然而其技术路线的提出本不是针对带阵列孔的金属基底上的石墨烯膜的转移，并且制备获得的石墨烯膜也无法满足冷冻电子显微镜技术中的使用。
12.有鉴于此，本发明提供了一种制作石墨烯电镜载网的方法，以烃类混合物为介质，将单层生长于金属基底表面的石墨烯高效转移到传统的例如多孔碳膜的电镜载网表面，得到性能更佳的电镜载网，可应用于生物冷冻电镜的制样过程。
13.用于解决问题的方案
14.经过发明人潜心研究，发现通过以下方案能够解决上述技术问题：
15.[1].一种石墨烯电镜载网的制备方法，包括：
[0016]
铺烃类混合物的步骤：将在金属基底上形成的石墨烯膜的表面至少部分地铺上烃类混合物；
[0017]
石墨烯膜转移到电镜载网的步骤：去除金属基底，将铺有烃类混合物的石墨烯膜转移到电镜载网上，获得烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构；
[0018]
去除烃类混合物的步骤：采用有机溶剂清洗烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构，以去除烃类混合物。
[0019]
[2].根据[1]所述的制备方法，其中，所述铺烃类混合物的步骤中，所述金属基底选自铜或铂基底；所述石墨烯膜表面的70％以上铺有所述烃类混合物。
[0020]
[3].根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，石墨烯膜转移到电镜载网的步骤中，通过刻蚀液以去除所述金属基底。
[0021]
[4].根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，在所述去除烃类混合物的步骤中，所述有机溶剂为溶解所述烃类混合物的有机溶剂；在高于烃类混合物的熔点5℃～20℃的温度范围内，采用有机溶剂清洗烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构。
[0022]
[5].根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，所述去除烃类混合物的步骤后，还包括采用清洗剂和水润洗的步骤；
[0023]
优选地，所述的清洗剂包括醇类、酮类、醚类或酯类清洗剂的一种或多种。
[0024]
[6].根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，所述烃类混合物为碳原子数为15～40的烃类混合物，其根据dsc测试的熔点在70℃以下，密度小于水的密度。
[0025]
[7].根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，在所述铺烃类混合物的步骤中，通过化学气相沉积法，在金属基底上生长石墨烯膜；
[0026]
优选地，所述石墨烯膜为单层石墨烯。
[0027]
[8].根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，在所述铺烃类混合物的步骤中，在石墨烯膜的表面的烃类混合物的厚度为0.1～0.5mm。
[0028]
[9].根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，在所述石墨烯膜转移到电镜载网的步骤中，采用腐蚀液刻蚀铜基底。
[0029]
[10].根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，所述电镜载网的材质选自铜、镍、钼、钛或金；所述电镜载网上设置有孔阵列。
[0030]
发明的效果
[0031]
通过以上技术方案的实施，本发明能够获得如下的技术效果：
[0032]
使用本发明制备石墨烯电镜载网，使用烃类混合物作为转移介质，相比传统pmma等聚合材料更经济有效，方法成功率高，能够保证更洁净的石墨烯转移。烃类混合物例如石蜡作为日常生活中最常见的有机物质之一，容易获取，其低熔点和有机溶剂中良好溶解性使其非常适合用来对cvd生长的石墨烯进行转移，得到单层石墨烯覆盖于特定基质上。有机溶剂例如石油醚作为烃类混合物例如石蜡的清洗溶剂，不仅价格便宜易获取，且相比氯仿等有机溶剂毒性更低，转移的石墨烯洁净度相比其它转移方法更高。避免了高温对于石墨烯膜与电镜载网的结构影响，同时经本发明的清洗步骤后无残留，不影响电镜的制样。后续用于冷冻样品电镜制样，能得到高分辨率的样品结构。
附图说明
[0033]
图1为本发明通过石蜡转移制备石墨烯电镜载网的一种实施方式的流程图。
[0034]
图2为实施例中通过石蜡转移制备石墨烯电镜载网的覆盖度结果。图2中的a为透射电子显微镜低倍(1650x)下石墨烯膜覆盖多孔碳膜图像，显示区域内超过99％的石墨烯覆盖度；图2中的b为a中区域的进一步放大(2700x)；图2中的c为b中区域的进一步放大(6500x)，所有图像均在-2.5μm欠焦值下拍摄。
[0035]
图3为石蜡转移石墨烯载网覆盖度、平整度与洁净度结果。图3中的a为原子力显微镜对石墨烯覆盖度的表征；图3中的b为利用原子力显微镜进一步显示单孔平整度与洁净度；图3中的c为b图中虚线区域的高度起伏曲线，显示该区域内高度起伏不超过1nm；图3中的d为透射电子显微镜单孔成像图像，石墨烯膜悬浮于多孔碳膜上，显示较高的洁净度与平整度；右上插图为相应电子衍射图像，能够清晰看到石墨烯六边形晶格衍射点。
[0036]
图4为用石墨烯载网制备的去铁铁蛋白(apoferritin)样品的冷冻电镜照片。可以看到apoferritin颗粒在石墨烯支撑膜上分散性很好，衬度很高。
具体实施方式
[0037]
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需
要说明的是：
[0038]
本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
[0039]
本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。
[0040]
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
[0041]
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
[0042]
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
[0043]
在本说明书中，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
[0044]
在本说明书中，提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0045]
在本发明中，术语“室温”可以为不加热或降低的自然温度，可以指约10℃至30℃、20℃至25℃、约25℃或约23℃的温度。
[0046]
本发明主要提供了一种制作石墨烯电镜载网的方法，以烃类混合物为介质，将单层生长于金属基底表面的石墨烯高效转移到传统的例如多孔碳膜的电镜载网表面，得到性能更佳的电镜载网。
[0047]
以下对本发明的技术方案进行具体的说明。
[0048]
《石墨烯膜表面铺烃类混合物》
[0049]
在本发明中，在金属基底上形成石墨烯膜，并在其上进一步形成烃类混合物。
[0050]
对于在金属基底上形成石墨烯膜的方式，没有特别限制，在本发明一些优选的实施方案中，所述石墨烯膜可以采用化学气相沉积法(cvd)生长于金属基底的表面，获得石墨烯膜-金属基底结构。在本发明的一些实施方案中，采用化学气相沉积法(cvd)生长于金属基底上的石墨烯膜为单层石墨烯。在本发明中，可以在金属基底的单面表面生长石墨烯膜，也可以在石墨烯膜的双面表面生长石墨烯膜。
[0051]
在本发明中，对于金属基底的材质没有特别的限制，例如可以使用铜或铂。考虑制备成本，优选使用铜(例如铜箔)作为金属基底。在一些具体的实施方案中，在进行上述沉积而形成石墨烯膜前，对金属基底进行表面处理。
[0052]
进一步，在所述金属基底上形成了石墨烯膜后，在石墨烯膜的表面至少部分区域形成烃类混合物(的层)。
[0053]
在本发明中，烃类混合物为碳原子数约为15～40的烃类混合物，其可以为直链烷
烃、带个别支链的烷烃和带长侧链的单环环烷烃中的一种或多种的混合物，所述的烃类混合物熔点在70℃以下，优选65℃以下。在本发明的一些实施方案中，从使用便利性的角度考虑，所述的烃类混合物熔点在40℃以上，优选45℃以上。在本发明的一些实施方案中，所述的烃类混合物密度小于水的密度，使其能漂浮于水及腐蚀液表面。
[0054]
上文所述的最高熔点，可以是依据dsc测试得到的最高熔点，在一些具体的实施方案中，对于混合物进行dsc测试，通过数学拟合熔融峰峰顶的切线交点所对应的温度值。
[0055]
在本发明的一些优选的实施方案中，所述的烃类混合物可以是石蜡。例如，全精炼石蜡、半精炼石蜡和粗石蜡，或是具有不同熔点(52℃、54℃、56℃、58℃)的石蜡。石蜡是一种从石油、页岩油或其他沥青矿物油的某些馏出物中提取的白色或淡黄色烷烃混合物，主要由20～40烷烃组成，不溶于水和乙醇，但溶于石油醚、二甲苯、氯仿等常用有机溶剂，无臭无味，常温下为固体，47～64℃以上开始熔化，密度为0.9g/cm3，比水轻的性质使其能漂浮于刻蚀液表面，因此石蜡作为石墨烯的转移介质，不仅安全经济，同时破坏力小，易去除，能保证良好的覆盖度和洁净程度，在保持石墨烯所有优良特性的前提下，得到的石墨烯载网为单层覆盖，可以批量化生成。
[0056]
在本发明的一些实施方案中，可以在石墨烯膜上铺0.1～0.5mm厚度的烃类混合物，作为石墨烯膜的转移介质。在该厚度下，烃类混合物可以为石墨烯提供足够的支撑强度，在刻蚀金属基底及清洗过程中，使石墨烯膜漂浮于液体表面，避免金属基底刻蚀完后石墨烯出现褶皱和缺陷，使得石墨烯膜保持完整及平整，不仅可以保证石墨烯膜的转移效果，而且便于后续的清洗处理，保证洁净程度，降低残留。
[0057]
在本发明中，在石墨烯膜上铺烃类混合物的方法没有特别的限制，例如可以取适量的烃类混合物在石墨烯膜的表面，通过加热金属基底的方式将烃类混合物熔化，铺展在石墨烯膜的表面，冷却后，烃类混合物凝固在石墨烯膜的表面，形成烃类混合物-石墨烯膜-金属基底结构。在本发明的一些具体的实施方案中，可以将石墨烯膜-金属基底结构平整放置于盖玻片上，之后将盖玻片放在高于烃类混合物的熔点的温度，例如70℃～100℃，优选90～100℃(例如95℃)的金属浴上，取适量大小烃类混合物于石墨烯膜表面。烃类混合物会迅速熔化铺展，并铺满石墨烯膜表面，随后取出盖玻片置于室温条件，烃类混合物迅速凝固，在石墨烯膜表面形成0.1～0.5mm厚度的烃类混合物。
[0058]
在本发明的一些实施方案中，如果采用化学气相沉积法生长的石墨烯膜分别覆盖于金属基底(例如，铜箔)的两侧表面，在准备向有石墨烯膜一侧的表面铺烃类混合物之前，将金属基底的另一侧的表面的石墨烯膜去除，例如采用等离子体清除石墨烯膜。在本发明的一些具体实施方案中，可以将剪裁合适大小的石墨烯膜覆盖的金属基底，将其不进行转移的一侧表面朝上放入例如gatan等离子清洗仪中，同时通入氧气(流速11.5sccm)和氩气(流速35sccm)进行等离子清洗10～60秒，去除金属基底该侧表面覆盖的石墨烯膜。
[0059]
在一些具体的实施方案中，本发明所述的烃类化合物所覆盖的石墨烯膜的面积，以石墨烯膜总面积为基准，为70％以上，优选为80％以上，进一步优选为90％以上。
[0060]
《石墨烯膜转移到电镜载网》
[0061]
在本发明中，在石墨烯膜表面铺烃类混合物后，需要将金属基底去除，获得烃类混合物-石墨烯膜结构，以备将石墨烯膜转移到电镜载网。
[0062]
在本发明中，去除金属基底的方法没有特别的限制，例如可以针对选择的金属基
底的材质，选择合适的溶液(腐蚀液/刻蚀液)进行浸泡，以刻蚀金属基底。由于烃类混合物的密度小于水，通过烃类混合物的厚度或量，可以控制烃类混合物-石墨烯膜-金属基底漂浮于腐蚀液表面，以避免其全部进入刻蚀液中，从而提高加工的便利性并避免刻蚀液对于石墨烯膜的潜在过度影响。另外，对于上述的刻蚀液，没有特别限定，可以选择本领域常规的对于金属基底，尤其是对于选定基底金属如铜具有溶解作用的溶液，例如硫酸系酸性溶液等。
[0063]
在本发明一些优选的实施方案中，针对铜箔作为金属基底，可以在室温下，将烃类混合物-石墨烯膜-金属基底结构放置在约0.3～0.8m(例如0.5m)过硫酸铵溶液中(烃类混合物面朝上，金属基底朝下)约3个小时、约4小时、约5小时或更长时间(根据刻蚀液浓度以及金属面积优化)，以将铜箔金属基底完全刻蚀掉。
[0064]
此外，除了上述去除金属基底的使用刻蚀液的方法以外，不受限制的，也可以采用本领域已知的其他方法去除金属基底，例如采用等离子体刻蚀等方法。
[0065]
在本发明中，去除金属基底后，可以采用去离子水清洗烃类混合物-石墨烯膜结构，例如，采用去离子水清洗烃类混合物-石墨烯膜结构1～10遍，优选3～8遍(例如5遍)。在本发明中，由于烃类混合物的密度小于水，采用去离子水清洗烃类混合物-石墨烯膜结构后，烃类混合物-石墨烯膜结构可以漂浮于去离子水表面，于35℃～45℃(例如37℃)烘箱中静置0.5～2小时(例如1小时)，进一步去除溶液残留。
[0066]
用电镜载网捞石墨烯：采用电镜载网捞起烃类混合物-石墨烯膜结构，从而将烃类混合物-石墨烯膜结构置于电镜载网上，获得烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构。
[0067]
在本发明中，对于电镜载网的材质没有特别的限制，例如电镜载网的材质选自铜、镍、钼、钛、金。通常，电镜载网上设置有孔阵列。在本发明的一些实施方案中，电镜载网可以选择金质多孔碳膜载网。
[0068]
在本发明中，将烃类混合物-石墨烯膜结构置于电镜载网之后，还包括干燥的步骤，在本发明中，烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构的干燥的方式没有特别的限制，例如可以采用在35℃～40℃(例如37℃或40℃)烘箱中干燥数小时。在本发明的一些实施方案中，在干燥前，还可以采用滤纸等吸收烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构上的水分，水分的吸收可以降低干燥的处理时间，使石墨烯膜与电镜载网贴合紧密，提高制备效率。
[0069]
《去除烃类混合物》
[0070]
在本发明中，烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构经干燥后，需去除烃类混合物，以获得石墨烯电镜载网。
[0071]
在本发明中，可以采用加热配合有机溶剂溶解的方式清洗烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构，以去除烃类混合物。用于清洗烃类混合物的有机溶剂可以选择溶解烃类混合物的有机溶剂。对于溶解烃类混合物的溶剂，原则上没有特别限制，在一些具体的实施方案中，针对石蜡，例如可以选择石油醚、二甲苯、氯仿等溶剂，并且优选石油醚。
[0072]
在一些优选的实施方案中，采用有机溶剂清洗之前，先将烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构置于70～120℃(优选80～120℃、90～120℃、100～120℃、更优选110～120℃，例如120℃)烘箱中20分钟，以进一步彻底干燥同时初步去除部分烃类混合物，具体实施中，将烃类混合物-石墨烯膜-电镜载网结构置于吸油纸或滤纸上效果更佳。
[0073]
同时为提高清洗的效果，可以在清洗的过程中进行加热，加热的温度可以为高于
research,cypher s，ac160ts-r3探针，弹性系数26，共振频率300)进行表征。
[0087]
结果如图2～图3所示，参见图2，实施例中通过石蜡转移制备石墨烯电镜载网在显示区域内具有超过99％的石墨烯覆盖度，参见图3，利用原子力显微镜进一步显示单孔平整度与洁净度，可见其高度起伏不超过1nm(图3中的b和c)。并且，通过透射电子显微镜单孔成像图像，石墨烯膜悬浮于多孔碳膜载网上，显示较高的洁净度与平整度，并且能够清晰看到石墨烯六边形晶格衍射点(图3中的d)。
[0088]
使用本发明实施例中制备的石墨烯电镜载网，可直接用于冷冻电镜制样，具体步骤为：石墨烯电镜载网制备好后，正面朝上放入辉光放电仪中抽2.5分钟真空，之后在低档下放电15秒，立即使用fei公司vitrobot进行冷冻样品制备，vitrobot腔体内湿度100％，温度8-12℃条件时，取4μl去铁铁蛋白(apoferritin)滴加到石墨烯电镜载网的石墨烯面，滤纸夹吸2秒(force设置为-2)后，快速插入液态乙烷中，然后在液氮中转移到电镜载网盒中，使用冷冻透射电子显微镜观察并收集数据，或液氮中保存备用。
[0089]
用200kv透射电子显微镜(thermo fisher scientific tecnai arctica)对所制样品进行单颗粒冷冻电镜数据的采集，所有照片在放大物理像素、欠焦-2.0至-3.2微米下拍摄，曝光1.2秒。每张照片拍摄19帧，累积电子剂量约结果如图4所示，可以看到apoferritin颗粒在石墨烯支撑膜上分散性很好，衬度很高。
[0090]
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。
[0091]
产业上的可利用性
[0092]
本发明提供的石墨烯电镜载网的制备方法可以应用于单层、平整且洁净度高的石墨烯电镜载网生产。