一种双受体双靶点载DOX给药系统的制备方法

一种双受体双靶点载dox给药系统的制备方法
技术领域
1.本发明涉及药品技术领域，尤其涉及一种双受体双靶点载dox给药系统的制备方法。


背景技术：

2.靶向给药系统是一种新的药物制剂类型。同时也是一种较为理想的给药方式。利用靶向给药系统的特性，可以较为精确的控制药物释放到特定的组织、器官或细胞，延长药物的传递过程，长时间的保持靶区的药物浓度，具有毒性小，生物利用度高等优点。但在靶向给药系统的研发过程中，也遇到了一些需要解决的问题：现有的给药系统在应用时存在血液环境下稳定性差导致药物泄露的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种双受体双靶点载dox给药系统的制备方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种双受体双靶点载dox给药系统的制备方法，包括以下步骤：步骤1：脂质体的合成，将蛋黄磷脂酰胆碱（epc）、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、阳离子脂质体(otap)和胆固醇加入二氯甲烷溶液中，混匀后，真空旋干，成膜；之后加入硫酸铵溶液，进行水化反应后得到脂质体悬浮液；步骤2：脂质体包裹药物，取药物水溶液与空白脂质体悬浮液共孵育，经过sephadex g-50进行纯化，得载药物脂质体（dlp）；步骤3：脂质体与ha结合，将dlp悬浮液添加到0.5 mg/ml ha溶液中搅拌获得ha包被dlp，再通过sephadex g-50柱凝胶过滤得ha-dlp；步骤4：双受体双靶点载dox给药系统的制备，将ha-dlp与edc和nhs溶于pbs中室温下磁力搅拌活化羧基；将去除多余的edc和nhs后的ha-dlp加入rgd肽，室温下充分反应后放入透析袋中避光透析，冷冻干燥，即得rgd@ha-dlp。
5.优选的，脂质体包裹药物及荧光染料，取药物水溶液、荧光染料dir和空白脂质体悬液在60℃环境下共孵育30min，经过sephadex g-50进行纯化，得载药物及dir脂质体（dlp-dir）。
6.优选的，药物水溶液、荧光染料dir和空白脂质体悬液的重量比为1：1：10。
7.优选的，步骤3：脂质体与ha结合，将dlp-dir悬浮液按照1：1体积比添加到浓度为0.5 mg/ml的ha溶液中搅拌获得ha包被dlp-dir，再通过sephadex g-50柱凝胶过滤得ha-dlp-dir。
8.优选的，步骤4：双受体双靶点载dox给药系统的制备，将ha-dlp-dir与edc和nhs溶于ph值为7.4的pbs溶液中室温下磁力搅拌30min活化羧基；将去除多余的edc和nhs后的ha-dlp-dir按照1：10的重量比加入rgd肽，室温下充分反应2h后放入透析袋中避光透析48h，冷
冻干燥，即得rgd@ha-dlp-dir。
9.优选的，将步骤1中制备得到的脂质体悬浮液经多次聚碳酸酯膜过滤，得到浓度均匀的脂质体悬浮液。
10.优选的，所述步骤2中药物水溶液与脂质体悬浮液的重量比为1：10；步骤2中孵育的温度为60℃，孵育的时间为30min。
11.优选的，所述步骤3中ha溶液的浓度为0.5mg/ml；dlp悬浮液和ha溶液的体积比为1：1。
12.优选的，所述步骤4中pbs溶液的ph值为7.4。
13.优选的，所述步骤4中去除多余的edc和nhs后的ha-dlp与rgd肽的重量比为1：10。
14.本发明的有益效果为：本发明制备所得的rgd@ha-dlp在血液环境下具有良好的稳定性，能够减少药物的泄露，且具有良好的ph敏感性；rgd@ha-dlp在体内迅速分布，且滞留时间长，rgd@ha-dlp对肿瘤4t1的靶向能力强于dlp和ha-dlp；rgd@ha-dlp对于肿瘤细胞的抑制效果最显著，尤其在高浓度下表现最为突出，说明rgd@ha-dlp脂质体能明显增强药物的抗肿瘤细胞生长作用。
附图说明
15.图1：a为dlp、ha-dlp、rgd@ha-dlp粒径分布及电镜图；b为dlp、ha-dlp、 rgd@ha-dlp电位；c为rgd@ha-dlp在血清中的稳定性；d为rgd@ha-dlp的包封率及载药量；e为rgd@ha-dlp在不同条件下的药物累积释放图；图2：a为激光共聚焦考察dlp、ha-dlp、rgd@ha-dlp对4t1细胞的体外靶向能力；b和d为dlp、ha-dlp、rgd@ha-dlp对4t1荷瘤小鼠的体内靶向能力；c为dlp、ha-dlp、rgd@ha-dlp在4t1荷瘤小鼠脏器分布情况；图3：a为考察空载体对于肿瘤细胞的抑制效果；b为装载不同浓度dox的脂质体对肿瘤细胞的抑制情况；c为给药后各组凋亡细胞散点图。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
17.实施例1步骤1：脂质体的合成，将蛋黄磷脂酰胆碱（epc）、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、阳离子脂质体(otap)和胆固醇加入二氯甲烷溶液中，混匀后，真空旋干，成膜；之后加入硫酸铵溶液，进行水化反应后得到脂质体悬浮液；步骤2：脂质体包裹药物，取药物水溶液与空白脂质体悬浮液共孵育，经过sephadex g-50进行纯化，得载药物脂质体（dlp）；步骤3：脂质体与ha结合，将dlp悬浮液添加到0.5 mg/ml ha溶液中搅拌获得ha包被dlp，再通过sephadex g-50柱凝胶过滤得ha-dlp；步骤4：双受体双靶点载dox给药系统的制备，将ha-dlp与edc和nhs溶于pbs中室温下磁力搅拌活化羧基；将去除多余的edc和nhs后的ha-dlp加入rgd肽，室温下充分反应后放
入透析袋中避光透析，冷冻干燥，即得rgd@ha-dlp。
18.实施例2步骤1：脂质体的合成，将蛋黄磷脂酰胆碱（epc）、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、阳离子脂质体(otap)和胆固醇加入二氯甲烷溶液中，混匀后，真空旋干，成膜；之后加入硫酸铵溶液，进行水化反应后得到脂质体悬浮液；步骤2：脂质体包裹药物，取药物水溶液与空白脂质体悬浮液共孵育，经过sephadex g-50进行纯化，得载药物脂质体（dlp）；步骤3：脂质体与ha结合，将dlp-dir悬浮液按照1：1体积比添加到浓度为0.5 mg/ml的ha溶液中搅拌获得ha包被dlp-dir，再通过sephadex g-50柱凝胶过滤得ha-dlp-dir；步骤4：双受体双靶点载dox给药系统的制备，将ha-dlp-dir与edc和nhs溶于ph值为7.4的pbs溶液中室温下磁力搅拌30min活化羧基；将去除多余的edc和nhs后的ha-dlp-dir按照1：10的重量比加入rgd肽，室温下充分反应2h后放入透析袋中避光透析48h，冷冻干燥，即得rgd@ha-dlp-dir。
19.本发明设置三组实验例，分别对脂质体表征、血清稳定性测定、包封率测定、体外释放率进行测定；脂质体靶向性研究；脂质体体外抗肿瘤活性研究：实验例1：脂质体表征、血清稳定性测定、包封率测定、体外释放率测定0.4g/l的阿霉素脂质体分散于pbs（ph = 7.4）缓冲液中，使用表面电位与粒度测定仪测定其粒径分布。应用动态光散射软件进行数据处理，记录其粒径分布特征。将脂质体溶液混合均匀后，滴至覆有支持膜的铜网上，待液体挥干后用 2%磷钨酸钠负染，室温干燥，用透射电镜（tem）观察其外貌形态。rgd@ha-dlp脂质体30μl 5mol %与3 ml的含10%胎牛血清（fbs）培养基混合，用移液枪吹打 3-5次，立刻用使用表面电位与粒度测定仪测定其粒径分布；每隔24h测定一次，连续测定7天。取包封过阿霉素的脂质体1ml，用蒸馏水稀释10倍，准确取1ml的稀释液滴加到预先平衡好的sephadexg-50凝胶柱上，以pbs（ph = 7.4）洗脱，每2ml收集一份，连续收集60ml，以空白脂质体为对照，测定各管480nm处脂质体阿霉素中阿霉素的含量，测定脂质体阿霉素的包封率和载药率。结果采用动态透析法考察载药脂质体的体外释放行为取2ml rgd@ha-dlp脂质体置于透析袋内，封口后投入装有10ml、pbs（ph = 7.4）释放介质的棕色瓶中，于37℃、100r/min 避光振摇。分别于不同时间点取样1ml，同时补充相同体积和温度的新pbs。利用紫外分光光度法测定样品的吸光度值，计算累积释放百分数。同法测定在不同条件下（ph=5.0的pbs，ph=7.4的透明质酸酶，ph=5.0的透明质酸酶）的累积释放百分数。
20.如图1a-1b所示，制备得到的脂质体粒径较小，经ha和rgd修饰后，脂质体粒径增大，zeta电位有所下降，负的rgd@ha-dlp zeta电位能够有效防止粒子聚集，增加脂质体稳定性，同时可以避免血浆蛋白的吸附，提高在血液中的循环稳定性。此外，rgd@ha-dlp脂质形貌为球形或类球形；图1c显示rgd@ha-dlp在血清中的稳定性良好；图1d显示rgd@ha-dlp包封率为63.5%，载药量为28.0%，经ha和rgd修饰后，脂质体的疏水性空间增大，对dox具有较好的亲和力，因此，rgd@ha-dlp的包封率有所提高。脂质体在不同的条件下释放初期无明显的突释效应，表明dox被全部包载于脂质体双层中，这与测定的较高包封率结果一致；图1e显示随着时间的延长，脂质体缓慢释放，24h后在ph=7.4的pbs，ph=5.0的pbs，ph =7.4的haase，ph =5.0的haase中累计释放百分率分别为19.35%，29.05%，59.05%，87%，表明在不同
酸性环境下 dox 的累计释放情况。
21.结果显示，在ph =7.4的条件下，dox的释放率一直保持在一个较低的状态，说明rgd@ha-dlp在ph =7.4的条件下具有良好的稳定性。由于血液的ph环境接近7.4，这也表明rgd@ha-dlp在血液环境下具有良好的稳定性，能够减少药物的泄露。同时，四种环境下的释放数据表明rgd@ha-dlp具有良好的ph敏感性。在ph =5.0的haase溶液中dox 的累计释放率高于ph =7.4的haase溶液中dox的累计释放率也说明酸性条件下，透明质酸酶的活性更好。由以上分析可知，透明质酸酶对rgd@ha-dlp中dox的释放影响是绝对的，且酶活性与ph之间存在协同作用。
22.实验例2：脂质体靶向性研究分别在共聚焦培养皿中加入用dmem培养基培养的4t1细胞系（3
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5 cells/ml）,并在37℃，二氧化碳浓度为5%，加湿空气环境下孵育12h，然后分别在每个培养皿中加200μl含有100 nmol/l的dlp，ha-dlp和rgd@ha-dlp的pbs（ph7.4）缓冲液，继续孵育2h后将培养基去除，然后用pbs（ph7.4）溶液清洗三遍除去未结合的探针，细胞核用12μg/ml hochest 33342染色剂染色，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞内探针的摄取情况。将200μl dlp-dir、ha-dlp-dir及rgd@ha-dlp-dir溶液（终浓度为50 μm）通过尾静脉注射入荷瘤昆明鼠(4t1)体内，分别于注射后5min，1h，3h，6h，9h，12h及24h将这些老鼠固定后置于近红外显像系统下进行活体实时显像监测，ccd照相机采集实时荧光信号并拍照保存，将获得的肿瘤荧光成像监测图通过肿瘤部位荧光信号强度的roi分析。为了进一步观察研究体内的显像结果，在24h后，分别取不同的探针注射的荷瘤老鼠处死解剖，取出肿瘤和主要脏器（心，肝，脾，肺，肾，肠），用生理盐水冲洗3次置于显像系统下进行显像检测。
23.体外细胞靶向实验结果如2a所示，rgd@ha-dlp对细胞的靶向能力强于dlp和ha-dlp，除了脂质体自身的被动靶向外，rgd与4t1细胞上整合素受体及ha与4t1细胞上的cd44受体进行特异性结合也起到了增强靶向的作用；体内细胞靶向实验结果如2b所示，不同的探针在进入体内5min后就迅速分布到全身，并在3小时时已经开始从肝脏代谢，在24 h时肝脏部位还有较强的荧光强度，具有一定的滞留效应。
24.由此表明，rgd@ha-dlp可以促进脂质体靶向聚集在肝脏部位，并且消除也相对较慢。图2d平均相对荧光强度表明体内rgd@ha-dlp对肿瘤4t1的靶向能力强于dlp和ha-dlp，与体外实验结果一致。图2c结果也说明了这一点。
25.实验例3：脂质体体外抗肿瘤活性研究将对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4t1按每孔3000-4000个接种于96孔板中，4-6h后，每孔分别加入ph为7.4的pbs，含dox 0.5μg/ml dlp，ha-dlp和rgd@ha-dlp各自100μl，每组设6复孔，在37℃，5% co2条件下培养12h后，每孔加入25μl mtt(5mg/ml)继续培养，4h后吸掉上清液，每孔加入150μl dmso，在490nm波长下检测每孔吸光度(a)值；计算细胞存活率考察空载体的安全性；另取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4t1接种于96孔板中，4-6h后，每孔分别加入含dox 0.25μg/ml ，0.5μg/ml ，1μg/ml，2μg/ml ，4μg/ml，6μg/ml的 dox，dlp，ha-dlp和rgd@ha-dlp各自100μl，每组设6复孔，按照相同的方法计算细胞存活率。含dox 0.5μg/ml 的dox，dlp，ha-dlp和rgd@ha-dlpdox与小鼠乳腺癌细胞4t1共同孵育，设定给药剂量为100μl，孵育24 h后，采用流式细胞仪以annexin v-fitc/pi双染色法检测肿瘤细胞凋亡率，以添加ph7.4 pbs（不含药物）作为对照，其余同以上处理。
26.实验结果如图3a所示，空载体对于肿瘤细胞的抑制效果不明显说明空载体具有一定的安全性；图3b结果显示rgd@ha-dlp对于肿瘤细胞的抑制效果最显著，尤其在高浓度下表现最为突出，说明rgd@ha-dlp脂质体能明显增强药物抑制肿瘤细胞生长的作用且抑制作用与浓度相关；图3c结果显示rgd@ha-dlp脂质体给药后引起的肿瘤细胞凋亡率最高，与其余组比较，均存在显著性差异，由此表明，rgd@ha-dlp脂质体具有很好的促肿瘤细胞凋亡效果。
27.本发明制备所得的rgd@ha-dlp在血液环境下具有良好的稳定性，能够减少药物的泄露，且具有良好的ph敏感性；rgd@ha-dlp的荧光强度高，且荧光滞留时间长，rgd@ha-dlp对肿瘤4t1的靶向能力强于dlp和ha-dlp；rgd@ha-dlp对于肿瘤细胞的抑制效果最显著，尤其在高浓度下表现最为突出，说明rgd@ha-dlp脂质体能明显增强药物的抗肿瘤细胞生长作用。
28.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。