表达嵌合抗原受体和嵌合刺激受体的细胞及其用途的制作方法

表达嵌合抗原受体和嵌合刺激受体的细胞及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月24日提交的美国临时申请号62/878,271、2019年7月29日提交的美国临时申请号62/879,629和2019年12月26日提交的美国临时申请号62/953,758的优先权，所述临时申请的公开内容出于所有目的以全文引用的方式据此并入。


背景技术：

3.其中将患者自身的t淋巴细胞工程化以表达嵌合抗原受体(car)的过继性t细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面已经显示出很大的前景，但在实体瘤中没有如此大的前景。另外，即使通常使用的共刺激片段诸如cd28或4-1bb(无论是以顺式表达还是以反式表达)，car本身也通常不是足够有效的，尤其是对于实体瘤。因此，需要更为有效且更长持续时间的t细胞免疫疗法。
4.cd30是受体蛋白质的tnf受体超家族的成员。在tnf受体家族成员之间的大部分同源性出现在细胞外结构域中，在细胞质结构域中几乎没有同源性。这表明tnf受体家族的不同成员可能利用不同的信号传导途径。与这种假设一致，tnf受体1型和fas已经显示通过称为死亡结构域的65个氨基酸结构域与一组细胞内信号传导分子相互作用，然而已经发现tnf受体2型和cd40与信号转导分子的肿瘤坏死因子受体相关因子(traf)家族的成员相关。
5.cd30的膜结合形式是120-kda的595个氨基酸的糖蛋白，其具有188个氨基酸的细胞质结构域。cd30与抗体或与cd30配体的交联在细胞中产生各种效应，包括在t细胞受体接合和nf-kb转录因子诱导后增强原代t细胞的增殖。cd30最初被鉴定为在霍奇金淋巴瘤细胞表面上表达的抗原。随后，显示cd30由具有激活表型的淋巴细胞、生发中心周围的细胞和cd45ro1(记忆)t细胞表达。cd30还可以在发展t辅助2型细胞中起作用。已经显示tnf受体家族成员4-1bb的t细胞激活特性涉及其细胞质结构域与酪氨酸激酶p56lck缔合的特定能力。cd30的细胞质结构域的序列显示与这些受体中的任何受体都几乎没有序列相似性；cd30缺乏明显的死亡结构域或p56lck结合位点。


技术实现要素：

6.除了其它方面，本发明提供了使用来自cd30的共刺激结构域(在本文中也称为cd30共刺激结构域)的嵌合刺激受体(csr)。如本文详细描述的，具有含有来自cd30的共刺激结构域的csr的t细胞表达比具有含有来自例如cd28或4-1bb的共刺激结构域的csr的t细胞少得多的pd-1(一种t细胞激活抑制剂)，并且同时展示出相等的细胞毒性潜力。在一些实施方案中，具有含有来自cd30的共刺激结构域的csr的t细胞表达比具有含有来自dap10的共刺激结构域的csr的t细胞少得多的pd-1。实例表明，如与通常使用的共刺激结构域(诸如cd28)相比，来自cd30的共刺激结构域改善了导致t细胞耗竭的功能无反应性(也称为应变力缺乏(anergy))，并且随后提供肿瘤细胞杀伤的优异持久性和增加的肿瘤浸润。由于cd30缺乏被认为对csr共刺激至关重要的p56lck结合位点，因此这是出乎意料的。
7.在一个方面，本公开的特征在于包含以下项的免疫细胞：(a)嵌合抗原受体(car)，
该car包含：(i)包含抗体部分(car抗体部分)的细胞外靶结合结构域；(ii)跨膜结构域(car跨膜结构域)；和(iii)初级信号传导结构域，以及(b)嵌合刺激受体(csr)，该csr包含：(i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；(ii)跨膜结构域(csr跨膜结构域)；和(iii)cd30共刺激结构域，其中该csr缺乏功能性初级信号传导结构域。
8.在一些实施方案中，cd30共刺激结构域包含可以与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列。在一些实施方案中，可以与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列对应于具有序列seq id no:65的全长cd30的残基561-573或578-586。在一些实施方案中，cd30共刺激结构域包含与seq id no:65的残基561-573或578-586至少80％、85％、90％、95％或100％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，cd30共刺激结构域包含与seq id no:75的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。
9.在这一方面的一些实施方案中，csr包含多于一个cd30共刺激结构域。在一些实施方案中，csr还包含至少一个共刺激结构域，该至少一个共刺激结构域包含与cd30不同的共刺激分子的细胞内序列。与cd30不同的共刺激分子可以选自由以下组成的组：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性地结合的配体和dap10。
10.在一些实施方案中，car还包含共刺激结构域(car共刺激结构域)。car共刺激结构域可以衍生自共刺激受体的细胞内结构域。共刺激受体可以选自由以下组成的组：cd30、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性地结合的配体和dap10。
11.在一些实施方案中，csr的配体结合模块衍生自受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，csr的配体结合模块包含抗体部分(csr抗体部分)。csr抗体部分可以是单链抗体片段。car抗体部分可以是单链抗体片段。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单链fv(scfv)、单链fab、单链fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异性抗体、细胞内抗体(intrabody)、纳米抗体(nanobody)或单链免疫因子(immunokine)。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单结构域多特异性抗体。在一些实施方案中，单结构域多特异性抗体是单结构域双特异性抗体。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单链fv(scfv)。在一些实施方案中，scfv为串联的scfv。
12.在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分与疾病相关抗原特异性地结合。疾病相关抗原是癌症相关抗原。疾病相关抗原是病毒相关抗原。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分特异性地结合细胞表面抗原。细胞表面抗原可以选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质。细胞表面抗原可以是cd19、cd20、cd22、cd47、cd158e、gpc3、ror1、ror2、bcma、gprc5d、fcrl5、muc16、mct4、psma或它们的变体或突变体。
13.在一些实施方案中，car抗体部分和csr抗体部分特异性地结合同一抗原。在特定实施方案中，car抗体部分和csr抗体部分特异性地结合同一抗原上的不同表位。
14.在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分特异性地结合mhc限制性抗
原。在一些实施方案中，mhc限制性抗原是包含肽和mhc蛋白的复合物，并且该肽衍生自选自由以下组成的组的蛋白质：wt-1、afp、hpv16-e7、ny-eso-1、prame、ebv-lmp2a、hiv-1、kras、foxp3、组蛋白h3.3、psa以及它们的变体或突变体。
15.在这一方面的一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19和cd22两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19和cd20两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd20和cd22两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19、cd20和cd22。
16.在这一方面的一些实施方案中，car抗体部分特异性地结合包含甲胎蛋白(afp)肽和mhc i类蛋白的复合物。在一些实施方案中，csr的配体结合模块特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)。在一些实施方案中，car抗体部分结合包含afp肽和mhc i类蛋白的复合物，并且csr的配体结合模块结合gpc3。
17.在一些实施方案中，car抗体部分和csr的配体结合模块两者都结合gpc3。在特定实施方案中，car抗体部分和csr的配体结合模块特异性地结合gpc3上的不同表位。
18.在一些实施方案中，car跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。在一些实施方案中，car跨膜结构域是cd8的跨膜结构域。在一些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域衍生自tcr共受体或t细胞共刺激分子的跨膜结构域。tcr共受体或t细胞共刺激分子可以选自由以下组成的组：cd8、4-1bb、cd27、cd28、cd30、ox40、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154和dap10。在某些实施方案中，tcr共受体或t细胞共刺激分子是cd30或cd8。在一些实施方案中，t细胞共刺激分子可以是cd30。在一些实施方案中，tcr共受体是cd8。
19.在一些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域是cd8、4-1bb、cd27、cd28、cd30、ox40、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154或dap10的跨膜结构域。在某些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域是cd30或cd8的跨膜结构域。在某些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。在某些实施方案中，csr跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。在某些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域是cd8的跨膜结构域。在某些实施方案中，car跨膜结构域和/或csr跨膜结构域包含选自由seq id no:66-71组成的组的氨基酸序列。
20.在这一方面的一些实施方案中，初级信号传导结构域包含衍生自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导序列的序列：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含衍生自cd3ζ
的细胞内信号传导序列的序列。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导序列。在某些实施方案中，初级信号传导结构域包含与seq id no:77的序列至少80％、85％、90％、95％或100％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。
21.在这一方面的一些实施方案中，免疫细胞中的car还包含在car的细胞外靶结合结构域与跨膜结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，免疫细胞中的car还包含在car的跨膜结构域与共刺激结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，免疫细胞中的car还包含在car的共刺激结构域与初级信号传导结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，免疫细胞中的csr还包含在csr的配体结合模块与跨膜结构域之间的肽接头。在一些实施方案中，免疫细胞中的csr还包含在csr的跨膜结构域与cd30共刺激结构域之间的肽接头。
22.在这一方面的一些实施方案中，csr的表达是诱导型的。在一些实施方案中，csr的表达在激活免疫细胞时是可诱导的。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。
23.在另一个方面，本公开的特征在于一个或多个编码本文所述的免疫细胞所包含的car和csr的核酸，其中该car和csr各自由一个或多个核酸所编码的一个或多个多肽链组成。
24.在另一个方面，本公开的特征在于一种或多种包含上述一个或多个核酸的载体。
25.在另一个方面，本公开的特征在于一种包含以下项的药物组合物：(a)本文所述的免疫细胞、本文所述的核酸或本文所述的载体，和(b)药学上可接受的载剂或稀释剂。
26.在另一个方面，本公开的特征在于一种杀死靶细胞的方法，该方法包括：使一个或多个靶细胞与本文所述的免疫细胞在足以使得免疫细胞介导对靶细胞的杀伤的条件和持续时间下接触，其中该靶细胞表达对该免疫细胞具有特异性的抗原，并且其中该免疫细胞在接触该靶细胞时表达低细胞耗竭水平。在一些实施方案中，免疫细胞表达选自由以下组成的组的耗竭标志物的低细胞耗竭水平：pd-1、tim-3、tigit和lag-3。在某些实施方案中，免疫细胞是t细胞。在某些实施方案中，免疫细胞表达pd-1的低细胞耗竭水平。在一些实施方案中，来自表达第1代car(例如，αafp-cd8t-z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞，cd4

t细胞)的pd-1与来自表达单独的第1代car的免疫细胞的pd-1的比率介于0.05与0.5之间(例如，介于0.05与0.45之间、介于0.05与0.4之间、介于0.05与0.35之间、介于0.05与0.3之间、介于0.05与0.25之间、介于0.05与0.2之间、介于0.05与0.15之间、介于0.05与0.1之间、介于0.1与0.45之间、介于0.15与0.45之间、介于0.2与0.45之间、介于0.25与0.45之间、介于0.3与0.45之间、介于0.35与0.45之间、或介于0.4与0.45)。在一些实施方案中，来自表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞，cd4

t细胞)的pd-1与来自表达单独的第2代car的免疫细胞的pd-1的比率介于0.05与0.5之间(例如，介于0.05与0.45之间、介于0.05与0.4之间、介于0.05与0.35之间、介于0.05与0.3之间、介于0.05与0.25之间、介于0.05与0.2之间、介于0.05与0.15之间、介于0.05与0.1之间、介于0.1与0.45之间、介于0.15与0.45之间、介于0.2与0.45之间、介于0.25与0.45之间、介于0.3与0.45之间、介于0.35与0.45之间、或介于0.4与0.45之间)。在某些实施方案中，免疫细胞表达tim-3的低细胞耗竭水平。在某些实施方案中，免疫细胞表达tigit的低细胞耗竭水
平。在某些实施方案中，免疫细胞表达lag-3的低细胞耗竭水平。在一些实施方案中，来自表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞，cd4

t细胞)的lag-3与来自表达单独的第2代car的免疫细胞的lag-3的比率介于0.1与0.9之间(例如，介于0.1与0.8之间、介于0.1与0.7之间、介于0.1与0.6之间、介于0.1与0.5之间、介于0.1与0.4之间、介于0.1与0.3之间、介于0.1与0.2之间、介于0.2与0.9之间、介于0.3与0.9之间、介于0.4与0.9之间、介于0.5与0.9之间、介于0.6与0.9之间、介于0.7与0.9之间、或介于0.8与0.9之间)。
27.在一些实施方案中，该免疫细胞与表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞相比表达更低水平的pd-1、tim-3、tigit或lag-3。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的pd-1，并且其中该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞的pd-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的tim-3，并且其中该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞的tim-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的lag-3，并且其中该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞的lag-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的tigit，并且其中该免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞的tigit表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
28.在一些实施方案中，该免疫细胞与表达包含4-1bb共刺激结构域的csr的对应免疫细胞相比表达更低水平的pd-1、tim-3、tigit或lag-3。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的pd-1，并且其中该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞的pd-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的tim-3，并且其中该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞的tim-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的lag-3，并且其中该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞的lag-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的tigit，并且其中该免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞的tigit表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
29.在一些实施方案中，该免疫细胞与表达包含dap10共刺激结构域的csr的对应免疫细胞相比表达更低水平的pd-1、tim-3、tigit或lag-3。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞相比表达更低水平的pd-1，并且其中该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞的pd-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞相比表达更低水平的tim-3，并且其中该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞的tim-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞相比表达更低水平的lag-3，并且其中该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞的
lag-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。在一些实施方案中，该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞相比表达更低水平的tigit，并且其中该免疫细胞与对应的dap10 csr免疫细胞的tigit表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
30.在这一方面的一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。癌细胞可以来自选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。癌细胞可以是血液癌细胞。癌细胞可以是实体瘤细胞。
31.在一些实施方案中，靶细胞是感染病毒的细胞。感染病毒的细胞可以来自由选自由以下组成的组的病毒引起的病毒感染：巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、乙型肝炎病毒(hbv)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(kshv)、人乳头瘤病毒(hpv)、传染性软疣病毒(mcv)、人t细胞白血病病毒1(htlv-1)、hiv(人免疫缺陷病毒)和丙型肝炎病毒(hcv)。
32.在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的免疫细胞、本文所述的核酸或本文所述的载体或者向受试者施用本文所述的药物组合物的步骤。在一些实施方案中，该疾病为病毒感染。在一些实施方案中，该疾病为癌症。癌症可以是血液癌。癌症可以是实体瘤癌症。
33.在一些实施方案中，受试者在实体瘤癌症中具有比受试者身体的其余部分更高密度的本文所述的免疫细胞。
34.在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。
35.在另一个方面，本公开的特征在于一种用于预防和/或逆转受试者的t细胞耗竭的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的核酸、本文所述的载体或向该受试者施用本文所述的包含该核酸或该载体的药物组合物。在一些实施方案中，该方法降低t细胞中的耗竭标志物的表达。耗竭标志物可以选自由以下组成的组：pd-1、tim-3、tigit和lag-3。
36.在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，该方法与用表达car和包含cd28或4-1bb共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤浸润或免疫细胞扩增增加，其中该方法包括向该受试者施用表达包含cd30共刺激结构域的相同car和对应的csr的对应免疫细胞，并且其中该对应免疫细胞包含本文所述的免疫细胞。在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，该方法与用表达car和包含dap10共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤浸润或免疫细胞扩增增加，其中该方法包括向该受试者施用表达包含cd30共刺激结构域的相同car和对应的csr的对应免疫细胞，并且其中该对应免疫细胞包含本文所述的免疫细胞。在一些实施方案中，可以在动物(例如，小鼠)中进行实验，通过使用一组包含具有cd30共刺激结构域的car和csr的免疫细胞和另一组包含具有非cd30共刺激结构域(例如，4-1bb共刺激结构域、cd28共刺激结构域或dap10共刺激结构域)的相同car和对应csr的免疫细胞来比较免疫细胞在治疗实体瘤癌症中的作用。
37.在本文所述的方法的一些实施方案中，被表达第二代car(例如，αafp-cd28z-car、αgpc3-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞浸润的肿瘤细胞数量与被表达单独的第2代car的免疫细胞浸润的肿瘤细胞数量的比率介于1与20之间(例如，介于1与18之间、介于1与16之间、介于1与14之间、介于1与12之间、介于1与10之间、介于1与8之间、介于1与6之间、介于1与4之间、介于1与2之间、介于2与20之间、介于4与20之间、介于6与20之间、介于8与20之间、介于10与20之间、介于12与20之间、介于14与20之间、介于16与20之间、或介于18与20之间)。
38.在本文所述的方法的一些实施方案中，表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car、αgpc3-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞的血液浓度与表达单独的第2代car的免疫细胞的血液浓度的比率介于1与5之间(例如，介于1与4之间、介于1与3之间、介于1与2之间、介于2与5之间、介于3与5之间、或介于4与5之间)。
39.在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，该方法与用表达car和包含cd28或4-1bb共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤消退增加，其中该方法包括向该受试者施用表达包含cd30共刺激结构域的相同car和对应的csr的对应免疫细胞，并且其中该对应免疫细胞包含本文所述的免疫细胞。在另一个方面，本公开的特征在于一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，该方法与用表达car和包含dap10共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤消退增加，其中该方法包括向该受试者施用表达包含cd30共刺激结构域的相同car和对应的csr的对应免疫细胞，并且其中该对应免疫细胞包含本文所述的免疫细胞。在一些实施方案中，可以在动物(例如，小鼠)中进行实验，通过使用一组包含具有cd30共刺激结构域的car和csr的免疫细胞和另一组包含具有非cd30共刺激结构域(例如，4-1bb共刺激结构域、cd28共刺激结构域或dap10共刺激结构域)的相同car和对应csr的免疫细胞来比较免疫细胞对肿瘤消退的影响。
40.在另一个方面，本公开的特征在于一种用于产生在受试者中中央记忆t细胞的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的核酸、本文所述的载体或向该受试者施用本文所述的包含该核酸或该载体的药物组合物。
41.在一些实施方案中，该方法增加该受试者中的中央记忆t细胞的数量和/或中央记忆t细胞在所有t细胞中的百分比。
42.在另一个方面，本公开提供了一种用于在体外产生中央记忆t细胞的方法，该方法包括：使一个或多个靶细胞与本文所述的免疫细胞在足以使得该免疫细胞发展成中央记忆t细胞的条件和持续时间下接触，其中该靶细胞表达对该免疫细胞具有特异性的抗原。
43.在一些实施方案中，该方法增加中央记忆t细胞的数量和/或中央记忆t细胞在从该免疫细胞传留下来的所有t细胞中的百分比。
44.在一些实施方案中，该方法产生比表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞更高数量的中央记忆t细胞和/或更高百分比的中央记忆t细胞。
45.在一些实施方案中，该方法产生比表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％数量的中央记忆t细胞和/或百分比的中央记忆t细胞。
46.在本文所述的方法的一些实施方案中，表达第1代car(例如，αafp-cd8t-z-car)和
cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生比表达单独的第1代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)更多的中央记忆t细胞。例如，在一些实施方案中，由表达第1代car(例如，αafp-cd8t-z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量与由表达单独的第1代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量的比率介于5与1000之间(例如，介于5与900之间、介于5与800之间、介于5与700之间、介于5与600之间、介于5与500之间、介于5与400之间、介于5与300之间、介于5与200之间、介于5与100之间、介于5与50之间、介于5与10之间、介于10与1000之间、介于50与1000之间、介于100与1000之间、介于200与1000之间、介于300与1000之间、介于400与1000之间、介于500与1000之间、介于600与1000之间、介于700与1000之间、介于800与1000之间、或介于900与1000之间)。例如，在一些实施方案中，由表达第1代car(例如，αafp-cd8t-z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量与由表达单独的第1代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量的比率介于1.5与8000之间(例如，介于1.5与7000之间、介于1.5与6000之间、介于1.5与5000之间、介于1.5与4000之间、介于1.5与3000之间、介于1.5与2000之间、介于1.5与1000之间、介于1.5与500之间、介于1.5与100之间、介于10与8000之间、介于500与8000之间、介于1000与8000之间、介于2000与8000之间、介于3000与8000之间、介于4000与8000之间、介于5000与8000之间、介于6000与8000之间、或介于7000与8000之间)。
47.在本文所述的方法的一些实施方案中，表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生比表达单独的第2代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)更多的中央记忆t细胞。例如，在一些实施方案中，由表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量与由表达单独的第2代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量的比率介于0.5与3500之间(例如，介于0.5与3000之间、介于0.5与2500之间、介于0.5与2000之间、介于0.5与1500之间、介于0.5与1000之间、介于0.5与500之间、介于0.5与100之间、介于0.5与50之间、介于50与3500之间、介于100与3500之间、介于500与3500之间、介于1000与3500之间、介于1500与3500之间、介于2000与3500之间、介于2500与3500之间、或介于3000与3500之间。例如，在一些实施方案中，由表达第2代car(例如，αafp-cd28z-car)和cd30-csr的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量与由表达单独的第2代car的免疫细胞(例如，cd8

t细胞)产生的中央记忆t细胞的数量的比率介于1.5与20,000之间(例如，介于1.5与18,000之间、介于1.5与16,000之间、介于1.5与14,000之间、介于1.5与12,000之间、介于1.5与10,000之间、介于1.5与8,000之间、介于1.5与6,000之间、介于1.5与4,000之间、介于1.5与2,000之间、介于1.5与1,800之间、介于1.5与1,600之间、介于1.5与1,400之间、介于1.5与1,200之间、介于1.5与1,000之间、介于1.5与800之间、介于1.5与600之间、介于1.5与400之间、介于1.5与200之间、介于1.5与100之间、介于100与20,000之间、介于200与20,000之间、介于400与20,000之间、介于600与20,000之间、介于800与20,000之间、介于1000与20,000之间、介于1,200与20,000之间、介于1,400与20,000之间、介于1,600与20,000之间、介于1,800与20,000之间、介于2,000与20,000之间、介于4,000与20,000之间、介于6,000与20,000之间、介于8,000与20,000之间、介于10,000与20,000之间、介于12,000与20,000之间、介于14,000与20,000之间、介于16,000与20,000、或介于18,000与20,000之
间)。
48.在一些实施方案中，中央记忆t细胞表达高水平的ccr7和低水平的cd45ra。
49.在一些实施方案中，中央记忆t细胞是cd8

t细胞。
50.定义
51.本发明的范围由所附权利要求限定，并且不受本文所述的特定实施方案限制；阅读本公开的本领域技术人员将觉察到可以等同于此类所描述的实施方案或以其它方式在权利要求的范围内的各种修改。
52.通常，除非另有明确说明，否则本文所使用的术语根据其在本领域中的理解含义。下面提供了某些术语的外在定义；在整个本说明书中的这些和其它术语在特定实例中的含义对于本领域技术人员而言将从上下文中变得清楚。
53.为了可以更容易地理解本发明，下面首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其它术语的附加定义。
54.施用：如本文所用，术语“施用”是指将组合物施用于受试者或系统(例如，施用于细胞、器官、组织、生物体或相关组分或其组分的集合)。普通技术人员将了解，施用途径可以根据例如组合物所施用的受试者或系统、组合物的性质、施用的目的等而变化。例如，在某些实施方案中，向动物受试者(例如，向人类)施用可以是通过支气管(包括通过支气管滴注)、经颊、肠内、真皮间、动脉内、皮内、胃内、肝内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、瘤内、静脉内、心室内、粘膜、鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道和/或玻璃体进行。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)。
55.亲和力：如本领域已知的，“亲和力”是特定配体与其配偶体结合的紧密度的量度。可以不同方式测量亲和力。在一些实施方案中，通过定量测定来测量亲和力。在一些此类实施方案中，结合配偶体浓度可以固定在过量的配体浓度以便模拟生理条件。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可以改变结合配偶体浓度和/或配体浓度。在一些此类实施方案中，可以将亲和力与在相当的条件(例如，浓度)下的参考进行比较。
56.亲和力成熟的(或亲和力成熟的抗体)：如本文所用，是指具有其在一个或多个cdr(或在一些实施方案中，框架区)中的一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致与不具有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力的改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体将具有对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。可以通过本领域已知的多种程序中的任一种程序产生亲和力成熟的抗体。marks等人，1992,biotechnology10:779-783描述了通过vh和v
l
结构域改组的亲和力成熟。cdr和/或框架残基的随机诱变例如由以下文献描述：barbas等人，1994,proc.nat.acad.sci.,u.s.a.91:3809-3813；schier等人，1995,gene 169:147-155；yelton等人，1995.j.immunol.155:1994-2004；jackson等人，1995,j.immunol.154(7):3310-9；以及hawkins等人，1992,j.mol.biol.226:889-896。具有改善的结合特性的结合剂的选择由以下文献描述：thie等人，2009,methods mol.bio.525:309-22。
57.药剂：如本文所用，可以指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖化物、脂质、小分子、金属或它们的组合。在一些实施方案中，药剂是或包含天然产物，因为其在自然界中发现和/或从自然界中获得。在一些实施方案中，药剂是或包含一个或多个为
人造的实体，因为其被设计、被工程化和/或通过人工的作用产生和/或在自然界中未发现。在一些实施方案中，药剂能以在分离或纯的形式被利用；在一些实施方案中，药剂能以粗产物形式被利用。在一些实施方案中，可以将潜在药剂作为例如可被筛选以鉴定或表征它们中的活性药剂的集合或文库提供。可以根据本发明利用的药剂的一些特定实施方案包括小分子、抗体、适体、核酸(例如，sirna、shrna、dna/rna杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方案中，药剂是或包含聚合物。在一些实施方案中，药剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，药剂含有至少一个聚合物部分。在一些实施方案中，药剂缺乏或基本上不含任何聚合物部分。
58.氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构h2n-c(h)(r)-cooh。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准l-氨基酸中的任一种标准l-氨基酸。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是否是合成制备还是从天然来源获得。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或置换。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的其它化学基团置换来修饰肽中的氨基酸(包括羧基和/或氨基末端氨基酸)。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一个或多个翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如，甲基基团、乙酸根基团、乙酰基基团、磷酸根基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用术语的上下文中将显而易见其是指游离氨基酸还是指肽的残基。
59.动物：如本文所用，是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任一性别和在任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指在任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗或猴)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。
60.抗体部分：如本文所用，该术语涵盖全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常含有三个高度可变环(称为互补决定区(cdr))(轻链(lc)cdr包括lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3，重链(hc)cdr包括hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以通过kabat、chothia或al-lazikani的惯例来限定或鉴定(al-lazikani 1997；chothia 1985；chothia 1987；chothia 1989；kabat 1987；kabat 1991)。重链或轻链的三个cdr插入已知为框架区(fr)的侧翼延伸段之间，该fr比cdr更高度保守并且形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。基于它们重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体被分配为多个类别。抗体的五个主要类别或同种型为iga、igd、ige、igg和igm，它们的特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。将几种主要抗体类别划分为亚类，
诸如lgg1(γ1重链)、lgg2(γ2重链)、lgg3(γ3重链)、lgg4(γ4重链)、lga1(α1重链)或lga2(α2重链)。
61.抗原结合片段或抗原结合部分：如本文所用，术语“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指抗体片段，包括例如双抗体(diabody)、fab、fab'、f(ab’)2、fv片段、二硫化物稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链fv(scfv)、scfv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个cdr的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼源化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scfv)结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合片段可以包含来自与来自一种或多种不同人抗体的框架区接枝的特定人抗体的一个或多个cdr。
62.生物活性：如本文所用，是指通过感兴趣的药剂或实体实现的可观察到的生物效应或结果。例如，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，调整(例如，诱导、增强或抑制)生物途径或事件是生物活性。在一些实施方案中，通过检测由感兴趣的生物途径或事件产生的直接或间接产物来评估生物活性的存在或程度。
63.双特异性抗体：如本文所用，是指其中结合部分中的至少一个和通常两个结合部分是或包含抗体部分的双特异性结合剂。各种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中是或包含抗体部分的每个结合部分包括vh区和/或v
l
区；在一些此类实施方案中，该vh区和/或v
l
区是在特定单克隆抗体中发现的那些区域。在一些实施方案中，在双特异性抗体含有两个抗体部分的情况下，每个抗体部分包括来自不同单克隆抗体的vh区和/或v
l
区。
64.如本文所用，术语“双特异性抗体”还指具有两个离散结合部分的多肽，每个离散结合部分结合不同的靶。在一些实施方案中，双特异性结合抗体是单一多肽；在一些实施方案中，双特异性结合抗体是或包含多个肽，在一些此类实施方案中，该多个肽可以彼此共价缔合，例如通过交联。在一些实施方案中，双特异性结合抗体的两个结合部分识别相同靶(例如，抗原)的不同位点(例如，表位)；在一些实施方案中，该两个结合部分识别不同的靶。在一些实施方案中，双特异性结合抗体能够同时结合具有不同结构的两个靶。
65.载剂：如本文所用，是指施用组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些示例性实施方案中，载剂可以包括无菌液体，例如水和油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。在一些实施方案中，载剂是或包括一种或多种固体组分。
66.cdr：如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”旨在表示在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。重链和轻链的可变区中的每个可变区中存在三个cdr，对于可变区中的每个可变区该三个cdr被命名为cdr1、cdr2和cdr3。“cdr的组”或“cdr组”是指出现在能够结合抗原的单个可变区中的一组三个或六个cdr，或是指能够结合抗原的同源重链和轻链可变区的cdr。这些特定区域已经由以下文献描述：kabat等人，j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等人，u.s.dept.of health and human services，“sequences of proteins of immunological interest”(1991)；chothia等人，j.mol.biol.196:901-917(1987)；al-lazikani b.等人，j.mol.biol.,273:927-948(1997)；maccallum等人，j.mol.biol.262:732-745(1996)；abhinandan和martin,
mol.immunol.,45:3832-3839(2008)；lefranc m.p.等人，dev.comp.immunol.,27:55-77(2003)；以及honegger和pl
ü
ckthun,j.mol.biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，用于指代抗体或接枝抗体或其变体的cdr的任一定义的应用旨在处于本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表1中示出了涵盖如由上文引用的参考文献中的每一篇参考文献所定义的cdr的氨基酸残基。cdr预测算法和界面是本领域已知的，包括例如abhinandan和martin,mol.immunol.,45:3832-3839(2008)；ehrenmann f.等人，nucleic acids res.,38:d301-d307(2010)；以及adolf-bryfogle j.等人，nucleic acids res.,43:d432-d438(2015)。本段落中引用的参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中以用于本发明中，并且可能包含在本文的一个或多个权利要求中。
67.表1
[0068] kabat1chothia2maccallum3imgt4aho
5vh cdr131-3526-3230-3527-3825-40v
h cdr250-6553-5547-5856-6558-77v
h cdr395-10296-10193-101105-117109-137v
l cdr124-3426-3230-3627-3825-40v
l cdr250-5650-5246-5556-6558-77v
l cdr389-9791-9689-96105-117109-137
[0069]1残基编号遵循kabat等人，同上的命名法
[0070]2残基编号遵循chothia等人，同上的命名法
[0071]3残基编号遵循maccallum等人，同上的命名法
[0072]4残基编号遵循lefranc等人，同上的命名法
[0073]5残基编号遵循honegger和pl
ü
ckthun，同上的命名法
[0074]
嵌合抗原受体(car)：如本文所用，是指含有细胞外靶结合(例如，抗原结合)结构域的人工构建的杂交单链蛋白质或单链多肽，直接或间接与跨膜结构域(“tm结构域”，例如，共刺激分子的跨膜结构域)连接，其进而直接或间接地与包含初级免疫细胞信号传导结构域的细胞内信号传导结构域(isd)(例如，参与t细胞或nk细胞激活的一个isd)连接。细胞外靶结合结构域可以是衍生自抗体的单链可变片段(scfv)。除了scfv之外，其它单链抗原结合结构域也可以用于car中，例如，串联scfv、单结构域抗体片段(vhh或sdab)、单结构域双特异性抗体(bsab)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、以及单链形式的fab、fab'或(fab’)2。细胞外靶结合结构域可以经由柔性铰链/间隔区连接到tm结构域。细胞内信号传导结构域(isd)包含初级信号传导序列或初级免疫细胞信号传导序列，其可以来自抗原依赖性的tcr相关t细胞激活分子，例如，tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的细胞内结构域的一部分。isd还可以包含共刺激信号传导序列；例如，抗原独立性共刺激分子(诸如cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、特异性地结合cd83的配体、dap10等)的细胞内结构域的一部分。car的特性包括其重定向免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)的能力、以mhc限制性(在tcr模拟抗体的情况下)或非mhc限制性(在针对细胞表面蛋白的抗体的情况下)方式针对选定靶的特异性和反应性、利用单克隆抗体的抗原
结合特性。非mhc限制性抗原识别为表达car的免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)提供识别独立于抗原处理的抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。
[0075]
目前存在三代car。“第一代”car通常是由scfv作为抗原结合结构域融合到与细胞质/细胞内结构域融合的跨膜结构域构成的单链多肽，该细胞质/细胞内结构域包含初级免疫细胞信号传导序列诸如来自cd3ζ链(其是来自内源性tcr的信号的初级传递器)的细胞内结构域。“第一代”car可以独立于hla介导的抗原呈递通过单个融合分子中的cd3ζ链信号传导结构域提供从头抗原识别并引起cd4

和cd8

t细胞两者的激活。“第二代”car将来自各种共刺激分子(例如，cd28、4-1bb、icos、ox40)的细胞内结构域添加到car的初级免疫细胞信号传导序列以向t细胞提供另外的信号。因此，“第二代”car包含提供共刺激(例如，cd28或4-ibb)和激活(例如，cd3ζ)的片段。临床前研究表明，“第二代”car可以改善t细胞的抗肿瘤活性。例如，在靶向患有慢性淋巴母细胞白血病(cll)和急性淋巴母细胞白血病(all)的患者的cd19分子的临床试验中证明了“第二代”car修饰的t细胞的稳健功效。“第三代”car包含提供多种共刺激(例如，cd28和4-1bb)和激活(例如，cd3ζ)的那些片段。描述了car t疗法的实例，参见例如美国专利号10,221,245(其描述了具有抗cd19细胞外靶结合结构域、来自cd8的跨膜结构域、来自4-1bb的共刺激结构域和来自cd3ζ的初级信号传导结构域的car ctl019)以及美国专利号9,855,298(其描述了具有抗cd19细胞外靶结合结构域、来自cd28的共刺激结构域和来自cd3ζ的初级信号传导结构域的car)。
[0076]
过继性细胞疗法：过继性细胞疗法是通常包括分离和离体扩增和/或操纵免疫细胞(例如，nk细胞或t细胞)并且随后向患者施用这些细胞例如用于治疗癌症的一种治疗方法。所施用的细胞可以是自体的或同种异体的。可以已知方式中的任何一种方式(包括例如通过使用rna和dna转染、病毒转导、电穿孔，所有这些都是本领域已知的技术)操纵细胞以表达工程化受体(包括car和csr)。
[0077]
术语“过继性细胞治疗组合物”是指包含适合于过继性细胞转移的细胞的任何组合物。在示例性实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的组的细胞类型：肿瘤浸润性淋巴细胞(til)和car和/或csr修饰的淋巴细胞。在另一个实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含选自由以下组成的组的细胞类型：t细胞、cd8

细胞、cd4

细胞、nk细胞、δγt细胞、调节性t细胞和外周血单核细胞。在另一个实施方案中，til、t细胞、cd8

细胞、cd4

细胞、nk细胞、δγt细胞、调节性t细胞或外周血单核细胞形成过继性细胞治疗组合物。在一个实施方案中，过继性细胞治疗组合物包含t细胞。
[0078]
在一些实施方案中，细胞中表达的car是第一代、第二代或第三代car，如上所述。根据本发明公开的主题，本文提供的工程化免疫细胞的car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。wo2019/032699描述了共表达car和诱导型双特异性抗体的t细胞。
[0079]
相当的：如本文所用，是指两种或更多种药剂、实体、情况、条件集合等可能彼此不相同，但足够类似以允许在其间进行比较，使得基于观察到的差异或相似性可以合理地得出结论。在一些实施方案中，相当的条件集合、情况、个体或群体的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少量不同的特征。在上下文中，本领域普通技术人员将理解，对于两种或更多种此类药剂、实体、情况、条件集合等在任何给定情况下需要什么程度的同一性以被认为是相当的。例如，本领域普通技术人员将理解，当以足够数量和类型的基本上相同的特征
来表征以保证合理的结论，即由在不同的情况、个体或群体的集合下或用不同的情况、个体或群体的集合所获得的结果或所观察到的现象的差异由变化的那些特征的变化引起或指示变化的那些特征的变化时，情况、个体或群体的集合彼此是相当的。
[0080]
对照：如本文所用，是指“对照”是结果与之比较的标准的本领域理解的含义。通常，将对照用于通过分离变量来增加实验的完整性以便关于此类变量得出结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时执行以提供比较器的反应或测定。如本文所用，“对照”可以指“对照抗体”。“对照抗体”可以是如本文所述的人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、cdr接枝的抗体、多特异性抗体或双特异性抗体、如本文所述不同的抗体、或亲本抗体。在一个实验中，应用“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，不应用“对照”(所测试的变量)。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，以前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包含印刷或以其它方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
[0081]
对应于：如本文所用，指定感兴趣的多肽中的氨基酸残基的位置/同一性。本领域普通技术人员将了解，出于简单的目的，通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基，使得“对应于”位置190处的残基的氨基酸例如实际上不必是在特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于在参考多肽中的190处发现的残基；本领域普通技术人员容易地了解如何鉴定“对应”氨基酸。
[0082]
检测实体/药剂：如本文所用，是指可检测的任何元素、分子、官能团、化合物、片段或部分。在一些实施方案中，提供或使用单独的检测实体。在一些实施方案中，提供和/或利用与另一种药剂缔合(例如，连接)的检测实体。检测实体的实例包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如，3h、14c、18f、19f、32p、35s、135i、125i、123i、64cu、187re、111in、90y、99mtc、177lu、89zr等)、荧光染料(关于特定的示例性荧光染料，参见下文)、化学发光剂(例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环己烷等)、生物发光剂、光谱可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)、纳米团簇、顺磁性金属离子、酶(关于酶的具体实例，参见下文)、比色标记(例如染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原和抗血清或单克隆抗体对其可用的蛋白质。
[0083]
效应子功能：如本文所用，是指由抗体fc区与fc受体或配体的相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和补体介导的细胞毒性(cmc)。在一些实施方案中，效应子功能是在结合抗原之后运作的效应子功能、独立于抗原结合运作的效应子功能、或两者。
[0084]
效应细胞：如本文所用，是指介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可以包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大的粒状淋巴细胞、朗格汉斯(langerhans)细胞、自然杀伤(nk)细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞中的一种或多种并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
[0085]
经工程化：如本文所用，通常是指由人工操纵的方面。例如，在一些实施方案中，当不以自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人工操纵而在经工程化多核苷酸中直接彼此连接时，多核苷酸可被视为“经工程化”。在一些特定的此类实施方案中，经工程化多核苷酸可以包含自然界中存在的与第一编码序列可操作缔合但不与第二编码序列
可操作缔合的调控序列，所述调控序列通过人工连接而使得其与第二编码序列可操作缔合。可替代地或另外地，在一些实施方案中，各自编码在自然界中彼此不连接的多肽元件或结构域的第一核酸序列和第二核酸序列可以在单个经工程化的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，之前不存在的新遗传物质已经被引入，或者之前存在的遗传物质已被改变或移除)，则该细胞或生物体可以被视为“经工程化”。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解的，即使实际的操纵是对先前的实体进行的，经工程化多核苷酸或细胞的后代通常仍然被称为“经工程化”。此外，本领域的技术人员将了解，可以通过多种可用的方法来实现如本文所述的“工程化”。例如，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统进行选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体的选择或设计)，该计算机系统被编程以进行分析或比较，或者以其他方式分析、建议和/或选择序列、改变等)。可替代地或另外地，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术(例如核酸扩增(例如经由聚合酶链反应)杂交、突变、转化、转染等)和/或多种受控交配方法中的任一种。如将由本领域的技术人员所了解，多种确立的此类技术(例如，用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染等))是本领域熟知的并且在整个本说明书中所引用和/或讨论的多篇一般和更具体的参考文献中有描述。参见例如，sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual(第2版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1989)。
[0086]
表位：如本文所用，包括由免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性地识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团构成。在一些实施方案中，当抗原采用相关三维构象时，此类化学原子或基团被表面暴露。在一些实施方案中，当抗原采用这样的构象时，此类化学原子或基团在空间中彼此物理地接近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，是线性化的)时，至少一些此类化学原子是彼此物理地分离的基团。本文所述的抗体部分可以与以下表位结合，该表位包含介于7个与50个之间的氨基酸(例如，介于7个与50个之间的连续氨基酸)，例如，介于7个与45个之间、介于7个和介于7个与40个之间、介于7个与35个之间、介于7个与30个之间、介于7个与25个之间、介于7个与20个之间、介于7个与15个之间、介于7个与10个之间、介于10个与50个之间、介于15个与50个之间、介于20个与50个之间、介于25个与50个之间、介于30个与50个之间、介于35个与50个之间、介于40个与50个之间、介于45个与50个之间、介于10个与45个之间、介于15个与40个之间、介于20个与35个之间、或介于25个与30个之间的氨基酸。
[0087]
赋形剂：如本文所用，是指可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所需的稠度或稳定作用的非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
[0088]
表达盒：如本文所用，是指当引入宿主细胞中时分别导致rna或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。
[0089]
异源的：如本文所用，是指不在宿主细胞或宿主生物体中天然存在的多核苷酸或多肽。可以使用熟知的重组方法例如使用包含任选地与启动子连接的异源多核苷酸的表达盒将异源多核苷酸或多肽引入宿主细胞或宿主生物体中。
[0090]
框架或框架区：如本文所用，是指可变区减去cdr的序列。因为可以通过不同系统确定cdr序列，所以同样地框架序列受到相应不同的解释。在每条链上，六个cdr将重链和轻链上的框架区划分为四个子区域(fr1、fr2、fr3和fr4)，其中cdr1定位于fr1与fr2之间、cdr2定位于fr2与fr3之间并且cdr3定位于fr3与fr4之间。在不指定特定子区域作为fr1、fr2、fr3或fr4的情况下，框架区(如其它)表示单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合fr。如本文所用，fr表示四个子区域中的一个子区域，fr1例如表示与可变区的氨基末端最接近并且相对于cdr1的5'的第一框架区，并且frs表示构成框架区的子区域中的两个或更多个子区域。
[0091]
宿主细胞：如本文所用，是指已经向其中引入了外源dna(重组或以其它方式)的细胞。本领域技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅指特定的受试者细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而出现在后续世代中，所以这样的后代事实上可以与亲本细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适合于表达外源dna(例如，重组核酸序列)的任何生命王国的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌属(bacillus spp.)、链霉菌属(streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、甲醇毕赤酵母(p.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，sf-9、sf-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞、或细胞融合物(例如杂交瘤或四重杂交瘤(quadroma))。在一些实施方案中，宿主细胞是人、猴、无尾猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的并且选自以下细胞：cho(例如cho kl、dxb-1 1cho、veggie-cho)、cos(例如cos-7)、视网膜细胞、vero、cv1、肾脏细胞(例如hek293、293ebna、msr 293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb 8065、hl-60(例如bhk21)、jurkat、daudi、a431(表皮)、cv-1、u937、3t3、l细胞、c127细胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、塞尔托利细胞(sertoli cell)、brl 3a细胞、ht1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞、以及来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如per.c6
tm
细胞)。
[0092]
人抗体：如本文所用，旨在包括具有从人免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，抗体(或抗体部分)可以被认为是“人”的，即使其氨基酸序列包括例如在一个或多个cdr以及尤其是cdr3中的、不由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或元素(例如，包括例如可以(最初)通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的序列变化)。人抗体、人抗体部分和它们的片段可以从人免疫细胞中分离或通过重组或合成(包括半合成)产生。
[0093]
人源化：如本领域已知的，术语“人源化”通常用于指其氨基酸序列包含来自非人物种(例如，小鼠)中产生的参考抗体的vh区和v
l
区序列、但也包含相对于旨在使其更多“人样”(即，更类似于人种系可变序列)的参考抗体的在那些序列中的修饰的抗体(或部分)。在一些实施方案中，“人源化”抗体(或抗体部分)是免疫特异性地结合感兴趣的抗原并且具有基本上含有人抗体的氨基酸序列的框架(fr)区以及基本上含有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(cdr)的“人源化”抗体(或抗体部分)。人源化抗体包含至少一个以及通常两个
可变结构域(fab、fab'、f(ab')2、fabc、fv)的基本上全部，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的那些，并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域两者。抗体还可以包含重链恒定区的ch1、铰链、ch2、ch3和任选地ch4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化v
l
区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化vh区。在一些某些实施方案中，人源化抗体含有人源化vh区和v
l
区。
[0094]
亲水性：如本文所用，术语“亲水性”和/或“极性”是指与水混合或容易地溶解在水中的趋势。
[0095]
疏水性：如本文所用，术语“疏水性”和/或“非极性”是指排斥水、不与水组合或不能容易地溶解在水中的趋势。
[0096]
改进、增加或减少：如本文所用，或它们的语法等同物指示相对于基线测量值的值，该基线测量值诸如为在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值、或在不存在本文所述的治疗的情况下在一个对照个体(或多个对照个体)中的测量值。“对照个体”是患有与受治疗的个体相同形式的疾病或伤害的个体。在一些实施方案中，与在接受治疗之前的个体或与对照个体相比，用于使用本文所述的免疫细胞治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法可以将在个体中的细胞凋亡增加(例如，将肿瘤细胞凋亡增加)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施方案中，与在接受治疗之前的个体或与对照个体相比，用于使用本文所述的免疫细胞治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法可以将在个体中的肿瘤大小减少(例如，将肿瘤大小减小)至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
[0097]
在体外：如本文所用，是指在人造环境中(例如在试管或反应容器中，在细胞培养物等中)而不是在多细胞生物体内发生的事件。
[0098]
在体内：如本文所用，是指在多细胞生物体(诸如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的语境中，该术语可以用于指在活细胞内(与例如体外系统相对)发生的事件。
[0099]
分离：如本文所用，是指已经(1)在最初产生时(无论在自然界中和/或在实验设置中)从其所关联的组分中的至少一些组分中分开的物质和/或实体，和/或(2)经人工设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以从约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的它们最初所关联的其它组分中分开。在一些实施方案中，分离的药剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。在一些实施方案中，如将由本领域的技术人员所理解，在与某些其它组分(例如，一种或多种载剂或赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等))组合后，物质仍可以被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，计算不包括此类载剂或
赋形剂的物质的分离百分比或纯度。仅举一个例子，在一些实施方案中，在自然界中存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或来源而不与在自然界中在其天然状态下伴随其的一些或全部组分关联时；b)在其实质上不含与在自然界中产生其的物种相同的物种的其它多肽或核酸时；c)在由不是在自然界中产生其的物种的细胞或其它表达系统表达或以其他方式与这些细胞或其它表达系统的组分关联时，被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在与在自然界中产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施方案中，已历经一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的；和/或b)当最初产生时与其关联的其他组分分开的程度上可被认为是“分离的”多肽。
[0100]
kd：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)的复合物的解离常数。
[0101]koff
：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)的复合物解离的解离速率常数。
[0102]kon
：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)与其配偶体(例如，抗体药剂或其结合组分结合的表位)结合的结合速率常数。
[0103]
接头：如本文所用，用于指多元件多肽的将不同元件彼此连接的那个部分。例如，本领域普通技术人员会了解，其结构包括两个或更多个功能性或组织性结构域的多肽通常包括将该功能性或组织性结构域彼此连接的在此类结构域之间的氨基酸延伸段。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有通式s1-l-s2的总体结构，其中s1和s2可以是相同的或不同的，并且表示通过接头彼此缔合的两个结构域。在一些实施方案中，接头为至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，接头具有介于3个与7个之间的氨基酸、介于7个与15个之间的氨基酸、或介于20个与30个之间(例如，介于20个与25个之间或介于25个与30个之间)的氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是给多肽提供柔性。在工程化本领域已知的多肽(例如，融合多肽)时可以适当地使用各种不同的接头元件(参见例如，holliger,p.等人，1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448；poljak,r.j.等人，1994,structure 2:1121-1123)。
[0104]
多价结合抗体(或多特异性抗体)：如本文所用，是指能够结合可以在同一分子上或在不同分子上的两种或更多种抗原的抗体。在一些实施方案中，如本文所述的多价结合抗体被工程化成具有两个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的蛋白质。如本文所述的多价结合抗体是指能够结合两个或更多个相关或不相关靶的抗体。多价结合抗体可以由单个抗体部分的多个拷贝或不同抗体部分的多个拷贝构成。此类抗体能够结合两种或更多种抗原并且可以是四价或多价的。多价结合抗体可以另外地包含治疗剂，例如免疫调节剂、毒素或rnase。在一些实施方案中，如本文所述的多价结合抗体能够同时结合至少两个具有不同结构的靶，例如，两种不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位。本发明的多价结合抗体可以是单特异性的(能够结合一种抗原)或多特异性(能够结合两种或更多种抗原)，并且可以由两个重链多肽和两个轻链多肽构成。在一
些实施方案中，每个结合位点由重链可变结构域和轻链可变结构域构成，其中总共六个cdr涉及每个抗原结合位点的抗原结合。
[0105]
核酸：如本文所用，在其最广泛的意义上，是指作为寡核苷酸链或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是作为寡核苷酸链或可以通过磷酸二酯键掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文中将清楚的是，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含rna；在一些实施方案中，“核酸”是或包含dna。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含一个或多个天然核酸残基，或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是一种或多种核酸类似物，包含一种或多种核酸类似物，或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物不同于核酸，因为核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”、或由一个或多个“肽核酸”组成，这些肽核酸是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被视为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯键和/或5'-n-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。
[0106]
在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基胞苷、c-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基尿苷、c5-丙炔基胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入型碱基以及它们的组合)、包含一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的那些糖相比被修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物(诸如rna或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过下述方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸为至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基长。在一些实施方案中，核酸是单链的。在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，该至少一个元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。
[0107]
可操作地连接：如本文所用，是指其中所描述的组分处于允许它们以它们的预期方式发挥功能的关系中的并置。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，使得在与该控制序列相容的条件下实现该编码序列的表达。“可操作地连接”的序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列和按照反式或在一定距离发挥作用以控制所述感
兴趣基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括这样的组分：它们的存在对于表达和加工来说是必需的，并且还可以包括这样的附加组分，它们的存在是有利的，例如前导序列和融合伴侣序列。
[0108]
生理条件：如本文所用，具有其在本领域理解的含义，是指细胞或生物体生活和/或繁殖的条件。在一些实施方案中，该术语是指对于生物体或细胞系统可以在自然界中存在的外部或内部环境的条件。在一些实施方案中，生理条件是存在于人或非人动物体内的那些条件，尤其是存在于手术部位处和/或手术部位内的那些条件。生理条件通常包括例如20-40℃的温度范围、大气压力1、ph 6-8、1-20mm的葡萄糖浓度、在大气水平的氧浓度和如它在地球上遇到的重力。在一些实施方案中，实验室中的条件被操纵和/或维持在生理条件下。在一些实施方案中，在生物体中遇到生理条件。
[0109]
多肽：如本文所用，是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施方案中，氨基酸通过肽键或经修饰的肽键彼此连接。在一些实施方案中，多肽具有在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有不在自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有因为它是合成设计和/或产生的而被工程化的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或者由其组成。在一些实施方案中，多肽可以包含仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸，或者由仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包含d-氨基酸、l-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含d-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含l-氨基酸。
[0110]
在一些实施方案中，多肽可以包括一个或多个侧基或其它修饰，例如，在多肽的n末端、在多肽的c末端、或其任何组合，修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可以选自由以下组成的组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括它们的组合。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含stapled多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称中；在此类情形中，其在本文中用于指共享相关活性或结构并且因此可以被认为是相同类别或多肽家族的成员的多肽。对于每个这样的类别，本说明书提供了和/或本领域技术人员将了解在其氨基酸序列和/或功能已知的类别内的示例性多肽；在一些实施方案中，此类示例性多肽是多肽类别的参考多肽。
[0111]
在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员与该类别的参考多肽(在一些实施方案中，与该类别中的所有多肽)显示显著的序列同源性或同一性，共享共同的序列基序(例如，特征序列元件)和/或共享共同活性(在一些实施方案中，在相当的水平或在指定范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示与参考多肽的总体序列同源性或同一性程度为至少约30％至40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、
与其相互作用的靶。在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或确定结合剂竞争在其配偶体与另一实体之间的替代相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一系列浓度范围内执行此类检测或确定来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过确定在同源靶和非同源靶之间的结合亲和力的差异来评估特异性结合。例如，结合剂可以具有比对非同源靶的结合亲和力高约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍的对同源靶的结合亲和力。
[0116]
特异性：如本领域已知的，“特异性”是特定配体将其结合配偶体与其它潜在结合配偶体进行区分的能力的量度。
[0117]
受试者：如本文所用，意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施方案中，该受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，使用术语“个体”或“患者”，并且旨在可与“受试者”互换。本发明还考虑了药物组合物的施用和/或治疗方法在子宫中的表现。
[0118]
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或几乎全部范围或程度的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因此本文使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象固有的完全性的潜在缺乏。
[0119]
基本序列同源性：如本文所用，短语“基本同源性”是指氨基酸序列或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所了解，如果两个序列在对应的位置上含有同源的残基，则它们通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。可替代地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域的普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或被归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的置换通常可以被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类总结如下：
[0120][0121][0122]
如本领域中所熟知，氨基酸序列或核酸序列可以使用多种算法中的任何算法来进行比较，该算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法，诸如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。此类示例性程序描述于altschul等人，1990,j.mol.biol.,215(3):403-410；altschul等人，1996,meth.enzymology 266:460-480；altschul等人，1997,nucleic acids res.25:3389-3402；baxevanis等人，bioinformatics:a practical guide to the analysis of genes and proteins,wiley,1998；以及misener等人，(编辑),bioinformatics methods and protocols(methods in molecular biology，第132卷),humana press,1999。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基在残基的相关延伸段上有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多是同源的，则认为这两个序列是基本上同源的。在一些实施方案中，相关延伸段是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸段是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、
至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个或更多个残基。
[0123]
表面等离子体共振：如本文所用，是指允许实时分析特异性结合相互作用的光学现象，例如通过检测在生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变，诸如通过使用biacore系统(pharmacia biosensor ab,uppsala,sweden和piscataway,n.j.)。关于另外的描述，参见jonsson,u.等人，1993,ann.biol.clin.51:19-26；jonsson,u.等人，1991,biotechniques 11:620-627；johnsson,b.等人，1995,j.mol.recognit.8:125-131；以及johnsson,b.等人，1991,anal.biochem.198:268-277。
[0124]
治疗剂：如本文所用，通常是指当施用于生物体时引发期望的药理学效果的任何药剂。在一些实施方案中，如果药剂在适当群体中展示出统计上显著的效果，那么该药剂被视为治疗剂。在一些实施方案中，适当群体可以是模型生物体的群体。在一些实施方案中，可以通过各种标准来定义适当群体，诸如某个年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床病状等。在一些实施方案中，治疗剂是可以用于缓解、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状，延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作，降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的严重程度，和/或降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发生率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在其可以被销售供施用于人类之前已经或需要获得政府机构批准的药剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是需要医疗处方来施用于人类的药剂。
[0125]
治疗有效量：如本文所用，意指所施用的产生期望效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗给药方案施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的群体时足以治疗该疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的发生率和/或降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的严重程度和/或延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发作的量。本领域普通技术人员将了解，术语“治疗有效量”实际上不要求在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是在施用于需要这种治疗的患者时在相当多的受试者中提供特定的所需药理学反应的量。在一些实施方案中，提及治疗有效量可以指在一种或多种特定组织(例如，受疾病、病症或病状影响的组织)或流体(例如，血液、唾液、血清、汗液、眼泪、尿液等)中测量到的量。本领域的普通技术人员将会了解，在一些实施方案中，可以单剂量配制和/或施用治疗有效量的特定药剂或疗法。在一些实施方案中，可以多个剂量(例如作为给药方案的一部分)配制和/或施用治疗有效的药剂。
[0126]
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)在其最广泛的意义上是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症或病状的一种或多种症状、特征和/或病因，延迟其发作，降低其严重程度，和/或降低其发生率的物质(例如，所提供的组合物)的任何施用。在一些实施方案中，可以将这种治疗施用于未表现出相关疾病、病症和/或病状的体征的受试者和/或用于仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可以将治疗施用于表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定体征的受试者。在一些实施方案中，可以将治疗用于已被诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，可以将治疗用于已知具有与发展相关疾病、病症和/或病状的风险增加在统计学上相关的一种或
多种易感因素的受试者。
[0127]
变体：如本文所用，术语“变体”是指与参考实体相比在一个或多个化学部分的存在或水平方面显示出与参考实体显著的结构同一性但与参考实体在结构上不同的实体。在许多实施方案中，变体与其参考实体在功能上也不同。通常，特定实体是否正确被认为是参考实体的“变体”是基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将了解，任何生物学或化学参考实体具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特征性结构元件的不同化学实体。仅举几个例子，多肽可以具有由在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置和/或有助于特定生物学功能的多个氨基酸构成的特征性序列元件，核酸可以具有由在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置的多个核苷酸残基构成的特征性序列元件。例如，变体多肽可以由于氨基酸序列的一个或多个差异和/或与多肽主链共价附接的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)的一个或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施方案中，变体多肽显示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。可替代地或另外地，在一些实施方案中，变体多肽不与参考多肽共享至少一个特征性序列元件。
[0128]
在一些实施方案中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽共享参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，与参考多肽相比，变体多肽显示出一种或多种生物活性的水平降低。在许多实施方案中，如果感兴趣的多肽具有与亲本的氨基酸序列相同但在特定位置处具有少量序列改变的氨基酸序列，则认为该感兴趣的多肽是亲本或参考多肽的“变体”。通常，与亲本相比，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被置换。在一些实施方案中，与亲本相比，变体具有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换的残基。通常，变体具有非常少量(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的置换的官能残基(即，参与特定生物活性的残基)的数量。此外，与亲本相比，变体通常具有不超过5个、4个、3个、2个或1个插入或缺失，并且通常没有插入或缺失。此外，任何添加或缺失通常都少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个，并且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲本或参考多肽是在自然界中存在的多肽。如本领域普通技术人员将理解，特定感兴趣的多肽的多个变体通常可以在自然界中存在，特别是当感兴趣的多肽是感染因子多肽时。
[0129]
载体：如本文所用，是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的dna区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。可以将其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体在引入宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
[0130]
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有其本领域理解的含义，是指具有如在自然界中在“正常”(相对于突变的、变异的、患病的、改变的等)状态或环境中存在的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将会了解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式
(例如，等位基因)存在。
附图说明
[0131]
图1：通过表达以下的t细胞的t细胞介导的短期靶细胞杀伤：(1)抗afp-cd28z-car；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr；(3)抗afp-cd8t-z-car；或(4)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr。
[0132]
图2a和图2b：表达以下的t细胞：(1)抗afp-cd28z-car；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr；(3)抗afp-cd8t-z-car；或(4)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr具有比没有csr的对应car t细胞高得多的ifnγ(图2a)和颗粒酶b(图2b)(t细胞活性/杀伤能力两者的指示器)分泌水平。
[0133]
图3a和图3b：hepg2(a2

/afp

/gpc3

)靶细胞由表达以下第1代car构建体的t细胞介导的t细胞存活和杀伤的结果：(1)抗afp-cd8t-z-car；(2)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd28-csr；或(3)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr。表达抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd28-csr或抗afp-cd8-z-car 抗gpc3-cd30-csr的t细胞的存活远远好于模拟物转导的t细胞和仅表达对应car的t细胞(图3a)。进一步地，表达抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd28-csr或抗afp-cd8-z-car 抗gpc3-cd30-csr的t细胞杀死的靶细胞远远多于仅表达对应car的t细胞(图3b)。
[0134]
图3c和图3d：hepg2(a2

/afp

/gpc3

)靶细胞由表达以下第2代car构建体的t细胞介导的t细胞存活和杀伤的结果：(1)抗afp-cd28z-car；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd28-csr；或(3)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr。表达抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd28-csr或抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr的t细胞的存活远远好于模拟物转导的t细胞和仅表达对应car的t细胞(图3c)。进一步地，表达抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd28-csr或抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr的t细胞杀死的靶细胞远远多于仅表达对应car的t细胞(图3d)。
[0135]
图4：为了可视化从施用过以下细胞的小鼠切下的肿瘤中的t细胞而用抗cd3抗体染色的肿瘤切片的图像：(1)模拟物转导的t细胞；(2)表达αafp-cd28z-car的t细胞；(3)表达αafp-cd28z-car αgpc3-cd28-csr的t细胞；或(4)表达αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr的t细胞。蓝色细胞是表示在“模拟物”图像中的所有细胞的肿瘤细胞，而棕色细胞是表示在“αafp-cd28z-car”图像中的所有细胞的小于5％、在“αafp-cd28z-car αgpc3-cd28-csr”图像中的所有细胞的约三分之一、以及在“αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr”图像中的所有细胞的约一半的t细胞。
[0136]
图5：在来自稍后用表达以下的t细胞治疗的植入hepg的小鼠的多个肿瘤切片中cd3

细胞(t细胞)在所有细胞(包括肿瘤细胞和cd3

细胞)中的百分比的定量：(1)αafp-cd28z-car；(2)αafp-cd28z-car αgpc3-cd28-csr；或(3)αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr。
[0137]
图6：为了可视化从施用过以下细胞的小鼠切下的肿瘤中的t细胞而用抗cd3抗体染色的肿瘤切片的图像：(1)模拟物转导的t细胞；(2)表达αgpc3-cd28z-car的t细胞；或(3)表达αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr的t细胞。蓝色细胞是表示在“模拟物”图像中的所有细胞的肿瘤细胞，而棕色细胞是表示在“αgpc3-cd28z-car”图像中的所有细胞的约四分
之一、以及在“αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr”图像中的所有细胞的约一半的t细胞。
[0138]
图7：在来自稍后用表达以下的t细胞治疗的植入hepg的小鼠的多个肿瘤切片中cd3

细胞(t细胞)在所有细胞(包括肿瘤细胞和cd3

细胞)中的百分比的定量：(第1组)αgpc3-cd28z-car；(第2组)αgpc3-cd30t-cd28-csr；或(第3组)αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr。
[0139]
图8a和图8b：表达抗cd19-cd8t-41bbz-car 抗cd19-cd28t-cd30-csr或抗cd19-cd8t-z-car 抗cd19-cd30-csr的t细胞的ifnγ(t细胞活性/杀伤能力的指示器)分泌水平远远高于表达抗cd19-cd8t-41bbz-car 抗cd19-cd28t-41bb-csr或抗cd19-cd8t-z-car 抗cd19-cd28-csr的对应t细胞。
[0140]
图9：表达抗ror1-cd8t-41bbz-car 抗ror1-cd28t-cd30-csr的t细胞(“tcd30”)与模拟物转导的t细胞相比对所有六种测试的癌症细胞系具有显著的ror1特异性细胞杀伤能力(通过ifnγ释放水平所测量)，并且它们的细胞杀伤能力相当于或好于共表达包含4-1bb共刺激结构域的csr的对应car t细胞(“t41bb”)。
[0141]
图10a至图10d：αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-cd30-csr t细胞(“tcd30”)和αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-41bb-csr t细胞(“t41bb”)分别在癌症细胞系mda-mb-231、a549、h1975和h1703的多重挑战下的存活率。所显示的总细胞#为t细胞数。
具体实施方式
[0142]
其中将患者自身的t淋巴细胞工程化以表达嵌合抗原受体(car)的过继性t细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面已经显示出很大的前景，但在实体瘤中没有如此大的前景。另外，即使通常使用的共刺激片段(无论是以顺式表达还是以反式表达)，car本身也通常不是足够有效的，尤其是对于实体瘤。因此，需要更为有效且更长持续时间的t细胞免疫疗法。
[0143]
在本文中我们公开了car和csr(特别是包含cd30共刺激片段的csr)的共表达将对靶向低密度抗原的任何car t细胞有益。大多数mhc限制性肽抗原和实体瘤抗原具有低密度。然而，甚至一些血癌相关的细胞表面抗原(例如，cd22)也具有低密度。当用于治疗实体瘤时，表达car和cd30-csr的t细胞具有增加的肿瘤浸润。
[0144]
本发明涉及使用来自cd30的共刺激结构域(在本文中也称为cd30共刺激结构域)的csr的发现，并且表达这些csr和car的t细胞的pd-1(t细胞激活抑制剂)表达远远少于具有相同car和含有来自例如cd28或4-1bb的共刺激结构域的csr的t细胞。在一些实施方案中，具有含有来自cd30的共刺激结构域的csr的t细胞表达比具有含有来自dap10的共刺激结构域的csr的t细胞少得多的pd-1。具有car和包含cd30共刺激结构域的csr的t细胞提供了优异的肿瘤细胞杀伤持续性。本发明还提供了此类t细胞治疗癌症的用途。(例如，血液癌或实体瘤癌症)。
[0145]
i.嵌合抗原受体(car)
[0146]
本公开提供了免疫细胞，该免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)和嵌合刺激受体(csr)。car包含(i)包含抗体部分(car抗体部分)的细胞外靶结合结构域；(ii)跨膜结构域(car跨膜结构域)；和(iii)初级信号传导结构域。在一些实施方案中，car还包含共刺激结构域(car共刺激结构域)。在一些实施方案中，car共刺激结构域衍生自共刺激受体的细胞
内结构域，该共刺激受体例如为选自由以下组成的组的共刺激受体：cd30、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性地结合的配体和dap10。本文所述的car的示例性序列可以在非正式序列表的表格中找到，例如，seq id no:1-12。在一些实施方案中，将具有myc标签的car用于体外和临床前测定。对于体内使用(即在人类中的体内使用)，使用不含myc标签的对应car构建体。
[0147]
在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于car的细胞外靶结合结构域与跨膜结构域之间。在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于car的跨膜结构域与共刺激结构域(如果存在)之间。在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于car的共刺激结构域(如果存在)与初级信号传导结构域之间。在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于car的跨膜结构域与初级信号传导结构域之间。间隔结构域可以是用于连接car的两个部分的任何寡核苷酸或多肽。间隔结构域可以包含至多约300个氨基酸，包括例如约10个至约100个或约25个至约50个氨基酸。
[0148]
ii.嵌合刺激受体(csr)
[0149]
本公开提供了嵌合刺激受体(csr)，也被我们称为嵌合信号传导受体，该csr包含：(i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；(ii)跨膜结构域(csr跨膜结构域)；和(iii)cd30共刺激结构域，其中该csr缺乏功能性初级信号传导结构域。本文所描述的csr特异性地结合靶配体(诸如细胞表面抗原或肽/mhc复合物)并且能够在靶配体结合时在其功能性地表达的表面上刺激免疫细胞。csr包含提供配体结合特异性的配体结合模块、跨膜模块和允许刺激免疫细胞的cd30共刺激免疫细胞信号传导模块。csr缺乏功能性的初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，csr缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施方案中，csr包含单个多肽链，该单个多肽链包含配体结合模块、跨膜模块和cd30共刺激信号传导模块。在一些实施方案中，csr包含第一多肽链和第二多肽链，其中该第一多肽链和该第二多肽链一起形成配体结合模块、跨膜模块和cd30共刺激信号传导模块。在一些实施方案中，该第一多肽链和该第二多肽链是单独的多肽链，并且csr是多聚体，诸如二聚体。在一些实施方案中，该第一多肽链和该第二多肽链诸如通过肽键或通过另一种化学键(诸如二硫键)共价地连接。在一些实施方案中，该第一多肽链和该第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施方案中，在car加csr免疫细胞中的csr表达是诱导型的。在一些实施方案中，在car加csr免疫细胞中的csr表达在通过car信号传导时是可诱导的。本文所述的csr的示例性序列可以在非正式序列表的表格中找到，例如，seq id no:13-42。在一些实施方案中，将具有myc标签的csr用于体外和临床前测定。对于体内使用(即在人类中的体内使用)，使用不含myc标签的对应csr构建体。
[0150]
csr的cd30共刺激结构域可以包含可以与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列。在一些实施方案中，可以与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列对应于具有序列seq id no:65的全长cd30的残基561-573或578-586。在某些实施方案中，cd30共刺激结构域包含与seq id no:65的残基561-573或578-586至少80％、85％、90％、95％或100％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。在某些实施方案中，cd30共刺激结构域包含与seq id no:75的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。如本文所述，具有car和包含来自cd30的共刺激结构域的csr的免疫t细胞表达的pd-1(t细胞激活抑制剂)远远少于具有相同car和不具有cd30共刺激结构域(例如，来自例如cd28、4-1bb或dap10的共刺激结构域)的对应csr的t细胞。具有含有来自cd30的共刺激结构域的csr的t细胞也表现出细胞毒性潜力的持久性。来自cd30的共刺激结构域可以改善导致t细胞耗竭的功能无反应性，即应变力缺乏。cd30共刺激结构域向t细胞提供优异的肿瘤细胞杀伤持久性的能力是出乎意料的，因为cd30缺乏被认为对共刺激至关重要的p56lck结合位点。
[0151]
csr可以包含多于一个cd30共刺激结构域。除了cd30共刺激结构域之外，在一些实施方案中，csr还包含至少一个共刺激结构域，该至少一个共刺激结构域包含与cd30不同的共刺激分子的细胞内序列。在特定实施方案中，与cd30不同的共刺激分子选自由以下组成的组：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性地结合的配体和dap10。
[0152]
在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于csr的配体结合模块与跨膜结构域之间。在一些实施方案中，间隔结构域可以存在于csr的跨膜结构域与cd30共刺激结构域之间。间隔结构域可以是用于连接car的两个部分的任何寡核苷酸或多肽。间隔结构域可以包含至多约300个氨基酸，包括例如约10个至约100个或约25个至约50个氨基酸。
[0153]
靶抗原
[0154]
在一些实施方案中，car的细胞外靶结合结构域和csr的配体结合模块可以靶向相同的靶抗原。在其它实施方案中，car的细胞外靶结合结构域和csr的配体结合模块可以靶向不同的靶抗原。在一些实施方案中，csr的配体结合模块衍生自受体的细胞外结构域。csr的配体结合模块可以包含抗体部分(csr抗体部分)。csr抗体部分和/或car抗体部分可以是单链抗体片段。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单链fv(scfv)、单链fab、单链fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异性抗体、细胞内抗体(intrabody)、纳米抗体(nanobody)或单链免疫因子(immunokine)。在某些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单结构域多特异性抗体，例如，单结构域双特异性抗体。在某些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分是单链fv(scfv)，例如串联scfv。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr抗体部分与疾病相关抗原特异性地结合。疾病相关抗原可以是癌症相关抗原或病毒相关抗原。
[0155]
car抗体部分和/或csr抗体部分可以特异性地结合细胞表面抗原。细胞表面抗原可以选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质。在某些实施方案中，细胞表面抗原是cd19、cd20、cd22、cd47、cd158e、gpc3、ror1、ror2、bcma、gprc5d、fcrl5、muc16、mct4、psma或它们的变体或突变体。car抗体部分和/或csr抗体部分可以特异性地结合mhc限制性抗原。mhc限制性抗原可以是包含肽和mhc蛋白的复合物，并且该肽可以衍生自选自由以下组成的组的蛋白质：wt-1、afp、hpv16-e7、ny-eso-1、prame、ebv-lmp2a、hiv-1、kras、foxp3、组蛋白h3.3、psa以及它们的变体或突变体。
[0156]
在一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且其中该csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一
些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd19，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd20。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd22，并且csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd19。在一些实施方案中，car抗体部分结合cd20，并且csr的配体结合模块结合cd22。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19和cd22两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19和cd20两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd20和cd22两者。在一些实施方案中，car抗体部分和/或csr的配体结合模块结合cd19、cd20和cd22。
[0157]
在一些实施方案中，car抗体部分特异性地结合包含甲胎蛋白(afp)肽和mhc i类蛋白的复合物。在一些实施方案中，csr的配体结合模块特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)。在一些实施方案中，car抗体部分结合包含afp肽和mhc i类蛋白的复合物，并且csr的配体结合模块结合gpc3。
[0158]
在一些实施方案中，根据本文所述的包含与靶抗原特异性地结合的抗体部分的car或csr中的任一个car或csr，该抗体部分包含对该靶抗原具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd19具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2017/066136a2)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd19具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:102的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:103的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd20具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:104的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:105的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd22具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，2018年3月30日提交的ussn 62/650,955和2019年3月29日提交的pct/us2019/025032)，它们的内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd22具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:98的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:99的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd22具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:100的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:101的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd47具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2018/200585a1)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对cd47具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:106的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:107的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。
[0159]
在一些实施方案中，该抗体部分包含对gpc3具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2018/200586a1，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对gpc3具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:108的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:109的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对gpc3具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(例如，包含seq id no:110的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的vh结构域、和/或包含seq id no:111的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的v
l
结构域、或在其中所含的cdr)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ror1具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/187220和wo2016/187216)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ror2具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/142768)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对bcma具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/090327和wo2016/090320)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对gprc5d具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/090329和wo2016/090312)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对fcrl5具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/090337)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对muc16具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，2019年5月8日提交的ussn 62/845,065和2018年11月16日提交的ussn 62/768,730，它们的内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对mct4具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，2019年3月21日提交的pct/us2019/023402，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对psma具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，2019年6月17日提交的pct/us2019/037534，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对wt-1肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2012/135854、wo2015/070078和wo2015/070061)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对afp肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/161390)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对hpv16-e7肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/182957)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ny-eso-1肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/210365)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对prame肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/191246)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对ebv-lmp2a肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/201124)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对kras肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2016/154047)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对psa肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2017/015634)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对foxp3肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域
(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，2018年2月14日提交的pct/us2019/018112，其内容以全文引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对组蛋白h3.3肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2018/132597)。在一些实施方案中，该抗体部分包含对hiv-1肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分的cdr或可变结构域(vh和/或v
l
结构域)(参见例如，wo2018057967)。在一些实施方案中，该抗体部分是包含vh结构域和v
l
结构域的scfv(单链可变片段)。在一些实施方案中，该scfv包含抗原结合模块，该抗原结合模块特异性地结合包含肽和mhc蛋白的复合物(称为肽/mhc复合物)。
[0160]
表a列出了其片段或肽可以通过car和csr靶向的示例性蛋白质。还列出了这种t细胞可以治疗的可能疾病，特别是可能的癌症(例如，实体瘤癌症)。
[0161]
表a
[0162][0163]
细胞外靶结合结构域/配体结合模块
[0164]
本文所述的car的细胞外靶结合结构域和/或csr的配体结合模块可以包含抗体部分或其抗原结合片段。在某些实施方案中，细胞外靶结合结构域可以是衍生自抗体的单链可变片段(scfv)、串联scfv、单结构域抗体片段(vhh或sdab)、单结构域双特异性抗体(bsab)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、以及单链形式的fab、fab'或(fab’)2。在其它实施方案中，细胞外靶结合结构域可以是包含可变片段的共价结合的多条链的抗体部分。细胞外靶结合结构域可以经由柔性铰链/间隔区连接到tm结构域。
[0165]
scfv和串联scfv
[0166]
本文所述的car的细胞外靶结合结构域和/或csr的配体结合模块可以包含作为单链fv(scfv)抗体的抗体部分。scfv抗体可以包含轻链可变区和重链可变区，其中该轻链可变区和该重链可变区可以通过合成接头使用重组方法连接以制备单个多肽链。在一些实施方案中，scfv可以具有结构“(n末端)轻链可变区-接头-重链可变区(c末端)”，其中该重链可变区通过接头连接到轻链可变区的c末端。在其它实施方案中，scfv可以具有结构“(n末端)重链可变区-接头-轻链可变区(c末端)”，其中该轻链可变区通过接头连接到重链可变
区的c末端。接头可以是包含2个至200个(例如，2个、3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个)氨基酸的多肽。合适的接头可以含有柔性氨基酸残基，诸如甘氨酸和丝氨酸。
[0167]
car的细胞外靶结合结构域和/或csr的配体结合模块可以包含抗体部分，该抗体部分是包含第一scfv和第二scfv的串联scfv(在本文中也称为“串联scfv多特异性抗体”)。在一些实施方案中，串联scfv多特异性抗体还包含至少一个(诸如至少约2个、3个、4个、5个或更多个中的任一者)另外的scfv。
[0168]
在一些实施方案中，提供了串联scfv多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含a)与靶配体的细胞外区域特异性地结合的第一scfv、以及b)第二scfv。在一些实施方案中，靶配体是cd22，并且第一scfv特异性地结合cd22的细胞外区域。在一些实施方案中，靶配体是cd19，并且第一scfv特异性地结合cd19的细胞外区域。在一些实施方案中，靶配体是甲胎蛋白(afp)肽，并且第一scfv特异性地结合afp肽的细胞外区域。
[0169]
在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合另一种抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合癌细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合不表达cd22的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合不表达cd19的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合不表达afp肽的细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合细胞毒性细胞表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合淋巴细胞表面上的抗原，该淋巴细胞诸如t细胞、nk细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合效应t细胞(诸如细胞毒性t细胞)表面上的抗原。在一些实施方案中，第二scfv特异性地结合效应细胞表面上的抗原，包括例如cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd28、cd16a、cd56、cd68、gds2d、ox40、gitr、cd137、cd27、cd40l和hvem。
[0170]
在一些实施方案中，第一scfv是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，第二scfv是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，第一scfv和第二scfv两者都是人的、人源化的或半合成的。在一些实施方案中，串联scfv多特异性抗体还包含至少一个(诸如至少约2个、3个、4个、5个或更多个中的任一者)另外的scfv。
[0171]
在一些实施方案中，提供了串联scfv多特异性(例如，双特异性)抗体，其包含a)与靶抗原的细胞外区域特异性地结合的第一scfv、以及b)第二scfv，其中该串联scfv多特异性抗体是串联二scfv或串联三scfv。在一些实施方案中，串联scfv多特异性抗体是串联二scfv。在一些实施方案中，串联scfv多特异性抗体是双特异性t细胞衔接器。
[0172]
在一些实施方案中，串联二scfv双特异性抗体以如下kd与靶抗原的细胞外区域或其一部分结合，该kd介于约0.1pm至约500nm之间(诸如约0.1pm、1.0pm、10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、10nm、50nm、100nm或500nm中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。在一些实施方案中，串联二scfv双特异性抗体以如下kd与靶抗原的细胞外区域或其一部分结合，该kd介于约1nm至约500nm之间(诸如约1nm、10nm、25nm、50nm、75nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm中的任一者，包括这些值之间的任何范围)。
[0173]
在本领域中已知多种技术用于设计、构建和/或产生多特异性抗体。可以构建利用全长免疫球蛋白框架(例如，igg)、单链可变片段(scfv)或其组合的多特异性抗体。双特异
性抗体可以由如上文所描述的两个scfv单元构成。在抗肿瘤免疫疗法的情况下，包含两个串联的单链可变片段(scfv)的双特异性抗体可以被设计成使得结合肿瘤抗原的scfv与接合t细胞(即，通过结合t细胞上的cd3)的scfv连接。因此，t细胞被募集到肿瘤位点以介导对肿瘤细胞的杀伤。可以例如通过将识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链组合来制备双特异性抗体。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂结合在其两个结合臂中的一个结合臂(一个vh/v
l
对)上的一个抗原(或表位)，并且结合在其第二臂(不同的vh/v
l
对)上的不同抗原(或表位)。通过该定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和cdr序列两者中)，并且对于其结合的每个抗原是单价的。在某些实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂包含第一scfv和第二scfv。在一些某些实施方案中，第一scfv连接到第二scfv的c末端。在一些某些实施方案中，第二scfv连接到第一scfv的c末端。在一些某些实施方案中，scfv通过接头(例如，srggggsggggsggggslema(seq id no:78))彼此连接。在一些某些实施方案中，scfv在没有接头的情况下彼此连接。
[0174]
接头可以是包含2个至200个(例如，2个、3个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个)氨基酸的多肽。合适的接头可以含有柔性氨基酸残基，诸如甘氨酸和丝氨酸。在某些实施方案中，接头可以含有gs、ggs、ggggs(seq id no:79)、ggsg(seq id no:80)或sggg(seq id no:81)的基序(例如多个或重复基序)。在一些实施方案中，接头可以具有序列gsgs(seq id no:82)、gsgsgs(seq id no:83)、gsgsgsgs(seq id no:84)、gsgsgsgsgs(seq id no:85)、ggsggs(seq id no:86)、ggsggsggs(seq id no:87)、ggsggsggsggs(seq id no:88)、ggsg(seq id no:89)、ggsgggsg(seq id no:90)或ggsgggsgggsg(seq id no:91)。在其它实施方案中，接头还可以含有除甘氨酸和丝氨酸以外的氨基酸，例如，srggggsggggsggggslema(seq id no:78)。
[0175]
跨膜结构域(tm)
[0176]
car和/或csr的跨膜结构域可以源自天然来源或来自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自t细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链、cd28、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd30、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154(即，至少包含它们的跨膜区)。在一些实施方案中，可以基于例如结合跨膜结构域或由跨膜结构域诱导的细胞因子的各种其它蛋白质或反式元件的性质来选择跨膜结构域。例如，衍生自cd30的跨膜结构域缺乏p56lck激酶的结合位点、tnf受体家族中的共同基序。在一些实施方案中，本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自cd8(即，至少包含它的跨膜区)，例如，包含与seq id no:66的序列具有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列的跨膜区。在一些实施方案中，本发明中特别使用的跨膜区可以衍生自cd30(即，至少包含它的跨膜区)，例如，包含与seq id no:70的序列具有至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列的跨膜区。
[0177]
在某些实施方案中，可以基于靶抗原选择跨膜结构域。例如，含有对afp肽/mhc复合物具有特异性的抗体部分和衍生自cd8的跨膜结构域的car似乎具有比含有衍生自cd30
的跨膜结构域的对应car更好的体外杀伤特性。在含有对cd19具有特异性的抗体部分的car中未观察到此结果。
[0178]
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其可以主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，可以在合成跨膜结构域的每个末端找到苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，具有例如介于约2个与约10个之间(诸如约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个中的任一者)的氨基酸长度的短的寡肽或多肽接头可以形成在本文所述的car或csr的跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，在car的细胞外靶结合结构域和/或csr的配体结合模块与跨膜结构域之间的接头包含分子(诸如与跨膜结构域原始分子相同或不同的分子)的部分细胞外结构域(ecd)。例如，连接衍生自或包含cd8或cd30的跨膜结构域的接头可以分别或可替代地包含cd8或cd30的ecd。
[0179]
在一些实施方案中，使用天然与car或csr的细胞内信号传导结构域中的序列之一相关的跨膜结构域。在一些实施方案中，可以通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
[0180]
细胞内信号传导结构域
[0181]
car和/或csr的细胞内信号传导结构域负责激活car和csr已经置于其中的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的一部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的情况下，可以使用这种截短的部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号即可。因此，术语“细胞内信号传导结构域”意在包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
[0182]
用于使用的细胞内信号传导结构域的实例包括t细胞受体(tcr)和协同起作用以引发抗原受体接合后的信号转导的共同受体的细胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
[0183]
已知通过单独的tcr产生的信号不足以完全激活t细胞并且还需要二级或共刺激信号。因此，t细胞激活可以说是由两个不同类别的细胞内信号传导序列介导：通过tcr(初级信号传导序列)引发抗原依赖性初级激活的那些和以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号(共刺激信号传导序列)的那些。
[0184]
初级信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam)。在一些实施方案中，本文所述的car包含一个或多个itam。
[0185]
含有在本发明中特别使用的初级信号传导序列的itam的实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一些实施方案中，含有初级信号传导序列的itam衍生自cd3ζ。
[0186]
在一些实施方案中，car包含衍生自cd3ζ的初级信号传导序列。例如，car的细胞内信号传导结构域可以包含cd3ζ细胞内信号传导序列它本身或与在本发明的car的上下文中
有用的任何其它期望的细胞内信号传导序列组合。例如，car的细胞内信号传导结构域可以包含cd3ζ初级细胞内信号传导序列和共刺激信号传导序列。
[0187]
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域能够激活免疫细胞。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导序列和共刺激信号传导序列。在一些实施方案中，初级信号传导序列包含cd3ζ细胞内信号传导序列。在一些实施方案中，共刺激信号传导序列包含cd30细胞内信号传导序列。
[0188]
iii.多特异性抗体
[0189]
car的细胞外靶结合结构域和/或csr的配体结合模块可以包含作为多特异性抗体的抗体部分。多特异性抗体可以包含第一结合部分和第二结合部分(诸如第二抗原结合部分)。多特异性抗体是对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性(例如，双特异性抗体对两种抗原或表位具有结合特异性)的抗体。还设想了具有超过两种特异性的多特异性抗体。例如，可以制备三特异性抗体(参见例如，tutt等人，j.immunol.147:60(1991))。应当了解，本领域技术人员可以选择本文所述的单个多特异性抗体的适当特征以彼此组合形成本发明的多特异性抗体。
[0190]
因此，例如，在一些实施方案中，提供了包含a)与第一靶抗原的细胞外区域特异性地结合的第一结合部分和b)第二结合部分(诸如抗原结合部分)的多特异性(例如，双特异性)抗体。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合不同的靶抗原。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合在细胞(诸如细胞毒性细胞)的表面上的抗原。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合淋巴细胞表面上的抗原，该淋巴细胞诸如t细胞、nk细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合效应t细胞，诸如细胞毒性t细胞(也称为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)或t杀伤细胞)。
[0191]
在一些实施方案中，第二结合部分特异性地结合肿瘤抗原。肿瘤抗原的实例包括但不限于甲胎蛋白(afp)、ca15-3、ca27-29、ca19-9、ca-125、钙视网膜蛋白、癌胚抗原、cd34、cd99、cd117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、上皮膜蛋白(ema)、因子viii、cd31 fl1、胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液状蛋白(gcdfp-15)、hmb-45、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、抑制素、角蛋白、cd45、淋巴细胞标志物mart-1(melan-a)、myo dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶(plap)、前列腺特异性抗原、s100蛋白、平滑肌肌动蛋白(sma)、突触囊泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、肿瘤m2-pk、和波形蛋白。
[0192]
在一些实施方案中，双特异性抗体中的第二抗原结合部分结合cd3。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合cd3ε。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合cd3ε的激动性表位。如本文所用，术语“激动性表位”意指(a)在多特异性抗体结合时，任选地在结合同一细胞上的若干种多特异性抗体时，允许所述多特异性抗体激活t细胞受体(tcr)信号传导并诱导t细胞激活的表位，和/或(b)仅由cd3的ε链的氨基酸残基构成并且当在t细胞上在其天然环境中呈现(即，被tcr、cd3γ链等包围)时可接近以被所述多特异性抗体结合的表位，和/或(c)在结合所述多特异性抗体时不会导致cd3ε相对于cd3γ的空间位置的稳定化的表位。
[0193]
在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合效应细胞表面上的抗原，包
括例如cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd28、cd16a、cd56、cd68、gds2d、ox40、gitr、cd137、cd27、cd40l和hvem。在其它实施方案中，第二抗原结合部分结合补体系统的组分(诸如c1q)。c1q是激活血清补体系统的c1酶复合物的亚基。在其它实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合fc受体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合fcγ受体(fcγr)。fcγr可以是自然杀伤(nk)细胞表面上存在的fcγriii、或者在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞表面上存在的fcγri、fcγriia、fcγriibi、fcγriib2和fcγriiib中的一个。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是fc区或其功能片段。如在该上下文中使用的“功能片段”是指抗体fc区的片段，其仍然能够以足够的特异性和亲和力与fcr结合(特别是与fcγr结合)以允许携带fcγr的效应细胞(特别是巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞)通过细胞毒性裂解或吞噬作用杀死靶细胞。功能性fc片段能够竞争性地抑制原始的全长fc部分与fcr(诸如激活fcγri)的结合。在一些实施方案中，功能性fc片段保留其对激活fcγr的亲和力的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，fc区或其功能片段是增强的fc区或其功能片段。如本文所用，术语“增强的fc区”是指被修饰以增强fc受体介导的效应子功能(特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体介导的吞噬作用)的fc区。这可以如本领域已知的那样实现，例如通过以导致对在自然杀伤(nk)细胞上表达的激活受体(例如，在自然杀伤(nk)细胞上表达的fcγriiia(cd16a))的亲和力增加和/或与抑制性受体(例如，fcγriib1/b2(cd32b))的结合降低的方式改变fc区。
[0194]
在一些实施方案中，多特异性抗体允许杀死抗原呈递靶细胞和/或可以有效地重定向ctl以裂解呈递靶的靶细胞。在一些实施方案中，本发明的多特异性(例如，双特异性)抗体显示范围为10ng/ml至500ng/ml的体外ec50，并且能够以约1:1至约50:1(诸如从约1:1至约15:1或从约2:1至约10:1)的ctl与靶细胞的比率通过ctl诱导约50％靶细胞的重定向裂解。
[0195]
在一些实施方案中，多特异性(例如，双特异性)抗体能够以裂解靶细胞的方式交联刺激或未刺激的ctl和靶细胞。这提供了多特异性抗体发挥其期望的活性不需要靶特异性t细胞克隆的产生或树突状细胞的常见抗原呈递的优点。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体能够重定向ctl以在不存在其它激活信号的情况下裂解靶细胞。在一些实施方案中，第二抗原结合部分特异性地结合cd3(例如，特异性地结合cd3ε)，并且不需要通过cd28和/或il-2的信号传导来重定向ctl以裂解靶细胞。
[0196]
用于测量多特异性抗体同时结合两种抗原(例如，在两种不同细胞上的抗原)的偏好的方法在本领域技术人员的正常能力范围内。例如，当第二结合部分特异性地结合第二抗原时，可以将多特异性抗体与第一抗原

/第二抗原-细胞和第一抗原-/第二抗原

细胞的混合物接触。然后，可以通过本领域已知的显微镜检查或荧光激活细胞分选(facs)评估多特异性抗体阳性单细胞的数量和通过多特异性抗体交联的细胞数量。
[0197]
在一些实施方案中，多特异性抗体是例如双抗体(db)、单链双抗体(scdb)、串联scdb(tandab)、线性二聚体scdb(ld-scdb)、环状二聚体scdb(cd-scdb)、二-双抗体、串联scfv、串联双scfv(例如，双特异性t细胞衔接器)、串联三scfv、三抗体、双特异性fab2、二-微抗体、四抗体、scfv-fc-scfv融合物、双亲和力再靶向(dart)抗体、双可变结构域(dvd)抗体、igg-scfab、scfab-ds-scfv、fv2-fc、igg-scfv融合物、对接和锁定(dock and lock，
dnl)抗体、杵臼结构(kih)抗体(由kih技术制备的双特异性igg)、duobody(由duobody技术制备的双特异性igg)、单结构域抗体片段(vhh或sdab)、单结构域双特异性抗体(bsab)、细胞内抗体、纳米抗体、单链形式的免疫因子、异源内聚体抗体或异源缀合物抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是单链抗体片段。在一些实施方案中，多特异性抗体是串联scfv(例如，串联双scfv，诸如双特异性t细胞衔接器)。
[0198]
iv.抗体-药物缀合物
[0199]
在一些实施方案中，提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含抗体部分和治疗剂(在本文中也称为“抗体-药物缀合物”或“adc”)。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性的、细胞抑制的或以其它方式防止或降低靶细胞分裂的能力的毒素。使用adc来局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)(syrigos和epenetos,anticancer research 19:605-614(1999)；niculescu-duvaz和springer,adv.drg.del.rev.26:151-172(1997)；美国专利号4,975,278)允许将药物部分靶向递送至靶细胞和在其中的细胞内积累，其中这些未缀合治疗剂的全身施用可能导致对正常细胞以及寻找被消除的靶细胞的不可接受的毒性水平(baldwin等人，lancet(mar.15,1986):603-605(1986)；thorpe,(1985)“antibody carriers of cytotoxic agents in cancer therapy:a review，”在monoclonal antibodies'84:biological and clinical applications中，a.pinchera等人(编辑)，第475-506页)。由此在最小毒性的情况下寻求最大功效。
[0200]
在免疫缀合物(例如，adc)中使用的治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(rowland等人，cancer immunol.immunother.21:183-187(1986))。在免疫缀合物中使用的毒素包括细菌毒素，诸如白喉毒素、植物毒素(诸如篦麻毒素)、小分子毒素(诸如格尔德霉素)(mandler等人，j.nat.cancer inst.92(19):1573-1581(2000)；mandler等人，bioorganic&med.chem.letters 10:1025-1028(2000)；mandler等人，bioconjugate chem.13:786-791(2002))、美登木素(maytansinoid)(ep 1391213；liu等人，proc.natl.acad.sci.usa93:8618-8623(1996))和卡奇霉素(lode等人，cancer res.58:2928(1998)；hinman等人，cancer res.53:3336-3342(1993))。毒素可以通过包括微管蛋白结合、dna结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。当与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或具有较少活性。
[0201]
可以使用的酶促活性毒素及其片段包括例如白喉毒素a链、白喉毒素的非结合活性片段、(来自铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的)外毒素a链、篦麻毒素a链、相思豆毒蛋白(abrin)a链、蒴莲根毒素a链、α八叠球菌素(α-sarcin)、油桐(aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的wo 93/21232。
[0202]
本文还设想了抗体部分和一种或多种小分子毒素的免疫缀合物(例如，adc)，该小分子毒素诸如卡奇霉素、美登木素、多拉司他汀、aurostatin、单端孢霉烯和cc1065、以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。
[0203]
在一些实施方案中，提供了包含具有细胞内活性的治疗剂的免疫缀合物(例如，
adc)。在一些实施方案中，免疫缀合物是内化的并且治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成细胞毒素，从而导致细胞死亡。在一些实施方案中，治疗剂是包含具有核糖体灭活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒素、蓖麻毒素a链、bryodin、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素a以及它们的变体。在一些实施方案中，在治疗剂是包含具有核糖体灭活活性的多肽的细胞毒素的情况下，免疫缀合物必须在与靶细胞结合时内化以便使蛋白质对细胞产生细胞毒性。
[0204]
在一些实施方案中，提供了包含用于破坏dna的治疗剂的免疫缀合物(例如，adc)。在一些实施方案中，用于破坏dna的治疗剂例如选自由以下组成的组：烯二炔(enediyne)(例如，卡奇霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子药剂(例如，博来霉素、甲锭丙基-edta-fe(ii))。
[0205]
本发明还设想了在抗体部分与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或dna内切核酸酶(诸如脱氧核糖核酸酶；dnase))之间形成的免疫缀合物(例如，adc)。
[0206]
在一些实施方案中，免疫缀合物包含用于破坏微管蛋白的药剂。此类药剂可以包括例如根霉素/美坦辛、紫杉醇、长春新碱和长春碱、秋水仙碱、auristatin、多拉司他汀10mmae和peloruside a。
[0207]
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，adc)包含烷化剂，该烷化剂包括例如asaley nsc 167780、azq nsc 182986、bcnu nsc 409962、白消安nsc 750、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)nsc271674、cbdca nsc 241240、ccnu nsc 79037、chip nsc 256927、瘤可宁nsc 3088、氯脲菌素nsc 178248、顺铂nsc 119875、氯乙矾nsc338947、氰基吗啉代多柔比星nsc 357704、cyclodisone nsc 348948、环氧乳醇nsc 132313、氟多潘nsc 73754、hepsulfam nsc 329680、海恩酮nsc 142982、美法仑nsc 8806、甲基ccnu nsc 95441、丝裂霉素c nsc26980、mitozolamide nsc 353451、氮芥nsc 762、pcnu nsc 95466、哌嗪nsc 344007、哌嗪双酮nsc 135758、哌泊溴烷nsc 25154、泊非霉素nsc 56410、螺乙内芥nsc 172112、替罗昔隆nsc 296934、四铂nsc363812、塞替派nsc 6396、三乙撑密胺nsc 9706、尿嘧啶氮芥nsc34462和yoshi-864 nsc 102627。
[0208]
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，adc)包含高放射性原子。各种放射性同位素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包括211at、131i、125i、90y、186re、188re、153sm、212bi、32p、212pb和lu的放射性同位素。
[0209]
在一些实施方案中，可以将抗体部分与在肿瘤预靶向中利用的“受体”(诸如链霉亲和素)缀合，其中抗体-受体缀合物施用于患者，然后使用清除剂从循环中去除未结合的缀合物并且然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
[0210]
在一些实施方案中，免疫缀合物(例如，adc)可以包含与前药激活酶缀合的抗体部分。在一些此类实施方案中，前药激活酶将前药转化为活性药物，诸如抗病毒药物。在一些实施方案中，此类免疫缀合物在抗体依赖性酶介导的前药疗法(“adept”)中是有用的。可以与抗体缀合的酶包括但不限于可用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将含肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷菌(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶b和l)；可用于转化含有d-氨基酸取代基的前药的d-丙氨酰羧
肽酶；可用于将糖基化的前药转化为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将用β内酰胺衍生化的药物转化为游离药物的β内酰胺酶；以及可用于分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在其胺基氮出衍生化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素v酰胺酶和青霉素g酰胺酶。在一些实施方案中，酶可以通过本领域熟知的重组dna技术与抗体部分共价地结合。参见例如，neuberger等人，nature 312:604-608(1984)。
[0211]
在一些实施方案中，免疫缀合物的治疗部分(例如，adc)可以是核酸。可以使用的核酸包括但不限于：反义rna、基因或其它多核苷酸(包括核酸类似物，诸如硫代鸟嘌呤和硫代嘌呤)。
[0212]
本技术还提供了包含与效应分子附接的抗体部分的免疫缀合物(例如，adc)，其中该效应分子是标签，该标签可以间接或直接产生可检测信号。这些免疫缀合物可以用于研究或诊断应用，例如用于体内检测癌症。标签优选地能够直接或间接地产生可检测信号。例如，标签可以是不透射线的或放射性同位素，诸如3h、14c、32p、35s、123i、125i、131i；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，标签是用于闪烁法研究的放射性原子，例如99tc或123i；或用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)的旋转标签，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并且与抗体缀合，例如用于pet成像(wo 2011/056983)。
[0213]
在一些实施方案中，免疫缀合物可间接地检测。例如，对免疫缀合物具有特异性并且含有可检测标签的第二抗体可以用于检测免疫缀合物。
[0214]
v.免疫细胞
[0215]
本发明提供了免疫细胞，该免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)以及嵌合刺激受体(csr)，该car包含(i)包含抗体部分的细胞外靶结合结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)初级信号传导结构域，该csr包含(i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；(ii)跨膜结构域；和(iii)cd30共刺激结构域，其中该免疫细胞中的该csr缺乏功能性初级信号传导结构域。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码car和csr的一种或多种核酸，其中该car和该csr由核酸表达并且定位于免疫细胞表面。在一些实施方案中，免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。在一些实施方案中，免疫细胞被修饰以阻断或减少免疫细胞的一种或多种内源性tcr亚基的表达。例如，在一些实施方案中，免疫细胞是经修饰以阻断或减少tcrα和/或β链的表达的αβt细胞，或者免疫细胞是经修饰以阻断或减少tcrγ和/或δ链的表达的γδt细胞。对细胞的破坏基因表达的修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如rna干扰(例如，sirna、shrna、mirna)、基因编辑(例如，基于crispr或talen的基因敲除)等。
[0216]
在示例性实施方案中，本公开的细胞是免疫细胞或免疫系统的细胞。因此，细胞可以是b淋巴细胞、t淋巴细胞、胸腺细胞、树突状细胞、自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、骨髓单核细胞性细胞、巨核细胞、外周血单核细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞。在示例性方面，细胞是t淋巴细胞。在示例性方面，t淋巴细胞是cd8

、cd4

、cd8

/cd4

或t调节性(t-reg)细胞。在示例性实施方案中，将t淋
巴细胞基因工程化以沉默内源性tcr的表达。在示例性方面，细胞是自然杀伤(nk)细胞。
[0217]
例如，在一些实施方案中，提供了免疫细胞(诸如t细胞)，其包含编码根据本文所述的car和csr中任何一种的car和csr的一种或多种核酸，其中该car和该csr由该核酸表达并且定位于该免疫细胞表面。在一些实施方案中，核酸序列包含在载体中。载体可以选自例如由以下组成的组：哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的那些)。在一些实施方案中，载体中的一种或多种被整合到免疫细胞的宿主基因组中。在一些实施方案中，核酸序列处于启动子的控制下。在一些实施方案中，启动子是诱导型的。在一些实施方案中，启动子可操作地连接到核酸序列的5'末端。在一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。
[0218]
因此，在一些实施方案中，提供了在其表面上表达本文所述的car和csr的免疫细胞(诸如t细胞)，其中该免疫细胞包含：编码该car的car多肽链和该csr的csr多肽链的核酸序列，其中该car多肽链和该csr多肽链由该核酸序列表达为单个多肽链。然后将该单个多肽链切割以形成car多肽链和csr多肽链，并且该car多肽链和该csr多肽链定位于该免疫细胞的表面。
[0219]
在其它实施方案中，提供了在其表面上表达本文所述的car和csr的免疫细胞(诸如t细胞)，其中该免疫细胞包含：编码该car的car多肽链的car核酸序列和编码该csr的csr多肽链的csr核酸序列，其中该car多肽链由该car核酸序列表达以形成该car，其中该csr多肽链由该csr核酸序列表达以形成该csr，并且其中该car和该csr定位于该免疫细胞的表面。
[0220]
vi.fc变体
[0221]
在一些实施方案中，本文所述的car和/或csr可以包含变体fc区，其中该变体fc区可以包含相对于参考fc区(或亲本fc区或野生型fc区)的至少一个氨基酸修饰。可以在fc区中制造氨基酸修饰以改变效应子功能和/或增加car和/或csr的血清稳定性。包含变体fc区的car和/或csr可以表现出对fc受体(例如，fcγr)的改变的亲和力，条件是该变体fc区在基于fc-fc受体相互作用的晶体学和结构分析(诸如由sondermann等人，2000,nature,406:267-273所公开的那些)与fc受体发生直接接触的位置处不具有置换。在与fc受体(诸如fcγr)发生直接接触的fc区内的位置的实例是氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(b/c环)、氨基酸297-299(c'/e环)和氨基酸327-332(f/g)环。在一些实施方案中，包含变体fc区的car和/或csr可以包含基于结构和晶体学分析与fcγr发生直接接触的至少一个残基的修饰。
[0222]
产生变体fc区的在fc区中的氨基酸修饰是本领域已知的，该氨基酸修饰例如改变对激活和/或抑制性受体的亲和力，导致改进的效应子功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc))，增加对c1q的结合亲和力，减少或消除fcr结合，增加半衰期(参见例如美国专利号9,051,373、9,040,041、8,937,158、8,883,973、8,883,147、8,858,937、8,852,586、8,809,503、8,802,823、8,802,820、8,795,661、8,753,629、8,753,628、8,735,547、8,735,545、8,734,791、8,697,396、8,546,543、8,475,792、8,399,618、8,394,925、8,388,955、8,383,109、8,367,805、8,362,210、8,338,574、8,324,351、8,318,907、8,188,231、8,124,731、8,101,720、8,093,359、8,093,357、8,088,376、8,
084,582、8,039,592、8,012,476、7,799,900、7,790,858、7,785,791、7,741,072、7,704,497、7,662,925、7,416,727、7,371,826、7,364,731、7,335,742、7,332,581、7,317,091、7,297,775、7,122,637、7,083,784、6,737,056、6,538,124、6,528,624和6,194,551)。
[0223]
在一些实施方案中，与亲本fc区(例如，非糖基化)相比，变体fc区可以具有不同的糖基化模式。在一些实施方案中，不同的糖基化模式可以由不同细胞系(例如，工程化细胞系)中的表达产生。
[0224]
本文所述的car和/或csr可以包含以更大的亲和力与一种或多种fcγr结合的变体fc区。如下文所讨论，此类car和/或csr优选地更有效地介导效应子功能。在一些实施方案中，本文所述的car和/或csr可以包含以更弱的亲和力与一种或多种fcγr结合的变体fc区。在某些情况下，例如在其作用机制涉及阻断或拮抗作用但不杀死携带靶抗原的细胞的car和/或csr的情况下，可能需要减少或消除效应子功能。在一些实施方案中，增加的效应子功能可以针对肿瘤细胞和表达外源抗原的细胞。
[0225]
vii.核酸
[0226]
还设想编码本文所述的car和csr的核酸分子。在一些实施方案中，根据本文所述的car和csr中的任何一种，提供了编码car和csr的核酸(或一组核酸)。
[0227]
本发明还提供了其中插入了本发明的核酸的载体。
[0228]
简而言之，由编码car和/或csr的核酸表达本文所述的car和/或csr可以通过以下方式来实现：将该核酸插入适当的表达载体中，使得该核酸可操作地连接到5'和3'调控元件，包括例如启动子(例如，淋巴细胞特异性启动子)和3'非翻译区(utr)。载体可以适合于在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆和表达载体含有可用于调节所期望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
[0229]
使用标准基因递送方案，本发明的核酸还可以用于核酸免疫和基因疗法。基因递送的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，它们以全文引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明提供了基因疗法载体。
[0230]
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
[0231]
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)，以及其它病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有至少一种生物体内的复制功能起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点、以及一个或多个可选择标记(参见例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0232]
已经开发出多个基于病毒的系统以使基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其体内或离体递送到受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒属载体。源自逆转录病毒
(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定的整合和其在子细胞中的传递。慢病毒载体具有优于源自肿瘤逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体的附加优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优势。
[0233]
另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，但是最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。在启动子元件之间的间隔经常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp后活性才开始下降。
[0234]
合适的启动子的一个示例是即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子1α(ef-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
[0235]
此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被设想为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够在期望这种表达时开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的分子开关，或者当不期望表达时关闭该表达。可用于真核细胞的示例性诱导型启动子系统包括但不限于激素调控元件(参见例如，mader,s.和white,j.h.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:5603-5607)、合成配体调控元件(参见例如，spencer,d.m.等人(1993)science 262:1019-1024)和电离辐射调控元件(例如参见manome,y.等人(1993)biochemistry 32:10607-10613；datta,r.等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa 89:1014-10153)。在以下文献中综述了可用于体外或体内哺乳动物系统的另外的示例性诱导型启动子系统：gingrich等人(1998)annual rev.neurosci 21:377-405。
[0236]
可用于本发明的示例性诱导型启动子系统是tet系统。此类系统基于由gossen等人(1993)所描述的tet系统。在示例性实施方案中，感兴趣的多核苷酸处于包含一个或多个tet操纵子(teto)位点的启动子的控制下。在无活性状态下，tet阻遏物(tetr)将与teto位点结合并且阻遏从启动子的转录。在活性状态下，例如在存在诱导剂诸如四环素(tc)、脱水四环素、多西环素(dox)或它们的活性类似物的情况下，诱导剂引起tetr从teto释放，从而允许转录发生。多西环素是具有1-二甲基氨基-2,4a,5,7,12-五羟基-11-甲基-4,6-二氧代-1,4a,11,11a,12,12a-六氢并四苯-3-甲酰胺的化学名称的抗生素四环素家族的成员。
[0237]
在一个实施方案中，对tetr进行密码子优化以在哺乳动物细胞(例如，鼠或人细胞)中表达。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由多于一个密码子编码，从而允许给定核酸的核苷酸序列的实质性变化而在由核酸编码的氨基酸序列中没有任何改变。然而，许多生物体显示出密码子使用的差异，也称为“密码子偏好性”(即，对使用给定氨基酸的特定密码子的偏好性)。密码子偏好性通常与特定密码子的主要trna种类的存在相关，这进而又增加了mrna翻译的效率。因此，源自特定生物体的编码序列(例如，原核生物)可以通过密码子优化来定制用于改善在不同生物体(例如，真核生物)中的表达。
[0238]
tet系统的其它特定变型包括以下“tet-off”和“tet-on”系统。在tet-off系统中，转录在存在tc或dox的情况下没有活性。在该系统中，由与来自单纯疱疹病毒的vp16的强反式激活结构域融合的tetr构成的四环素控制的反式激活因子蛋白(tta)调节在四环素响应性启动子元件(tre)的转录控制下的靶核酸的表达。tre由与启动子(通常是衍生自人巨细胞病毒(hcmv)即时早期启动子的最小启动子序列)融合的teto序列串联体组成。在不存在tc或dox的情况下，tta结合tre并且激活靶基因的转录。在存在tc或dox的情况下，tta不能结合tre，并且靶基因的表达保持无活性。
[0239]
相反，在tet-on系统中，转录在存在tc或dox的情况下是有活性的。tet-on系统基于反向四环素控制的反式激活因子rtta。与tta一样，rtta是由tetr阻遏物和vp16反式激活结构域组成的融合蛋白。然而，tetr dna结合部分中的四个氨基酸变化改变了rtta的结合特性，使得其仅可以在存在dox的情况下识别靶转基因的tre中的teto序列。因此，在tet-on系统中，仅在存在dox的情况下，通过rtta刺激tre调控的靶基因的转录。
[0240]
另一种诱导型启动子系统是来自大肠杆菌(e.coli)的lac阻遏物系统。(参见brown等人，cell 49:603-612(1987))。lac阻遏物系统通过调节与包含lac操纵子(laco)的启动子可操作地连接的感兴趣的多核苷酸的转录来起作用。lac阻遏物(lacr)结合laco，从而防止感兴趣的多核苷酸的转录。感兴趣的多核苷酸的表达由合适的诱导剂(例如异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg))诱导。
[0241]
用于本发明中的另一种示例性诱导型启动子系统是激活的t细胞(nfat)系统的核因子。转录因子的nfat家族是t细胞激活的重要调节剂。nfat应答元件发现于例如il-2启动子中(参见例如durand,d.等人,molec.cell.biol.8,1715-1724(1988)；clipstone,na,crabtree,gr.nature.1992 357(6380):695-7；chmielewski,m.等人cancer research 71.17(2011):5697-5706；以及zhang,l.等人molecular therapy 19.4(2011):751-759)。在一些实施方案中，本文所述的诱导型启动子包含一个或多个(诸如2个、3个、4个、5个、6个或更多个)nfat应答元件。在一些实施方案中，诱导型启动子包含6个nfat应答元件，例如包含seq id no:112的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的诱导型启动子包含与最小启动子(诸如最小ta启动子)连接的一个或多个(诸如2个、3个、4个、5个、6个或更多个)nfat应答元件。在一些实施方案中，最小ta启动子包含seq id no:113的核苷酸序列。在一些实施方案中，诱导型启动子包含seq id no:114的核苷酸序列。
[0242]
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有可选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选择标记可以携带在单独的dna片段上并在共转染程序中使用。可选择标记和报告基因两者均可以侧接适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
[0243]
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并且用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达并且编码其表达由一些易于检测的特性(例如，酶促活性)表现的多肽的基因。在将dna引入接受者细胞中之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因、或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tel等人，2000febs letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术
来制备或可商业获得。通常，构建体中显示出最高的报告基因表达水平的最小5'侧接区被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接并且用于评价药剂的调节启动子驱动的转录的能力。
[0244]
在一些实施方案中，提供了编码根据本文所述的car和csr中的任何一种的car和/或csr的核酸。在一些实施方案中，核酸包含编码该car的所有多肽链的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码该csr的所有多肽链的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，核酸包含编码该car和该csr的所有多肽链的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，该一个或多个核酸序列中的每一个包含在单独的载体中。在一些实施方案中，至少一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施方案中，所有核酸序列都包含在同一载体中。载体可以选自例如由以下组成的组：哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的那些)。
[0245]
例如，在一些实施方案中，car是包含单个car多肽链的单体，并且csr是包含单个csr多肽链的单体，并且核酸包含编码该car多肽链的第一核酸序列和编码该csr多肽链的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一核酸序列包含在第一载体中，并且第二核酸序列包含在第二载体中。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列包含在一个载体中。在一些实施方案中，第一核酸序列处于第一启动子的控制下，并且第二核酸序列处于第二启动子的控制下。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子具有相同的序列。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列在多顺反子载体中在单个启动子的控制下表达为单个转录物。参见例如kim,jh，等人，plos one 6(4):e18556,2011。在一些实施方案中，一种或多种启动子是诱导型的。在一些实施方案中，编码csr多肽链的核酸序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，诱导型启动子包含响应于免疫细胞激活的一个或多个元素，诸如nfat应答元件。
[0246]
在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列在宿主细胞(诸如t细胞)中具有类似(诸如基本上相同或约相同)的表达水平。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列在宿主细胞(诸如t细胞)中具有相差了至少约两倍(诸如至少约2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍中的任一者)的表达水平。可以在mrna或蛋白质水平上确定表达。可以通过使用各种熟知的方法(包括northern印迹、定量rt-pcr、微阵列分析等)测量从核酸转录的mrna的量来确定mrna表达的水平。蛋白质表达的水平可以通过已知的方法测量，该方法包括免疫细胞化学染色、酶联免疫吸附测定(elisa)、western印迹分析、发光测定、质谱、高效液相色谱、高压液相色谱-串联质谱等。
[0247]
因此，在一些实施方案中，提供了编码a)根据本文所述的car中的任何一种的car多肽链；和b)根据本文所述的csr中的任何一种的csr多肽链的核酸。在一些实施方案中，核酸序列包含在载体(诸如慢病毒载体)中。在一些实施方案中，编码car多肽链的核酸的部分在第一启动子的控制下，并且编码csr多肽链的核酸的部分处于第二启动子的控制下。在一些实施方案中，第一启动子与car核酸序列的5'末端可操作地连接。在一些实施方案中，第二启动子与csr核酸序列的5'末端可操作地连接。在一些实施方案中，仅使用一个启动子。在一些实施方案中，如果存在对car具有特异性的启动子，那么存在选自由以下组成的组的核酸接头：内部核糖体进入位点(ires)和编码将car核酸序列的3'末端与csr核酸序列的5'末端或与csr连接的启动子的5'末端连接的自切割2a肽(诸如p2a、t2a、e2a或f2a)的核酸。
在一些实施方案中，如果存在对car具有特异性的启动子，那么存在选自由以下组成的组的核酸接头：内部核糖体进入位点(ires)和编码将csr核酸序列的3'末端与car核酸序列的5'末端或与car连接的启动子的5'末端连接的自切割2a肽(诸如p2a、t2a、e2a或f2a)的核酸。在一些实施方案中，car核酸序列和csr核酸序列在一个启动子的控制下转录为单个rna。
[0248]
因此，在一些实施方案中，提供了两种核酸，其中第一核酸编码根据本文所述的car中任何一种的car多肽链；并且第二核酸编码根据本文所述的csr中任何一种的csr多肽链。在一些实施方案中，两个核酸包含在两个载体(诸如慢病毒载体)中。
[0249]
在一些实施方案中，第一启动子和/或第二启动子是诱导型的。在一些实施方案中，第一载体和/或第二载体是病毒载体(诸如慢病毒载体)。应了解，还设想了其中交换任何核酸序列(诸如其中car核酸序列与csr核酸序列交换)的实施方案。
[0250]
viii.car和csr生产
[0251]
所提供的car和/或csr或其部分或编码它们的核酸可以通过任何可用的方式生产。生产方法是本领域熟知的。用于产生抗体(例如，scfv抗体、单克隆抗体和/或多克隆抗体)的技术在本领域中是可用的。应当了解，各种动物物种可以用于生产抗血清，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、猴和鸡。动物的选择可以根据易于操作、成本或血清的期望量来决定，如本领域技术人员已知的。应当了解，抗体也可以通过产生对于感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列是转基因的哺乳动物或植物(例如，对于人免疫球蛋白重链和轻链基因是转基因的转基因啮齿动物)而转基因地生产。结合在哺乳动物中的转基因生产，可以在山羊、牛或其它哺乳动物的奶中生产和从山羊、牛或其它哺乳动物的奶中回收抗体(参见例如美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957；这些美国专利以全文引用的方式并入本文)。可替代地，可以在鸡中制备抗体，从而生产igy分子(schade等人，1996,altex 13(5):80-85)。
[0252]
尽管本文中广泛讨论了采用含有人抗体的car和/或csr的实施方案(即，包括人cdr序列的人重链和轻链可变区序列)，但是本发明还提供了含有非人抗体的car和/或csr。在一些实施方案中，非人抗体包含来自如本文所述的抗体的人cdr序列、以及非人框架序列。在一些实施方案中，非人框架序列包括可以用于使用如本文所述的一个或多个人cdr序列产生合成的重链和/或轻链可变区的任何序列，包括例如由小鼠、大鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、猴、鸡等产生的序列。在一些实施方案中，所提供的car或csr包括通过将如本文所述的一个或多个人cdr序列接枝到非人框架序列(例如，小鼠或鸡框架序列)上产生的抗体。在许多实施方案中，所提供的car或csr包含或是人抗体(例如，人单克隆抗体或其片段、人抗原结合蛋白或多肽、人多特异性抗体(例如，人双特异性抗体)、具有人免疫球蛋白多肽的一种或多种结构组分的人多肽)。
[0253]
在一些实施方案中，适合用于本发明的抗体是近似人类的灵长类动物抗体。例如，可以在例如国际专利申请公开号1991/11465中和在losman等人，1990,int.j.cancer 46:310中找到用于在狒狒中产生治疗有用的抗体的通用技术。在一些实施方案中，可以使用杂交瘤方法来制备抗体(例如，单克隆抗体)(milstein和cuello,1983,nature 305(5934):537-40)。在一些实施方案中，也可以通过重组方法来制备抗体(例如，单克隆抗体)(参见例如，美国专利号4,166,452)。
[0254]
与通过b细胞永生化产生抗体相关的许多困难都可以使用噬菌体展示在大肠杆菌
或酵母中通过工程化和表达car或csr组分来克服。为了确保高亲和力抗体的回收，组合免疫球蛋白文库通常必须含有大的组库大小。典型的策略利用从免疫小鼠的淋巴细胞或脾细胞中获得的mrna，以使用逆转录酶合成cdna。通过pcr单独扩增重链和轻链基因并且将它们连接到噬菌体克隆载体中。可以产生两个不同的文库，一个含有重链基因，一个含有轻链基因。文库可以是原初的或它们可以是半合成的，即所有氨基酸(半胱氨酸例外)同样可能存在于cdr中的任何给定位置处。从每个文库分离噬菌体dna，并且将重链和轻链序列连接在一起并包装以形成组合文库。每个噬菌体含有一对随机的重链和轻链cdna，并且在感染大肠杆菌时引导在感染细胞中的car或csr中的多肽的表达。为了鉴定识别感兴趣的抗原的car或csr，铺板噬菌体文库，并将存在于斑块中的car或csr分子转移到过滤器中。将过滤器与放射性标记的抗原一起孵育，然后洗涤以去除过量的未结合配体。放射自显影图上的放射性斑点鉴定含有结合抗原的car或csr的斑块。可替代地，鉴定识别感兴趣的抗原的car或csr可以通过以下方式来实现：噬菌体与抗原(该抗原与固体支持物(例如珠粒或哺乳动物细胞)结合)的迭代结合、然后去除非结合的噬菌体并洗脱特异性地结合的噬菌体。在此类实施方案中，首先将抗原生物素化以固定到例如链霉亲和素缀合的dynabeads m-280上。将噬菌体文库与细胞、珠或其它固体支持物一起孵育，并且通过洗涤去除非结合的噬菌体。选择结合感兴趣的抗原的car或csr噬菌体克隆并测试进行进一步表征。
[0255]
一旦选择，可以通过流式细胞术测试阳性克隆与在活细胞表面上表达的感兴趣的抗原的结合。简而言之，可以将噬菌体克隆与表达抗原或不表达抗原的细胞(例如，经工程化以表达感兴趣的抗原、或天然地表达抗原的那些细胞)一起孵育。可以将细胞洗涤，并且然后用小鼠抗m13外壳蛋白单克隆抗体标记。可以将细胞再次洗涤并且在流式细胞术之前用荧光缀合的第二抗体(例如，fitc山羊(fab)2抗小鼠igg)标记。可用于生产人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体可以例如从stratagene cloning systems(la jolla,ca)获得。
[0256]
可以采用类似的策略来获得高亲和力scfv克隆。可以通过使用与所有已知vh、vκ和vλ基因家族对应的pcr引物从非免疫人供体中分离v基因来构建具有大组库的文库。在扩增后，可以组合vκ和vλ池以形成一个池。可以将这些片段连接到噬菌粒载体中。可以将scfv接头(例如，(g4s)n)连接到v
l
片段上游(或如此期望的vh片段上游)的噬菌粒上。可以扩增vh和接头-v
l
片段(或v
l
和接头-vh片段)和将它们组装在jh区域上。可以将所得的v
h-接头-v
l
(或v
l-接头-vh)片段连接到噬菌粒载体中。噬菌粒文库可以使用如上所述的过滤器或使用免疫管(nunc；maxisorp)淘洗。类似的结果可以通过从免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白文库并通过在巴斯德毕赤酵母中表达scfv来实现(参见例如，ridder等人，1995,biotechnology,13:255-260)。另外，在分离适当的scfv抗体后，可以通过亲和力成熟过程(诸如诱变和链改组)来获得更高的结合亲和力和较慢的解离速率(参见例如，jackson等人，1998,br.j.cancer,78:181-188)；osbourn等人，1996,immunotechnology,2:181-196)。
[0257]
可以使用各种技术(即，将人ig基因引入其中内源性ig基因已被部分或完全失活的转基因动物中，可以利用该转基因动物来合成人抗体)来生产人抗体。在一些实施方案中，可以通过免疫经工程化以响应于用人抗原的抗原攻击而制造人抗体的非人动物来制造人抗体。
[0258]
还可以例如通过利用经工程化以表达编码car或csr的核酸的宿主细胞系统来生产所提供的car和csr。可替代地或另外地，所提供的car可以通过化学合成(例如，使用自动化肽合成器或基因合成编码car或csr的核酸)部分或完全制备。可以使用任何适当的载体或表达盒来表达本文所述的car和/或csr。各种载体(例如，病毒载体)和表达盒是本领域已知的，并且可以如本领域已知的那样(例如，使用连续或补料分批培养系统)培养其中可以引入此类载体或表达盒的细胞。在一些实施方案中，可以将细胞进行基因工程化；用于基因工程化细胞以表达工程化多肽的技术是本领域熟知的(参见例如，ausabel等人，编辑，1990,current protocols in molecular biology(wiley,new york))。
[0259]
可以纯化本文所述的car和/或csr，即使用过滤、离心和/或多种色谱技术(诸如hplc或亲和色谱)。在一些实施方案中，通过包括用酶(诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原来切割二硫键获得所提供的car和/或csr的片段。
[0260]
应当了解，可以改善car和/或csr的特性和/或活性的方式工程化、生产和/或纯化所提供的car和/或csr。例如，改善的特性包括但不限于增加的稳定性、改善的结合亲和力和/或亲合力、增加的结合特异性、增加的生产、减少的聚集、降低的非特异性结合等。在一些实施方案中，所提供的car和/或csr可以包含改善蛋白质稳定性、抗原结合、表达水平的一个或多个氨基酸置换(例如，在免疫球蛋白或其片段(例如，scfv抗体)的上下文中的框架区中)，或提供治疗剂、诊断剂或检测剂的缀合的位点或位置。
[0261]
纯化标签
[0262]
在一些实施方案中，可以将纯化标签连接到本文所述的car和/或csr上。纯化标签是指可以用于纯化、分离或鉴定多肽的任何长度的肽。可以将纯化标签连接到多肽上(例如，连接到多肽的n末端或c末端上)，以帮助纯化多肽和/或从例如细胞裂解物混合物中分离多肽。在一些实施方案中，纯化标签与对纯化标签具有特定亲和力的另一个部分结合。在一些实施方案中，将与纯化标签特异性地结合的此类部分附接到固体支持物(诸如基质、树脂或琼脂糖珠)上。可以连接到car或csr的纯化标签的实例包括但不限于六组氨酸肽、血球凝集素(ha)肽、flag肽和myc肽。在一些实施方案中，可以将两个或更多个纯化标签连接到car或csr(例如，六组氨酸肽和ha肽)上。六组氨酸肽(hhhhhh(seq id no:93))以微摩尔亲和力与镍官能化琼脂糖亲和柱结合。在一些实施方案中，ha肽包括序列ypydvpdya(seq id no:94)或ypydvpdyas(seq id no:95)。在一些实施方案中，ha肽包括整数倍的序列ypydvpdya(seq id no:94)或ypydvpdyas(seq id no:95)的串联系列(例如，3xypydvpdya或3xypydvpdyas)。在一些实施方案中，flag肽包含序列dykddddk(seq id no:96)。在一些实施方案中，flag肽包含整数倍的序列dykddddk(seq id no:96)的串联系列(例如，3xdykddddk)。在一些实施方案中，myc肽包含序列eqkliseedl(seq id no:97)。在一些实施方案中，myc肽包含整数倍的序列eqkliseedl的串联系列(例如，3xeqkliseedl)。
[0263]
ix.治疗剂和检测剂
[0264]
可以治疗剂或检测剂与本文所述的car或csr附接。治疗剂可以是任何类别的化学实体，包括例如但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、小有机分子、非生物聚合物、金属、离子、放射性同位素等。在一些实施方案中，根据本发明使用的治疗剂可以具有与治疗癌症一种或多种症状或病因相关的生物活性。在一些实施方案中，根据本发明使用的治疗剂可以具有与免疫系统的调节和/或t细胞介导的细胞毒性的增强相关的生物活性。在一些
实施方案中，根据本发明使用的治疗剂具有一种或多种其它活性。
[0265]
检测剂可以包含例如由于其特定功能特性和/或化学特性可以使用测定来检测的任何部分。此类药剂的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、着色颗粒或配体(诸如生物素)。
[0266]
许多检测剂是本领域已知的，如其与蛋白质和肽的附接的系统(参见例如，美国专利号5,021,236；4,938,948；和4,472,509)。此类检测剂的实例包括顺磁性离子、放射性同位素、荧光团、nmr可检测物质、x射线成像剂等。例如，在一些实施方案中，顺磁性离子是铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镍(ii)、铜(ii)、钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝(iii)、钬(iii)、铒(iii)、镧(iii)、金(iii)、铅(ii)和/或铋(iii)中的一种或多种。
[0267]
放射性同位素可以是锕-225、砹-211、铋-212、碳-14、铬-51、氯-36、钴-57、钴-58、铜-67、铕-152、镓-67、氢-3、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铟-111、铁-59、铅-212、镥-177、磷-32、镭-223、镭-224、铼-186、铼-188、硒-75、硫-35、锝(technicium)-99m、钍-227、钇-90和锆-89中的一种或多种。可以根据本领域熟知的技术生产放射性标记的car或csr。
[0268]
荧光标签可以是或可以包括以下中的一种或多种：alexa 350,alexa430,amca,bodipy 630/650,bodipy 650/665,bodipy-fl,bodipy-r6g,bodipy-tmr,bodipy-trx、级联蓝(cascade blue)、cy3,cy5,6-fam、异硫氰酸荧光素、hex,6-joe、俄勒冈绿(oregon green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(pacific blue)、reg、罗丹明绿(rhodamine green)、罗丹明红(rhodamine red)、renographin、rox、tamra、tet、四甲基罗丹明、和/或德克萨斯红(texas red)等。
[0269]
x.治疗方法
[0270]
本发明的组合物可以施用于个体(例如，哺乳动物，诸如人类)以治疗包括病毒感染和癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的疾病。
[0271]
可以使用本文所述的方法中的任一种治疗的癌症包括不被血管化的肿瘤或尚未实质上血管化的肿瘤、以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。待治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤和胶质瘤以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤(malignant tumor)、以及恶性肿瘤(malignancies)(例如，肉瘤、癌、黑色素瘤和胶质瘤)。还包括成年人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
[0272]
设想通过本文所述的方法中的任何方法治疗的实体瘤包括cns肿瘤，诸如胶质瘤(例如，脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也被称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤(诸如高级星形细胞瘤)、小儿胶质瘤或胶质母细胞瘤(诸如小儿高级胶质瘤(hgg)和扩散型内因性脑桥胶质瘤(dipg))、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、许旺细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑脊膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移灶。
[0273]
在一些实施方案中，癌症是小儿胶质瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是低级胶质瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是高级胶质瘤(hgg)。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，小儿胶质瘤是扩散型内因性脑桥胶质瘤(dipg)。在一些实施方案中，dipg为ii级的。在一些实施方案中，dipg为iii级的。在一些实
施方案中，dipg为iv级的。
[0274]
设想用于治疗的另外的实体瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤(诸如透明细胞软骨肉瘤)、软骨母细胞瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、wilms肿瘤、宫颈癌(例如，宫颈癌和侵袭前宫颈发育不良)，肛门、肛管或直肠肛门、阴道的癌症，外阴癌(例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌和纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、莱迪希细胞细胞肿瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤和脂肪瘤)、膀胱癌(bladder carcinoma)、黑色素瘤、子宫癌(例如，子宫内膜癌)和尿道上皮癌(例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、输尿管癌和膀胱癌(urinary bladder cancer))。
[0275]
设想通过本文所述的方法中的任何方法治疗的血液癌包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病以及成髓细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0276]
其它癌症的实例包括但不限于急性淋巴细胞性白血病(all)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞性白血病(cll)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、促淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病和非急性淋巴细胞性白血病(null-acute lymphoblastic leukemia)。
[0277]
可以例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、至进展的时间、存活持续时间、无进展存活期、总体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价癌症治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射性成像测量应答。
[0278]
在用于治疗癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的任何方法的一些实施方案中，该car和csr在被施用于个体之前与细胞(诸如免疫细胞，例如t细胞)缀合。因此，例如，提供了治疗个体中的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法，该方法包括a)将本文所述的car和csr或其抗体部分与细胞(诸如免疫细胞，例如，t细胞)缀合以形成car csr/细胞缀合物，和b)向该个体施用有效量的包含该car csr/细胞缀合物的组合物。在一些实施方案中，细胞来源于该个体。在一些实施方案中，细胞不来源于该个体。在一些实施方案中，通过与细胞表面上的分子共价连接将car和csr与细胞缀合。在一些实施方案中，通过与细胞表面上的分子非共价连接将car和csr与细胞缀合。在一些实施方案中，通过将car的一部分和csr的一部分插入细胞的外膜中将car和csr与细胞缀合。
[0279]
可以例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、至进展的时间、存活持续时间、无进展存活期、总体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射性成像测量应答。
[0280]
在一些实施方案中，治疗的功效可以测量为肿瘤生长抑制百分比(％tgi)，其可以使用等式100-(t/c
×
100)来计算，其中t是经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且c是未经治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在一些实施方案中，％tgi为约2％、约4％、约6、约8％、10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或超过95％。
[0281]
xi.car加csr免疫细胞的制备
[0282]
在一个方面中，本发明提供了表达根据本文所述的任何实施方案的car和csr的免疫细胞(诸如淋巴细胞，例如t细胞)。本文提供了制备表达car和csr的免疫细胞(诸如t细胞)(car加csr免疫细胞，诸如car加csr t细胞)的示例性方法。
[0283]
在一些实施方案中，可以通过将编码与靶抗原(诸如疾病相关抗原)特异性地结合的car(诸如本文所述的任何car)和与靶配体特异性地结合的csr(诸如本文所述的任何csr)的一个或多个核酸(包括例如慢病毒载体)引入免疫细胞中来产生car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)。将一个或多个核酸引入免疫细胞中可以使用本领域已知的技术(诸如本文中关于核酸所描述的技术)来完成。在一些实施方案中，本发明的car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可能导致对与靶抗原的表达相关的疾病(诸如癌症或病毒感染)的持续控制。
[0284]
在一些实施方案中，本发明涉及施用表达根据本文所述的任何car的与靶抗原特异性地结合的car和根据本文所述的任何csr的与靶配体特异性地结合的csr的经遗传修饰的t细胞，用于使用淋巴细胞输注来治疗患有或处于发展与靶抗原的表达相关的疾病和/或病症(在本文中也称为“靶抗原阳性”或“ta阳性”疾病或病症)(包括例如癌症或病毒感染)的风险的患者。在一些实施方案中，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者中收集自体pbmc，并且使用本文所述和本领域已知的方法激活和扩增t细胞并且然后将其输注回患者体内。
[0285]
在一些实施方案中，提供了表达根据本文所述的任何car的与靶抗原特异性地结合的car和根据本文所述的任何csr的与靶配体特异性地结合的csr的t细胞(在本文中也称为“car加csr t细胞”)。本发明的car加csr t细胞可以经历稳健的体内t细胞扩增并且可以建立在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量的靶抗原特异性记忆细胞。在一些实施方案中，输注到患者体内的本发明的car加csr t细胞可以在患有靶抗原相关疾病的患者中体内消除靶抗原呈递细胞，诸如靶抗原呈递癌症或病毒感染细胞。在一些实施方案中，输注到患者体内的本发明的car加csr t细胞可以在患有对于至少一种常规治疗而言难治的靶抗原相关疾病的患者中体内消除靶抗原呈递细胞，诸如靶抗原呈递癌症或病毒感染细胞。
[0286]
在扩增和遗传修饰t细胞之前，从受试者获得t细胞源。t细胞可以从许多来源获得，该来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的一些实施方案中，可以使用本领域中可用的任何数量的t细胞系。在本发明的一些实施方案中，可以使用对本领域技术人员而言已知的任何数量的技术(诸如ficoll
tm
分离)从受试者收集的血液单位获得t细胞。在一些实施方案中，通过单采术获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过采集术收集的细胞以去除血浆级分，并且将细胞置于适当的缓冲液或介质中用于随后
的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易了解的，可以通过本领域技术人员已知的方法(诸如通过使用半自动“流过”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate或haemonetics cell saver 5)根据制造商的说明书)来实现洗涤步骤。在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(诸如无ca
2
、无mg
2
的pbs、plasmalyte a或其它具有或不具有缓冲液的盐水溶液)中。可替代地，可以去除单采术样品的不期望组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
[0287]
在一些实施方案中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞，例如通过经由percoll
tm
梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离t细胞的特定亚群，诸如cd3

、cd28

、cd4

、cd8

、cd45ra

和cd45ro

t细胞。例如，在一些实施方案中，通过与抗cd3/抗cd28(即，3
×
28)缀合的珠(诸如m-450cd3/cd28 t)一起孵育持续足以阳性选择期望的t细胞的时间段来分离t细胞。在一些实施方案中，该时间段为约30分钟。在一些实施方案中，该时间段在30分钟到36小时或更长时间的范围内(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施方案中，该时间段是至少一个小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，该时间段为10到24小时。在一些实施方案中，孵育时间段为24小时。为了从患有白血病的患者分离t细胞，使用较长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产率。较长的孵育时间可以用于在与其它细胞类型相比存在很少的t细胞的任何情形下分离t细胞，诸如用于从肿瘤组织或从免疫受损的个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(til)。此外，使用较长的孵育时间可以增加cd8

t细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长t细胞被允许与cd3/cd28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与t细胞的比率，对于或针对在培养起始时或在过程期间的其它时间点可以优先地选择t细胞亚群。另外，通过增加或降低抗cd3和/或抗cd28抗体对珠或其它表面的比率，对于或针对在培养起始时或在其它期望的时间点可以优先地选择t细胞亚群。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，可能期望执行选择程序并且在激活和扩增过程中使用“未经选择的”细胞。“未经选择的”细胞也可以进行另外轮的选择。
[0288]
通过阴性选择富集t细胞群可以用针对阴性选择的细胞所独特的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是经由使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集cd4 细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在一些实施方案中，可能期望富集或阳性选择通常表达cd4

、cd25

、cd62lhi、gitr

和foxp3

的调节性t细胞。可替代地，在一些实施方案中，通过抗cd25缀合的珠或其它类似的选择方法耗竭t调节细胞。
[0289]
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度可以变化。在一些实施方案中，可能期望显著降低其中珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施方案中，使用约1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml中的任一者的细胞浓
度。在一些实施方案中，使用约1.25亿或约1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可以弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(诸如cd28阴性t细胞)或从存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)中更有效地捕获细胞。此类细胞群可以具有治疗价值并且将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达的cd8

t细胞。
[0290]
在本发明的一些实施方案中，在治疗后直接从患者获得t细胞。就这一点而言，已经观察到，在某些癌症治疗(特别是用损伤免疫系统的药物治疗)后，在治疗后不久当患者通常从治疗中恢复时的期间内，所获得的t细胞的质量对于其离体扩增的能力可能是最佳的或改善的。同样，在使用本文所述的方法离体操纵后，这些细胞可以处于用于增强接合和体内扩增的优选状态中。因此，在本发明的上下文中设想了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括t细胞、树突状细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在一些实施方案中，动员(例如，用gm-csf的动员)和调理方案可以用于在受试者中创建其中尤其是在疗法后的限定时间窗口期间特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的的条件。说明性的细胞类型包括免疫系统的t细胞、b细胞、树突状细胞和其它细胞。
[0291]
无论在t细胞的遗传修饰之前还是之后表达期望的car、csr和任选的sse，t细胞可以通常使用如例如以下文献中所描述的方法来遗传地激活或扩增：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
[0292]
通常，本发明的t细胞通过跟与其附接了刺激cd3/tcr复合相关信号的药剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增。特别地，可以诸如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗cd2抗体接触或者通过跟与钙离子导体结合的蛋白激酶c激活剂(例如，苔藓抑素(bryostatin))接触来刺激t细胞群。为了在t细胞表面上共刺激辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4

t细胞或cd8

t细胞的增殖，抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括可以用于本领域通常已知的其它方法中的9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,france)(berg等人，transplant 30(8):3975-3977,1998；haanen等人，j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人，j.immunol.meth.227(1-2):53-63,1999)。
[0293]
xii.遗传修饰
[0294]
在一些实施方案中，通过用编码如本文所述的car和如本文所述的csr的一种或多种病毒载体转导免疫细胞(诸如通过本文所述的方法制备的t细胞)来产生本发明的car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，其在递送到免疫细胞中之后具有附加型或整合的基因组。关于基因疗法程序的综述，参见anderson,science 256:808-813(1992)；nabel和feigner,tibtech 11:211-217(1993)；mitani和caskey,tibtech 11:162-166(1993)；dillon,tibtech 11:167-175(1993)；miller,nature 357:455-460(1992)；van brunt,biotechnology 6(10):1149-1 154(1988)；vigne,restorative neurology and neuroscience 8:35-36(1995)；kremer和perricaudet,british medical bulletin51(l):31-44(1995)；以及yu等人，gene therapy 1:13-26
(1994)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞包含整合到car加csr免疫细胞基因组中的一个或多个载体。在一些实施方案中，该一个或多个病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是包含整合到其基因组中的慢病毒载体的car加csr t细胞。
[0295]
在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是经修饰以阻断或减少其内源性tcr链中的一个或两个的表达的t细胞。例如，在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是经修饰以阻断或减少tcrα和/或β链的表达的αβt细胞，或者car加csr免疫细胞是经修饰以阻断或减少tcrγ和/或δ链的表达的γδt细胞。对细胞的破坏基因表达的修饰包括本领域已知的任何此类技术，包括例如rna干扰(例如，sirna、shrna、mirna)、基因编辑(例如，基于crispr或talen的基因敲除)等。
[0296]
在一些实施方案中，使用crispr/cas系统产生具有降低的t细胞内源性tcr链表达的car加csr t细胞。关于基因编辑的crispr/cas系统的综述，参见例如jian w和marraffini la,annu.rev.microbiol.69,2015；hsu pd等人，cell,157(6):1262-1278,2014；以及o’connell mr等人，nature 516:263-266,2014。在一些实施方案中，使用基于talen的基因组编辑产生具有降低的t细胞内源性tcr链表达的car加csr t细胞。
[0297]
xiii.富集
[0298]
在一些实施方案中，提供了对异质细胞群体富集根据本文所述的car加csr免疫细胞中的任一者的car加csr免疫细胞的方法。
[0299]
可以通过阳性选择技术富集与靶抗原和靶配体特异性地结合的car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)的特定亚群。例如，在一些实施方案中，通过与靶抗原缀合的珠和/或靶配体缀合的珠一起孵育持续足以阳性选择期望的car加csr免疫细胞的时间段来富集car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)。在一些实施方案中，该时间段为约30分钟。在一些实施方案中，该时间段在30分钟到36小时或更长时间的范围内(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施方案中，该时间段是至少一个小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，该时间段为10到24小时。在一些实施方案中，孵育时间段为24小时。为了分离以低水平存在于异质细胞群中的car加csr免疫细胞，使用较长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产率。在与其它细胞类型相比存在很少car加csr免疫细胞的任何情形下，较长的孵育时间可以用于分离car加csr免疫细胞。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。
[0300]
为了通过阳性选择分离期望的car加csr免疫细胞群，细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度可以变化。在一些实施方案中，可能期望显著降低其中珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用约10亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于约1亿个细胞/ml。在一些实施方案中，使用约1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml中的任一者的细胞浓度。在一些实施方案中，使用约1.25亿或约1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产率增加、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可以弱表达car和/或csr的car加csr免疫细胞。
[0301]
在一些本文所述的任何此类实施方案中，富集导致car加csr免疫细胞的最少耗竭
或基本上无耗竭。例如，在一些实施方案中，富集导致car加csr免疫细胞的少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)变得被耗竭。可以通过本领域已知的任何方式(包括本文所述的任何方式)来确定免疫细胞耗竭。
[0302]
在一些本文所述的任何此类实施方案中，富集导致car加csr免疫细胞的最少终末分化或基本上无终末分化。例如，在一些实施方案中，富集导致car加csr免疫细胞的少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)变得被终末分化。可以通过本领域已知的任何方式(包括本文所述的任何方式)来确定免疫细胞分化。
[0303]
在一些本文所述的任何此类实施方案中，富集导致在car加csr免疫细胞上的car和/或csr最少内化或基本上无内化。例如，在一些实施方案中，富集导致在car加csr免疫细胞上的少于约50％(诸如少于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％中的任一者)的car和/或csr变得被内化。可以通过本领域已知的任何方式(包括本文所述的任何方式)来确定在car加csr免疫细胞上的car和/或csr的内化。
[0304]
在一些本文所述的任何此类实施方案中，富集导致car加csr免疫细胞的增殖增加。例如，在一些实施方案中，富集导致在富集后car加csr免疫细胞的数量增加至少约10％(诸如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多中的任一者)。
[0305]
因此，在一些实施方案中，提供了富集表达与靶抗原特异性地结合的car和与靶配体特异性地结合的csr的car加csr免疫细胞的异质细胞群的方法，该方法包括：a)使该异质细胞群与包含该靶抗原或在其中所含的一个或多个表位的第一分子和/或包含该靶配体或在其中所含的一个或多个表位的第二分子接触以形成包含与该第一分子结合的该car加csr免疫细胞的复合物、和/或包含与该第二分子结合的该car加csr免疫细胞的复合物；和b)从该异质细胞群分离该复合物，从而产生富集该car加csr免疫细胞的细胞群。在一些实施方案中，该第一分子和/或该第二分子被单独地固定到固体支持物上。在一些实施方案中，该固体支持物是微粒(诸如珠)。在一些实施方案中，该固体支持物是表面(诸如孔的底部)。在一些实施方案中，该第一分子和/或该第二分子单独地用标签进行标记。在一些实施方案中，该标签是荧光分子、亲和标签或磁性标签。在一些实施方案中，该方法还包括从该第一分子和/或该第二分子上洗脱该car加csr免疫细胞并且回收洗脱液。
[0306]
xiv.效应细胞疗法
[0307]
本技术还提供了使用如本文所述的免疫细胞将效应细胞(诸如原代t细胞)的特异性重定向到癌细胞的方法。因此，本发明还提供了刺激对哺乳动物中的靶细胞群或包含癌细胞的组织的效应细胞介导的反应(诸如t细胞介导的免疫应答)的方法，该方法包括向该哺乳动物施用表达如本文所述的car和csr的效应细胞(诸如t细胞)的步骤。在一些实施方案中，“刺激”免疫细胞是指引发效应细胞介导的反应(诸如t细胞介导的免疫应答)，其不同于激活免疫细胞。
[0308]
可以将表达如本文所述的car和csr的效应细胞(诸如t细胞)输注到有需要的接受者中。所输注的细胞能够杀死接受者中的癌细胞。在一些实施方案中，与抗体疗法不同，效应细胞(诸如t细胞)能够在体内复制，从而导致长期持久性，这可能导致持续的肿瘤控制。
[0309]
在一些实施方案中，效应细胞是可以经历稳健的体内t细胞扩增并且可以持续延
长的时间量的t细胞。在一些实施方案中，本发明的t细胞发展成特定的记忆t细胞，其可以被再激活以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
[0310]
本发明的效应细胞(诸如t细胞)还可以用作哺乳动物中的离体免疫和/或体内疗法的一类疫苗。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。
[0311]
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前在体外发生以下中的至少一者：i)细胞的扩增，ii)将编码car和csr的核酸引入细胞中，和/或iii)细胞的冷冻保存。离体程序是本领域熟知的。简而言之，从哺乳动物(优选地，人)分离细胞并用表达本文所公开的car和csr的载体对其进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将细胞施用于哺乳动物接受者以提供治疗益处。该哺乳动物接受者可以是人，并且细胞对于接受者可以是自体的。可替代地，细胞对于接受者而言可以是同种异体的、同基因的或异种的。用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于美国专利号5,199,942(其以引用的方式并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的；因此，本发明不限于任何离体扩增细胞的特定方法。简而言之，离体培养和扩增t细胞包括：(1)从外周血单核细胞(pbmc)收集t细胞；和(2)离体扩增此类细胞。除了在美国专利号5,199,942中所描述的细胞生长因子以外，其它因子诸如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。
[0312]
除了根据离体免疫使用基于细胞的疫苗以外，本发明还提供用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明的效应细胞(诸如t细胞)可以单独施用或与稀释剂和/或其它组分(诸如il-2或其它细胞因子或细胞群)组合作为药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的效应细胞(诸如t细胞)。此类组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中，将效应细胞(诸如t细胞)组合物配制用于通过静脉内、鞘内、颅内、脑内或脑室内途径施用。
[0313]
可以在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、感染的程度或转移和患者(受试者)状况的个体差异的情况下由医师确定待施用的本发明的效应细胞(诸如car t细胞)组合物的精确量。在一些实施方案中，以约104个至约109个细胞/kg体重，诸如约104个至约105个、约105个至约106个、约106个至约107个、约107个至约108个、或约108个至约109个细胞/kg体重中的任一者(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用包含效应细胞(诸如t细胞)的药物组合物。也可以将效应细胞(诸如t细胞)组合物以这些剂量施用多次。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如，rosenberg等人，new eng.j.of med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
[0314]
在一些实施方案中，可能期望将激活的效应细胞(诸如t细胞)施用于受试者，并且随后再抽取血液(或进行单采术)，根据本发明从其激活t细胞，并且用这些激活的和扩增的t细胞再输注到患者中。此过程可以每几周进行多次。在一些实施方案中，可以从抽取的10cc到400cc血液中激活t细胞。在一些实施方案中，从抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液中激活t细胞。
[0315]
效应细胞(诸如t细胞)的施用可以以任何便利的方式进行，该任何便利的方式包
括通过注射、摄入、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下地、皮内地、瘤内地、结节内地、髓内地、肌肉内地、鞘内地、颅内地、脑内地、脑室内地、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内地施用于患者。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向患者施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过静脉内注射施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过鞘内注射施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过颅内注射施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过脑内注射施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。在一些实施方案中，通过脑室内注射施用本发明的效应细胞(诸如t细胞)组合物。效应细胞(诸如t细胞)的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
[0316]
xv.使用car和csr诊断和成像的方法
[0317]
可以将标记的car和csr用于诊断目的以检测、诊断或监测癌症。例如，可以将本文所述的car和csr用于原位、体内、离体、和体外诊断测定或成像测定中。
[0318]
本发明的另外的实施方案包括诊断个体(例如，哺乳动物，诸如人)的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法。该方法包括检测个体中的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，提供了诊断个体(例如，哺乳动物，诸如人)的癌症(例如，血液癌或实体瘤癌症)的方法，该方法包括(a)将有效量的根据上文所述的任何实施方案的标记的抗体部分施用于该个体；和(b)确定个体中的标签水平，使得高于阈值水平的标签水平指示个体患有癌症。阈值水平可以通过各种方法确定，该各种方法包括例如通过在患有癌症的第一组个体中和不具有癌症的第二组个体中检测根据上文所述的诊断方法的标签，并且将阈值设置成允许在该第一组与该第二组之间进行区分的水平。在一些实施方案中，该阈值水平为零，并且该方法包括确定个体中的标签的存在或不存在。在一些实施方案中，该方法还包括在施用步骤(a)之后等待一个时间间隔以允许标记的抗体部分优先集中在个体中表达抗原的部位处(并且等待未结合的标记抗体部分被清除)。在一些实施方案中，该方法还包括减去标签的背景水平。背景水平可以通过各种方法来确定，该各种方法包括例如通过检测在施用标记的抗体部分之前的个体中的标签，或者通过在不具有癌症的个体中检测根据上文所述的诊断方法的标签。
[0319]
本发明的抗体部分可以用于使用本领域技术人员已知的方法测定生物样品中的抗原呈递细胞的水平。合适的抗体标签是本领域已知的并且包括酶标签，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(131i、125i、123i、121i)、碳(14c)、硫(35s)、氚(3h)、铟(115min、113min、112in、111in)、锝(99tc、99mtc)、铊(201ti)、镓(68ga、67ga)、钯(103pd)、钼(99mo)、氙(133xe)、氟(18f)、钐(153sm)、镥(177lu)、钆(159gd)、钷(149pm)、镧(140la)、镱(175yb)、钬(166ho)、钇(90y)、钪(47sc)、铼(186re、188re)、镨(142pr)、铑(105rh)和钌(97ru)；鲁米诺；荧光标签，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。
[0320]
本领域已知的技术可以应用于本发明的标记的抗体部分。此类技术包括但不限于使用双官能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。除了以上测定之外，各种体内和离体测定对于技术人员而言是可获得的。例如，人们可以将受试者体内的细胞暴露于任选地用可检测标签(例如，放射性同位素)标记的抗体部分，并且可以评价该抗体部分与细胞的结合，例如，通过外部扫描放射性或通过分析源
自先前暴露于该抗体部分的受试者的样品(例如，活检或其它生物样品)。
[0321]
xvi.药物组合物
[0322]
本文还提供了car加csr免疫细胞组合物(诸如药物组合物，在本文中也称为配制品)，其包含在其表面上呈现根据本文所述的任何car的car和根据本文所述的任何csr的csr的免疫细胞(诸如t细胞)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0323]
该组合物可以包含同质细胞群或异质细胞群，该同质细胞群包含相同细胞类型的car加csr免疫细胞并且表达相同的car和csr，或该异质细胞群包含多个car加csr免疫细胞群，该多个car加csr免疫细胞群包含不同细胞类型的car加csr免疫细胞、表达不同的car和/或表达不同的csr。该组合物还可以包含不是car加csr免疫细胞的细胞。
[0324]
因此，在一些实施方案中，提供了car加csr免疫细胞组合物，其包含相同细胞类型的car加csr免疫细胞(诸如car加csr t细胞)的同质细胞群并表达相同的car和csr。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0325]
在一些实施方案中，提供了包含异质细胞群的car加csr免疫细胞组合物，该异质细胞群包含多个car加csr免疫细胞群，该多个car加csr免疫细胞群包含不同细胞类型的car加csr免疫细胞、表达不同的car和/或表达不同的csr。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群彼此独立地属于选自由细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞组成的组的细胞类型。在一些实施方案中，该组合物中的所有car加csr免疫细胞具有相同的细胞类型(例如，所有car加csr免疫细胞都是细胞毒性t细胞)。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群属于与其它car加csr免疫细胞群不同的细胞类型(例如，一个car和csr免疫细胞群由细胞毒性t细胞组成，并且其它car加csr免疫细胞群由自然杀伤t细胞组成)。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达相同的car。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的car。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的car。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶抗原特异性地结合的car。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶抗原特异性地结合的car(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶抗原特异性地结合的car的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶抗原特异性地结合的car(例如，每个靶抗原与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达相同的csr。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的csr。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的csr。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶配体特异性地结合的csr。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶配体特异性地结合的csr(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶配体特异性地结
合的csr的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶配体特异性地结合的csr(例如，每个靶配体与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0326]
因此，在一些实施方案中，提供了car加csr免疫细胞组合物，其包含根据本文所述的任何实施方案的多个car加csr免疫细胞群，其中该组合物中的所有car加csr免疫细胞属于相同的细胞类型(例如，所有car加csr免疫细胞都是细胞毒性t细胞)，并且其中每个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的car。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶抗原特异性地结合的car。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶抗原特异性地结合的car(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶抗原特异性地结合的car的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶抗原特异性地结合的car(例如，每个靶抗原与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0327]
在一些实施方案中，提供了car加csr免疫细胞组合物，其包含根据本文所述的任何实施方案的多个car加csr免疫细胞群，其中该组合物中的所有car加csr免疫细胞属于相同的细胞类型(例如，所有car加csr免疫细胞都是细胞毒性t细胞)，并且其中每个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的csr。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶配体特异性地结合的csr。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶配体特异性地结合的csr(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶配体特异性地结合的csr的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶配体特异性地结合的csr(例如，每个靶配体与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0328]
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含根据本文所述的任何实施方案的多个car加csr免疫细胞群，其中至少一个car加csr免疫细胞群属于与其它car加csr免疫细胞群不同的细胞类型。在一些实施方案中，所有car加csr免疫细胞群都属于不同的细胞类型。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群彼此独立地属于选自由细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞组成的组的细胞类型。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达相同的car。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的car。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的car。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶抗原特异性地结合的car。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶抗原特
异性地结合的car(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶抗原特异性地结合的car的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶抗原特异性地结合的car(例如，每个靶抗原与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达相同的csr。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的csr。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与其它car加csr免疫细胞群不同的csr。在一些实施方案中，每个car和csr免疫细胞群表达与相同靶配体特异性地结合的csr。在一些实施方案中，至少一个car加csr免疫细胞群表达跟与其它car加csr免疫细胞群不同的靶配体特异性地结合的csr(例如，一个car和csr免疫细胞群特异性地结合pmhc复合物，并且其它car加csr免疫细胞群特异性地结合细胞表面受体)。在一些实施方案中，在至少一个car加csr免疫细胞群表达与不同的靶配体特异性地结合的csr的情况下，每个car和csr免疫细胞群表达跟与相同疾病或病症相关的靶配体特异性地结合的csr(例如，每个靶配体与癌症(诸如乳腺癌)相关)。在一些实施方案中，car加csr免疫细胞组合物是药物组合物。
[0329]
在制备组合物期间的各个点处，冷冻保存细胞可能是必要的或有益的。术语“冷冻(frozen/freezing)”和“冷冻保存的/冷冻保存”可以互换使用。冷冻包括冷冻干燥。
[0330]
如本领域普通技术人员所理解，细胞的冷冻可以是破坏性的(参见mazur,p.,1977,cryobiology 14:251-272)，但有许多程序可用于防止这种损害。例如，可以通过(a)使用冷冻保护剂、(b)控制冷冻速率和/或(c)在足够低的温度下储存以使降解反应最小化来避免损害。示例性低温保护剂包括二甲亚砜(dmso)(lovelock和bishop,1959,nature 183:1394-1395；ashwood-smith,1961,nature 190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(rinfret,1960,ann.n.y.acad.sci.85:576)、聚乙二醇(sloviter和ravdin,1962,nature 196:548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、异赤藓醇、d-核糖醇、d-甘露糖醇(rowe等人，1962,fed.proc.21:157)、d-山梨糖醇、异肌醇、d-乳糖、氯化胆碱(bender等人，1960,j.appl.physiol.15:520)、氨基酸(phan the tran和bender,1960,exp.cell res.20:651)、甲醇、乙酰胺、甘油单乙酸酯(lovelock,1954,biochem.j.56:265)和无机盐(phan the tran和bender,1960,proc.soc.exp.biol.med.104:388；phan the tran和bender,1961，关于radiobiology，第三届澳大利亚放射性生物学会议的会议录(proceedings of the third australian conference on radiobiology)，ilbery编辑，butterworth,london，第59页)。在特定实施方案中，可以使用dmso。添加血浆(例如，至20％-25％的浓度)可以增强dmso的保护作用。在添加dmso之后，可以将细胞保持在0℃直到冷冻，因为1％的dmso浓度在高于4℃的温度下可以是有毒的。
[0331]
在细胞的冷冻保存中，缓慢控制的冷却速率可能至关重要并且不同的冷冻保护剂(rapatz等人，1968,cryobiology 5(1):18-25)和不同的细胞类型具有不同的最佳冷却速率(关于冷却速度对干细胞存活率和对其移植潜力的影响，参见例如，rowe和rinfret,1962,blood 20:636；rowe,1966,cryobiology 3(1):12-18；lewis等人，1967,transfusion 7(1):17-32；以及mazur,1970,science 168:939-949)。其中水转变为冰的融合相的热量应该是最小的。冷却程序可以通过使用例如可编程的冷冻装置或甲醇浴程序来实施。可编程冷冻设备允许确定最佳冷却速率并促进标准的可重复冷却。
[0332]
在特定实施方案中，可以将经dmso处理的细胞在冰上预冷却并且转移到含有冰冷甲醇的托盘中，该托盘进而又放置在-80℃的机械冷藏库中(例如，harris或revco)。甲醇浴和样品的热电偶测量指示1
°
至3℃/分钟的冷却速率可能是优选的。在至少两小时之后，样本可以达到-80℃的温度，并且可以直接放置到液氮(-196℃)中。
[0333]
在彻底冷冻之后，可以将细胞快速转移到长期低温储存容器。在优选实施方案中，可以将样品低温储存在液氮(-196℃)或蒸气(-1℃)中。通过可获得高效液氮冷藏库来促进此类存储。
[0334]
用于操纵细胞、冷冻保存细胞和长期储存细胞的另外考虑和程序可以在以下示例性参考文献中发现：美国专利号4,199,022；3,753,357；和4,559,298；gorin,1986,clinics in haematology 15(1):19-48；bone-marrow conservation,culture and transplantation,proceedings of a panel,moscow,1968年7月22-26日international atomic energy agency,vienna，第107-186页；livesey和linner,1987,nature 327:255；linner等人，1986,j.histochem.cytochem.34(9):1 123-1 135；simione,1992,j.parenter.sci.technol.46(6):226-32)。
[0335]
在冷冻保存后，可以根据本领域普通技术人员已知的方法解冻冷冻细胞以供使用。优选地快速解冻冷冻的细胞并在解冻时立即冷却。在特定实施方案中，含有冷冻细胞的小瓶可以在温水浴中浸没到其颈部；温和旋转将确保细胞悬浮液在其解冻时混合，并且增加从温水到内部冰块的热传递。一旦冰完全熔化，就可以将小瓶立即放置在冰上。
[0336]
在特定实施方案中，可以将方法用于在解冻期间防止细胞结块。示例性方法包括：在冷冻之前和/或之后添加dnase(spitzer等人，1980,cancer45:3075-3085)、低分子量葡聚糖和柠檬酸盐、羟乙基淀粉(stiff等人，1983,cryobiology 20:17-24)等[0162]。如本领域普通技术人员所理解的，如果使用对人类有毒的冷冻保护剂，则应在治疗使用之前将其去除。dmso没有严重毒性。
[0337]
在美国专利公开号2010/0183564的第14-15页描述了示例性的载剂和细胞的施用模式。另外的药物载剂描述于remington:the science and practice of pharmacy，第21版，david b.troy编辑，lippicott williams&wilkins(2005)。
[0338]
在特定实施方案中，可以从培养基中收获细胞，并且洗涤并以治疗有效量浓缩到载剂中。示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克斯氏溶液(hanks'solution)、林格氏溶液、nonnosol-r(abbott labs)、plasma-lyte a(r)(baxter laboratories,inc.,morton grove,il)、甘油、乙醇以及它们的组合。
[0339]
在特定实施方案中，载剂可以补充有人血清白蛋白(hsa)或其它人血清组分或胎牛血清。在特定实施方案中，用于输注的载剂包含具有5％has或葡萄糖的缓冲盐水。另外的等渗剂包括多元糖醇，包括三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
[0340]
载剂可以包括缓冲剂，诸如柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
[0341]
稳定剂是指广泛类别的赋形剂，其可以从增积剂到帮助防止细胞粘附到容器壁上的添加剂的功能范围。典型的稳定剂可以包括多元糖醇；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨
酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油和环醇诸如肌醇；peg；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，《10个残基)；蛋白质，诸如hsa、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，诸如棉子糖，以及多糖，诸如葡聚糖。
[0342]
在必要或有益的情况下，组合物可以包括局部麻醉剂，诸如利多卡因，以减轻在注射部位的疼痛。
[0343]
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
[0344]
组合物内的治疗有效量的细胞可以为大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于10
10
个细胞、或大于10
11
个细胞。
[0345]
在本文公开的组合物和配制品中，细胞通常在一升或更小、500ml或更小、250ml或更小或100ml或更小的体积中。因此，所施用的细胞的密度通常为大于104个细胞/ml、107个细胞/ml或108个细胞/ml。
[0346]
本文还提供了包含编码本文所述的car和/或csr和/或sse的任何核酸的核酸组合物(诸如药物组合物，在本文中也称为配制品)。在一些实施方案中，核酸组合物是药物组合物。在一些实施方案中，核酸组合物还包含等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂和/或防腐剂中的任一种；和/或水性媒介物，诸如纯化水、糖水溶液、缓冲溶液、生理盐水、聚合物水溶液或无rnase水。可以根据核酸组合物的使用形式合适地选择要添加的此类添加剂和水性媒介物的量。
[0347]
本文公开的组合物和配制品可以制备用于通过例如注射、输注、灌注或灌洗来施用。组合物和配制品可以进一步配制成用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、瘤内、肌内、囊内和/或皮下注射。
[0348]
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这易于通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。
[0349]
xvii.剂量和施用
[0350]
施用于个体(诸如人)的组合物的剂量可以根据特定组合物、施用模式和待治疗的疾病类型而变化。在一些实施方案中，组合物的量足以在个体中产生完全应答。在一些实施方案中，组合物的量足以在个体中产生部分应答。在一些实施方案中，所施用的组合物的量(例如，当单独施用时)足以在用该组合物治疗的个体群体中产生大于约2％、4％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中的任一者的总体应答率。可以例如基于肿瘤生长抑制百分比(％tgi)来确定个体对本文所述方法的治疗的应答。
[0351]
在一些实施方案中，组合物的量足以延长个体的总存活期。在一些实施方案中，组合物的量(例如当一起施用时)足以在用该组合物治疗的个体群体中产生大于约2％、4％、
6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或77％的临床益处。
[0352]
在一些实施方案中，组合物的量是与治疗之前在相同受试者中对应的肿瘤尺寸、癌细胞数量或肿瘤生长速率相比或与未接受治疗的其它受试者的对应活性相比，足以将肿瘤的尺寸减小、将癌细胞数量减少或将肿瘤生长速率降低至少约2％、4％、6％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的量。可以将标准方法用于测量这种效果的量级，诸如使用纯化酶的体外测定、基于细胞的测定、动物模型或人类测试。
[0353]
在一些实施方案中，组合物的量低于诱导毒理学作用(即，高于临床上可接受的毒性水平的作用)的水平或处于当将组合物施用于个体时可以控制或耐受潜在的副作用的水平。在一些实施方案中，组合物的量接近在相同给药方案之后组合物的最大耐受剂量(mtd)。在一些实施方案中，组合物的量为mtd的大于约80％、90％、95％或98％中的任一者。在一些实施方案中，组合物的量包括在约0.001μg至约1000μg的范围内。在任何上述方面的一些实施方案中，组合物的有效量在约0.1μg/kg总体重至约100mg/kg总体重的范围内。
[0354]
组合物可以经由各种途径施用于个体(诸如人)，该各种途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、鼻内、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、颅内、脑内、脑室内、经粘膜和经皮。在一些实施方案中，可以使用组合物的持续连续释放配制品。在一些实施方案中，静脉内地施用组合物。在一些实施方案中，动脉内地施用组合物。在一些实施方案中，腹膜内地施用组合物。在一些实施方案中，鞘内地施用组合物。在一些实施方案中，颅内地施用组合物。在一些实施方案中，脑内地施用组合物。在一些实施方案中，脑室内地施用组合物。在一些实施方案中，鼻内地施用组合物。
[0355]
xviii.制造
[0356]
在本发明的一些实施方案中，提供了含有可用于治疗以下疾病的材料的制品：靶抗原阳性疾病诸如癌症(例如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或甲状腺癌)或病毒感染(例如由cmv、ebv、hbv、kshv、hpv、mcv、htlv-1、hiv-1或hcv引起的感染)。所述制品还可包括容器以及容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。一般来讲，容器保存有效治疗本文所述的疾病或病症的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是在其表面上呈递本发明的car和csr的免疫细胞。标签或包装说明书指出组合物可用于治疗特定病状。标签或包装说明书还将包含用于将car加csr免疫细胞组合物施用于患者的说明。还设想了包含本文所述的组合疗法的制品(article of manufacture)和药盒(kit)。
[0357]
包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用此类治疗产品的指示、用途、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。在一些实施方案中，包装说明书指出组合物可用于治疗靶抗原阳性癌症(诸如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细
胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或甲状腺癌)。在其它实施方案中，包装包装说明书指出组合物可用于治疗靶抗原阳性病毒感染(例如由cmv、ebv、hbv、kshv、hpv、mcv、htlv-1、hiv-1或hcv引起的感染)。
[0358]
另外地，该制品还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述容器还可包含商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
[0359]
还提供了可用于各种目的(例如用于治疗本文所述的靶抗原阳性疾病或病症，任选地与该制品组合)的药盒。本发明的药盒包括一个或多个容器，该一个或多个容器包含car加csr免疫细胞组合物(或单位剂型和/或制品)，并且在一些实施方案中，还包含另一种药剂(诸如本文所述的药剂)和/或根据本文所述的任何方法使用的说明。药盒可以还包含对适合于治疗的个体的选择的描述。在本发明的药盒中提供的说明书通常是在标签或包装说明书上的书面说明(例如，包括在药盒中的纸张，但机器可读说明(例如，在磁性或光学存储盘上承载的说明)也是可接受的。
[0360]
例如，在一些实施方案中，药盒包含组合物，该组合物包含在其表面上呈递car和csr的免疫细胞。在一些实施方案中，药盒包含a)含有在其表面上呈递car和csr的免疫细胞的组合物，以及b)有效量的至少一种其它药剂，其中该其它药剂增加mhc蛋白质的表达和/或增强mhc蛋白(例如，ifnγ、ifnβ、ifnα或hsp90抑制剂)的对肽的表面呈递。在一些实施方案中，药盒包含a)含有在其表面上呈递car和csr的免疫细胞的组合物，以及b)用于将car加csr免疫细胞组合物施用于个体以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。在一些实施方案中，药盒包含a)含有在其表面上呈递car和csr的免疫细胞的组合物，b)有效量的至少一种其它药剂，其中该其它药剂增加mhc蛋白质的表达和/或增强mhc蛋白(例如，ifnγ、ifnβ、ifnα或hsp90抑制剂)的对肽的表面呈递，以及c)用于将car加csr免疫细胞组合物和其它药剂施用于个体以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明。car加csr免疫细胞组合物和其它药剂可以存在于多个单独的容器中或单个容器中。例如，药盒可以包含一种独特的组合物或两种或更多种组合物(其中一种组合物包含car加csr免疫细胞并且另一种组合物包含另一种药剂)。
[0361]
在一些实施方案中，药盒包含a)包含car和csr的一种或多种组合物，和b)用于将car和csr与免疫细胞(诸如免疫细胞，例如，来源于个体的t细胞或自然杀伤细胞)组合以形成包含在其表面上呈递car和csr的免疫细胞的组合物，并且将car加csr免疫细胞组合物施用于个体以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明书。在一些实施方案中，药盒包含a)含有car和csr的一种或多种组合物，以及b)免疫细胞(诸如细胞毒性细胞)。在一些实施方案中，药盒包含：a)含有car和csr的一种或多种组合物，b)免疫细胞(诸如细胞毒性细胞)，和c)用于将car和csr与免疫细胞组合以形成包含在其表面上呈递car和csr的免疫细胞的组合物，并且将car加csr免疫细胞组合物施用于个体以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明书。
[0362]
在一些实施方案中，药盒包含编码car和csr的核酸(或一组核酸)。在一些实施方案中，药盒包含a)编码car和csr的核酸(或一组核酸)，以及b)用于表达该核酸(或一组核酸)的宿主细胞(诸如免疫细胞)。在一些实施方案中，药盒包含a)编码car和csr的核酸(或一组核酸)，以及b)用于i)在宿主细胞(诸如免疫细胞，例如t细胞)中表达car和csr，ii)制
备包含表达car和csr的宿主细胞的组合物，以及iii)向个体施用包含表达car和csr的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明书。在一些实施方案中，宿主细胞来源于个体。在一些实施方案中，药盒包含：a)编码car和csr的核酸(或一组核酸)，b)用于表达该核酸(或一组核酸)的宿主细胞(诸如免疫细胞)，以及c)用于i)在宿主细胞中表达car和csr，ii)制备包含表达car和csr的宿主细胞的组合物，以及iii)向个体施用包含表达car和csr的宿主细胞的组合物以治疗靶抗原阳性疾病(诸如癌症或病毒感染)的说明书。
[0363]
本发明的药盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)等。药盒可任选地提供附加组分，诸如缓冲剂和解释性信息。因此，本技术还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、柔性包装等。
[0364]
涉及使用car加csr免疫细胞组合物的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可提供药盒，其包含足够剂量的如本文所公开的car加csr免疫细胞组合物以提供持续延长的时间段，诸如以下中的任一者的个体有效治疗：一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。药盒还可以包括car和csr以及药物组合物的多个单位剂量和使用说明书，其以足以在药房(例如，医院药房和配混药房)中储存和使用的量包装。
[0365]
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内，若干实施方案是可能的。现在将通过参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
[0366]
实施例
[0367]
材料和方法
[0368]
细胞样品、细胞系和抗体
[0369]
细胞系hepg2(atcc hb-8065；hla-a2

、afp

、gpc3

)、sk-hep-1(atcc htb-52；hla-a2

、afp-)、raji(atcc ccl-86；cd19

、cd22

)、nalm6(atcc crl-1567；cd19

)、jurkat细胞(atcc tib-152、cd20-、cd22-)、rpmi-8226(atcc crm-ccl-155、ror1

)、lncap(atcc crl-1740；psma

)、和im9(atcc ccl-159；hla-a2

、ny-eso-l

)从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得。
[0370]
hepg2是表达afp和gpc3的肝细胞癌细胞系；sk-hep1是不表达afp的肝腺癌细胞系。通过用表达微基因盒的afp158肽转导sk-hep1亲本细胞系来产生sk-hepl-afp mg，这导致afp158/hla-a*02:01复合物在sk-hep1中的高水平细胞表面表达。通过用gpc3表达盒进一步转导sk-hep1-afp-mg细胞系来产生sk-hepl-afp mg-gpc3，这导致afp158/hla-a*02:01复合物和gpc3在sk-hep1中的高水平细胞表面表达。raji是表达cd19和cd22的伯基特淋巴瘤细胞系。nalm6是也表达cd19的白血病细胞系。jurkat是不表达cd22的急性t细胞淋巴瘤细胞系。rpmi-8226细胞是表达ror1的骨髓瘤细胞。lncap前列腺肿瘤细胞系表达psma。im9是表达ny-eso-1的多发性骨髓瘤细胞系。将所有细胞系在补充有10％fbs和2mm谷氨酰胺的rpmi 1640或dmem中在37℃/5％co2下培养。
[0371]
针对人或小鼠cd3、cd4、cd8、cd28、ccr7、cd45ra或myc标签的抗体购买自
invitrogen；抗cd22和cd20抗体购买自biolegend。
[0372]
afp158/hla-a*02:01特异性抗体、cd19特异性抗体、cd20特异性和cd22特异性抗体、ror1特异性抗体、gpc3特异性抗体、psma特异性抗体和ny-eso-1抗体在eureka therapeutics内部开发并生产。使用bd facs canto ii收集流式细胞术数据并使用flowjo软件包进行分析。
[0373]
所有肽均购买自并由elim biopharma合成。肽为》90％纯的。将肽以10mg/ml溶解于dmso中或在盐水中稀释，并冷冻在-80℃。通过用重组hla-a*02:01和β2微球蛋白(β2m)使肽重新折叠来产生生物素化的单链afp158/hla-a*02:01和对照肽/hla-a*02:01复合物单体。通过bira酶将bsp肽连接到hla-a*02:01细胞外结构域(ecd)的c末端来使该单体生物素化。将荧光标记的链霉亲和素与生物素化的肽/hla-a*02:01复合物单体混合以形成荧光标记的肽/hla-a*02:01四聚体。
[0374]
例如通过用编码car的载体转染293t细胞来生产含有car的慢病毒。在存在白介素2(il-2)的情况下100u/ml用cd3/cd28珠(invitrogen)刺激一天之后将原代人t细胞用于转导。将浓缩的慢病毒应用于retronectin(takara)涂覆的6孔板中的t细胞，持续96小时。通过流式细胞术评估抗afp/mhc car(或“抗afp car”或“抗afp-car”)和抗afp/mhc car加抗gpc3 csr(或“抗afp-car 抗gpc3-csr”)构建体的转导效率。对于抗afp car，使用分别具有pe缀合的链霉亲和素或抗myc抗体的生物素化的afp158/hla-a*02:01四聚体(“afp158四聚体”)。对于抗gpc3 csr，使用抗myc抗体。在第5天和之后每3-4天进行重复流式细胞术分析。对于抗cd19car，使用pe缀合的抗cd19抗个体基因型抗体进行测定。
[0375]
用编码car或car和csr两者的载体或用两种载体(一种编码car、一种编码csr)转导细胞系。转导后五天，使用抗myc抗体产生细胞裂解物以用于western印迹。
[0376]
通过cytox 96非放射性ldh细胞毒性测定(promega)来测定肿瘤细胞毒性。使用负面耗竭cd14、cd16、cd19、cd20、cd36、cd56、cd66b、cd123、血型糖蛋白a表达细胞的easysep人t细胞分离试剂盒(stemcell technologies)从富含pbmc的全血中制备cd3

t细胞。根据制造商的方案，将人t细胞激活并且用例如cd3/cd28 dynabeads(invitrogen)扩增。将激活的t细胞(atc)培养并维持在具有10％fbs加100u/ml il-2的rpmi 1640培养基中并且在第7-14天使用。激活的t细胞(免疫细胞)和靶细胞以各种效应物与靶比率(例如，2.5:1或5:1)共培养16小时并测定细胞毒性。
[0377]
实施例1a-短期体外癌细胞杀伤测定
[0378]
将激活的car cd30-csr t细胞(包含car和含有cd30共刺激结构域的csr的t细胞)和靶细胞以5:1比率与αcd19或αafp抗体一起共培养16小时。通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定特异性杀伤。通过ldh细胞毒性测定(promega)来测定肿瘤细胞毒性。根据制造商的方案，将购买自allcells的人t细胞激活并用cd3/cd28 dynabeads(invitrogen)扩增。将激活的t细胞(atc)培养并维持在具有10％fbs加100u/ml il-2的rpmi 1640培养基中并且在第7-14天使用。通过facs分析，t细胞为》99％cd3

的。激活的t细胞(效应细胞)和靶细胞(nalm6或hepg2细胞)以5:1的比率分别与不同浓度的αcd19或αafp抗体一起共培养16小时。然后通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定细胞毒性。
[0379]
car cd30-csr t细胞比不含csr的对应car t细胞具有更高的杀伤功效，并且如果没有更好的话，也具有与car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞大致相同的杀伤功
效。
[0380]
实施例1b-短期体外癌细胞杀伤测定
[0381]
进行测定比较各种car t细胞(包括第1代和第2代car t细胞)的短期杀伤能力。本实施例中使用的效应细胞包括以下：
[0382]
1)不含csr的car t细胞；
[0383]
2)具有包含至少细胞内cd30共刺激结构域(cd30 ic结构域)的csr的car t细胞，其具有cd30跨膜结构域(称为“car cd30-csr t细胞”)或不同共刺激分子的跨膜(tm)结构域(例如，cd28 tm)(称为“car cd28t-cd30-csr t细胞”)；
[0384]
3)具有包含至少细胞内cd28共刺激结构域的csr的car t细胞，其具有cd28跨膜结构域(称为“car cd28-csr t细胞”)或不同的共刺激分子的跨膜(tm)结构域(例如，cd30 tm)(称为“car cd30t-cd28-csr t细胞”)；
[0385]
4)具有包含至少细胞内4-1bb共刺激结构域的csr的car t细胞，其具有4-1bb tm结构域(称为“car 41bb-csr t细胞”)或不同的共刺激分子的tm结构域(例如，cd28 tm)(称为“car cd28t-41bb-csr t细胞”)；以及
[0386]
5)具有包含至少细胞内dap10共刺激结构域的csr的car t细胞，其具有dap10 tm结构域(称为“car dap10-csr t细胞”)或不同的共刺激分子的tm结构域(例如，cd28 tm)(称为“car cd28t-dap10-csr t细胞”)。
[0387]
本文公开了可以使用的构建体/t细胞的其它构建体或更详细的描述，例如实施例9。
[0388]
将激活的效应细胞及其对应的靶细胞以介于2:1至5:1之间的e:t比率共培养16-24小时。通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定特异性杀伤。通过ldh细胞毒性测定(promega)来测定肿瘤细胞毒性。根据制造商的方案，将购买自allcells的人t细胞激活并用cd3/cd28 dynabeads(invitrogen)扩增。将激活的t细胞(atc)培养并维持在具有10％fbs加100u/ml il-2的rpmi 1640培养基中并且在第7-14天使用。通过facs分析，t细胞为》99％cd3

的。激活的t细胞(效应细胞)和靶细胞(例如，hepg2细胞)以2:1到5:1比率共培养16-24小时，通常16小时。然后通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定细胞毒性。
[0389]
还通过测量在与靶细胞接合时从t细胞释放的细胞因子的量/水平来确定各种car t细胞的短期杀伤能力。用luminex magpix技术使用biorad bio-plex试剂盒或用elisa定量共培养16小时后在上清液中的细胞因子释放水平。具有高细胞毒性效力的t细胞分泌高水平的与t细胞活性相关的细胞因子，诸如tnfα、gm-csf、ifnγ和il-2。
[0390]
具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞的杀伤功效高于不含csr的对应car t细胞的杀伤功效，并且高于或大致相同于具有不含cd30 ic结构域但含有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的对应car t细胞的杀伤功效。
[0391]
实施例2-增殖潜力和持久性测定
[0392]
遗传修饰的t细胞的增殖和持久性对于过继性t细胞转移疗法在治疗癌症时的成功至关重要。为了测定csr对t细胞增殖和持久性的影响，我们将t细胞用细胞内染料cfse标记并观察在用肿瘤细胞刺激时t细胞分裂时染料的稀释。我们还能够通过计数在指定日剩余的cfse阳性细胞的数量来测量t细胞的持久性。
[0393]
相应的t细胞是血清饥饿过夜的，并且使用celltrace cfse(thermo fisher c34554)用cfse标记的。将50,000个到100,000个t细胞在2:1的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)下孵育，并且使用流式细胞术观察在指定日t细胞分裂时的cfse染料的连续稀释。用fac计数t细胞的总数。
[0394]
具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞的增殖高于不含csr的对应car t细胞的增殖，并且高于或大致相同于具有不含cd30 ic结构域但含有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的对应car t细胞的增殖。
[0395]
实施例3a-在多周接合后的体外t细胞和肿瘤细胞计数
[0396]
将对靶细胞进行计数的基于facs的测定用于比较car csr t细胞的长期杀伤潜力。还通过与raji细胞共培养来测量通过car cd30-csr t细胞的长期杀伤。在靶细胞接合后所有car cd30-csr t细胞显示出相当的存活期。
[0397]
car cd30-csr t细胞在肿瘤细胞的多次接合后持续更长的时间段，并且比不含csr的对应car t细胞杀死更多的肿瘤细胞，并且如果没有更好的话，也与car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞大致相同。
[0398]
实施例3b-在多周接合后的长期体外t细胞和靶细胞计数
[0399]
将对t细胞和靶细胞进行计数的基于facs的测定用于比较car cd30-csr t细胞与不具有csr或具有包含其它共刺激片段的csr的car t细胞的长期存活期和靶细胞杀伤潜力。通常，将50,000个至100,000个t细胞与靶细胞一起以2:1的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)孵育。在不同的天(通常在第一次接合后每7天)用靶细胞再攻击细胞。在每次靶细胞接合后不同的天用facs定量剩余的靶细胞和总t细胞的数量。
[0400]
具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞比不含csr的对应car t细胞在肿瘤靶细胞的多次接合中持续/存活更长的时间段并且杀死更多的肿瘤细胞，并且比具有不含cd30 ic结构域但含有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的对应car t细胞存活更好和/或杀死更多的肿瘤细胞或与之大致相同。
[0401]
实施例4-体内细胞因子释放
[0402]
为了确定体内细胞因子释放水平，在向携带nalm-6肿瘤的小鼠施用car cd30-csr t细胞之后16、24、48和72小时分析关键的细胞因子，包括与临床细胞因子释放综合征有关的那些细胞因子。使用biorad bio-plex试剂盒用luminex magpix技术定量细胞因子水平。
[0403]
car cd30-csr t细胞比不含csr的对应car t细胞分泌更高水平的与t细胞活性有关的细胞因子，诸如tnfα、gm-csf、ifnγ和il-2。例如，car cd30-csr t细胞比car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞分泌更高水平的与t细胞活性有关的细胞因子，诸如tnfα、gm-csf、ifnγ和il-2。
[0404]
实施例5a-t细胞亚组随时间的分化(ccr7/cd45ra)
[0405]
在两个独立的流式细胞术测定中，在靶细胞接合之前和之后测量car cd30-csr t细胞的增殖和存活。在靶接合之前，与car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞相比，car cd30-csr t细胞的facs分析显示出更高水平的t细胞分化标志物ccr7和cd45ra表达。
[0406]
与car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞相比，car cd30-csr t细胞具有增加的记忆和原初t细胞百分比。
[0407]
实施例5b-t细胞亚组随时间的分化(ccr7/cd45ra)和记忆t细胞定量
[0408]
car cd30-csr t细胞在靶刺激后发展成并维持高记忆t细胞群，包括中央记忆和效应记忆t细胞。为了确定与仅表达car或car与包含不同的共刺激片段(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr共表达相比表达car cd30-csr对t细胞发展成并维持记忆t细胞的能力的作用，我们测量了记忆t细胞标志物ccr7和cd45ra的细胞表面表达。如本领域已知的，具有高ccr7表达水平和低cd45ra表达水平的t细胞被认为是中央记忆t细胞，具有低ccr7和低cd45ra表达水平的t细胞是效应记忆t细胞，具有低ccr7和高cd45ra表达水平的t细胞是效应t细胞，而具有高ccr7和高cd45ra的t细胞是作为在靶/抗原攻击/识别之前的初始t细胞类型的原初t细胞(mahnke等人，eur j immunol.43(11):2797-809,2013)。当响应于遇到抗原时，原初t细胞增殖并分化成效应细胞，其大多数执行破坏靶的工作并且然后死亡，然而小部分的t细胞最终发展成可以将针对特定靶的t细胞免疫力储存的长寿命的记忆t细胞。在记忆t细胞中，发现中央记忆t细胞比效应记忆t细胞具有更长的寿命并且能够产生效应记忆t细胞，但反之则不能。因此，发展成和维持记忆t细胞(尤其是中央记忆t细胞)的能力是潜在成功的t细胞疗法的重要和期望的特征。
[0409]
将表达单独的car构建体的效应细胞与靶细胞一起以2:1的e:t比率(例如，在96孔板上的每个孔中100,000个受体

t细胞和50,000个靶细胞)孵育7天。然后每7天用每孔50,000-100,000个靶细胞再攻击细胞。
[0410]
将car cd30-csr和car 其它csr t细胞与靶细胞一起以1:2的e:t比率(例如，在每个孔中25,000个受体

t细胞和50,000个靶细胞)孵育7天。然后每7天用每孔50,000-100,000个靶细胞再攻击细胞。
[0411]
在一些实验中，在第四次和第五次靶细胞接合(e4和e5)之前将car csr t细胞和靶细胞混合物以1:6稀释以避免由于显著的t细胞扩增而导致t细胞的过高密度性，使得先前剩余的细胞中的仅六分之一被50,000-100,000靶细胞再攻击。
[0412]
在每次靶细胞接合后的选定日，将来自每个样品的孔中的整个细胞混合物都用针对ccr7和cd45ra的抗体染色并通过流式细胞术进行分析。计数受体

t细胞数，并且基于其ccr7和cd45ra表达水平将细胞分组为各种t细胞类型：中央记忆t细胞(cd45ra-ccr7

)、效应记忆t细胞(cd45ra-ccr7-)、效应t细胞(cd45ra

ccr7-)和原初t细胞(cd45ra

ccr7

)。计算各种类型的t细胞在受体

t细胞的总数中的百分比。在一些实验中，还用针对cd8或cd4的抗体染色细胞以确定所计数的t细胞的cd8-cd4特征。
[0413]
在靶细胞接合之前和之后测量car或car csr t细胞的增殖和存活。具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞能够在与靶细胞接合时发展成和维持高数量和高百分比的中央记忆t细胞，高于单独表达car或共表达car和不具有cd30 ic结构域但具有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的t细胞。
[0414]
实施例6-在与靶细胞共培养之后t细胞中的t细胞耗竭标志物的表达
[0415]
分子诸如pd-1、lag3、tim3和tigit是在t细胞失去功能时在t细胞上累积的抑制性受体。由于这种现象，这些分子的表达被视为耗竭t细胞的标志物。为了检查抗原刺激时在car csr转导的细胞上表达的耗竭标志物的水平，使用easysep人t细胞分离试剂盒(stemcell technologies)从富含pbmc的全血制备cd3

t细胞，并且如上所述用cd3/cd28 dynabeads激活。激活和扩增的细胞群为通过流式细胞术确定的》99％cd3

。然后用编码car cd30-csr、具有其它csr或没有csr的慢病毒载体转导这些细胞7-9天。将转导的t细胞(效
应细胞)与靶细胞一起以1:1到2.5:1的效应物与靶比率共培养16小时。使用针对耗竭标志物pd-1、lag3、tigit或tim3的抗体，通过流式细胞术分析在转导的t细胞上的耗竭标志物水平(例如，mfi水平)。在一些实验中，将细胞孵育更长时间并且每7天用靶细胞再攻击，并且在每次靶细胞接合后的选定日测量耗竭标志物水平。
[0416]
在一系列靶细胞接合中，car cd30-csr t细胞的t细胞耗竭标志物水平低于不含csr的对应car t细胞和其它测试的共刺激结构域-csr t细胞(例如，car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞)。具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞的t细胞耗竭标志物水平低于不含csr的对应car t细胞的t细胞耗竭标志物水平，并且低于具有不含cd30 ic结构域但含有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的对应car t细胞的t细胞耗竭标志物水平。
[0417]
实施例7-肿瘤细胞杀伤
[0418]
进行测定比较各种t细胞的肿瘤细胞杀伤能力。将激活的t细胞和靶细胞以5:1的比率共培养16小时。通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定特异性杀伤。通过ldh细胞毒性测定(promega)来测定肿瘤细胞毒性。根据制造商的方案，将购买自allcells的人t细胞激活并用cd3/cd28dynabeads(invitrogen)扩增。将激活的t细胞(atc)培养并维持在具有10％fbs加100u/ml il-2的rpmi 1640培养基中并且在第7-14天使用。通过facs分析，t细胞为》99％cd3

的。激活的t细胞(效应细胞)和靶细胞(nalm6或hepg2细胞)以5:1的比率共培养16小时。然后通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定细胞毒性。
[0419]
car cd30-csr t细胞比不含csr的对应car t细胞和car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞具有更高的体内肿瘤细胞杀伤功效。
[0420]
实施例8a-t细胞的体内肿瘤浸润/穿透
[0421]
将约107个hepg2肿瘤细胞皮下植入nsg小鼠中并允许形成150mm3的实体瘤块。将5x106个car t细胞静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中。t细胞给药后3周，将小鼠处死并取出肿瘤，固定并切片到载玻片上。将肿瘤切片用cd3抗体染色，以可视化存在于实体瘤内的t细胞。cd3

细胞数量的定量可以用于评分t细胞的肿瘤浸润能力(t细胞/mm2)
[0422]
car cd30-csr t细胞比不含csr的对应car t细胞或对应的car cd28(或其它共刺激结构域)-csr t细胞具有更高的体内肿瘤浸润/穿透率/水平(即，更高的t细胞数量/mm2)。
[0423]
实施例8b-t细胞的体内肿瘤浸润
[0424]
将约107个用于动物模型的肿瘤细胞(例如，用于肝癌动物模型的hepg2细胞、用于cd19

淋巴瘤动物模型的nalm6或raji细胞、用于ror1

淋巴瘤动物模型的jeko1、用于ror1

乳腺癌动物模型的mda-mb-231细胞、用于ror1

多发性骨髓瘤动物模型的rpmi8226细胞、a549细胞、h1975细胞或用于ror1

肺癌动物模型的h1703细胞)皮下植入nsg小鼠中并允许形成实体瘤，例如，具有约150-250mm3肿块的实体瘤。将约5x106个至1x107个各种car t细胞(例如，仅car、car cd30 csr、car cd28-csr、car dap10-csr、car 4-1bb-csr或car 其它共刺激结构域-csr t细胞)静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中。t细胞给药后10天至3周，将小鼠处死并取出肿瘤，固定并切片到载玻片上。
[0425]
在肿瘤切片上进行对cd3、t细胞标志物染色的免疫组织化学，以可视化实体瘤内存在的t细胞，这代表浸润实体瘤的所有t细胞(包括穿透肿瘤的那些和从穿透的t细胞增
殖/扩增的那些)。例如用自动化免疫组织化学成像仪和/或使用qupath软件定量这些切片中的cd3阳性和cd3阴性细胞，以便确定由t细胞浸润的肿瘤块的分数，表示为cd3

细胞(t细胞)的所有细胞的％或t细胞数量/mm2肿瘤切片。在所有细胞中更高％的t细胞或更高的t细胞数量/mm2指示t细胞的更高/增加的肿瘤浸润率/水平，这反映了t细胞的肿瘤穿透和细胞增殖能力的组合。
[0426]
具有包含至少cd30 ic结构域的csr的car t细胞的体内肿瘤浸润率/水平/能力高于不含csr的对应car t细胞或具有不含cd30 ic结构域但含有不同共刺激分子的ic结构域(例如，cd28、4-1bb或dap10的ic结构域)的csr的对应car t细胞的体内肿瘤浸润率/水平/能力。
[0427]
实施例9-构建体
[0428]
对于肝癌(包括hcc)：
[0429]
构建体：与包含cd28或cd30共刺激片段的抗gpc3 csr共表达的第1代和第2代抗afp car。
[0430]
构建体：第1代αafp-cd8t-z-car：包含抗afp/mhc ec、cd8 tm和cd3ζic(no共刺激)的第1代car。
[0431]
构建体：第1代αafp-cd8t-z-car αgpc3-cd28-csr：与包含抗gpc3ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的第1代抗afp-cd8t-z-car
[0432]
构建体：第1代αafp-cd8t-z-car αgpc3-cd30-csr：与包含抗gpc3ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的第1代抗afp-cd8t-z-car
[0433]
构建体：第1代αafp-cd8t-z-car αgpc3-cd8t-cd30-csr：与包含抗gpc3 ec、cd8 tm和cd30 ic的csr共表达的第1代抗afp-cd8t-z-car
[0434]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car：包含抗afp/mhc ec、cd8 tm、cd30 ic和cd3ζic的第2代car
[0435]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28-csr：与包含抗gpc3ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0436]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30-csr：与包含抗gpc3ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0437]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd8t-cd30-csr：与包含抗gpc3 ec、cd8 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0438]
构建体：αafp-cd28z-car：包含抗afp/mhc ec、cd28 tm、cd28 ic和cd3ζic的第2代car
[0439]
构建体：αafp-cd28z-car αgpc3-cd28-csr：与包含抗gpc3 ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗afp-cd28z-car
[0440]
构建体：αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr：与共包含抗gpc3 ec、cd30 tm和cd30 ic的csr表达的抗afp-cd28z-car
[0441]
构建体：αafp-cd28z-car αgpc3-cd8t-cd30-csr：与包含抗gpc3ec、cd8 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd28z-car
[0442]
构建体：αafp-cd8t-41bbz-car：包含抗afp/mhc ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic的第2代car
[0443]
构建体：αafp-cd8t-41bbz-car αgpc3-cd30-csr：与包含抗gpc3ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-41bbz car
[0444]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30-csr
[0445]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bb-csr：与包含抗gpc3ec、4-1bb tm和4-1bb ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0446]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-ox40-csr：与包含抗gpc3ec、ox40 tm和ox40 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0447]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd27-csr：与包含抗gpc3ec、cd27 tm和cd27 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0448]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30-csr：与包含抗gpc3ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0449]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr：与包含抗gpc3 ec、cd30 tm和cd28 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0450]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30t-41bb-csr：与包含抗gpc3 ec、cd30 tm和4-1bb ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0451]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30t-ox40-csr：与包含抗gpc3 ec、ox40 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0452]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd30t-cd27-csr：与包含抗gpc3 ec、cd30 tm和cd27 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0453]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28t-cd30-csr：与包含抗gpc3 ec、cd28 tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0454]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28-csr：与包含抗gpc3ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0455]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28t-41bb-csr：与包含抗gpc3 ec、cd28 tm和4-1bb ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0456]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28t-ox40-csr：与包含抗gpc3 ec、cd28 tm和ox40 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0457]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-cd28t-cd27-csr：与包含抗gpc3 ec、cd28 tm和cd27 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0458]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bbt-cd30-csr：与包含抗gpc3 ec、4-1bb tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0459]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bb-csr：与包含抗gpc3ec、4-1bb tm和4-1bb ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0460]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bbt-cd28-csr：与包含抗gpc3 ec、4-1bb tm和cd30 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0461]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bbt-ox40-csr：与包含抗gpc3 ec、4-1bb tm和4-1bb ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
[0462]
构建体：αafp-cd8t-cd30z-car αgpc3-41bbt-cd27-csr：与包含抗gpc3 ec、4-1bb tm和cd27 ic的csr共表达的抗afp-cd8t-cd30z-car
ic的csr共表达的抗cd19-cd28z-car
[0503]
构建体：αcd19-cd28z-car αcd19-cd30-csr：与包含抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd28z-car
[0504]
构建体：αcd19-cd8t-41bbz-car：包含抗cd19 ec、cd8 tm、41-bb ic和cd3ζic的第2代car
[0505]
构建体：αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28-csr：与包含抗cd19ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd19-cd8t-41bbz-car
[0506]
构建体：αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd30-csr：与包含抗cd19ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd8t-41bbz-car
[0507]
构建体：αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-cd30-csr：与包含抗cd19 ec、cd28 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd8t-41bbz-car
[0508]
构建体：αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-41bb-csr：与包含抗cd19 ec、cd28 tm和41bb ic的csr共表达的抗cd19-cd8t-41bbz-car
[0509]
构建体：跟与包含其它共刺激片段的csr共表达的相同car相比，与抗cd19 cd30 csr共表达的第2代抗cd19 cd30 car
[0510]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd30-csr
[0511]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd28-csr：与包含抗cd19 ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0512]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-41bb-csr：与包含抗cd19 ec、4-1bb tm和4-1bb ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0513]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-ox40-csr：与包含抗cd19 ec、ox40 tm和ox40 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0514]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd27-csr：与包含抗cd19 ec、cd27 tm和cd27 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0515]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd28t-cd30-csr：与包含抗cd19ec、cd28 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0516]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-41bbt-cd30-csr：与包含抗cd19ec、4-1bb tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0517]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-ox40t-cd30-csr：与包含抗cd19ec、ox40 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0518]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd27t-cd30-csr：与包含抗cd19ec、cd27 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0519]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd19-cd8t-cd30-csr：与包含抗cd19ec、cd8 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd19-cd30z-car
[0520]
构建体：与包含cd28或cd30共刺激片段的抗cd22 csr共表达的第2代抗cd22 car
[0521]
构建体：αcd22-cd30z-car：包含抗cd22 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的第2代car
[0522]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd28-csr：与包含抗cd22 ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0523]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0524]
构建体：αcd22-cd28z-car：包含抗cd22 ec、cd28 tm、cd28 ic和cd3ζic的第2代car
[0525]
构建体：αcd22-cd28z-car αcd22-cd28-csr：与包含抗cd22 ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd22-cd28z-car
[0526]
构建体：αcd22-cd28z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd28z-car
[0527]
构建体：αcd22-cd8t-41bbz-car：包含抗cd22 ec、cd8 tm,41-bb ic和cd3ζic的第2代car
[0528]
构建体：αcd22-cd8t-41bbz-car αcd22-cd28-csr：与包含抗cd22ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd22-cd8t-41bbz-car
[0529]
构建体：αcd22-cd8t-41bbz-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22ec、cd30 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd8t-41bbz-car
[0530]
构建体：跟与包含其它共刺激片段δ的csr共表达的相同car相比，与抗cd22 cd30 csr共表达的第2代抗cd22 cd30 car
[0531]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd30-csr
[0532]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd28-csr：与包含抗cd22 ec、cd28 tm和cd28 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0533]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-41bb-csr：与包含抗cd22 ec、4-1bb tm和4-1bb ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0534]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-ox40-csr：与包含抗cd22 ec、ox40 tm和ox40 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0535]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd27-csr：与包含抗cd22 ec、cd27 tm和cd27 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0536]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd28t-cd30-csr：与包含抗cd22ec、cd28 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0537]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-41bbt-cd30-csr：与包含抗cd22ec、4-1bb tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0538]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-ox40t-cd30-csr：与包含抗cd22ec、ox40 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0539]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd27t-cd30-csr：与包含抗cd22ec、cd27 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0540]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-cd8t-cd30-csr：与包含抗cd22ec、cd8 tm和cd30 ic的csr共表达的抗cd22-cd30z-car
[0541]
构建体：与抗cd19、抗cd22和/或抗cd20、cd30 csr共表达的双特异性第2代抗cd19、抗cd22、cd30 car
[0542]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car：包含抗cd19 ec、抗cd22 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的双特异性第2代car
[0543]
构建体：αcd22-αcd19-cd30z-car：包含抗cd22 ec、抗cd19 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的双特异性第2代car
[0544]
构建体：αcd19-cd30z-car：包含抗cd19 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的单特异性第2代car
[0545]
构建体：αcd22-cd30z-car：包含抗cd22 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的单特异性第2代car
[0546]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd19-cd30-csr：与包含抗cd19ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0547]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0548]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0549]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd19-cd30z-car
[0550]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd19-cd30-csr：与包含抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd22-cd30z-car
[0551]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd19-cd30z-car
[0552]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd22-cd30z-car
[0553]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd22-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0554]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd20-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0555]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd22-αcd20-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0556]
构建体：αcd22-cd30z-car αcd22-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd22ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的单特异性抗cd22-cd30z-car
[0557]
构建体：与抗cd19、抗cd22和/或抗cd20、cd30 csr共表达的三特异性第2代抗cd19、抗cd22、抗cd20、cd30 car
[0558]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car：包含抗cd19 ec、抗cd22ec、抗cd20 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的三特异性第2代car
[0559]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car：包含抗cd19 ec、抗cd22 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的双特异性第2代car
[0560]
构建体：αcd19-cd30z-car：包含抗cd19 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的单特异性第2代car
[0561]
构建体：αcd22-cd30z-car：包含抗cd22 ec、cd30 tm、cd30 ic和cd3ζic的单特异性第2代car
[0562]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd19-cd30-csr：与包含抗cd19 ec、
cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0563]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0564]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0565]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0566]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd22-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd19-cd30z-car
[0567]
构建体：αcd19-cd30z-car αcd20-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的单特异性csr共表达的单特异性抗cd19-cd30z-car
[0568]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd22-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0569]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd20-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0570]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd22-αcd20-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd22-cd30z-car
[0571]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd20-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd20 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0572]
构建体：αcd19-αcd22-cd30z-car αcd22-αcd20-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd20 ec、cd30 tm和cd30 ic的双特异性csr共表达的双特异性抗cd19-抗cd22-cd30z-car
[0573]
构建体：αcd19-αcd22-αcd20-cd30z-car αcd22-αcd20-αcd19-cd30-csr：与包含抗cd22 ec、抗cd20 ec、抗cd19 ec、cd30 tm和cd30ic的三特异性csr共表达的三特异性抗cd19-抗cd22-抗cd20-cd30z-car
[0574]
构建体：抗ror1-car 抗ror1-csr
[0575]
对于实体瘤(神经母细胞瘤)和cll(最常见的白血病)、套细胞淋巴瘤(mcl、5％nhl)：
[0576]
构建体：αror1-cd30z-car：抗ror1 ec、cd30 tm和cd30 ic、cd3ζic
[0577]
构建体：αror1-cd30z-car αror1-cd30-csr：抗ror1 ec、cd30tm和ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd30 tm和ic
[0578]
构建体：αror1-cd30z-car αror1-cd28-csr：抗ror1 ec、cd30tm和ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd28 tm和ic
[0579]
构建体：αror1-cd30z-car αror1-41bb-csr：抗ror1 ec、cd30tm和ic和cd3ζic 抗ror1 ec、4-1bb tm和ic。
[0580]
构建体：αror1-cd28z-car：抗ror1 ec、cd28 tm和cd28 ic、cd3ζic
[0581]
构建体：αror1-cd28z-car αror1-cd30-csr：抗ror1 ec、cd28tm和cd28 ic、cd3ζ
ic 抗ror1 ec、cd30 tm和ic。
[0582]
构建体：αror1-cd8t-cd30z-car：抗ror1 ec、cd8 tm、cd30 ic和cd3ζic
[0583]
构建体：αror1-cd8t-cd30z-car αror1-cd30-csr：抗ror1 ec、cd8 tm、cd30 ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd30 tm和ic
[0584]
构建体：αror1-cd8t-41bbz-car：抗ror1 ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic
[0585]
构建体：αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd30-csr：抗ror1 ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd30 tm和ic
[0586]
构建体：αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-cd30-csr：抗ror1ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd28 tm和cd30 ic
[0587]
构建体：αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-41bb-csr：抗ror1ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd28 tm和41bb ic
[0588]
构建体：αror1-cd28t-41bbz-car：抗ror1 ec、cd28 tm、4-1bb ic和cd3ζic
[0589]
构建体：αror1-cd28t-41bbz-car αror1-cd30-csr：抗ror1 ec、cd28 tm、4-1bb ic和cd3ζic 抗ror1 ec、cd30 tm和ic
[0590]
构建体：抗psma-car 抗psma-csr：与包含cd30 tm和ic的抗pmsa-csr共表达的第2代抗psma1 cd30或4-1bb car。
[0591]
前列腺癌：
[0592]
构建体：αpsma-cd30z-car：抗psma ec、cd30 tm和ic、cd3ζic
[0593]
构建体：αpsma-cd30z-car αpsma-cd30-csr：抗psma ec、cd30tm和ic和cd3ζic 抗psma ec、cd30 tm和ic
[0594]
构建体：αpsma-cd8t-cd30z-car：抗psma ec、cd8 tm、cd30 ic、cd3ζic
[0595]
构建体：αpsma-cd8t-cd30z-car αpsma-cd30-csr：抗psma ec、cd8 tm、cd30 ic和cd3ζic 抗psma ec、cd30 tm和ic
[0596]
构建体：αpsma-cd8t-41bbz-car：抗psma ec、cd8 tm、4-1bb ic、cd3ζic
[0597]
构建体：αpsma-cd8t-41bbz-car αpsma-cd30-csr：抗psma ec、cd8 tm、4-1bb ic和cd3ζic 抗psma ec、cd30 tm和ic
[0598]
构建体：抗ny-eso-1/mhc car 抗egfr-csr：第2代抗ny-eso-1/mhc car以及cd30或4-1bb ic和cd3ζic 抗egfr-cd30-csr
[0599]
构建体：αnyeso1-cd30z-car：抗ny-eso-1/mhc ec、cd30 tm和ic、cd3ζic
[0600]
构建体：αnyeso1-cd30z-car αegfr-cd30-csr：抗ny-eso-1/mhc ec、cd30 tm和ic、cd3ζic αegfr ec、cd30 tm和ic-csr。
[0601]
构建体：αnyeso1-cd8t-cd30z-car：抗ny-eso-1/mhc ec、cd8tm、cd30 ic、cd3ζic
[0602]
αnyeso1-cd8t-cd30z-car αegfr-cd30-csr抗ny-eso-1/mhc ec、cd8 tm、cd30 ic、cd3ζic αegfr ec、cd30 tm和ic csr。
[0603]
构建体：αnyeso1-cd8t-41bbz-car：抗ny-eso-1/mhc ec、cd8tm、4-1bb ic、cd3ζic
[0604]
构建体：αnyeso1-cd8t-41bbz-car αegfr-cd30-csr：抗ny-eso-1/mhc ec、cd8 tm、4-1bb ic、cd3ζic αegfr ec、cd30 tm和ic csr。
[0605]
实施例10-抗afp/mhc car 抗gpc3-csr t细胞对靶细胞的短期杀伤
[0606]
本实施例显示，与不含csr的car t细胞相比，表达car cd30-csr的t细胞具有更高
的特异性肿瘤细胞杀伤功效。原代t细胞是模拟物转导的(未添加dna)或用编码以下的慢病毒载体转导：(1)抗afp-cd28z-car(seq id no:7)；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr(分别为seq id no:7 seq id no:13)；(3)抗afp-cd8t-z-car(seq id no:1)；或(4)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr(分别为seq id no:1 seq id no:13)，持续7-9天。通过用pe标记的afp158/hla-a*02:01四聚体(“afp158四聚体”)染色来确定转导效率。将car t细胞归一化为35％car

(或“受体
”)并且用基于facs的测定测试其杀死癌细胞的能力。将激活的t细胞和靶细胞hepg2(afp

、hla-a2

、gpc3

)以2:1的效应物与靶比率共培养。通过使用cytox 96非放射性细胞毒性测定(promega)测量孵育16小时后的培养物上清液中的ldh活性来确定特异性裂解。如图1中所示，与不含csr的对应car t细胞相比，用编码两种car(第1代：抗afp-cd8t-z-car或第2代：抗afp-cd28z-car)和cd30-csr的载体转导的t细胞具有更高的体外肿瘤细胞杀伤功效。
[0607]
实施例11-抗afp/mhc car 抗gpc3-csr t细胞的细胞因子产生和分泌
[0608]
本实施例显示与不含csr的car t细胞相比，表达car cd30-csr的t细胞具有更高的特异性t细胞活性。ifnγ和颗粒酶b两者都是t细胞活性/杀伤能力的指示器。在转导之后，将50,000个car

抗afp-car t细胞和抗afp-car 抗gpc3-cd30-csr t细胞与hepg2靶细胞一起以1:1的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)孵育。在第一次接合后每7天用100,000个hep2g靶细胞再攻击细胞。在三次接合之后，分别用biolegend(san diego,ca)的elisa max
tm deluxe set人ifnγ和r&d systems(minneapolis,mn)的人颗粒酶b duoset elisa来定量培养物上清液中的ifnγ和颗粒酶b水平，并且将结果分别显示在图2a和图2b中。在实施例10中表现出细胞毒性效力增加的反应也显示出释放的细胞因子(ifnγ和颗粒酶b)的量的增加。具体地，与不含csr的对应car t细胞相比，用编码两种car(第1代：抗afp-cd8t-z-car或第2代：抗afp-cd28z-car)和cd30-csr的载体转导的t细胞具有高得多的ifnγ和颗粒酶b分泌水平。
[0609]
实施例12-抗afp/mhc car 抗gpc3-csr t细胞对靶细胞的长期杀伤和t细胞存活
[0610]
将对靶细胞进行计数的基于facs的测定用于比较car t细胞的长期杀伤潜力。所使用的效应细胞是来自供体受试者的用编码各种car构建体的载体转导的原代t细胞。效应细胞用编码以下的载体转导：第1代car构建体(图3a和图3b)：(1)抗afp-cd8t-z-car(seq id no:1)；(2)抗-afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd28-csr(seq id no:1 seq id no:14)；或(3)抗afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr(seq id no:1 seq id no:13)，或第2代car构建体(图3c和图3d)：(1)抗afp-cd28z-car(seq id no:7)；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd28-csr(seq id no:7 seq id no:14)；或(3)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr(seq id no:7 seq id no:13)，持续7-9天。基于afp158四聚体染色，将效应细胞归一化为35％受体

。
[0611]
所使用的靶细胞是hepg2(a2

/afp

/gpc3

)细胞。本实验中的效应物与靶比率(e:t比率)为1:1。具体地，将50,000个受体

t细胞和50,000个hepg2细胞在每个孔中的没有细胞因子的rpmi 10％fbs中一起孵育。每7天用每孔100,000个hepg2细胞再攻击细胞。在每次靶细胞接合后的选定日定量剩余的靶细胞和受体

t细胞的数量。t细胞存活(总t细胞数，不仅仅是受体

t细胞)和长期杀伤(由剩余的靶细胞相对于与模拟物转导的t细胞孵育的靶细胞的百分比表示)的结果显示在图3a至图3d中，其中第1代car的结果示于图3a和图3b中并且第2代car的结果示于图3c和图3d中。图3b显示了与表达单独的car的t细胞相比，表达与抗
gpc3-cd30-csr或抗gpc3-cd28-csr共表达的第1代抗afp-car的t细胞两者均杀死了多得多的靶细胞。令人惊讶的是，与具有cd28-csr的对应t细胞相比，表达与cd30-csr共表达的第1代car的t细胞杀死了显著更多的靶细胞。
[0612]
图3d显示了表达与抗-gpc3-cd30-csr或抗gpc3-cd28-csr共表达的第2代抗afp-car(抗afp-cd28z-car)的t细胞两者有效地介导对几乎所有的最初接合的和再攻击的靶细胞的杀伤，不同于相对于模拟物转导的t细胞几乎不杀死任何靶细胞的仅表达第2代抗afp-car的t细胞。令人惊讶的是，图3a和图3c显示分别表达抗afp-cd8-z-car 抗gpc3-cd30-csr和抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr的t细胞不仅存活远远好于模拟物转导的t细胞和仅表达对应的car的t细胞，而且存活并且甚至繁殖显著好于表达对应的car cd28-csr的t细胞。
[0613]
实施例13-在与靶细胞共培养后抗afp/mhc car 抗gpc3-csr t细胞t细胞中的t细胞耗竭标志物的表达
[0614]
为了检查抗原刺激时在car转导的细胞上表达的耗竭标志物的水平，使用easysep人t细胞分离试剂盒(stemcell technologies)从富含pbmc的全血制备cd3

t细胞，并且用cd3/cd28 dynabeads激活。激活和扩增的细胞群为通过流式细胞术确定的》99％cd3

。然后用编码下面表2、表3和表4中描述的构建体的慢病毒载体转导这些细胞，持续7-9天。基于afp158四聚体染色，将转导的细胞(效应细胞)归一化为35％受体

。然后将效应细胞与hepg2靶细胞以1:1的e:t比率共培养。具体地，将50,000个受体

t细胞和50,000个hepg2细胞在每个孔中的没有细胞因子的rpmi 10％fbs中一起孵育。每7天用每孔100,000个hepg2细胞再攻击细胞。耗竭标志物pd-1、lag3和tigit在受体

t细胞上的mfi水平在每次靶细胞接合后的选定日通过流式细胞术进行分析。pd-1、lag3和tigit是在t细胞失去功能时在t细胞上累积的抑制性受体。由于这种现象，这些分子的表达被视为耗竭t细胞的标志物。这些耗竭标志物的mfi水平和car cd30-csr t细胞的一些耗竭标志物水平与car cd28-csr或单独的car t细胞的一些耗竭标志物水平的比率显示在表2、表3和表4中。令人惊讶的是，与表达单独的car或car cd28-csr相比，表达car cd30-csr导致t细胞具有显著更少的耗竭标志物积累，指示显著更多的功能性和较少耗竭的t细胞。同样显著的是，在cd8

t细胞(更直接参与靶细胞杀伤的细胞毒性t细胞)和cd4

t细胞(有助于其它免疫细胞的功能(包括细胞毒性t细胞的激活和生长)的t辅助细胞)两者中都看到由car cd30-csr表达引起的t细胞耗竭标志物的较低水平。
[0615]
表2：受体

t细胞上的pd1表达水平
[0616][0617]
表3a.受体

t细胞上的lag3表达水平
[0618][0619]
表3b.受体

t细胞上的lag3表达水平
[0620][0621]
表3c.受体

t细胞上的lag3表达水平
[0622][0623]
表3d.受体

t细胞上的lag3表达水平
[0624][0625]
表4.受体

t细胞上的tigit表达水平
[0626][0627]
实施例14-记忆细胞从抗afp/mhc car 抗gpc3-csr t细胞的发展和维持
[0628]
本实施例显示，在靶刺激之后，car cd30-csr t细胞发展成并维持高的记忆t细胞群，包括中央记忆和效应记忆t细胞。为了确定与仅表达car或car cd28-csr相比表达car cd30-csr对t细胞发展成并维持记忆t细胞的能力的作用，我们测量了记忆t细胞标志物
ccr7和cd45ra的细胞表面表达。如本领域已知的，具有高ccr7表达水平和低cd45ra表达水平的t细胞被认为是中央记忆t细胞，具有低ccr7和低cd45ra表达水平的t细胞是效应记忆t细胞，具有低ccr7和高cd45ra表达水平的t细胞是效应t细胞，而具有高ccr7和高cd45ra的t细胞是作为在靶/抗原攻击/识别之前的初始t细胞类型的原初t细胞(eur j immunol.2013年11月；43(11):2797-809.doi:10.1002/eji.201343751。电子出版于2013年10月30日。the who's who of t-cell differentiation:human memory t-cell subsets.mahnke yd1,brodie tm,sallusto f,roederer m,lugli e.)。当响应于遇到抗原时，原初t细胞增殖并分化成效应细胞，其大多数执行破坏靶的工作并且然后死亡，然而小部分的t细胞最终发展成可以将针对特定靶的t细胞免疫力储存的长寿命的记忆t细胞。在记忆t细胞中，发现中央记忆t细胞比效应记忆t细胞具有更长的寿命并且能够产生效应记忆t细胞，但反之则不能。因此，发展成和维持记忆t细胞(尤其是中央记忆t细胞)的能力是潜在成功的t细胞疗法的重要和期望的特征。将原代t细胞进行模拟物转导或用编码各种car构建体的载体转导。效应细胞用编码以下的载体转导：第1代car构建体：(1)抗afp-cd8t-z-car(seq id no:1)；(2)抗-afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd28-csr(seq id no:1 seq id no:14)；或(3)抗-afp-cd8t-z-car 抗gpc3-cd30-csr(seq id no:1 seq id no:13)；或第2代car构建体：(1)抗afp-cd28z-car(seq id no:7)；(2)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd28-csr(seq id no:7 seq id no:14)；或(3)抗afp-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr(seq id no:7 seq id no:13)，持续7-9天。基于afp158四聚体染色，将效应细胞归一化为35％受体

。
[0629]
将表达单独的第1代或第2代car构建体(抗afp-cd8t-z-car或抗afp-cd28z-car)的效应细胞与hepg2靶细胞一起以2:1的e:t比率(在96孔板上的每个孔中100,000个受体

t细胞和50,000个hepg2细胞)孵育7天。然后每7天用每孔100,000个hepg2细胞再攻击细胞。
[0630]
将表达car csr构建体的效应细胞与hepg2靶细胞一起以1:2的e:t比率(在每个孔中25,000个受体

t细胞和50,000个hepg2细胞)孵育7天。然后每7天用每孔100,000个hepg2细胞再攻击细胞。
[0631]
每个不同的t细胞和靶细胞混合物样品以重复进行，以确保至少一个混合物可用于在每个选定日进行定量。在第四次和第五次靶细胞接合(e4和e5)之前将car或car csr效应细胞和靶细胞混合物以1:6稀释以避免由于显著的t细胞扩增而导致t细胞的过高密度性，使得先前剩余的细胞中的仅六分之一被100,000个hepg2细胞再攻击。
[0632]
在每次靶细胞接合后的选定日，将来自每个样品的孔中的整个细胞混合物都用针对ccr7和cd45ra的抗体染色并通过流式细胞术进行分析。计数受体

t细胞数，并且基于其ccr7和cd45ra表达水平将细胞分组为各种t细胞类型：中央记忆t细胞(cd45ra-ccr7

)、效应记忆t细胞(cd45ra-ccr7-)、效应t细胞(cd45ra

ccr7-)和原初t细胞(cd45ra

ccr7

)。计算各种类型的t细胞在受体

t细胞的总数中的百分比。在一些实验中，还用针对cd8或cd4的抗体染色细胞以确定所计数的t细胞的cd8-cd4特征。
[0633]
总受体

t细胞(包括cd8

和cd4

t细胞)的中央记忆t细胞计数的结果以及car cd30-csr t细胞的记忆t细胞计数比car cd28-csr或单独的car t细胞的记忆t细胞计数的比率显示在表5至表7中。表5和表6显示了表达单独的αafp-cd8t-z-car或还表达csr(αgpc3-cd28-csr或αgpc3-cd30-csr)的第1代car

t细胞的中央记忆t细胞计数。在表5的car csr t细胞中共表达的car和csr在两个单独的载体上编码，而表6的car和csr在一个载体上
编码。表7显示了表达单独的αafp-cd28z-car或还表达csr(αgpc3-cd28-csr或αgpc3-cd30-csr)的第2代car

t细胞的中央记忆t细胞计数。在本实施例中公开的所有实验中共表达的第2代car和csr(包括表7的那些)在两个单独的载体上编码。表5至表7中的结果表明，令人惊讶的是，与表达单独的car或car cd28-csr相比，表达car cd30-csr在几乎所有时间点(尤其是在与靶细胞接合后的延长时间(例如，在第1次接合后7天和从第2次接合开始))导致多得多的中央记忆t细胞。
[0634]
表5.car和csr在两个单独的载体上编码的第1代car

t细胞的中央记忆t细胞计数。
[0635][0636][0637]a在第四次靶细胞接合(e4)之前将car或car csr效应细胞和靶细胞混合物以1:6稀释。
[0638]
表6.car和csr在一个载体上编码的第1代car

t细胞的中央记忆t细胞计数。
[0639][0640]a在第四次靶细胞接合(e4)之前将car或car csr效应细胞和靶细胞混合物以1:6
稀释。
[0641]
表7.car和csr在两个单独的载体上编码的第2代car

t细胞的中央记忆t细胞计数。
[0642][0643][0644]a在第四次靶细胞接合(e4)之前将car或car csr效应细胞和靶细胞混合物以1:6稀释。b在第五次靶细胞接合(e5)之前将car或car csr效应细胞和靶细胞混合物再次以1:6稀释。
[0645]
除了t细胞计数之外，连同car cd30-csr t细胞的记忆t细胞百分比与car cd28-csr t细胞的记忆t细胞百分比的比率，计算中央记忆t细胞在受体

t细胞总数中的百分比并显示在表8至表10中。这些表中显示了其百分比数据的t细胞是在表5至表7中显示了其细胞计数数据的相同的t细胞。
[0646]
表8.在表达在两个单独的载体上编码的car和csr的第1代car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0647][0648]
表9.在表达在一个载体上编码的car和csr的第1代car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0649][0650]
表10.在表达在两个单独的载体上编码的car和csr的第2代car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0651][0652]
这些令人惊讶的结果表明，表达car cd30-csr的t细胞能够在与靶细胞接合时发展成并维持高数量和高百分比的中央记忆t细胞，高于表达单独的car或car cd28-csr的t细胞，使得car cd30-csr t细胞平台成为潜在成功的t细胞疗法平台。
[0653]
除了确定总的中央记忆受体

t细胞计数及其在所有受体

t细胞中的百分比之外，相同的t细胞-靶细胞混合物样品也用针对cd8的抗体染色，以便确定cd8

受体

中央记忆t细胞的数量并计算在cd8

受体

t细胞中的中央记忆t细胞的百分比。结果显示在表11至表16中，连同car cd30-csr t细胞的记忆t细胞计数或百分比与car cd28-csr或单独的car t细胞的记忆t细胞计数或百分比的比率。
[0654]
表11.car和csr在两个单独的载体上编码的第1代car

t细胞的cd8

中央记忆t细胞计数。
[0655][0656]
表12.car和csr在一个载体上编码的第1代car

t细胞的cd8

中央记忆t细胞计数。
[0657][0658][0659]
表13.car和csr在两个单独的载体上编码的第2代car

t细胞的cd8

中央记忆t细胞计数。
[0660][0661]
表14.在表达在两个单独的载体上编码的car和csr的第1代cd8

car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0662][0663]
表15.在表达在一个载体上编码的car和csr的第1代cd8

car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0664][0665]
表16.在表达在两个单独的载体上编码的car和csr的第2代cd8

car

t细胞中的中
央记忆t细胞百分比。
[0666][0667]
这些令人惊讶的结果显示表达car cd30-csr的cd8

细胞毒性t细胞能够发展成并维持高于表达单独的car或car cd28-csr的cd8

t细胞的高数量和高百分比的中央记忆t细胞，使得car cd30-csr t细胞平台成为特别是用于靶细胞(包括癌细胞)杀伤和癌症治疗的巨大t细胞疗法平台。
[0668]
从本实验中还发现，至少在用第1代car的情况下，共表达cd30-csr与表达单独的car或共表达cd28-csr(数据未示出)相比还产生更多的效应记忆t细胞(除了更多的中央记忆t细胞之外)，这也有助于t细胞疗法。
[0669]
实施例15-抗afp-car 抗gpc3-csr t细胞的体内肿瘤浸润
[0670]
将约10 7
个hepg2肿瘤细胞皮下植入nsg小鼠中并允许形成150mm3的实体瘤块。在一个实验中，将5x106个模拟物转导的t细胞或表达(1)αafp-cd28z-car(seq id no:7)；(2)αafp-cd28z-car αgpc3-cd28-csr(seq id no:7 seq id no:14)；或(3)αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr(seq id no:7 seq id no:13)的car

t细胞静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中，每个样品组三只小鼠。t细胞给药后三周，将小鼠处死并取出肿瘤，固定并切片到载玻片上。将肿瘤切片用抗cd3抗体染色，以可视化存在于实体瘤内的t细胞。图4中显示了每个样品组的肿瘤切片的代表性图像。cd3

细胞(t细胞)数量的定量以及所有细胞数量的定量在每只小鼠肿瘤的四个代表性切片上完成，并且计算每个car t样品组的平均t细胞％(为cd3

细胞的所有细胞的％)并且显示在图5和表17中，作为car t细胞的肿瘤浸润能力的指示器。图4和图5以及表17显示，令人惊讶的是，αafp-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞与不含csr的对应car t细胞或对应的car cd28-csr t细胞相比具有显著更高的体内肿瘤浸润/穿透率/水平/能力(即，在所有细胞中的更高的cd3

细胞％)。表17还显示了在肿瘤样品中car cd30-csr t细胞(cd3

)在所有细胞中的％与car cd28-csr或单独car t细胞在所有细胞中的％的比率。
[0671]
表17.抗afp car和抗afp-car 抗gpc3-csr t细胞的肿瘤浸润。
[0672][0673]
实施例16-抗gpc3-car 抗gpc3-csr t细胞的体内肿瘤浸润
[0674]
按照如实施例15中所述的类似方案，包括使用hepg2肿瘤细胞植入nsg小鼠，还在体内测试了αgpc3-cd28z-car和αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞的肿瘤浸润能力。通过用编码αgpc3-cd28z-car或αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr的慢病毒载体转导原代t细胞产生此类car t细胞。αgpc3-cd30-csr与先前实施例中公开的与αafp-cd28z-car共表达的αgpc3-cd30-csr相同。在这些t细胞的car和csr中的αgpc3抗体部分包含不同的gpc3结合序列，如非正式序列表中所公开的。将107个hepg2肿瘤细胞皮下植入nsg小鼠中并允许形成约250mm3的实体瘤块。将1x107个car t细胞(50％car受体阳性)或5x106个模拟物t细胞静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中。t细胞给药后两周，将小鼠处死并取出肿瘤，固定并切片到载玻片上。将肿瘤切片用抗cd3抗体染色，以可视化存在于实体瘤内的t细胞。cd3

细胞(t细胞)和总细胞的数量的定量使用qupath软件完成以评分t细胞的肿瘤浸润能力(组合的肿瘤穿透和穿透后t细胞增殖能力)。图6中显示了每个样品组的肿瘤切片的代表性图像。t细胞和总细胞的数量的定量在每只小鼠肿瘤的四个代表性切片上完成，并且计算每个car t样品组的平均t细胞％(为cd3

细胞的所有细胞的％)并且显示在表18中。表18还显示了在肿瘤样品中car cd30-csr t细胞在所有细胞中的％与单独car t细胞在所有细胞中的％的比率。图6以及表18显示，αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞与不含csr的对应car t细胞相比具有显著更高的体内肿瘤浸润能力(即，在所有细胞中的更高的cd3

细胞％)。
[0675]
表18.抗gpc3 car和抗gpc3-car 抗gpc3-csr t细胞的肿瘤浸润。
[0676][0677]
实施例17-表达抗gpc3-cd30-csr与抗gpc3-cd30t-cd28-csr的抗gpc3-car t细胞的另外的体外和体内测定
[0678]
体外肿瘤细胞杀伤测定
[0679]
使用实施例1a和1b中所述的方法进行基于ldh的测定以比较各种抗gpc3-car t细胞的短期杀伤能力。本实施例中使用的效应细胞组包括以下。通过用编码以下car或car csr的慢病毒载体转导原代car t细胞(来自与实施例16中使用的原代t细胞来源不同的供体)产生这些car t细胞。
[0680]
第1)组不含csr的car t细胞：抗gpc3-cd28z-car；
[0681]
第2)组具有包含cd30跨膜和cd28细胞内结构域的csr的car t细胞：抗gpc3-cd28z-car 抗gpc3-cd30t-cd28-csr
[0682]
第3)组具有包含cd30跨膜结构域和细胞内cd30共刺激结构域(cd30 ic结构域)的csr的car t细胞：抗gpc3-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr。
[0683]
用skhep1(gpc3-)细胞作为阴性对照，将激活的效应细胞(抗gpc3-car受体阳性t细胞)和靶细胞(hepg2细胞，其是gpc3

的)以2:1的e:t比率共培养16小时。通过测量培养物上清液中的ldh活性来确定特异性杀伤。通过ldh细胞毒性测定(promega)来测定肿瘤细胞毒性。结果表明，所有三种抗gpc3 car t细胞组显示出显著且相当的gpc3特异性杀伤功效(所有约60％的特异性裂解)。
[0684]
体内肿瘤浸润测定
[0685]
此外，按照与实施例8a、实施例8b、实施例15和实施例16中所描述的那些方案类似的方案，测试上文在实施例17(a)中所描述的三种不同car t效应细胞组的体内肿瘤浸润能力。将5
×
106个hepg2肿瘤细胞皮下植入每只nsg小鼠中并允许形成约150mm3的实体瘤块。当肿瘤达到适当尺寸时，将动物分配到各个实验组中，每组测试三只小鼠。将1x107个总t细胞(对于car t细胞组，50％car受体阳性)静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中。当t细胞给药后10天肿瘤生长平稳时将动物处死。此时，将小鼠处死并且取出肿瘤，固定并切片到载玻片上。对肿瘤切片进行免疫组织化学以染色cd3。用自动化免疫组织化学成像仪定量这些切片中的cd3阳性和cd3阴性细胞，以便确定由t细胞浸润的肿瘤块的分数。cd3 细胞(t细胞)数量的定量以及所有细胞数量的定量在每只小鼠肿瘤的代表性切片上进行，总细胞数量在每个切片55,000个至几乎700,000个范围内。计算每个car t样品组的平均t细胞％(为cd3

细胞的所有细胞的％)并且显示在图7和表19中。图7以及表19显示，与不含csr(“第1组”)或具有αgpc3-cd30t-cd28-csr(“第2组”)的对应car t细胞相比，αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞(“第3组”)具有显著更高的体内肿瘤浸润能力(即，在所有细胞中的更高的cd3

细胞％)。
[0686]
表19.抗gpc3 car、抗gpc3-car 抗gpc3-cd30-csr和抗gpc3-car 抗gpc3-cd30t-cd28-csr t细胞的肿瘤浸润。
[0687][0688]
结果显示具有cd30 tm和cd30 ic结构域的αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞的体内肿瘤浸润能力(组合肿瘤穿透和穿透后t细胞增殖能力)最高，令人惊讶地远远高于仅细胞内区域与car cd30-csr t细胞不同的αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr t细胞，表明cd30 ic共刺激结构域在car cd30-csr t细胞的高体内肿瘤浸润能力中起着重要作用。
[0689]
终末血液样品中的体内t细胞扩增/增殖
[0690]
为了测试αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr t细胞的体内细胞扩增/增殖能力，当将小鼠处死时从用于实施例17(b)中公开的体内肿瘤浸润测定中的小鼠中抽取终末血液样品。确定car受体

cd3

细胞和总cd3

细胞的浓度(每ml血液的细胞数量)，并且结果显示在表20中。表20还显示了car cd30-csr t细胞(cd3

)的外周血浓度与car cd28-csr或单独的car t细胞的浓度的比率。
[0691]
表20.抗gpc3 car、抗gpc3-car 抗gpc3-cd30-csr和抗gpc3-car 抗gpc3-cd30t-cd28-csr t细胞的体内细胞扩增/增殖。
[0692][0693]
结果显示具有cd30 tm和cd30 ic结构域的αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30-csr t细胞的体内细胞扩增/增殖能力)最高，令人惊讶地远远高于仅细胞内区域与car cd30-csr t细胞不同的αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr t细胞，表明cd30 ic共刺激结构域在car cd30-csr t细胞的高体内细胞扩增/增殖能力中起着重要作用。
[0694]
终末血液样品的体内记忆t细胞计数
[0695]
为了测试αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr t细胞的体内记忆t细胞产生能力，当将小鼠处死时从用于实施例17(b)中公开的体内肿瘤浸润测定中的小鼠中抽取终末血液样品。如上文实施例中所描述确定了外周血中的中央记忆t细胞(cd45ra-ccr7

t细胞、cd8

或cd4

)的数量，并且计算总t细胞中的中央记忆t细胞的百分比并显示在表21中。表21还显示了car cd30-csr t细胞的中央记忆t细胞百分比与car cd28-csr或单独的car t细胞的中央记忆t细胞百分比的比率。
[0696]
表21.抗gpc3 car、抗gpc3-car 抗gpc3-cd30-csr和抗gpc3-car 抗gpc3-cd30t-cd28-csr t细胞的体内中央记忆t细胞百分比。
[0697][0698]
体内外周血结果显示，两个cd8

和cd4

中央记忆t细胞百分比也是抗gpc3-cd28z-car 抗gpc3-cd30-csr t细胞最高，也令人惊讶地远远高于仅细胞内区域与car cd30-csr t细胞不同的αgpc3-cd28z-car αgpc3-cd30t-cd28-csr t细胞，表明cd30 ic共刺激结构域在car cd30-csr t细胞的高体内中央记忆t细胞产生能力中起着重要作用。
[0699]
实施例18-表达抗cd19-cd30-csr与抗cd19-cd28-csr或41bb-csr的抗cd19-car t细胞的多个体外测定
[0700]
短期杀伤和ifn-γ产生
[0701]
使用以下构建体如在实施例1a中所述进行测定比较各种t细胞的短期杀伤能力：
[0702]
所使用的第1代构建体：
[0703]
αcd19-cd8t-z-car αcd19-cd28-csr；以及
[0704]
αcd19-cd8t-z-car αcd19-cd30-csr。
[0705]
所使用的第2代构建体：
[0706]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-41bb-csr；以及
[0707]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-cd30-csr。
[0708]
用编码每个构建体的载体转导原代t细胞。确定转导效率，并且通过与模拟物转导的t细胞混合将t细胞匹配为40％受体阳性。以1:1的效应物与靶比率使用nalm6或raji细胞。72小时后测量在培养基中的ifnγ释放。使用magpix多重系统(luminex)用bio-plex pro人细胞因子8重测定(biorad)测量培养基中的ifnγ水平。将来自nalm6或raji靶反应的测定上清液稀释4倍。用biorad bio-plex试剂盒提供的标准曲线确定细胞因子浓度。
[0709]
与car 41bb-csr相比，在使用car cd30-csr的情况下体外杀伤和随后细胞因子水平的增加显著更大或相当，使用nalm6和raji细胞两者在表达第1代car的效应t细胞中观察到最显著的增加(图8a和8b)。当杀死nalm6或raji时用car cd30-csr观察到的ifnγ释放的显著增加证明了car cd30-csr在抗cd19模型中保持其增加的细胞毒性信号传导潜力。
[0710]
使用第1代car csr效应细胞和nalm6靶细胞的长期杀伤测定和中央记忆t细胞测量
[0711]
使用表达第1代car csr的效应细胞进行测定比较各种t细胞的长期杀伤能力(参见例如，样品实验方案的实施例3a、实施例3b和实施例12)：
[0712]
所使用的第1代car：
[0713]
αcd19-cd8t-z-car αcd19-cd28-csr；
[0714]
αcd19-cd8t-z-car αcd19-cd30-csr。
[0715]
中央记忆t细胞(tcm)的百分比表示总受体

t细胞群体(cd8

t细胞和cd4

t细胞)中的tcm％。在多周测定过程中测量中央记忆t细胞的％，并且使用表达car cd30-csr的细胞的记忆t细胞％除以表达car cd28-csr的效应细胞的tcm％来计算比率。表22显示car-cd30-csr表达在测定过程中诱导了显著更多的中央记忆t细胞持续存在并扩增，一致地优于car cd28-csr细胞。靶细胞是nalm6。显示了代表性数据。
[0716]
表22.在表达car和csr的第1代car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0717][0718]
使用raji细胞作为靶的测定也显示出与在car cd28-csr群体中相比更多的tcm细胞存在于car cd30-csr群体中，表示为受体

t细胞(cd8

cd4

)百分比。与表达car cd28-csr
的效应细胞相比，在整个测定期间用表达car cd30-csr的效应细胞的测定中的中央记忆t细胞％略微且一致更高(数据未示出)。
[0719]
使用第2代car csr效应细胞和nalm6靶细胞的长期杀伤测定和中央记忆t细胞测量
[0720]
在本实施例中使用的构建体包括以下第2代car：
[0721]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-41bb-csr；
[0722]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-cd30-csr。
[0723]
使用表达car cd30-csr和car 41bb-csr的第2代car效应细胞在长期测定中评估了在nalm6靶细胞接合后的总t细胞(cd4

t细胞和cd8

t细胞)的靶抗原特异性记忆t细胞组分的扩增。在长期测定的整个过程中，与car 41bb-csr相比，car cd30-csr的中央记忆t细胞百分比的比率可靠地更高。在同一时段期间，与表达car 41bb-csr的细胞相比，在表达car cd30-csr的效应细胞中cd8

中央记忆t细胞百分比的比率同样一致更大。所有car csr测定均显示出稳健的靶细胞杀伤(未示出)。显示了代表性数据；参见表23a和表23b。
[0724]
表23a.在表达car和csr的第2代car

t细胞中的中央记忆t细胞百分比。
[0725][0726]
表23b.在表达car和csr的第2代car

t细胞中的cd8

中央记忆t细胞百分比
[0727][0728]
在测定过程中，raji细胞数据显示在car 41bb-csr与car cd30-csr群体之间的中央记忆t细胞百分比相当。
[0729]
使用第2代car csr效应细胞和nalm6作为靶细胞的长期杀伤测定和对总t细胞和受体

t细胞的测量
[0730]
本实施例中使用的构建体包括以下：
[0731]
所使用的第2代car：
[0732]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-41bb-csr；
[0733]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-cd30-csr。
[0734]
在用nalm6靶细胞群使用表达41bb-csr或cd30-csr的第2代car t细胞的长期杀伤测定的过程中测量总t细胞群、t细胞的受体

组分和靶组分。与在表达car 41bb-csr的群体中相比，在表达car cd30-csr的群体中对总t细胞、受体

t细胞和靶细胞数量的比较显示出一致更多数量的总t细胞。与表达car 41bb-csr的细胞相比，对于表达car cd30-csr的效应群体在测定的最后一周(e3d5至e4d7)期间这些t细胞的受体

组分更多，但是在开始时对于cd30-csr和41bb-csr效应细胞两者水平在培养物中相当。在测定的持续时间期间，在两个群体中发现少量的靶细胞。比较cd30-csr与41bb-csr细胞数量的总t细胞计数和受体

t细胞计数的比率显示出在表达cd30-csr的效应细胞培养物中存在一致更多数量的t细胞和r

t细胞。显示了代表性数据。参见表24a和表24b。
[0735]
表24a.在nalm6靶细胞接合后使用表达car csr的效应细胞的总t细胞计数
[0736][0737]
表24b.在nalm6靶细胞接合后使用表达car csr的效应细胞的受体

t细胞计数
[0738][0739]
来自raji靶接合的数据显示在每个测定时间点期间的类似的t细胞和受体

t细胞计数以及在测定过程期间的低靶细胞数(未示出)。
[0740]
使用第1代或第2代car csr效应细胞的长期杀伤测定中的耗竭标志物表达
[0741]
在本实施例中使用的构建体包括在测量总t细胞(cd4

cd8

)中的pd1表达水平的测定中的以下第2代car：
[0742]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-41bb-csr；
[0743]
αcd19-cd8t-41bbz-car αcd19-cd28t-cd30-csr。
[0744]
使用nalm6和raji细胞两者作为靶，在表达car csr的效应细胞的长期培养物中分析pd1耗竭标志物表达。在使用nalm6或raji细胞作为靶的测定过程中(e1d3-e4d7)，与表达41bb-csr的群体相比，靶接合后在总t细胞中和在cd8

t细胞中的pd1耗竭标志物表达在表达cd30-csr的群体中更低。通过流式细胞术测量t细胞中的pd1表达并计算pd1的平均荧光强度(mfi)。t细胞中pd1的表达降低表明，当与长期测定培养物中的car 41bb-csr表达相比时，car cd30-csr表达降低了t细胞功能的退化。参见表25a、表25b、表26a和表26b。
[0745]
表25a.nalm6靶细胞接合后在总t细胞中的pd1表达水平
[0746][0747]
表25b.nalm6靶细胞接合后在cd8

t细胞中的pd1表达水平
[0748][0749]
实施例19-表达抗ror1-cd28t-cd30-csr与抗ror1-cd28t-41bb-csr的抗ror1-car t细胞的多个体外测定
[0750]
本实施例显示，共表达包含cd30共刺激结构域的ror1靶向csr的ror1靶向car t细胞有效地杀死癌细胞，并且在细胞耗竭标志物水平和中央记忆t细胞测量测定中表现优于共表达包含4-1bb共刺激结构域的csr的对应的car t细胞。
[0751]
在本实施例中使用的两个效应细胞组为以下这些。
[0752]
模拟物转导的t细胞；
[0753]
αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-cd30-csr t细胞(“tcd30”)；以及
[0754]
αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-41bb-csr t细胞(“t41bb”)。
[0755]
这些car和csr的抗ror1抗原结合结构域(抗体部分)包含相同的scfv序列(seq id no:50)。通过用具有在单个载体上编码的car和csr的慢病毒载体转导原代t细胞来产生这些car t细胞。
[0756]
在本实施例中使用的靶细胞系为以下这些，所有均表达ror1(ror1

)。
[0757]
jeko1(淋巴瘤细胞系)；
[0758]
rpmi8226(多发性骨髓瘤细胞系)；
[0759]
mda-mb-231(乳腺癌细胞系)；以及
[0760]
a549、h1975和h1703(三种不同的肺癌细胞系)。
[0761]
a.与抗ror1 car csr t细胞的癌细胞杀伤相关的短期杀伤和细胞因子产生
[0762]
如实施例1b中所述，通过测量在与各种靶细胞接合时从t细胞释放的细胞因子的量/水平来确定两个抗ror1 car csr t细胞组的短期体外靶细胞杀伤能力。将2x105个car

t细胞与靶细胞以1:1的et比率共培养约16小时。对共培养后上清液中的ifnγ释放水平进行定量。结果显示于图9中，并且它们指示抗ror1-cd8t-41bbz-car 抗ror1-cd28t-cd30-csr t细胞(“tcd30”)与模拟物转导的t细胞相比对所有六种测试的癌症细胞系具有显著的ror1特异性细胞杀伤能力(通过ifnγ释放水平所测量)，并且它们的细胞杀伤能力相当于或略好于共表达包含4-1bb共刺激结构域的csr的对应car t细胞(“t41bb”)。
[0763]
b.多周接合后的长期抗ror1 car csr t细胞和靶细胞计数
[0764]
本实施例显示在长期杀伤测定中抗ror1 car cd30-csr t细胞杀死更多的靶细胞并且大多少存活好于对应的car 41bb-csr t细胞的表现。
[0765]
将如本实施例中所述的两个抗ror1 car csr细胞组的105个car

(受体

)t细胞首先在多个重复中以1:1的et比率与各种靶细胞共培养/接合。本实施例(实施例19b)中使用的靶细胞是mda-mb-231(乳腺癌细胞系)、a549、h1975和h1703(肺癌细胞系)，它们全部都是实体瘤细胞和贴壁细胞。在第一次接合后每七天，将每个样品组的一个样品t细胞-靶细胞混合物的剩余的活靶细胞(粘附到板上)裂解并用晶体紫染色以进行总靶细胞数量/团块定量，而每个组的未裂解样品(包括培养悬浮液中的t细胞和粘附的靶细胞)每七天用105个新鲜的靶细胞再攻击。
[0766]
表26显示了使用各种癌细胞系(h1975、mda-mb-231、h1703和a549)，攻击αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-cd30-csr t细胞(“car cd30-csr”)与攻击αror1-cd8t-41bbz-car αror1-cd28t-41bb-csr t细胞(“car 41bb-csr”)后剩余的靶细胞数量/团块的比率。使用facs在每次靶细胞接合后不同天对每个样品组中剩余的活t细胞(在培养悬浮液中)进行定量，并且结果显示于图10a至图10d中。
[0767]
表26.
[0768][0769]
从表26中可以看出，在长期杀伤测定中，抗ror1 car cd30-csr t细胞出人意料地在四个靶细胞系的攻击中的每一个攻击中比car 41bb-csr t细胞杀死更多的靶细胞。图10a至图10d显示，在长期杀伤测定中，抗ror1 car cd30-csr t细胞大多数比car 41bb-csr t细胞具有更高的细胞存活率，这指示car cd30-csr t细胞具有更好的t细胞持久性。此外，
由于在两个car csr构建体之间唯一的差异是csr的细胞内结构域，因此car cd30-csr t细胞的更高的长期靶细胞杀伤和t细胞存活能力主要是由于cd30的细胞内结构域或共刺激结构域。
[0770]
c.在与靶细胞共培养后在抗ror1 car csr t细胞中的t细胞耗竭标志物的表达
[0771]
使用上文公开的一些ror1

癌细胞系根据实施例6和实施例13中所述的方法测量两个抗ror1 car csr t细胞组的t细胞耗竭标志物pd1的表达水平。将如本实施例中所述的两个抗ror1 car csr细胞组的105个car

(受体

)t细胞首先在96孔板上在多个重复中以1:1的et比率与各种靶细胞共培养/接合。本实施例(实施例19c)中使用的靶细胞是a549、h1975、mda-mb-231和多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226。在靶细胞接合后的选定日测量每个样品组的至少一个样品的t细胞的pd1表达水平。第一次接合后每7天，用105个新鲜的靶细胞再攻击每组未使用的重复细胞混合物样品。pd1表达水平测量值(mfi值)的代表性结果和计算的car cd30-csr与car 41bb-csr t细胞的mfi值的比率显示在下表26a至表29b中。
[0772]
表26a.在用a549靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd8

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0773][0774]
表26b.在用a549靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd4

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0775][0776][0777]
表27a.在用h1975靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd8

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0778][0779]
表27b.在用h1975靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd4

t细胞的pd1表达水平的
比较。
[0780][0781]
表28a.在用mda-mb-231靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd8

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0782][0783][0784]
表28b.在用mda-mb-231靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd4

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0785][0786]
表29a.在用rpmi8226靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd8

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0787][0788]
表29b.在用rpmi8226靶细胞接合之后抗ror1 car csr cd4

t细胞的pd1表达水平的比较。
[0789][0790]
结果表明，令人惊讶地，与表达car 41bb-csr相比，表达car cd30-csr导致t细胞具有显著更少的耗竭标志物pd1积累，指示显著更多的功能性和较少耗竭的t细胞。此外，由于在两个car csr构建体之间唯一的差异是csr的细胞内结构域，因此细胞耗竭能力的降低主要是由于cd30的细胞内结构域或共刺激结构域。同样显著的是，与car 41bb-csr相比由car cd30-csr表达产生的较低水平的t细胞耗竭标志物也在cd8

t细胞(细胞毒性t细胞)和cd4

t细胞(t辅助细胞)中看到。
[0791]
抗ror1-cd8tm-41bbz-car 抗ror1-cd28tm-cd30ic-csr t细胞也表现出较低的pd-1表达，并且显示出中央记忆t亚群的较高百分比和总细胞数，表明更好的持久性。
[0792]
d.与靶细胞共培养后中央记忆t细胞从抗ror1 car csr t细胞的发展和维持
[0793]
本实施例显示，在靶刺激之后抗ror1-car 抗ror1-cd30-csr t细胞发展成并维持高的中央记忆t细胞群，包括总cd3

中央记忆t细胞和cd8

亚群中央记忆t细胞。使用上文公开的所有六个ror1

癌细胞系，根据实施例5a、实施例5b和实施例14中所述的方法的记忆t细胞标志物ccr7和cd45ra的细胞表面表达。将如本实施例中所述的两个抗ror1car csr细胞组的105个car

(受体

)t细胞首先在96孔板上在多个重复中以1:1的et比率与各种靶细胞共培养/接合。在靶细胞接合后的选定日定量每个样品组的至少一个样品的中央记忆t细胞(tcm细胞计数)的数量，它们也针对cd3(对于总t细胞，包括cd8

t细胞和cd4

t细胞)或cd8(对于cd8

t细胞)进行了标记。第一次接合后每7天，用105个新鲜的靶细胞再攻击每组未使用的重复细胞混合物样品。表30至表44中显示了car cd30-csr和car 41bb-csr t细胞的中央记忆t细胞计数和tcm百分比的代表性结果。在所有t细胞中的中央记忆t细胞百分比为在总t细胞(cd3

细胞)群中的tcm％。在cd8

细胞中的tcm百分比为在cd8

t细胞群中的tcm％。计算在car cd30-csr与car 41bb-csr t细胞的tcm细胞计数和tcm百分比的比率。
[0794]
表30.在与a549靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0795][0796]
表31.在与h1703靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0797][0798]
表32.在与h1975靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0799]
[0800][0801]
表33.在与jeko1靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0802][0803]
表34.在与mda-mb-231靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0804][0805]
表35.在与rpmi8226靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的总中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0806][0807]
表36.在与a549靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的所有t细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0808][0809]
表37.在与h1975靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的所有t细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0810][0811]
表38.在与jeko1靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的所有t细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0812]
[0813][0814]
表39.在与rpmi8226靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的所有t细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0815][0816]
表40.在与h1975靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的cd8

中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0817][0818]
[0819]
表41.在与mda-mb-231靶细胞接合之后抗ror1 car csr t细胞的cd8

中央记忆t(tcm)细胞计数。
[0820][0821]
表42.在与h1975靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的cd8

细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0822][0823][0824]
表43.在与jeko1靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的cd8

细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0825][0826]
表44.在与rpmi8226靶细胞接合之后在来自抗ror1 car csr t细胞的cd8

细胞中的中央记忆t细胞(tcm)百分比。
[0827][0828][0829]
结果表明，令人惊讶地与表达car 41bb-csr相比表达car cd30-csr产生具有显著更高的中央记忆t细胞的t细胞，指示更多的“存储”针对特定靶的长期t细胞免疫功能的能力。此外，因为在两个car csr构建体之间的唯一差异是csr的细胞内结构域，所以发展并维持高数量的中央记忆t细胞的能力主要是由于cd30的细胞内结构域或共刺激结构域。
[0830]
示例性实施方案
[0831]
根据本发明公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
[0832]
1.一种免疫细胞，包含：
[0833]
(a)嵌合抗原受体(car)，所述car包含：
[0834]
(i)包含抗体部分(car抗体部分)的细胞外靶结合结构域；
[0835]
(ii)跨膜结构域(car跨膜结构域)；以及
[0836]
(iii)初级信号传导结构域，以及
[0837]
(b)嵌合刺激受体(csr)，所述csr包含：
[0838]
(i)能够与靶配体结合或相互作用的配体结合模块；
[0839]
(ii)跨膜结构域(csr跨膜结构域)；以及
[0840]
(iii)cd30共刺激结构域，
[0841]
其中所述csr缺乏功能性初级信号传导结构域。
[0842]
2.根据实施方案1所述的免疫细胞，其中所述cd30共刺激结构域包含能够与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列。
[0843]
3.根据实施方案2所述的免疫细胞，其中所述能够与细胞内traf信号传导蛋白结合的序列对应于具有seq id no:65的序列的全长cd30的残基561-573或578-586。
[0844]
4.根据实施方案1至3中任一项所述的免疫细胞，其中所述cd30共刺激结构域包含与seq id no:65的残基561-573或578-586至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
[0845]
5.根据实施方案1至4中任一项所述的免疫细胞，其中所述cd30共刺激结构域包含与seq id no:75的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
[0846]
6.根据实施方案1至5中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr包含多于一个cd30共刺激结构域。
[0847]
7.根据实施方案1至6中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr还包含至少一个共刺激结构域，所述至少一个共刺激结构域包含与cd30不同的共刺激分子的细胞内序列。
[0848]
8.根据实施方案7所述的免疫细胞，其中与cd30不同的共刺激分子选自由以下组成的组：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性地结合的配体。
[0849]
9.根据实施方案1至8中任一项所述的免疫细胞，其中所述car还包含共刺激结构域(car共刺激结构域)。
[0850]
10.根据实施方案9所述的免疫细胞，其中所述car共刺激结构域衍生自共刺激受体的细胞内结构域。
[0851]
11.根据实施方案10所述的免疫细胞，其中所述共刺激受体选自由以下组成的组：cd30、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性地结合的配体。
[0852]
12.根据实施方案1至11中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块衍生自受体的细胞外结构域。
[0853]
13.根据实施方案1至11中任一项所述的免疫细胞，所述csr的所述配体结合模块包含抗体部分(csr抗体部分)。
[0854]
14.根据实施方案13所述的免疫细胞，其中所述csr抗体部分是单链抗体片段。
[0855]
15.根据实施方案1至14中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分是单链抗体片段。
[0856]
16.根据实施方案1至15中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分是单链fv(scfv)、单链fab、单链fab'、单结构域抗体片段、单结构域多特异
性抗体、细胞内抗体(intrabody)、纳米抗体(nanobody)或单链免疫因子。
[0857]
17.根据实施方案16所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分是单结构域多特异性抗体。
[0858]
18.根据实施方案17所述的免疫细胞，其中所述单结构域多特异性抗体是单结构域双特异性抗体。
[0859]
19.根据实施方案1至18中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分是单链fv(scfv)。
[0860]
20.根据实施方案19所述的免疫细胞，其中所述scfv是串联scfv。
[0861]
21.根据实施方案1至20中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分特异性地结合疾病相关抗原。
[0862]
22.根据实施方案21所述的免疫细胞，其中所述疾病相关抗原是癌症相关抗原。
[0863]
23.根据实施方案21所述的免疫细胞，其中所述疾病相关抗原是病毒相关抗原。
[0864]
24.根据实施方案1至23中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分特异性地结合细胞表面抗原。
[0865]
25.根据实施方案24所述的免疫细胞，其中所述细胞表面抗原选自由以下组成的组：蛋白质、碳水化合物和脂质。
[0866]
26.根据实施方案24或25所述的免疫细胞，其中所述细胞表面抗原是cd19、cd20、cd22、cd47、cd158e、gpc3、ror1、ror2、bcma、gprc5d、fcrl5、muc16、mct4、psma或它们的变体或突变体。
[0867]
27.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和所述csr抗体部分特异性地结合同一抗原。
[0868]
28.根据实施方案27所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和所述csr抗体部分特异性地结合所述同一抗原上的不同表位。
[0869]
29.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr抗体部分特异性地结合mhc限制性抗原。
[0870]
30.根据实施方案29所述的免疫细胞，其中所述mhc限制性抗原是包含肽和mhc蛋白的复合物，并且其中所述肽衍生自选自由以下组成的组的蛋白质：wt-1、afp、gpc3、hpv16-e7、ny-eso-1、prame、ebv-lmp2a、hiv-1、kras、foxp3、组蛋白h3.3、psa、ror1以及它们的变体或突变体。
[0871]
31.根据实施方案1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd19，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd19。
[0872]
32.根据实施方案1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd22，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd22。
[0873]
33.根据实施方案1至28中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd20，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd20。
[0874]
34.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd19，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd22。
[0875]
35.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd19，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd20。
[0876]
36.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd22，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd20。
[0877]
37.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd22，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd19。
[0878]
38.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd20，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd19。
[0879]
39.根据实施方案1至26中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合cd20，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合cd22。
[0880]
40.根据实施方案1至26中任一项所述的car，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合cd19和cd22两者。
[0881]
41.根据实施方案1至26中任一项所述的car，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合cd19和cd20两者。
[0882]
42.根据实施方案1至26中任一项所述的car，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合cd20和cd22两者。
[0883]
43.根据实施方案1至26中任一项所述的car，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合cd19、cd20和cd22。
[0884]
44.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含甲胎蛋白(afp)肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0885]
45.根据实施方案44所述的免疫细胞，其中所述afp肽包含seq id no:157-167中任一者的序列。
[0886]
46.根据实施方案44或45所述的免疫细胞，其中抗体部分包含：
[0887]
(a)分别地seq id no:168-170的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:171的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:172-174的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:175的序列的轻链可变区；或
[0888]
(b)分别地seq id no:176-178的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:179的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:180-182的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:183的序列的轻链可变区；或
[0889]
(c)分别地seq id no:184-186的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:187的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:188-190的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:191的序列的轻链可变区；或
[0890]
(d)分别地seq id no:192-194的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:195的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:196-198的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:199的序列的轻链可变区；或
[0891]
(e)分别地seq id no:200-202的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:203的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:204-206的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:207的序列的轻链可变区。
[0892]
47.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)。
[0893]
48.根据实施方案1至30和47中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体
结合模块特异性地结合gpc3。
[0894]
49.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分结合包含afp肽和mhc i类蛋白的复合物，并且其中所述csr的所述配体结合模块结合gpc3。
[0895]
50.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和所述csr的所述配体结合模块两者均结合gpc3。
[0896]
51.根据实施方案47、48和50中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和所述csr的所述配体结合模块特异性地结合gpc3上的不同表位。
[0897]
52.根据实施方案47、48、50和51中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块包含：
[0898]
(a)分别地seq id no:208-210的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:211的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:212-214的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:215的序列的轻链可变区；或
[0899]
(b)分别地seq id no:216-218的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:219的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:220-222的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:223的序列的轻链可变区；或
[0900]
(c)分别地seq id no:224-226的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:227的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:228-230的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:231的序列的轻链可变区；或
[0901]
(d)分别地seq id no:232-234的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:235的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:236-238的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:239的序列的轻链可变区；或
[0902]
(e)分别地seq id no:240-242的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:243的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:244-246的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:247的序列的轻链可变区；或
[0903]
(f)分别地seq id no:248-250的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:251的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:252-254的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:255的序列的轻链可变区；或
[0904]
(g)分别地seq id no:256-258的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:259的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:260-262的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:263的序列的轻链可变区。
[0905]
53.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含kras肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0906]
54.根据实施方案53所述的免疫细胞，其中所述kras肽包含seq id no:264-272中任一者的序列。
[0907]
55.根据实施方案53或54所述的免疫细胞，其中抗体部分包含：
[0908]
(a)分别地seq id no:273-275的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:276的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:277-279的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:280的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:281的序列的scfv；或
[0909]
(b)分别地seq id no:282-284的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:285的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:286-288的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:289的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:290的序列的scfv；或
[0910]
(c)分别地seq id no:291-293的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:294的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:295-297的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:298的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:299的序列的scfv；或
[0911]
(d)分别地seq id no:300-302的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:303的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:304-306的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:307的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:308的序列的scfv；或
[0912]
(e)分别地seq id no:309-311的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:312的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:313-315的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:316的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:317的序列的scfv；或
[0913]
(f)分别地seq id no:318-320的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:321的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:322-324的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:325的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:326的序列的scfv；或
[0914]
(g)分别地seq id no:327-329的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:330的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:331-333的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:334的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:335的序列的scfv；或
[0915]
(h)分别地seq id no:336-338的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:339的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:340-342的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:343的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:344的序列的scfv。
[0916]
56.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含psa肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0917]
57.根据实施方案56所述的免疫细胞，其中所述psa肽包含seq id no:345-355中任一者的序列。
[0918]
58.根据实施方案56或57所述的免疫细胞，其中抗体部分包含：
[0919]
(a)具有seq id no:356-370中任一者的序列的hcdr1、具有seq id no:371-384中任一者的序列的hcdr2、具有seq id no:385-402中任一者的序列的hcdr3，以及任选地具有seq id no:403-420中任一者的序列的重链可变区；并且/或者
[0920]
(b)具有seq id no:421-437中任一者的序列的lcdr1、具有seq id no:438-450中任一者的序列的lcdr2、具有seq id no:451-468中任一者的序列的lcdr3，以及任选地具有seq id no:469-486中任一者的序列的轻链可变区。
[0921]
59.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含psma肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0922]
60.根据实施方案59所述的免疫细胞，其中抗体部分包含具有seq id no:487-488的序列的scfv。
[0923]
61.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合ror1。
[0924]
62.根据实施方案61所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块结合具有seq id no:489-492中任一者的序列的ror1肽。
[0925]
63.根据实施方案61或62所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分和/或所述csr的所述配体结合模块包含：
[0926]
(a)分别地seq id no:493-495的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:496的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:497-499的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:500的序列的轻链可变区；或
[0927]
(b)分别地seq id no:501-503的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:504的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:505-507的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:508的序列的轻链可变区。
[0928]
64.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含ny-eso-1肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0929]
65.根据实施方案64所述的免疫细胞，其中所述ny-eso-1肽包含seq id no:509-519中任一者的序列。
[0930]
66.根据实施方案64或65所述的免疫细胞，其中所述抗体部分包含：
[0931]
(a)分别地seq id no:520-522的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:523的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:524-526的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:527的序列的轻链可变区；或
[0932]
(b)分别地seq id no:528-530的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:531的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:532-534的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:535的序列的轻链可变区；或
[0933]
(c)分别地seq id no:536-538的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:539的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:540-542的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:543的序列的轻链可变区；或
[0934]
(d)分别地seq id no:544-546的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:547的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:548-550的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:551的序列的轻链可变区；或
[0935]
(e)分别地seq id no:552-554的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:555的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:556-558的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:559的序列的轻链可变区；或
[0936]
(f)分别地seq id no:560-562的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:563的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:564-566的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:567的序列的轻链可变区；或
[0937]
(g)分别地seq id no:568-570的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:571的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:572-574的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:575的序列的轻链可变区。
[0938]
67.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含prame肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0939]
68.根据实施方案67所述的免疫细胞，其中所述prame肽包含seq id no:576-580中任一者的序列。
[0940]
69.根据实施方案67或68所述的免疫细胞，其中所述抗体部分包含：
[0941]
(a)分别地seq id no:581-583的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:584的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:585-587的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:588的序列的轻链可变区；或
[0942]
(b)分别地seq id no:589-591的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:592的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:593-595的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:596的序列的轻链可变区；或
[0943]
(c)分别地seq id no:597-599的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:600的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:601-603的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:604的序列的轻链可变区；或
[0944]
(d)分别地seq id no:605-607的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:608的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:609-611的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:612的序列的轻链可变区；或
[0945]
(e)分别地seq id no:613-615的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:616的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:617-619的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:620的序列的轻链可变区；或
[0946]
(a)分别地seq id no:621-623的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:624的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:625-627的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:628的序列的轻链可变区；或
[0947]
(a)分别地seq id no:629-631的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:632的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:633-635的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:636的序列的轻链可变区。
[0948]
70.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述car抗体部分特异性地结合包含wt1肽和mhc i类蛋白的复合物。
[0949]
71.根据实施方案70所述的免疫细胞，其中所述wt1肽包含seq id no:637的序列。
[0950]
72.根据实施方案70或71所述的免疫细胞，其中抗体部分包含：
[0951]
(a)分别地seq id no:638-640的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:641的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:642-644的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:645的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:646的序列的scfv；或
[0952]
(b)分别地seq id no:647-649的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:650的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:651-653的lcdr1、lcdr2和lcdr3的
id no:911或912的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:913-915的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:916
[0994]
或917的序列的轻链可变区。
[0995]
89.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合frα肽。
[0996]
90.根据实施方案89所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含：
[0997]
(a)分别地seq id no:918-920的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:921的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:923-925的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:926的序列的轻链可变区。
[0998]
91.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合egfr肽。
[0999]
92.根据实施方案91所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:928-930的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:931的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:932-934的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:935的序列的轻链可变区；以及任选地具有seq id no:936的序列的scfv。
[1000]
93.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合egfrviii肽。
[1001]
94.根据实施方案93所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:937-939的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:940的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:941-943的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:944的序列的轻链可变区。
[1002]
95.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合her3肽。
[1003]
96.根据实施方案95所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:945-947的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:948的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:949-951的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:952的序列的轻链可变区，以及任选地具有seq id no:953的序列的scfv。
[1004]
97.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合dll3肽。
[1005]
98.根据实施方案97所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:954-956的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:957的序列的重链，以及分别地seq id no:958-960的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:961的序列的轻链。
[1006]
99.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合c-met肽。
[1007]
100.根据实施方案99所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:962-964的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:965的序列的重链，以及分别地seq id no:966-968的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，和任选地具有seq id no:969的序列的轻链。
[1008]
101.根据实施方案1至30中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块结合cd70肽。
[1009]
102.根据实施方案101所述的免疫细胞，其中所述csr的所述配体结合模块包含分别地seq id no:970-972的hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列，和任选地具有seq id no:973的序列的重链可变区，以及分别地seq id no:974-976的lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列，以及任选地具有seq id no:977的序列的轻链。
[1010]
103.根据实施方案1至102中任一项所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。
[1011]
104.根据实施方案1至102中任一项所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域是cd8的跨膜结构域。
[1012]
105.根据实施方案1至104中任一项所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域衍生自tcr共受体或t细胞共刺激分子的跨膜结构域。
[1013]
106.根据实施方案105所述的免疫细胞，其中所述tcr共受体或t细胞共刺激分子选自由以下组成的组：cd8、4-1bb、cd27、cd28、cd30、ox40、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
[1014]
107.根据实施方案105或106所述的免疫细胞，其中所述tcr共受体或t细胞共刺激分子是cd30或cd8。
[1015]
108.根据实施方案107所述的免疫细胞，其中所述t细胞共刺激分子是cd30。
[1016]
109.根据实施方案107所述的免疫细胞，其中所述tcr共受体是cd8。
[1017]
110.根据实施方案1至104中任一项所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域是cd8、4-1bb、cd27、cd28、cd30、ox40、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154的跨膜结构域。
[1018]
111.根据实施方案110所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域是cd30或cd8的跨膜结构域。
[1019]
112.根据实施方案111所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。
[1020]
113.根据实施方案112所述的免疫细胞，其中所述csr跨膜结构域是cd30的跨膜结构域。
[1021]
114.根据实施方案112所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域是cd8的跨膜结构域。
[1022]
115.根据实施方案1至114中任一项所述的免疫细胞，其中所述car跨膜结构域和/或所述csr跨膜结构域包含选自由seq id no:66-71组成的组的氨基酸序列。
[1023]
116.根据实施方案1至115中任一项所述的免疫细胞，其中所述初级信号传导结构域包含衍生自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导序列的序列：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
[1024]
117.根据实施方案116所述的免疫细胞，其中所述初级信号传导结构域包含衍生自cd3ζ的细胞内信号传导序列的序列。
[1025]
118.根据实施方案116所述的免疫细胞，其中所述初级信号传导结构域包含cd3ζ的细胞内信号传导序列。
[1026]
119.根据实施方案1至118中任一项所述的免疫细胞，其中所述初级信号传导结构域包含与seq id no:77的序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
[1027]
120.根据实施方案1至119中任一项所述的免疫细胞，其还包含在所述car的所述细胞外靶结合结构域与所述跨膜结构域之间的肽接头。
[1028]
121.根据实施方案1至120中任一项所述的免疫细胞，其还包含在所述car的所述跨膜结构域与所述共刺激结构域之间的肽接头。
[1029]
122.根据实施方案1至121中任一项所述的免疫细胞，其还包含在所述car的所述共刺激结构域与所述初级信号传导结构域之间的肽接头。
[1030]
123.根据实施方案1至122中任一项所述的免疫细胞，其还包含在所述csr的所述配体结合模块与所述跨膜结构域之间的肽接头。
[1031]
124.根据实施方案1至123中任一项所述的免疫细胞，其还包含在所述csr的所述跨膜结构域与所述cd30共刺激结构域之间的肽接头。
[1032]
125.根据实施方案1至124中任一项所述的免疫细胞，其中所述csr的表达是可诱导的。
[1033]
126.根据实施方案125所述的免疫细胞，其中所述csr的表达在激活所述免疫细胞时是可诱导的。
[1034]
127.根据实施方案1至126中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性t细胞、辅助t细胞、自然杀伤t细胞和抑制t细胞。
[1035]
128.一种或多种核酸，其编码根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞所包含的car和csr，其中所述car和csr各自由所述一种或多种核酸编码的一个或多个多肽链组成。
[1036]
129.一种或多种载体，其包含根据实施方案128所述的一种或多种核酸。
[1037]
130.一种药物组合物，其包含：(a)根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞、根据实施方案128所述的一种或多种核酸、或根据实施方案129所述的一种或多种载体，以及和(b)药学上可接受的载剂或稀释剂。
[1038]
131.一种杀伤靶细胞的方法，包括：
[1039]
使一个或多个靶细胞与根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞在足以使得所述免疫细胞介导对所述靶细胞的杀伤的条件和持续时间下接触，
[1040]
其中所述靶细胞表达对所述免疫细胞具有特异性的抗原，并且
[1041]
其中所述免疫细胞在接触所述靶细胞时表达低细胞耗竭水平。
[1042]
132.根据实施方案131所述的方法，其中所述免疫细胞表达低细胞耗竭水平的耗竭标志物，所述耗竭标志物选自由以下组成的组：pd-1、tim-3、tigit和lag-3。
[1043]
133.根据实施方案131或132所述的方法，其中所述免疫细胞是t细胞。
[1044]
134.根据实施方案131至133中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞表达低细胞耗竭水平的pd-1。
[1045]
135.根据实施方案131至133中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞表达低细胞耗竭水平的tim-3。
[1046]
136.根据实施方案131至133中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞表达低细胞耗竭水平的lag-3。
[1047]
137.根据实施方案131至133中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞表达低细胞耗竭水平的tigit。
[1048]
138.根据实施方案131至137中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞相比表达更低水平的pd-1、tim-3、tigit或lag-3。
[1049]
139.根据实施方案138所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的pd-1，并且其中所述免疫细胞与所述对应的cd28 csr免疫细胞的pd-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1050]
140.根据实施方案138所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的tim-3，并且其中所述免疫细胞与所述对应的cd28 csr免疫细胞的tim-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1051]
141.根据实施方案138所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的lag-3，并且其中所述免疫细胞与所述对应的cd28 csr免疫细胞的lag-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1052]
142.根据实施方案138所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的cd28 csr免疫细胞相比表达更低水平的tigit，并且其中所述免疫细胞与所述对应的cd28 csr免疫细胞的tigit表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1053]
143.根据实施方案131至137中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与表达包含4-1bb共刺激结构域的csr的对应免疫细胞相比表达更低水平的pd-1、tim-3、tigit或lag-3。
[1054]
144.根据实施方案143所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的pd-1，并且其中所述免疫细胞与所述对应的4-1bb csr免疫细胞的pd-1表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1055]
145.根据实施方案143所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的tim-3，并且其中所述免疫细胞与所述对应的4-1bb csr免疫细胞的tim-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1056]
146.根据实施方案143所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的lag-3，并且其中所述免疫细胞与所述对应的4-1bb csr免疫细胞的lag-3表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1057]
147.根据实施方案143所述的方法，其中所述免疫细胞与对应的4-1bb csr免疫细胞相比表达更低水平的tigit，并且其中所述免疫细胞与所述对应的4-1bb csr免疫细胞的tigit表达水平的比率为0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更低。
[1058]
148.根据实施方案131至147中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
[1059]
149.根据实施方案148所述的方法，其中所述癌细胞来自选自由以下组成的组的癌症：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。
[1060]
150.根据实施方案147或148所述的方法，其中所述癌细胞是血液癌细胞。
[1061]
151.根据实施方案147或148所述的方法，其中所述癌细胞是实体瘤细胞。
[1062]
152.根据实施方案131至147中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是感染病毒的细胞。
[1063]
153.根据实施方案152所述的方法，其中所述感染病毒的细胞来自由选自由以下组成的组的病毒引起的病毒感染：巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、乙型肝炎病毒(hbv)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(kshv)、人乳头瘤病毒(hpv)、传染性软疣病毒(mcv)、人t细胞白血病病毒1(htlv-1)、hiv(人免疫缺陷病毒)和丙型肝炎病毒(hcv)。
[1064]
154.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向受试者施用根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞、根据实施方案128所述的一种或多种核酸或根据实施方案129所述的一种或多种载体或者向所述受试者施用根据实施方案130所述的药物组合物的步骤。
[1065]
155.根据实施方案154所述的方法，其中所述疾病是病毒感染。
[1066]
156.根据实施方案154所述的方法，其中所述疾病是癌症。
[1067]
157.根据实施方案156所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症。
[1068]
158.根据实施方案156所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
[1069]
159.根据实施方案158所述的方法，其中所述受试者在实体瘤癌症中比在受试者身体的其余部分中具有更高密度的根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞。
[1070]
160.根据实施方案154至159中任一项所述的方法，其中与用相同数量的表达相同car和包含cd28或4-1bb共刺激结构域的对应csr的免疫细胞治疗相同类型的疾病相比，所述受试者在所述受试者的外周血中具有更高密度的根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞。
[1071]
161.根据实施方案154至159中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管上皮癌、结肠直肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、头颈癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、嗜铬细胞瘤、浆细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和甲状腺癌。
[1072]
162.一种预防和/或逆转受试者的t细胞耗竭的方法，包括向所述受试者施用根据实施方案128所述的一种或多种核酸或根据实施方案129所述的一种或多种载体、或根据实施方案130所述的包含所述一种或多种核酸或所述一种或多种载体的药物组合物。
[1073]
163.根据实施方案162所述的方法，其中所述方法降低t细胞中的耗竭标志物的表达。
[1074]
164.根据实施方案162或163所述的方法，其中所述耗竭标志物选自由以下组成的组：pd-1、tim-3、tigit和lag-3。
[1075]
165.一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，所述方法与用表达car和包含cd28或4-1bb共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤浸润增加，其中所述方法包括向所述受试者施用表达相同car和包含cd30共刺激结构域的对应csr的对应免疫细胞，并且其中所述对应免疫细胞包含根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞。
[1076]
166.一种治疗受试者的实体瘤癌症的方法，所述方法与用表达car和包含cd28或4-1bb共刺激结构域的csr的免疫细胞治疗相同类型的实体瘤癌症相比使肿瘤消退增加，其中所述方法包括向所述受试者施用表达相同car和包含cd30共刺激结构域的对应csr的对
应免疫细胞，并且其中所述对应免疫细胞包含根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞。
[1077]
167.一种在受试者中产生中央记忆t细胞的方法，包括向所述受试者施用根据实施方案128所述的一种或多种核酸或根据实施方案129所述的一种或多种载体、或根据实施方案130所述的包含所述一种或多种核酸或所述一种或多种载体的药物组合物。
[1078]
168.根据实施方案167所述的方法，其中所述方法增加所述受试者中的中央记忆t细胞的数量和/或中央记忆t细胞在所有t细胞中的百分比。
[1079]
169.一种在体外产生中央记忆t细胞的方法，包括：使一种或多种靶细胞与根据实施方案1至127中任一项所述的免疫细胞在足以使得所述免疫细胞发展成中央记忆t细胞的条件和持续时间下接触，其中所述靶细胞表达对所述免疫细胞具有特异性的抗原。
[1080]
170.根据实施方案169所述的方法，其中所述方法增加中央记忆t细胞的数量和/或中央记忆t细胞在从所述免疫细胞传留下来的所有t细胞中的百分比。
[1081]
171.根据实施方案169或170所述的方法，其中所述方法产生比表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞更高数量的中央记忆t细胞和/或更高百分比的中央记忆t细胞。
[1082]
172.根据实施方案171所述的方法，其中所述方法产生比表达包含cd28共刺激结构域的csr的对应免疫细胞高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％数量的中央记忆t细胞和/或百分比的中央记忆t细胞。
[1083]
173.根据实施方案169至172中任一项所述的方法，其中所述中央记忆t细胞表达高水平的ccr7和低水平的cd45ra。
[1084]
174.根据实施方案169至173中任一项所述的方法，其中所述中央记忆t细胞是cd8 t细胞。
[1085]
非正式序列表
[1086]
[1087]
[1088]
[1089]
[1090]
[1091]
[1092]
[1093]
[1094]
[1095]
[1096]
[1097]
[1098]
[1099]
[1100]
[1101]
[1102]
[1103]
[1104]
[1105]
[1106]
[1107]
[1108]
[1109]
[1110]
[1111]
[1112]
[1113]
[1114]
[1115]
[1116]
[1117]
[1118]
[1119]
[1120]
[1121]
[1122]
[1123]
[1124]
[1125]
[1126]
[1127]
[1128]
[1129]
[1130]
[1131]
[1132]
[1133]
[1134]
[1135]
[1136]
[1137]
[1138]
[1139]
[1140]
[1141]
[1142]
[1143]
[1144]
[1145]
[1146]
[1147]
[1148]
[1149]
[1150]
[1151]
[1152]
[1153][1154]
在不脱离本公开的范围的情况下，来自本文所述的任何实施方案或在附图中的一个或多个特征可以与附图中的、本文所述的任何其它实施方案的一个或多个特征组合。
[1155]
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入一样。尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述公开内容，但是根据本公开的教导对本领域普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些改变和修改。