一种阿达木单抗药的ADA即时检测试纸条和试剂盒的制作方法

一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条和试剂盒
技术领域
1.本发明属于临床快速(即时)检测以及抗药抗体生物分析技术领域，尤其涉及一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条和试剂盒。


背景技术：

2.免疫原性通常是指治疗性蛋白药物诱发对自身免疫应答或免疫相关反应的能力。当治疗类蛋白产品作为疾病治疗药物产生非预期的免疫应答会给药物的安全和疗效带来一定的风险，主要会引起人体产生抗药抗体(ada)，影响药物的生物学活性、药代动力学参数、进而使药物药效降低或消失，更为严重的是可能对人体造成安全隐患。
3.在药物上市前临床试验过程中，免疫原性是重要的药物安全性指标，对药物是否可以上市提供重要参考意义。尽管药品研发企业会根据临床试验中获得数据评估免疫原性的风险和影响，监管局也是基于可接受的风险-获益比批准药物。但是，在药物上市后实际使用中，由于患者群体无法避免的个体差异、长期用药等原因所带来的药物效果差等问题，而这一系列不及预期的结果，临床医生无法第一时间快速准确的得到是否因为患者体内产生药物ada所导致，为后期制定个性化的治疗方案带来一定的困扰，以及无法为临床医生开展针对该药物的全面研究提供便捷。
4.阿达木单抗(商品名：修美乐)连续多年雄踞全球药物销售额榜首，它适用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗，一般与甲氨蝶呤合用，用以减少药物ada的形成，即使如此，大量临床试验数据测试结果显示，临床仍然有很高的ada的检出率，显示其较强的免疫原性。传统的ada检测方法为elisa方法，不仅测得结果所需的时间较长，而且需要匹配昂贵的仪器、在实验室里完成，及对操作人员有较高的要求，方法开发也耗时耗力，不宜普及。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条和试剂盒，采用本发明提供的ada即时检测试纸条15min即可得到检测结果，不需要借助昂贵仪器。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条，包括底板、样品金标一体垫、硝酸纤维素膜和吸水棉；
8.所述样品金标一体垫上设置有加样孔和金标线，所述金标线上喷涂有阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物；
9.所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上喷涂有鼠抗人igg单克隆抗体，所述质控线上喷涂有羊抗鸡igy多克隆抗体。
10.优选的，所述金标线上阿达木单抗胶体金偶联物的喷涂浓度为1mg/ml。
11.优选的，所述金标线上鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物的喷涂浓度为1mg/ml。
12.优选的，所述检测线上鼠抗人igg单克隆抗体的喷涂浓度为1mg/ml。
13.优选的，所述质控线上羊抗鸡igy多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/ml。
14.优选的，将所述阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物分别经稀释液i稀释后喷涂，所述稀释液i的组分包括：0.1m tris、体积百分含量为1％牛血清白蛋白和体积百分含量为2％蔗糖，所述稀释液i的ph值为8.0。
15.优选的，所述鼠抗人igg单克隆抗体和羊抗鸡igy多克隆抗体分别经稀释液ii稀释后喷涂，所述稀释液ii的组分包括：1
×
pbs和1％牛血清白蛋白，所述稀释液ii的ph值为7.2。
16.本发明还提供了一种阿达木单抗药的ada即时检测试剂盒，包括权利要求1～7任一项所述的ada即时检测试纸条、滴管和样品稀释液。
17.优选的，所述样品稀释液的组分包括：1
×
pbs和0.1％吐温20，所述样品稀释液的ph值为7.2。
18.本发明提供了一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条，检测机理是：
19.为检测阿达木单抗药物的ada，通过金标垫上标记了胶体金的鼠抗人igg单克隆抗体和鸡igy单克隆抗体作为显色指示，如果样本中含有ada，ada与标记了胶体金的阿达木单抗形成复合体，在迁移至t线处，会被鼠抗人igg捕获从而在t线处显色，鸡igy与c线处羊抗鸡igy多克隆抗体结合显色，且无论样本中是否含有ada，c线都会显色。即如果样本为阴性样本，不存在ada，则t线不显色，c线显色，如果样本为阳性样本，存在ada，则t线与c线均显色。
20.本发明的有益效果：
21.本发明提供的ada即时检测试纸条适用于全血、血清、血浆样本类型，兼容性更强。在15min时间内检测出阿达木单抗ada的产生，且灵敏度达到elisa试剂盒水平，大大降低了操作时间以及操作难度，具有操作简单、无需复杂的仪器设备、结果判读迅速等优点，把其作为ada即时检测的方法学具有诸多优势。可以第一时间得到患者在接受药物治疗前后ada变化、药物治疗后产生ada时间点、个体间ada产生量差异，为临床主治医生对患者病情判定、药物药效等治疗过程中的问题提供辅助判定依据。随着国内外上市的阿达木单克隆抗体生物类似药越来越多，本发明有极大的应用前景。
附图说明
22.图1为阿达木单抗ada即时检测原理和结构图；
23.图2为实施例3的阴性样本试剂条检测结果；
24.图3为实施例5的阴性样本以及阳性样本稳定性结果。
具体实施方式
25.本发明提供了一种阿达木单抗药的ada即时检测试纸条，包括底板、样品金标一体垫、硝酸纤维素膜和吸水棉；
26.所述样品金标一体垫上设置有加样孔和金标线，所述金标线上喷涂有阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物；
27.所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上喷涂有鼠抗人igg单
克隆抗体，所述质控线上喷涂有羊抗鸡igy多克隆抗体。
28.在本发明中，所述试纸条的宽度优选为4～6mm，对长度无要求，依据卡壳设定即可。
29.在本发明中，所述抗药抗体试纸条的组装优选包括：将所述样品金标一体垫压住硝酸纤维素膜3mm，将所述吸水棉压住硝酸纤维素膜3mm，再将样品金标一体垫、硝酸纤维素膜和洗水棉组装到底板上。在本发明中，所述底板优选为聚氯乙烯板。
30.在本发明中，所述样品金标一体垫上设置有加样孔和金标线，所述金标线上喷涂有阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物。本发明对加样孔和金标线的距离没有特殊限定，本领域技术人员依据常规即可。本发明对所述加样孔没有特殊限定，本领域技术人员根据常规设置加样孔即可。在本发明中，所述金标线上阿达木单抗胶体金偶联物的喷涂浓度优选为1mg/ml。在本发明中，所述金标线上鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物的喷涂浓度优选为1mg/ml。在本发明中，所述阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物优选分别经稀释液i稀释后喷涂，所述稀释液i的组分优选包括：0.1m tris、体积百分含量为1％牛血清白蛋白和体积百分含量为2％蔗糖，所述稀释液i的ph值优选为8.0。本发明对所述阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy胶体金偶联物的制备方法没有特殊限定，本领域技术人员根据常规操作将阿达木单抗和胶体金偶联制备即可，根据常规操作将鸡igy单克隆抗体和胶体金偶联制备即可。本发明优选按照4ul/cm喷涂稀释后的阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物。本发明对所述金标线的宽度没有特殊限定，采用常规设置金标线的宽度即可。本发明对所述阿达木单抗和鸡igy单克隆抗体的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。
31.在本发明中，所述阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物的制备方法，优选如下：
32.1.向烧杯中加入制备好的胶体金颗粒20ml，加入0.1m碳酸钾100μl，在磁力搅拌器上转速200转/min，反应5min。
33.2.向烧杯中再加入1mg/ml待标记抗体100μl，在磁力搅拌器上200转/min，反应30min。
34.3.向烧杯中再加入10％bsa 200μl，在磁力搅拌器上200转/min，反应15min。
35.4.将反应产物配平后于离心机上7800转/min 4℃离心20min，弃上清，收集沉淀，收集体积为标记体积的1/40，用于后期试验。
36.在本发明中，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上喷涂有鼠抗人igg单克隆抗体，所述质控线上喷涂有羊抗鸡igy多克隆抗体。本发明对检测线和质控线的距离没有特殊限定，本领域技术人员依据常规即可。在本发明中，所述检测线上鼠抗人igg单克隆抗体的喷涂浓度为1mg/ml。在本发明中，所述质控线上羊抗鸡igy多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/ml。在本发明中，所述鼠抗人igg单克隆抗体和羊抗鸡igy多克隆抗体优选分别经稀释液ii稀释后喷涂，所述稀释液ii的组分优选包括：1
×
pbs和1％牛血清白蛋白，所述稀释液ii的ph值优选为7.2。本发明对所述igg单克隆抗体和羊抗鸡igy多克隆抗体的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。本发明优选按照1.4ul/cm喷涂稀释后的igg单克隆抗体和羊抗鸡igy多克隆抗体。本发明对所述检测线和质控线的宽度没有特殊限定，采用常规设置的宽度即可。
37.本发明还提供了一种阿达木单抗药的ada即时检测试剂盒，包括上述技术方案所述的ada即时检测试纸条、滴管和样品稀释液。在本发明中，所述样品稀释液的组分优选包括：1
×
pbs和0.1％吐温20，所述样品稀释液的ph值为7.2。在本发明中，所述ada即时检测试剂盒还优选包括干燥剂，本发明对所述干燥剂没有特殊限定，采用常规试剂盒中使用的干燥剂即可。本发明对所述试剂盒中装入ada即时检测试纸条和滴管的数量、样品稀释液的装量没有特殊限定。
38.在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括：将所述试纸条水平放置，在加样孔中加入10ul样本，再滴加2～3滴样品稀释液，静置15min后观察结果。在本发明中，所述试剂盒优选在2～8℃下保存，使用时恢复至室温。
39.在本发明中，所述样品优选包括全血、血清或血浆。
40.在本发明中，所述结果判定方式如下：
41.阳性：质控线(以下简称c线)和检测线(以下简称t线)各有一条红色线条出现，表示样本中存在阿达木单抗ada，检测结果呈阳性。
42.阴性：仅质控线(c线)有一红色线条，而检测线(t线)无红色线条出现，表示样本中没有阿达木单抗ada或ada低于检出水平，检测结果呈阴性。
43.无效：控线(c线)无红色线条出现，表示失效。可能由于操作不正确或试剂盒失效引起，应按说明重新检测。
44.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.阿达木单抗药的ada即时检测试纸条和试剂盒的制备：
47.1.喷金处理：将阿达木单抗药-45nm胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物分别按照4微升/厘米、浓度为1mg/ml均匀的喷到样品金标一体垫上，稀释液i(0.1m tris、1％bsa、2％蔗糖，ph8.0)，放于37℃过夜处理。
48.阿达木单抗胶体金偶联物和鸡igy单克隆抗体胶体金偶联物的制备方法，分别具体如下：
49.向烧杯中加入制备好的胶体金颗粒20ml，加入0.1m碳酸钾100μl，在磁力搅拌器上转速200转/min，反应5min；
50.向烧杯中再加入1mg/ml待标记抗体100μl，在磁力搅拌器上200转/min，反应30min；
51.向烧杯中再加入10％bsa 200μl，在磁力搅拌器上200转/min，反应15min；
52.将反应产物配平后于离心机上7800转/min 4℃离心20min，弃上清，收集沉淀，收集体积为标记体积的1/40，用于后期试验。
53.2.划膜处理：将nc膜对齐贴在底板上，将鼠抗人igg单克隆抗体与羊抗鸡igy多克隆抗体分别用稀释液ii(1*pbs、1％bsa，ph7.2)进行稀释划线，1.4微升/厘米、浓度均为1mg/ml，放于37℃过夜处理。
54.3.内部组装：将37℃处理过夜的样品金标一体垫一侧边缘压住nc膜三毫米进行组装，洗水棉以同样的方法进行组装，具体构造可参见原理图。
55.4.卡壳组装：将上述组装完成的卡片切片机切成宽度4毫米条，按照顺序将卡条组
装于卡条中，得到检测卡。
56.5.封装：将上述检测卡、滴管、稀释液iii(1*pbs、0.1％吐温20，ph7.2)、干燥剂以及说明书封装值铝箔袋中4℃保存使用，得到试剂盒。
57.实施例2
58.使用实施例1的阿达木单抗的抗药抗体检测试剂盒确认临界点，使用方法为：将试纸条水平放置，在加样孔中加入10ul样本，再滴加2～3滴样品稀释液，静置15min后观察结果。
59.结果判定方式如下：
60.阳性：质控线(以下简称c线)和检测线(以下简称t线)各有一条红色线条出现，表示样本中存在阿达木单抗ada，检测结果呈阳性。
61.阴性：仅质控线(c线)有一红色线条，而检测线(t线)无红色线条出现，表示样本中没有阿达木单抗ada或ada低于检出水平，检测结果呈阴性。
62.无效：控线(c线)无红色线条出现，表示失效。
63.分别收集了100个未接触过阿达木单抗的个体人血清以及相应人全血的样本进行阴性样本临界值设定，且为防止人为判别误差，借助了t线与c线的灰度比值(t/c值)(借助灰度值扫描仪器)进行辅助确认。结果如表1-1和表1-2和图2，其中直接判读表示为眼睛观看所得结果，三人同时进行判定。
64.表1-1阴性样本试剂卡检测结果
65.[0066][0067]
表1-2阴性样本试剂卡检测结果
[0068]
[0069][0070]
由上述试验结果发现，使用100例正常个体人血清(未接触过阿达木抗体药物)样本进行实验，99％的个体样本表现为阴性，即使用检测卡未检测出阳性样本，存在1％个体出现眼睛直接判定出现异议，即为争议样本，通过t/c值与直接判读结果对比可知，直观判读存在阴性样本与阳性样本t/c区间值无法判定区间。通过对上述100例正常个体人血清按照“平均值
±
3*标准差”方式进行阴性样本判定，阴性样本t/c平均值为0.020，标准差为0.008，因此确定t/c比值区间处于0-0.045区间内属于绝对阴性样本，该区域样本均被肉眼判定为阴性样本，因此将0.045作为阴性样本临界值，即绝对阴性样本，从上述试验结果可以得出，使用设计的试纸条和检测方法出现假阳的概率非常低，数据结果十分可靠。
[0071]
实施例3
[0072]
阳性样本确认：
[0073]
针对于本方法主要为操作者观察判定，为了进一步探究t/c值与操作者直接观察判定结果存在的争议区间，保证直接判读结果均为阳性样本，因此通过配制不同浓度的阳性样本进行实验，实验操作按实施例3的操作流程。实验结果如表2。
[0074]
表2-1阳性样本检测结果
[0075][0076]
表2-2阳性样本检测结果
[0077][0078]
由上述试验结果发现，当ada浓度为50ng/ml时，判读结果不存在异议，均被判定为阳性结果(表2-1和表2-2)，为了进一步确认操作者直接判读结果的临界区域，将ada浓度进一步细分后检测发现，在t/c值在0.06-0.10区间为操作员识别存在分歧区域，而t/c值大于0.11操作员均一致认为是阳性区域。因此综上所述，将阳性样本ada浓度为50ng/ml作为试剂检测卡的最低灵敏度范围，根据临床试验所需该检测灵敏度完全满足要求，即操作者观
察到检测线(t线)，即ada浓度≥50ng/ml，而随着ada浓度增加检测线颜色越来越高，从而可以使操作人员非常直观的判定不同患者同一用药时长、不同患者随着时间ada浓度变化，从而判定不同患者、不同时间体内ada浓度变化。
[0079]
实施例4
[0080]
稳定性实验：
[0081]
针对实施例2和3的试验结果，进一步对实施例1的试剂盒稳定性进行验证，分别将试剂盒组成成分置于45℃、25℃以及2-8℃储存，探究试剂长期储存稳定性的试验，分别选取3个个体人血清阴性样本以及3组ada浓度为50ng/ml的阳性样本进行测试，测试结果如下表3-1至表3-3和图3。
[0082]
表3-1阴性以及阳性样本稳定性测试结果
[0083][0084]
表3-2阴性以及阳性样本稳定性测试结果
[0085][0086]
表3-3阴性以及阳性样本稳定性测试结果
[0087][0088][0089]
由表3-1至表3-3的实验结果发现，将试剂盒分别存放于不同储存条件下(45℃、25℃以及2-8℃)，2-8℃以及25℃储存条件下，阴性样本以及阳性样本结果均保持一致的稳定性，未检测出现假阳或者假阴结果，均符合检测要求，25℃条件下储存45天结果阳性样本信
号值结果有所降低，但仍然满足要求；45℃在储存30天后及第45天结果出现假阴样本结果，即试剂盒表现出不稳定，由图3可知，在45℃储存条件下保存15天后阳性样本信号值开始降低，至储存时间为30天仍满足要求，因此，通过加速稳定性试验结果表明实施例2的试剂盒可以在2-8℃条件下保存一年以上，检测结果稳定，可很好的应用于临床药物ada的阴阳性检测。
[0090]
综上所述，针对于临床阿达木单抗ada检测分析方法完全满足试验需求，且数据具有一定的可靠性，不仅使临床医生可以第一时间了解患者体内产生ada解决了方法开发的难题，也将实验操作流程大大简化，是一种极具创新性的ada检测方法
[0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。