一种脯氨酸和N-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法及其应用与流程

一种脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及分析技术领域，具体涉及一种将脯氨酸还原成脯氨醇的方法及1-甲基吡咯烷-2-丙烯酸的制备方法。


背景技术：

2.马来酸吡咯替尼是我国自主研发，用于治疗人表皮生长因子受体her-2阳性的小分子靶向新药，n-甲基-d，l-脯氨酸是合成马来酸吡咯替尼边链的关键中间体。“d，l-脯氨酸”为合成“n-甲基-d，l-脯氨酸”的关键原料(路线见下方)，检测中发现使用常规分析手段很难对二者进行有效的分离和检测，原因(1)原料与产物二者基本无紫外吸收，不能使用实验室常规的紫外检测器进行检测，原因(2)原料与产物二者均属于大极性化合物，在常规的色谱柱上几乎无保留行为，很难进行分离。
[0003][0004]
gb/t32946-2016公开了蜂蜜中脯氨酸的测定，高效液相色谱法。采用液相色谱荧光检测器检测。采用荧光检测器，需要对样品进行衍生化，操作复杂。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法及其应用，方便快捷，方便。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法，其特征在于：应用高效液相色谱法，并采用蒸发光散射检测器联用，所述高效液相色谱法以cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm为色谱柱，10mm的乙酸铵水溶液和乙腈为流动相。
[0007]
上述方案中：10mm的乙酸铵水溶液和乙腈的体积比为15：85。
[0008]
上述方案中：所述脯氨酸为d,l-脯氨酸，所述n-甲基脯氨酸为n-甲基-d,l-脯氨酸。
[0009]
上述方案中：流动相流速1.0ml/min，色谱柱温度：30℃，运行时间：20min。
[0010]
上述方案中：蒸发光散射检测器工作参数为：雾化器温度：40℃漂移管稳定：45℃，雾化器流量：1.6l/min。
[0011]
所述的脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法在监测脯氨酸反应成n-甲基脯氨酸的反应中的应用。
[0012]
本发明选择蒸发光散射检测器(elsd)，这属于一款通用型检测器，稳定性好、灵敏度高，解决了原料(脯氨酸)和产物(n-甲基脯氨酸)二者信号响应的问题；其次我们采用hilic洗脱模式，解决了原料和产物难分离的问题。二者的巧妙结合，可快速进行检测，方法的灵敏度高，操作简单，大大降低了分析成本，缩短了分析时间，保证了检测结果的准确性。
附图说明
[0013]
图1为实施例1中的空白溶剂色谱图。
[0014]
图2为实施例1中的n-甲基-d，l-脯氨酸对照色谱图。
[0015]
图3为实施例1中的d，l-脯氨酸对照色谱图。
[0016]
图4为实施例2中的用紫外检测器测定混合对照品溶液色谱图。
[0017]
图5为实施例2中的用elsd检测器测定混合对照品溶液色谱图。
[0018]
图6为实施例3中的供试品溶液色谱图。
[0019]
图7为实施例4中的n-甲基-d，l-脯氨酸线性回归图。
[0020]
图8为实施例4中的d，l-脯氨酸线性回归图。
[0021]
图9为实施例5中的n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸loq色谱图。
[0022]
图10为实施例5中的n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸lod色谱图。
[0023]
图11为实施例6中的混合对照品溶液色谱图。
[0024]
图12为中控图谱。
具体实施方式
[0025]
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0026]
实施例1
[0027]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260infimityⅱelsd检测器
[0028]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0029]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(15：85)
[0030]
elsd雾化器温度：40℃
[0031]
elsd漂移管温度：45℃
[0032]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0033]
流速：1.0ml/min
[0034]
柱温：30℃
[0035]
运行时间：20min
[0036]
进样体积：20ul
[0037]
取n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸对照品，分别用50％乙腈溶解，配制成含n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸均为2mg/ml的对照品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见图1～3，图1为空白溶剂色谱图，可以看出空白无干扰检测色谱峰；图2中保留时间为9.628min的色谱峰为n-甲基-d，l-脯氨酸；图3中保留时间为14.496min的色谱峰为d，l-脯氨酸。
[0038]
实施例2
[0039]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260vwd检测器和安捷伦
1260infimityⅱelsd检测器
[0040]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0041]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(15：85)
[0042]
elsd雾化器温度：40℃
[0043]
elsd漂移管温度：45℃
[0044]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0045]
波长(uv)：210nm
[0046]
流速：1.0ml/min
[0047]
柱温：30℃
[0048]
运行时间：20min
[0049]
进样体积：20ul
[0050]
取n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸对照品，分别用50％乙腈溶解，配制成含n-甲基-d，l-脯氨酸和d，l-脯氨酸均为2mg/ml的混合对照品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图4～5，图4是紫外检测器210nm下的检测图谱，保留时间为9.513min的色谱峰为n-甲基-d，l-脯氨酸，保留时间为14.308min的色谱峰为d，l-脯氨酸；图5是elsd检测器下的检测图谱，保留时间为9.618min的色谱峰为n-甲基-d，l-脯氨酸，保留时间为14.422min的色谱峰为d，l-脯氨酸。可看出紫外检测器的响应值低，elsd检测器的响应值明显优于紫外检测器。分离度6.5，符合要求。
[0051]
实施例3：
[0052]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260infimityⅱelsd检测器
[0053]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0054]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(体积比15：85)
[0055]
elsd雾化器温度：40℃
[0056]
elsd漂移管温度：45℃
[0057]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0058]
流速：1.0ml/min
[0059]
柱温：30℃
[0060]
运行时间：20min
[0061]
进样体积：20ul
[0062]
取n-甲基-d，l-脯氨酸供试品，分别用50％乙腈溶解，配制成浓度为1mg/ml的供试品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图6，图6中保留时间为9.755min的色谱峰为n-甲基-d，l-脯氨酸，保留时间为15.433min的色谱峰为d，l-脯氨酸。
[0063]
实施例4：
[0064]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260infimityⅱelsd检测器
[0065]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0066]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(15：85)
[0067]
elsd雾化器温度：40℃
[0068]
elsd漂移管温度：45℃
[0069]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0070]
流速：1.0ml/min
[0071]
柱温：30℃
[0072]
运行时间：20min
[0073]
进样体积：20ul
[0074]
取实施例2项下混合对照品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，依次进样0.5μl、2μl、6μl、10μl、20μl、30μl，记录色谱图。结果见附图7～8和表格1～2，表格1和图7为n-甲基-d，l-脯氨酸线性回归结果；表格2和图8为d，l-脯氨酸线性回归结果。由结果可知，二者线性结果均符合r≥0.995的标准要求。
[0075]
表1
[0076][0077]
表2
[0078]
[0079][0080]
实施例5
[0081]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260infimityⅱelsd检测器
[0082]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0083]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(15：85)
[0084]
elsd雾化器温度：40℃
[0085]
elsd漂移管温度：45℃
[0086]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0087]
流速：1.0ml/min
[0088]
柱温：30℃
[0089]
运行时间：20min
[0090]
进样体积：20ul
[0091]
取实施例1项下对照品溶液，逐级稀释进样，得到信噪比s/n≈10时作为定量限loq，得到信噪比s/n≈3时作为检测限lod。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图9～10，图9为loq图谱；图10为lod图谱。实验结果表明，n-甲基-d，l-脯氨酸的loq为0.33ug，lod为0.11ug；d，l-脯氨酸的loq为0.42ug，lod为0.14ug。
[0092]
实施例6
[0093]
高效液相色谱仪：安捷伦1260hplc系统、安捷伦1260infimityⅱelsd检测器
[0094]
色谱柱：cosmosil hilic 4.6
×
250mm，5μm；
[0095]
流动相组成：0.01mol/l的乙酸铵缓冲液溶液-乙腈(体积比20：80)
[0096]
elsd雾化器温度：40℃
[0097]
elsd漂移管温度：45℃
[0098]
elsd雾化气流量：1.6l/min
[0099]
流速：1.0ml/min
[0100]
柱温：30℃
[0101]
运行时间：20min
[0102]
进样体积：20ul
[0103]
取实施例2项下混合对照品溶液。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图11，图11中保留时间为7.248min的色谱峰为n-甲基-d，l-脯氨酸，保留时间为9.498min的色谱峰为d，l-脯氨酸，分离度5.8，符合要求。实验结果表明，调整流动相后依然能获得很好的分离度。
[0104]
实施例7
[0105]
d,l-脯氨酸150g，甲醇600ml，多聚甲醛45g，10％pd/c2g，投入3000ml高压釜中，通入氢气，50℃，反应16个小时左右，hplc取样监控，
[0106]
取样的样品过滤掉pd/c，称取反应液，反应液加乙腈稀释至n-甲基-d,l-脯氨酸(按照n-甲基-d,l-脯氨酸理论得量计算)的浓度为2mg/ml，计算浓度时要将反应液中的甲醇计算成溶剂。监控图谱如图12所示。
[0107]
当监控原料反应完全，反应液过滤，滤液减压浓缩至干，得到白色固体n-甲基-d,l-脯氨酸160g，收率94.9％。
[0108]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。