用于对样本进行成像和消融的系统和方法与流程

1.本公开总体上涉及用于对样本进行成像和消融的系统、装置和方法。特别地，本公开涉及用于对生物样本进行成像和消融的系统、装置和方法，其能够获得亚细胞细节并且能够将消融目标转移到接收器，而不会过度损害目标，以允许额外的下游分析。


背景技术：

[0002]“组学”领域寻求表征、量化或以其他方式分析与目标生物或目标生物群的结构、功能或动力学相关的生物分子集。每个组学领域都与相关“组”的研究有关。组学领域包含领域：基因组学，其是基因组研究；表观基因组学，其是对基因组支持结构的研究，包含dna结合剂和dna的化学修饰；转录组学，其是对目标生物生成的一组rna分子的研究，包含mrna、mirna、rrna和trna；蛋白质组学，其是对目标生物生成的蛋白质补体的研究；和代谢组学，其是对通过目标生物的细胞过程生成的代谢物集合的研究。
[0003]“多组学”(有时也称为综合组学)涉及对一个或多个此类组的分析。多组学分析的目标是收集和/或分析复杂的生物学数据，例如，以更好地确定疾病标志物，更好地理解特定条件下的基因型、表型和环境影响之间的划分，并提供对各种组调节和相互影响方式的更深入了解的方式发现各种组之间的关联。
[0004]
然而，进一步推进多组学领域仍然存在一些挑战。特别地，当沿着从基因组到转录组再到蛋白质组和代谢组的基因型到表型路径移动时，化学多样性和复杂性的水平呈指数增长。随着复杂性的增加，获得和分析相关生物分子的难度也随之增加。
[0005]
此外，目标生物分子所在的相关区域通常处于亚细胞水平。因此，以允许对生物分子进行有效下游分析的方式获得目标生物分子是具有挑战性的。然而，诸如激光消融电喷雾电离(laesi)的常规方法，包含皮秒红外laesi(pir laesi)，不允许在亚细胞水平上收集生物分子。在laesi中，激光消融材料被来自电喷雾离子源的纳米级液滴电离，然后输送到质谱仪进行分析。然而，常规laesi系统具有导致低数值孔径(na)光学器件的固有空间限制。用于样本消融的低na光学器件导致大的消融光斑尺寸。例如，最小光斑尺寸通常比整个活细胞大得多，而且根本不足以小到允许对相关亚细胞区域进行目标消融。
[0006]
直接获得活细胞的细胞内和/或细胞间生物材料也是在实时条件下有效分析此类细胞的生化方面的关键。然而，获得用于进一步下游分析的目标细胞材料的常规方法通常依赖于固定并且通常是干燥样本。例如，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(maldi tof)使用基质电离分子组分。固定样本的要求使得maldi tof与活细胞监测不兼容。
[0007]
因此，持续需要能够以允许对获得的材料进行有效下游分析的方式在亚细胞水平从活细胞获得细胞材料的系统、装置和方法。


技术实现要素：

[0008]
本文所述的实施例能够以不会过度损害生物材料并允许对获得的材料进行有效下游分析的方式从样本中收集目标生物材料。在某些实施例中，样本可以包含活细胞，并且
可以在正常环境条件下(例如，没有压力控制、湿度控制等)获得目标生物材料。在某些实施例中，样本的相关目标区域可以具有亚细胞尺寸。在某些实施例中，可以以甚至可以允许细胞存活以任选地用于进一步测试的方式从细胞中移除目标生物材料而对剩余细胞结构的影响最小。
[0009]
在一个实施例中，用于对样本进行成像和消融的装置包含样本台，其具有配置成用于在其上放置样本的第一侧(例如，上侧)和与第一侧相对设置的第二侧(例如，下侧)。装置还包含具有物镜和激光器的光学组件。物镜设置在样本台的第二侧并且配置成能够对放置在样本台上的样本进行显微成像。激光器设置在样本台的第二侧并且配置成引导激光穿过样本台并进入样本以选择性地消融样本的至少一部分，诸如样本的相关目标区域。装置还包含设置在样本台的第一侧的接收器。接收器配置成接收从样本中喷出的消融材料，以能够对消融材料进行进一步分析。
[0010]
在一个实施例中，激光器和物镜配置成使得激光被引导通过物镜并且被定向为使得激光大体上在由样本消融产生的消融羽流的预期移动方向上传播。这有利地允许膨胀的消融羽流沿着大体上平行于传播激光的方向而不是逆着该方向的线有效地朝向接收器行进。
[0011]
光学组件可以配置成能够实现明场成像、切片(例如，通过共焦显微镜)、落射荧光成像、双光子成像或其组合。物镜可具有约0.5或更大、或约0.65或更大、或约0.75或更大、或约0.8或更大的数值孔径(na)。
[0012]
激光器优选地是飞秒红外激光器。激光器和其他光学组件部件可以配置成每μm3样本递送约1nj至约10μj的脉冲能量。待消融的相关目标区域可具有约50μm或更小、或约30μm或更小、或约10μm或更小、或约5μm或更小、或约3μm或更小、或约1.5μm或更小、或约1μm或更小的“光斑尺寸”直径。在体积方面，待消融的相关目标区域可以具有约500μm3或更小、约250μm3或更小、约100μm3或更小、约50μm3或更小、约25μm3或更小、约10μm3或更小、约5μm3或更小、或约2μm3或更小的体积。因此，光学组件可用于消融多个全细胞、单个全细胞或亚细胞体积，诸如目标细胞器或其他细胞内结构，或细胞外的细胞外体积。
[0013]
在一个实施例中，接收器包含一种介质，该介质配置成用于对诸如微孔板或芯片的消融材料的各个子样本进行非重叠的空间区分。在一个实施例中，接收器包含纳米液滴阵列。在一个实施例中，接收器包含电喷雾探针，该电喷雾探针配置成收集消融子样本并将它们以电离液滴的形式输送到质谱仪的入口。电喷雾探针可以与提供用于润湿电喷雾探针外表面的溶剂的毛细管相关联。
[0014]
在一个实施例中，用于对样本的目标区域进行消融和分析的系统包含成像和消融装置以及配置成接收和分析由接收器接收的消融材料的至少一部分的分析器。分析器可以包含例如一个或多个pcr机器、测序机器、光谱仪、核磁共振(nmr)光谱仪、质谱仪、色谱装置、离心机、电泳装置、放射性标记和放射性标签检测装置、其他分析生化装置或其组合。系统还可以包含上游处理器，诸如电动液滴分选机、分选离心机等，其配置成用于在将样本定位在样本台上之前对样本进行分选或以其他方式处理。
[0015]
在一个实施例中，对样本进行成像和消融以能够分析样本的消融部分的方法包含步骤：提供成像和消融装置，获取样本的图像，选择样本内的相关区域，将激光递送到相关区域以消融相关区域的至少一部分，并且在接收器上捕获消融材料的至少一部分。
[0016]
在一个实施例中，消融是在环境气氛中进行。在一个实施例中，样本包含活细胞。在一个实施例中，从目标细胞中移除消融子样本而不杀死目标细胞。
[0017]
在一个实施例中，对样本施加多个激光脉冲。多个消融子样本可以由多个消融事件形成，并且可以在接收器处以非重叠的空间区分位置收集。激光脉冲频率、激光脉冲能量水平或激光脉冲深度中的一种或多种可以跨多个激光脉冲动态地变化。例如，在一种操作模式中，将激光脉冲强度设置为初始高水平以移除上覆相关区域的样本中的材料，然后将激光脉冲强度设置为较低水平以消融相关区域的至少一部分。
[0018]
提供本发明内容来以简化形式介绍概念的选择，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在识别所要求保护的主题的关键特征或本质特征，也不旨在用作对所要求保护的主题的范围的指示。
[0019]
本公开的额外的特征和优势将在下面的说明书中阐述，且部分地在说明书中将是明显的，或可以通过本公开的实践被了解。本公开的特征和优势可以借助于所附权利要求中特别指出的仪器和组合实现和获得。本公开的这些和其他特征将根据以下描述和所附权利要求书变得更为充分地明显，或者可以通过如下文阐述的本公开的实践被了解。
附图说明
[0020]
为了描述可以获得本公开的上述以及其他优点和特征的方式，将通过参考附图中所展示的特定实施例呈现对以上简要描述的本公开的更具体描述。应当理解，这些附图仅描绘了本公开的典型实施例，并且因此不应被视为限制本公开的范围。将通过使用附图以额外的特征和细节来描述和阐述本公开，在附图中：
[0021]
图1示出了常规激光辅助电喷雾电离(laesi)系统；
[0022]
图2示出了用于对样本进行成像和消融的系统的示意图，该系统提供了优于常规成像和消融系统的一个或多个优点，该系统包含具有光学组件、样本台和接收器的成像/消融装置；
[0023]
图3示出了上游电动液滴分选器形式的示例性上游处理器；
[0024]
图4示出了可用于如本文所述的成像/消融装置中的光学组件的示例；
[0025]
图5示出了接收器的示例，该接收器包含空间区分的介质，诸如微孔板；
[0026]
图6a示出了包含纳米滴阵列的接收器的示例；
[0027]
图6b示出了用于形成纳米滴阵列的示例过程；
[0028]
图7示出了接收器的实施例，该接收器包含电喷雾探针并且配置成用于生成含有消融子样本的电离液滴以输送到质谱仪的入口；
[0029]
图8示出了下游过程的一个示例，其中一种或多种试剂可以添加到接收器的空间分离的隔室和/或一种或多种子样本可以传递到液相色谱柱，该液相色谱柱联接到电喷雾探针以将电离样本传递到质谱仪；
[0030]
图9示出了用于将消融子样本在接收器上的位置与消融事件和样本载玻片上的相关目标区域相关联的示例性方法；
[0031]
图10以图形方式示出了示例成像/消融装置操作模式，其中样本的矩形xy区域被扫描和消融；以及
[0032]
图11以图形方式示出了成像/消融装置操作模式的示例，该模式可用于通过动态
地调整所施加的激光脉冲的位置和脉冲能量水平来移除上覆相关目标区域的一层组织、介质或其他阻碍材料。
具体实施方式
[0033]
引言
[0034]
在详细描述本公开的各种实施例之前，应理解，本公开不限于特别示例的系统、方法、设备、产物、工艺和/或试剂盒的参数，所述参数理所当然地可以变化。因此，虽然将参考特定配置、参数、部件、元件等来详细描述本公开的某些实施例，但是所述描述为说明性的，并且不应被解释为限制所要求保护的发明的范围。另外，本文中所用的术语是出于描述实施例的目的，且不一定意图限制所要求保护的发明的范围。
[0035]
此外，应理解，对于本文中描述的任何给定部件或实施例，除非隐含地或明确地另有理解或陈述，否则针对所述部件列出的任何可能候选或替代方案通常可以个别地使用或彼此结合使用。另外，将理解，除非另外隐含地或明确地理解或陈述，否则此类候选或替代方案的任何列表仅是说明性的，而不是限制性的。
[0036]
另外，除非另外指示，否则在说明书和权利要求书中所使用的表达数量、构成、距离或其他度量的数字应被理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可根据寻求通过本文提出的主题获得的期望特性而改变的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。尽管阐述本文呈现的主题的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告特定示例中阐述的数值。然而，任何数值固有地含有某些必然因其相应测试测量值中存在的标准偏差所致的误差。
[0037]
本文所使用的标题和小标题只是出于组织目的，而不意图用于限制本说明书或权利要求书的范围。
[0038]
图1示出了常规laesi系统60。如图所示，激光40被引导至设置在样本载玻片30上的样本10。激光40被调谐以引起样本10的一部分的消融，导致在与激光传播方向相反的方向上向上传播的消融羽流20。电喷雾探针50设置在样本载玻片30上方，在样本载玻片30和激光40穿过的光学器件之间的高度处。电喷雾探针50跨消融羽流20的路径发射电喷雾液滴52。这些液滴52中的一些将与消融羽流20的液滴相互作用以形成电离样本液滴54。质谱仪入口56通常与电喷雾探针50对齐并且定位成接收一些电离样本液滴54用于分析。
[0039]
尽管诸如系统60之类的常规laesi系统能够收集和分析样本10的消融部分，但存在若干限制。特别地，固有的空间限制严重限制了激光40可以应用于样本10的分辨率，这意味着光斑尺寸相对较大，通常比全细胞大得多。为了使电喷雾液滴52流穿过消融羽流20，电喷雾探针50和质谱仪入口56必须定位在样本载玻片30和激光40传播通过的光学组件之间。这限制了系统的聚焦潜力，并使光学器件的na小于理想na。除了空间限制之外，还可能需要光学器件通过电喷雾液滴52流聚焦以聚焦在样本10上。
[0040]
这种常规laesi系统60的另一缺点是激光40的传播方向(即，激光的k矢量)与消融羽流20必须行进的方向相反地延伸，以到达电喷雾液滴52的交叉路径。这降低了将消融材料输送到质谱仪入口56的效率。此外，部件的空间定位意味着来自消融羽流20的碎屑会弄
脏光学器件和其他上覆部件，进一步降低系统的性能并增加清洁和/或部件更换的操作成本。
[0041]
成像和消融系统概述
[0042]
图2示出了用于对样本进行成像和消融的系统100的示意图。所示的系统100可以改进如上所述的常规laesi系统60的一个或多个限制。系统100包含成像/消融装置110。成像/消融装置110包含光学组件112、样本台114和接收器116。如图所示，光学组件112设置在样本台114下方的倒置位置，使得光向上传播通过光学组件112并进入样本台114。
[0043]
在操作中，光形式成像和/或消融穿过光学组件112，然后穿过样本台114并进入定位在样本台114上的样本10(例如，在本身定位在样本台114上的样本载玻片上)。相同的光学组件112可用于样本10的成像和样本10内的相关目标区域的消融。在消融期间，以样本10内的相关区域为目标，并且将激光引导通过光学组件112并进入相关区域。可以调谐定向激光以使相关区域消融并形成从样本台114向接收器116延伸的消融羽流20。接收器116定位在样本台114上方，使得可以在接收器116处捕获延伸的消融羽流20的至少一部分。样本台114、接收器116或两者可以包含允许它们在至少两个轴向方向上、优选地在所有三个轴向方向上选择性地移动的定位系统。
[0044]
与常规laesi系统60相比，示出的成像/消融装置110提供了处于倒置位置的光学组件112。这有益地提供了相对于样本台114定位光学组件112的更大自由度，允许使用更高的na光学器件。反过来，更高的na光学器件能够聚焦于较小的相关区域和较小的消融光斑尺寸。如下文更详细阐述的，一些实施例可以实现亚细胞水平的消融光斑尺寸。
[0045]
示出的成像/消融装置110还配置成将激光引导到消融羽流20延伸的方向。在所示的成像/消融装置110中，消融羽流20旨在与传播激光在相同的方向上延伸，而不是像在常规laesi系统60中那样与其相反。所示的成像/消融装置110因此能够提供消融样本材料到接收器116的有效转移，而不需要消融羽流20与传播激光的方向相反地行进。
[0046]
此外，所示的成像/消融装置110的配置将光学组件112从延伸的消融羽流20的路径中移除。这有益地限制了由消融碎屑接触或聚集在光学组件112上导致的光学损害和/或部件损坏。
[0047]
接收器116可以配置成在空间和/或时间上区分接收到的消融材料的各个子样本(即，分别对应于每个消融事件的材料)。在一些实施例中，接收器116包含配置成用于各个子样本的空间区分的介质，诸如微孔板或纳米液滴阵列。这样的介质允许对收集的和空间区分的子样本进行后续分析，诸如消融材料内的核酸的pcr或消融材料内的核酸测序。
[0048]
接收器116可以附加地或替代地包含电喷雾探针。电喷雾探针可用于生成电离样本液滴以输送到质谱仪入口。接收器116也可以配置为溶剂润湿的表面。溶剂可以具有使得接收的消融子样本基于时间上它们被消融和接收的时间在空间上被区分的流速。
[0049]
在一些实施例中，电喷雾探针和润湿表面结合。例如，如下文更详细阐述的，电喷雾探针可以部分地设置在毛细管内，具有从毛细管伸出并终止于尖端的暴露的远端部分。暴露的远端部分被定位成接收来自样本台的消融子样本(即，位于样本台上方)。毛细管构造成将溶剂施加到电喷雾探针的外表面，使得溶剂沿着暴露的远端部分的外表面流向电喷雾探针的尖端。以这种方式，当消融的子样本被暴露的远端部分捕获时，它们然后流向探针的尖端，在那里它们被电离并输送到质谱仪入口。
[0050]
接收器116，特别是接收器的最初接触和接收消融羽流20的部分，可以与样本台的上表面间隔开约1mm或更小、或约500μm或更小、或约350μm或更小、或约250μm或更小、或约200μm或更小、或约150μm或更小的距离。已发现上述范围内的尺寸可通过接收器有效收集消融材料。
[0051]
样本和接收器116最初接收消融羽流20的部分之间的距离也可以被调整以提供消融材料到接收器116的有效转移。消融材料将以动能(与速度成二次方)从样本中置换出来，但会经历使材料减速并移除动能的阻力(与速度成二次方)。所有动能将在约为l的距离内被移除：
[0052][0053]
其中h是样本消融部分的厚度/高度，ρs是样本密度，ρg是气体密度，c是阻力系数(通常约为1)。通常，l算出约为700h。样本的上表面和接收器之间的距离因此优选地小于l，或者换句话说，优选地小于样本的消融部分的高度的约700倍。
[0054]
在一些实施例中，成像/消融装置110包含培养容器(未示出)，其在尺寸和形状上配置为设置在样本台114和接收器116之间，并配置成为放置在样本台114上的样本10提供培养环境。
[0055]
所示的系统100还可以包含上游处理器120，其配置成在将样本定位在样本台114上之前对样本进行分选、空间定向和/或以其他方式处理样本。例如，上游处理器120可以包含用于将细胞或其他样本部件分选到样本载玻片上的分选装置，诸如电动液滴分选器，该样本载玻片配置成用于随后放置在样本台114上。上游处理器120可以附加地或替代地包含离心机，诸如cytospin
tm
离心机。离心机可以配置成例如将细胞悬浮液旋转到载玻片上，载玻片配置成用于随后放置在样本台114上。如本领域已知的用于分选和定位样本和/或细胞的其他上游处理部件可以附加地或替代地包含在上游处理器120中。
[0056]
上游处理器的一个示例是如图3所示的电动液滴分选器220。一系列液滴11可以传递到偏转器222(例如，一个或多个电极)附近，该偏转器用于选择性地偏转相关液滴，诸如含有细胞12的液滴。细胞12可被引导至定位在响应台213上的成像载玻片215。随着额外的液滴被分选到载玻片215上，响应台213可以顺序移动以在载玻片215上提供空间。载玻片215可以具有参考标记，允许参考各个分选液滴的空间位置。照相机224允许记录各个分选液滴的位置，该位置也可以与液滴流数据相关联(例如，指示何时从液滴流中分选每个单独分选液滴的定时数据)。
[0057]
诸如图2所示，在已将所需数量的液滴分选到载玻片215上之后，载玻片215可被转移到样本台114。由照相机224记录的载玻片215上的各个分选液滴的位置可以与使用成像/消融装置110获得的图像相关联。因此，消融子样本可以追溯到使用成像/消融装置110获得的图像，然后回到载玻片215上的空间位置，并最终回到液滴流数据。
[0058]
附加的或替代的上游处理操作可以包含将细胞固定到载玻片上。然而，如上所述，本文所述的系统、装置和方法能够在环境条件下执行活细胞的成像和消融，因此固定细胞不是必要的预处理步骤。其他附加的或替代的上游处理操作可以包含对样本进行染色和/或将标签添加到样本。
[0059]
再次参考图2，所示的系统100还可以包含下游分析器130，其配置成从接收器116
接收消融样本以进行进一步分析。下游分析器130可以包含例如pcr机器、测序机器、光谱仪、质谱仪或其组合。可以附加地或替代地包含本领域已知的其他生物分子分析装置。在包含质谱仪的情况下，分析器130可以包含例如飞行时间(tof)质谱仪、轨道阱质谱仪、线性离子阱质谱仪、四极质谱仪、四极离子阱质谱仪、扇形磁质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振(fticr)质谱仪中的一种或多种。
[0060]
所示的系统100还可以包含控制器140，该控制器通信地联接到系统的其他部件中的一个或多个，以提供系统100的控制和/或反馈。控制器140包含一个或多个处理器142、存储器144(例如，在一个或多个硬件存储装置上)和通信模块146(用于控制控制器与系统100的与控制器140联接的各种部件之间的数据发送和接收)。控制器140还可以包含本领域已知的用于接收来自用户的输入和/或用于向用户显示信息的输入/输出硬件148。
[0061]
下面描述与系统100有关的附加细节和实施例。应当理解，下面描述的实施例可以以任何组合提供并且与如上所述的整个系统100结合使用。在下面描述的实施例中，相似的数字可以用来指代相似的部件。
[0062]
光学组件
[0063]
图4示意性地示出了可以在诸如如上所述的系统100的成像和消融系统中使用的光学组件312的一个示例。在一些实施例中，光学组件312配置成提供落射荧光成像。光学组件312可以包含物镜318，其优选地具有约0.5或更大、或约0.65或更大、或约0.75或更大、或约0.8或更大的na。光学组件312还包含成像光源356、消融光源354(即，激光源354)和照相机352(例如，电荷耦合装置(ccd)照相机)。
[0064]
光学组件312还可以包含一个或多个二向色分束器/反射镜，诸如二向色镜355和357。例如，二向色镜357配置成将来自成像光源356的激发光或其一部分反射向物镜318，并允许样本发射回物镜318的发射光通过。然后发射的光可以被二向色镜355反射向照相机352。一个或多个滤光片也可以沿光路定位，以便根据特定应用需要过滤/阻挡源光和/或反射的激发光。例如，一个或多个激发滤光片可用于抑制来自激发光源的不想要的背景，一个或多个发射滤光片可用于抑制从样本和/或其他已知的所需滤光元件发出的不想要的荧光背景。二向色镜355还可用于允许来自消融光源354的消融光朝向物镜318通过。也可以包含一个或多个反射镜/滤光片353，用于沿着源354和物镜318之间的光路操纵激光。
[0065]
例如，成像光源356可以包含氙弧灯、汞气灯或led。消融光源354优选地包含红外激光器(例如，近红外或“nir”)。激光器还优选地是飞秒激光器。激光器还可以配置成使用物镜318实现双光子成像。消融光源354可以附加于光源356或作为该光源的替代物用于成像目的以及用于消融。例如，如下所述，nir源可以在低脉冲能量下用于获得成像信息并且在高脉冲能量下用于消融。
[0066]
特别是与使用紫外(uv)光相比，使用来自消融光源354的nir对于预期的消融操作可能是特别有利的。例如，消融光与目标生物样本的有意义的相互作用受限于光在生物材料结构处(例如，膜、细胞核、囊泡等处的折射率变化)的散射。这会导致信息丢失，并且难以以有意义的方式将目标信息集中在检测器上。所施加的消融光还将受到生物结构上的相移和损失以及生物结构对光的吸收的影响。因为这些限制主要是所施加光的波长的函数，所以当使用nir光时限制会更加宽松。因此，将消融光源354配置为nir源与作为uv应用(诸如uv maldi应用)相比具有更好的分辨率和样本穿透深度。
[0067]
此外，为了通过定位实现优于约20nm的超分辨率，一个被限制为典型固定生物样本厚度的约1μm的穿透深度。对于标准可见(vis)范围分辨率或约250nm，穿透深度最大约为10μm至20μm。在nir的情况下，双光子激发的穿透深度要高得多，诸如高达约100μm。因此，nir的使用有利地允许更深的穿透到目标样本组织中，并且甚至能够对相对复杂的组织(例如，脑)进行消融。增强的深度穿透和分辨率还增加了剩余材料在激光操作后存活和/或保留结构信息的机会。此外，虽然较厚样本的成像在vis范围内是不可行的，但使用低nir脉冲能量的双光子成像有利地允许在更大深度进行成像，因此允许更好的体积信息。
[0068]
尽管在本文示出了示例性光学系统312，但应当理解，用于成像和/或消融的其他光学部件，包含其他二向色镜、滤光片、反射镜、光源、照相机和/或本领域已知的其他光学部件，可以附加地或替代地包含以提供其他成像方式。光学组件312也可以配置成，例如，实现明场成像和/或切片(例如，使用共焦成像部件)。本文所述的光学组件可以配置成为成像和消融中的每一个提供独立的焦点控制。即，可以包含一个或多个自适应光学组件以提供例如对给定成像视场内的消融光斑尺寸的动态控制。
[0069]
当用于消融相关区域时，激光器可以配置为对于给定的1μm x 1μm x 2μm体素递送约1nj到约20μj的脉冲能量。更大的相关区域能够吸收更多的能量，因此能够承受更大的绝对脉冲能量。换言之，激光器可以配置成每μm3递送约0.5nj/至约10μj的脉冲能量。
[0070]
10μj/μm3上限表示在预期过度发生碎裂和电离之前的上限，因此表示希望保留相关消融区域的上限。然而，如下文更详细阐述的，在一些实施方式中，可能期望通过递送一个或多个高于10μj/μm3上限的脉冲来使目标区域碎裂/电离。简而言之，例如，可能需要将激光聚焦在细胞内相关区域上方的大量介质上，并在随后消融细胞内相关区域之前吹掉上覆介质。这个过程可以为相关消融区域从样本台行进到接收器提供更大的间隙(参见对应于图11的相关论述)。
[0071]
如上所述，本文所述的成像/消融装置有利地能够把相对较小的相关区域作为目标。例如，光学组件可以配置成提供约50μm或更小、或约30μm或更小、或约10μm或更小、或约5μm或更小、或约3μm或更小、或约1.5μm或更小、或约1μm或更小的目标区域的光斑尺寸直径。就体积而言，光学组件可以配置为消融约500μm3或更小、约250μm3或更小、约100μm3或更小、约50μm3或更小、约25μm3或更小、约10μm3或更小、约5μm3或更小、或约2μm3或更小的目标区域。
[0072]
在一些实施方式中，光学组件可以配置成消融全细胞或多个细胞的集合。在其他实施方式中，光学组件可配置成用于消融亚细胞尺寸的目标区域，诸如特定细胞器或其他细胞内区域、或特定细胞外区域。
[0073]
消融样本接收器
[0074]
图5示出了接收器416的示例，该接收器包含空间区分介质，诸如微孔板、微孔芯片、纳米液滴阵列或能够接收各个消融子样本并将单独的子样本保持在不同的、空间分离的隔室中的其他结构。接收器416可以附接到接收器台417，该接收器台能够选择性地在至少两个轴向上移动，更优选地在所有三个轴向上移动。
[0075]
如上面关于其他实施例所述，光学组件412配置成提供放置在样本台414上的样本10的成像和/或消融。在消融期间，产生的消融羽流20向上朝向接收器416延伸，在该接收器处它被收集并在空间上与其他消融子样本区分开来。当已经收集到所需数量的子样本时，
或当接收器416已满时，可将其从接收器台417移除并传递到分析器以对所收集子样本进行进一步处理和/或分析。
[0076]
图6a示出了接收器516配置成纳米液滴阵列的特定实施例。与其他实施例一样，光学组件512配置成提供放置在样本台514上的样本10的成像和/或消融。在消融期间，产生的消融羽流20向上朝向接收器516延伸，在该接收器处它可以被收集到相应的纳米液滴519或一系列这样的纳米液滴519中。单独的纳米液滴519因此形成单独的隔室，其用于在空间上将不同的消融子样本与单独的消融事件分开。如上所述，当已收集到所需数量的子样本时，或当接收器516已满时，可将其从接收器台移除并传递至分析器以对所收集子样本进行进一步处理和/或分析。
[0077]
图6b示出了用于形成诸如包含在接收器516中的纳米液滴阵列的示例性过程。声换能器562可用于施加声能以分离条形码阵列560中的条形码溶液。所得纳米液滴从条形码阵列560输送到上覆载玻片515。纳米液滴519可以包含不同的条形码并且因此准备好用于随后分析由纳米液滴捕获的消融子样本，诸如随后的pcr或捕获的核酸的测序。条形码可以与载玻片515上纳米液滴519的空间位置相关。
[0078]
图7示出了包含电喷雾探针670的接收器616的实施例。这种类型的接收器对于生成包含消融子样本的电离液滴可能特别有用，以便通过质谱法进行分析。电喷雾探针670穿过毛细管674。探针670的暴露的远端部分676延伸超出毛细管674的远端。溶剂672设置在毛细管674内并流出以润湿暴露的远端部分676的表面。毛细管674配置成施加溶剂672，使得溶剂672沿着暴露的远端部分676的外表面流向电喷雾探针670的尖端。电喷雾探针670的尖端形成电喷雾液滴并将它们引向质谱仪入口678。溶剂可以包含例如水和/或一种或多种挥发性有机化合物，诸如甲醇、乙腈、乙酸等。
[0079]
如图所示，暴露的远端部分676的润湿表面可以定位在消融羽流20上方，使得在使用光学组件612对样本10进行消融期间将消融子样本收集在润湿表面上。样本台614和接收器台617的定位系统可以协调以将消融羽流20与暴露的远端部分676对齐。可根据消融频率控制溶剂672的流速以确保由流动溶剂672在暴露的远端部分676的润湿表面上捕获的连续子样本的有效空间分离。
[0080]
与电离相对小部分消融材料的常规laesi系统相比，已发现所示配置能够以约20％或更多、约35％或更多、约50％或更多、约65％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多、或约99％或更多的效率电离消融材料。
[0081]
消融样本分析器
[0082]
如上所述，下游分析器可用于进一步处理和/或分析接收器收集的消融子样本。取决于所需的处理和/或分析的类型，下游分析器可以包含一个或多个，例如pcr机器、测序机器、光谱仪、核磁共振(nmr)光谱仪、质谱仪、色谱装置、离心机、电泳装置、放射性标记和放射性标签检测装置、其他分析生化装置或其组合。
[0083]
在包含质谱仪的情况下，分析器可以包含例如飞行时间(tof)质谱仪、轨道阱质谱仪、线性离子阱质谱仪、四极质谱仪、四极离子阱质谱仪、扇形磁质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振(fticr)质谱仪中的一种或多种。
[0084]
在使用测序的情况下，测序机器可以配置为执行下一代测序(ngs)，有时也称为高通量测序。合适的测序方式包含454焦磷酸测序、离子激流测序、纳米孔测序、合成测序(即
illumina测序)和/或本领域已知或将开发的其他测序方法。也可以使用更常规的链终止方法(例如，sanger测序)。
[0085]
图8示出了下游过程的一个示例，其中一种或多种试剂可以添加到接收器716的空间分离的隔室(本示例中的纳米液滴719)中。可以添加一种或多种试剂以进行例如细胞裂解、蛋白质提取、还原、烷基化、分解和/或其他所需的反应以制备所收集子样本。
[0086]
图8还示出了子样本可以附加地或替代地转移到液相色谱质谱(lc ms)系统。例如，子样本可以传递到液相色谱柱780，该色谱柱联接到电喷雾探针770，用于将电离样本传递到质谱仪730。
[0087]
操作模式
[0088]
本文所述的装置和系统可以配置成执行各种成像和/或消融过程。图9示出了用于将消融子样本在接收器上的位置与消融事件和样本载玻片上的相关目标区域相关联的示例性方法800。如上所述，样本载玻片上的相关区域可以进一步与上游分选/流动数据相关联(参见例如图3和相关描述)。方法800可以使用通信地联接到系统的某些部件的控制器来执行，诸如上面关于系统100描述的控制器140。
[0089]
在所示方法中，控制器可以首先使用样本的所收集图像数据记录相关区域的空间位置(步骤810)。例如，可以使用明场成像、切片、落射荧光成像和/或双光子成像中的一种或多种来完成成像。此外，可以使用相同的物镜来完成成像，消融激光脉冲随后穿过该物镜用于对相关目标区域进行消融。
[0090]
控制器然后可以将相关区域的空间位置与导致相关区域的至少一部分消融的消融事件相关联，消融事件形成将来自相关区域的消融材料的消融子样本携带到接收器的消融羽流(步骤820)。因此，该步骤可以将消融事件的时间信息与样本载玻片上相关区域的空间位置相关联。
[0091]
然后控制器可以记录消融子样本在接收器上的位置(步骤830)，然后将消融事件与消融子样本在接收器上的位置相关联，消融子样本在接收器上的位置由此与消融事件和相关区域的空间位置均相关联(步骤840)。因此，这些步骤可以使接收器上的消融子样本的空间位置与消融事件的对应时间信息和样本载玻片上相关区域的空间位置相关联。因此，该组相关性允许随后将子样本数据追溯回导致子样本数据的对应时间事件和空间位置。
[0092]
在消融期间，激光脉冲频率、激光脉冲能量水平和激光脉冲深度可以独立变化以提供所需的操作能力。例如，在标准实施方式中，单个脉冲可以指向固定的焦点位置。可选择脉冲能量以优化消融，优化羽流形成和/或使转移子样本的损害最小化。
[0093]
在其他实施方式中，所施加的激光脉冲的深度和/或脉冲能量水平可以动态地变化以提供期望的效果。图10以图形方式示出了一种示例性操作模式，其中矩形xy区域被扫描和消融。可以调谐激光脉冲频率以平衡停留时间和脉冲到脉冲的重叠。这种类型的实施方式可以用于以空间协调的方式消融整个结构(例如，细胞内的各种细胞器)或其所需部分。请注意，沿图表的轴的单位仅用于说明目的，不一定是明确的比例。
[0094]
图11以图形方式示出了可以在有一层组织、介质或其他阻碍材料上覆相关目标区域的情况下使用的操作模式的另一个示例。“z驱动”线表示所施加的激光脉冲沿轴向/竖直通道(即沿z轴)的移动。“焦点位置”线表示相关目标区域所在的深度。如图所示，上层最初会经历更高能量的激光脉冲，这些激光脉冲可以被更好地调整以用于移除上覆材料并打开
轴向通道。一旦动态移动的激光脉冲到达相关区域的深度，激光脉冲能量水平可以降低到更适合于消融相关区域的水平。然后，在形成的通道在相关区域上破裂之前，消融材料可以离开样本并朝向接收器行进。请注意，沿图表的轴的单位仅用于说明目的，不一定是明确的比例。
[0095]
如图11所示的操作模式可以有利地允许消融从上表面测量的样本内稍微较深的目标区域。例如，在不首先移除一些上覆材料的情况下，在某些情况下，消融可能仅限于样本的上部2μm至10μm，因为需要通过任何剩余的上覆材料将产生的羽流向上输送到接收器。动态地配置诸如图11中的操作模式可以移除或减少上覆组织的数量，因此允许来自更深相关区域的消融羽流有效地输送到接收器。
[0096]
如本文所述的成像和消融装置也可以操作以将消融激光聚焦在距样本上表面与空间分辨率值相关联的深度处(即，样本上仍可区分的两点之间的最短距离)。也就是说，当所需的空间分辨率值较小时，消融激光聚焦的最大深度也更小，当所需和/或使用的空间分辨率值较大时，消融激光聚焦的最大深度也更大。这种方法允许在有效把相关区域作为目标所需的空间分辨率值足够大的情况下获得更大的聚焦深度，但在所需空间分辨率值较小的情况下限制聚焦深度，由此增加产生的消融羽流能够成功地从样本输送到接收器的可能性。
[0097]
例如，消融激光可以聚焦在从样本上表面测量的不超过空间分辨率的r倍的深度，其中r是约5至约30的值，诸如约10、15、20或25的值。然而，应当理解，大于由r值规定的深度可以在至少一些应用中被消融，诸如在使用动态激光操作的情况下，如图11所示的操作。
[0098]
设置在样本的底表面和激光焦点之间的样本的至少一部分可以保持未消融。因此，特定深度处的特定子样本体积可以以允许将所产生的消融羽流成功输送到接收器的方式作为消融的目标。
[0099]
计算机/控制器系统
[0100]
应了解，计算机系统越来越多地采取各种各样的形式。在本说明书中和在权利要求书中，术语“控制器”、“计算机系统”或“计算系统”广泛地定义为包含任何装置或系统或其组合，其包含至少一个物理和有形处理器和能够在其上具有可由处理器执行的计算机可执行指令的物理和有形存储器。作为示例而非限制，如本文中所使用的术语“计算机系统”或“计算系统”意图包含个人计算机、台式计算机、膝上型计算机、平板电脑、手持型装置(例如，移动电话、pda、寻呼机)、基于微处理器的或可编程的消费电子产品、微型计算机、大型计算机、多处理器系统、网络pc、分布式计算系统、数据中心、消息处理器、路由器、交换机和甚至常规上尚未认为是计算系统的装置，诸如可穿戴物(例如，眼镜)。
[0101]
存储器可采取任何形式，且可取决于计算系统的性质和形式。存储器可以是物理系统存储器，其包含易失性存储器、非易失性存储器或两者的某一组合。术语“存储器”在本文中还可用于指代非易失性大容量存储装置，诸如物理存储介质。
[0102]
计算系统在其上还具有通常称为“可执行部件”的多个结构。例如，计算系统的存储器可以包含可执行部件。术语“可执行部件”是计算领域的普通技术人员充分理解为可以是软件、硬件或其组合的结构的结构的名称。
[0103]
例如，当在软件中实施时，本领域普通技术人员将理解，可执行部件的结构可以包含可由计算系统上的一个或多个处理器执行的软件对象、例程、方法等等，无论这种可执行
部件是否存在于计算系统的堆中，或可执行部件是否存在于计算机可读存储介质上。可执行部件的结构以这种形式存在于计算机可读介质上，使得其在由计算系统的一个或多个处理器执行时可操作以使计算系统进行一个或多个功能，诸如本文中所描述的功能和方法。这种结构可以是由处理器直接计算机可读的——如同可执行部件是二进制的情况一样。替代地，结构可构造成可解译和/或编译的(无论是在单个级中还是在多个级中)，以便生成可由处理器直接解译的这种二进制。
[0104]
术语“可执行部件”也由普通技术人员很好地理解为包含专用或接近专用地在硬件逻辑部件中实施的结构，诸如在现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)、程序专用标准产品(assp)、片上系统(soc)、复杂可编程逻辑装置(cpld)或任何其他专用电路内。因此，术语“可执行部件”是用于计算领域的普通技术人员很好地理解的结构的术语，无论是在软件、硬件还是其组合中实施。
[0105]
术语“部件”、“服务”、“引擎”、“模块”、“控制”、“发生器”或其类似物也可用于本说明书中。如在本说明书中和在这种情况下所使用的，这些术语——无论是用修改子句还是不用修改子句来表达——也意图与术语“可执行部件”同义，且因此也具有由计算领域的普通技术人员很好地理解的结构。
[0106]
虽然不是所有的计算系统都需要用户接口，但在一些实施例中，计算系统包含用于传达来自用户的信息/向用户传达信息的用户接口。用户接口可以包含输出机构以及输入机构。本文中所描述的原理不限于精确的输出机构或输入机构，因为这将取决于装置的性质。然而，输出机构可以包含例如扬声器、显示器、触觉输出、投影、全息图等等。输入机构的示例可以包含例如麦克风、触摸屏、投影、全息图、照相机、键盘、触控笔、鼠标或其他指针输入、任何类型的传感器等等。
[0107]
因此，本文中所描述的实施例可以包括或利用专用或通用计算系统。本文中所描述的实施例还包含物理和其他计算机可读介质，用于携带或存储计算机可执行指令和/或数据结构。这种计算机可读介质可以是可由通用或专用计算系统存取的任何可用介质。存储计算机可执行指令的计算机可读介质是物理存储介质。携带计算机可执行指令的计算机可读介质是输送介质。因此，作为示例而非限制，本文中所公开或设想的实施例可以包括至少两种明显不同种类的计算机可读介质：存储介质和输送介质。
[0108]
计算机可读存储介质包含ram、rom、eeprom、固态驱动器(“ssd”)、闪存、相变存储器(“pcm”)、cd-rom或其他光盘存储、磁盘存储或其他磁性存储装置，或可用于存储呈计算机可执行指令或数据结构形式的所需程序代码且可由通用或专用计算系统存取和执行以实施本发明的所公开功能性的任何其他物理和有形存储介质。例如，计算机可执行指令可体现在一个或多个计算机可读存储介质上以形成计算机程序产品。
[0109]
输送介质可以包含网络和/或数据链路，所述网络和/或数据链路可用于携带呈计算机可执行指令或数据结构形式的所需程序代码，且可由通用或专用计算系统存取和执行。上述的组合也应包含在计算机可读介质的范围内。
[0110]
另外，在到达各种计算系统部件时，可将呈计算机可执行指令或数据结构形式的程序代码从输送介质自动转移到存储介质(或反之亦然)。例如，通过网络或数据链路接收到的计算机可执行指令或数据结构可在网络接口模块(例如，“nic”)内的ram中缓冲，且接着最终转移到计算系统ram和/或计算系统处的较不易失性存储介质。因此，应理解，存储介
质可以包含在也利用或甚至主要利用输送介质的计算系统部件中。
[0111]
本领域的技术人员将进一步了解，计算系统还可含有允许计算系统通过例如网络与其他计算系统通信的通信信道。因此，本文中所描述的方法可在具有许多类型的计算系统和计算系统配置的网络计算环境中实践。所公开的方法还可在分布式系统环境中实践，其中通过网络(通过硬连线数据链路、无线数据链路或通过硬连线和无线数据链路的组合)链接的本地和/或远程计算系统都进行任务。在分布式系统环境中，处理、存储器和/或存储能力也可以是分布式的。
[0112]
本领域的技术人员还将了解，所公开的方法可在云计算环境中实践。云计算环境可以是分布式的，但这不是必需的。当分布时，云计算环境可在组织内国际分布和/或具有跨多个组织拥有的部件。在本说明书和所附权利要求书中，“云计算”定义为用于实现对可配置计算资源(例如，网络、服务器、存储装置、应用和服务)的共享池的按需网络访问的模型。“云计算”的定义不限于当适当部署时可从这种模型获得的其他众多优点中的任一个。
[0113]
云计算模型可由各种特性构成，诸如按需自助服务、广泛网络访问、资源池、快速弹性、测量的服务等等。云计算模型还可以各种服务模型的形式出现，诸如例如软件即服务(“saas”)、平台即服务(“paas”)和基础设施即服务(“iaas”)。云计算模型还可使用诸如私有云、社区云、公共云、混合云等等的不同部署模型来部署。
[0114]
所定义术语的缩写列表
[0115]
为了辅助理解本书面描述和所附权利要求书的范围和内容，下文直接定义了选择的几个术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
[0116]
如本文中所使用的术语“大约”、“约”和“大体上”表示接近仍进行所需功能或实现所需结果的具体陈述的量或条件的量或条件。例如，术语“大约”、“约”和“大体上”可指偏离具体陈述的量或条件小于10％，或小于5％，或小于1％，或小于0.1％，或小于0.01％的量或条件。
[0117]
如本文所用，术语“消融”是指将能量选择性地施加到目标区域，以便将目标区域内的生物分子从周围结构中释放出来。消融的材料通常会形成远离目标区域初始位置行进的材料“羽流”。
[0118]
如本文所用，术语“相关区域”旨在被理解为成像/消融装置的视野内的任何区域，其中存在需要收集、处理和/或分析的一个或多个生物分子。相关区域可以包含整个视场，但更典型地是视场的一部分并且可以是例如细胞或细胞集合、细胞内/亚细胞区域，诸如细胞内的细胞器，或细胞外区域。
[0119]
如本文所用，术语“子样本”旨在指在空间和/或时间上彼此分离的消融材料的各个部分，诸如通过在接收器上彼此空间分离和/或通过在不同时间由接收器从不同消融事件接收。因此，术语子样本旨在将所收集的消融材料的单独部分与较大的整体“样本”区分开来，该样本位于可以成像和选择性消融的载玻片/台上。
[0120]
可参考本质上是示范性的一个或多个实施例或实施例来说明本公开的各种方面，包含装置、系统和方法。如本文中所使用，术语“示范性”意味着“充当示例、例子或说明”，且未必应解释为相比本文中所公开的其他实施例为优选的或有利的。此外，对本公开或本发明的“实施例”的引用包含对其一个或多个实施例的具体引用，且反之亦然，且所述引用意
图提供说明性示例而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书而不是以下描述指示。
[0121]
如说明书中所使用，以单数出现的词语涵盖其复数对应物，且以复数出现的词语涵盖其单数对应物，除非以其他方式隐含地或明确地理解或陈述。因此，应注意，除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。例如，对单数指代物(例如，“小部件”)的引用包含一个、两个或更多个指代物，除非以其他方式隐含地或明确地理解或陈述。类似地，除非内容和/或上下文清楚地规定，否则对多个指代物的引用应解释为包括单个指代物和/或多个指代物。例如，对复数形式的指代物(例如，“小部件”)的引用不一定需要多个这种指代物。相反，应了解，除非另有说明，否则独立于所推断的指代物的数目，在本文中设想了一个或多个指代物。
[0122]
如本文中所使用，诸如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“近侧”、“远侧”、“相邻”和其类似物的方向术语在本文中仅用于指示相对方向，且不意图以其他方式限制本公开和/或所要求保护的发明的范围。
[0123]
结论
[0124]
本文中已采用的术语和表达用作描述性术语而非限制，且在使用这种术语和表达时不意图排除所展示和描述的特征或其部分的任何等效物，而是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应理解，虽然本发明已通过优选实施例、示范性实施例和任选特征进行特别地公开，但本领域的技术人员可对本文中所公开的概念进行修改和改变，且这种修改和改变视为在由所附权利要求书限定的本发明范围内。本文中所提供的具体实施例是本发明的有用实施例的示例，且可在不脱离由权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下对所说明实施例作出本文中所说明的发明特征的各种更改和/或修改和相关领域的技术人员将想到的且拥有本公开的本文中所说明的原理的额外应用，且这些视为在本公开的范围内。
[0125]
还应了解，根据本公开的某些实施例的系统、装置、产品、套件、方法和/或过程可以包含、并入或以其他方式包含本文中所公开和/或描述的其他实施例中所描述的性质或特征(例如，部件、构件、元件、零件和/或部分)。因此，某些实施例的各种特征可与本公开的其他实施例兼容、组合、包含在本公开的其他实施例中和/或并入本公开的其他实施例中。因此，相对于本公开的特定实施例的某些特征的公开不应解释为将所述特征的应用或包含限制于特定实施例。相反，应了解，在不一定脱离本公开的范围的情况下，其他实施例还可以包含所述特征、构件、元件、零件和/或部分。
[0126]
此外，除非特征描述为需要与其组合的另一特征，否则本文中的任何特征可与本文中所公开的相同或不同实施例的任何其他特征组合。此外，为了避免混淆示例实施例的各方面，本文中未特别详细地描述说明性系统、方法、装置和其类似物的各种众所周知的方面。然而，这种方面在本文中也是设想的。
[0127]
本技术中列举的所有参考文献在不与本技术中的公开不一致的程度上特此通过引用以其全文并入。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，除了本文中具体描述的那些之外的方法、装置、装置元件、材料、程序和技术可应用于如本文中广泛公开的本发明的实践，而无需借助过度实验。本文中具体描述的方法、装置、装置元件、材料、程序和技术的
所有本领域已知的功能等效物意图由本发明涵盖。
[0128]
当本文中公开材料、组合物、组分或化合物的群组时，应理解，那些群组的所有个别成员和其所有子群组是分开公开的。当在本文中使用马库什(markush)群组或其他分组时，所述群组的所有个别成员和所述群组的所有可能组合和子组合意图个别地包含于本公开中。除非另有说明，否则本文中所描述或示范的每种制剂或组分的组合可用于实践本发明。每当在说明书中给出例如温度范围、时间范围或组成范围的范围时，所有中间范围和子范围以及包含在给出的范围中的所有个别值意图包含在本公开中。
[0129]
落入权利要求书的同等含义和范围内的所有改变均应涵盖在权利要求书的范围内。