用于治疗白血病或骨髓增生异常综合征的与维奈托克、吉瑞替尼、米哚妥林或其他化合物组合的阿扎胞苷的制作方法

用于治疗白血病或骨髓增生异常综合征的与维奈托克、吉瑞替尼、米哚妥林或其他化合物组合的阿扎胞苷
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年6月20日提交的美国临时申请62/864413的优先权的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
2.提供了使用5-氮杂胞苷与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗疾病和障碍的方法，所述疾病和障碍包括癌症，例如但不限于急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、与异常细胞增殖相关的障碍、血液系统障碍和免疫障碍等。


背景技术：

3.癌症是世界范围内的重大公共健康问题，且许多类型的癌症已在医学文献中进行描述。例子包括血液癌症、骨癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌和肠癌。随着一般人群变老以及出现新的癌症形式，癌症的发病率持续攀升。一直需要有效的疗法来治疗癌症患者。
4.骨髓增生异常综合征(mds)是指一组各种各样的造血干细胞障碍。mds的年发病率估计为全球每10万人中有4.9个病例，并且在美国每年有约10,000人被诊断为患有mds。mds的特征可以在于具有受损的形态和成熟(骨髓生成障碍)的蜂窝状骨髓、外周血血球减少症以及由无效的血细胞产生引起的进展为急性白血病的可变风险。
5.mds被分组在一起是由于在一个或多个造血谱系中存在发育异常变化，包括骨髓、红细胞以及巨核细胞系列的发育异常变化。这些变化导致所述三个谱系中的一个或多个的血球减少症。患有mds的患者可能发展与贫血、嗜中性粒细胞(感染)和/或血小板减少症(出血)相关的并发症。约10％至约70％的患有mds的患者可能发展急性白血病。在mds的早期阶段，血球减少症的主要原因是增加的程序性细胞死亡(细胞凋亡)。随着疾病发展并转化成白血病，白血病细胞的增殖压倒健康骨髓。病程有所不同，其中一些病例表现为无痛性疾病而其他病例在很短的临床病程中表现为侵略性，其转化成急性形式的白血病。患有高危mds的大部分人最终经历骨髓衰竭。高达50％的mds患者在进展为aml之前死于并发症，如感染或出血。
6.急性髓性白血病(aml)是一种类型的癌症，其影响骨髓和血液。aml有各种各样的名字，包括急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病。在急性骨髓性白血病中的词语“急性”反映了疾病的快速进展。其被称为急性髓性白血病是因为它影响一类被称为骨髓细胞的白血细胞，这一类白血细胞通常发育成各种类型的成熟血细胞，如红血细胞、白血细胞和血小板。换句话说，aml是骨髓前体细胞系的恶性肿瘤，其特征在于异常细胞的快速增殖，所述异常细胞积聚在骨髓中并干扰正常细胞的产生。
7.aml通常归类为从头的，或者在暴露于先前的细胞毒性化学疗法后或在先前骨髓
增生异常综合征(mds)或既往血液系统障碍(ahd)的病史之后出现时归类为继发性的。aml的在基因水平上的发病机制也是异质的。引起aml的遗传改变包括在酪氨酸激酶基因中的内部串联重复，改变涉及白血病生成的基因的功能的染色体重排以及导致转录因子的激活的突变等。aml中的遗传改变的全面谱分析将提高疾病分类、风险分层和预后，并最终允许更精确的治疗性干预。mv4-11和molm-13是表达flt3突变的aml细胞系。参见quentmeier等人,leukemia,17(1):120-4(2003年1月)。flt3-itd上调mcl-1以促进在aml中干细胞的存活。参见yoshimoto等人,blood,114(24):5034-43(2009年12月3日)。
8.aml治疗的当前策略包括用于诱导缓解的诱导型化学疗法和旨在用于延长存活期的低强度疗法。缓解诱导型化学疗法是实现缓解或至少有效地降低肿瘤负荷的细胞减少性模式。阿糖胞苷和蒽环霉素的组合已成为诱导缓解的主要治疗方法。常见的诱导方案由以下组成：剂量为100至200mg/m2/天的阿糖胞苷持续7天以及剂量为45至90mg/m2/天的柔红霉素持续3天，经常称为“7 3方案”。如果实现缓解，则使用另外的化学疗法周期或从供体进行干细胞移植(同种异体造血干细胞移植[hsct])进行巩固。尽管诱导型化学疗法已成为较年轻合适患者的标准，但它在老年人和不适合人群中仍是一个有争议的问题。在接受ic的老年患者中，结局不那么有利主要是由于增加的治疗相关死亡率以及不佳的预后因素，从而导致在老年人群中所观察到的较低缓解率。对于由于年龄、体能状态以及共病而被视为不合格或不适合的患者或选择不接受ic当前化学疗法选项的患者的治疗选项包括低剂量阿糖胞苷、5-氮杂胞苷或地西他滨。
[0009]
尽管诱导型化学疗法在约60％至80％的较年轻成年人中以及在新诊断为aml的40％至50％的较老成年人中产生形态完全缓解(cr)，但有大量患者群体无法达到cr(即难治性aml)。即使对于在诱导型治疗后达到cr的患者，相当一部分最终会复发，导致在治疗后三年时仅约29％无复发存活率。
[0010]
因此，需要用于治疗癌症(包括但不限于aml和/或mds)的更有效的治疗方法，并且本公开文本解决了这种需求。


技术实现要素：

[0011]
本文提供了使用5-氮杂胞苷与至少一种另外的治疗剂的组合治疗疾病和障碍的方法，所述疾病和障碍包括aml、mds、癌症、与异常细胞增殖相关的障碍、血液系统障碍以及免疫障碍。
[0012]
本文的某些实施方案提供了所述另外的治疗剂是吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布或维奈托克。
[0013]
本文的某些实施方案提供了将所述5-氮杂胞苷作为组合物施用，所述组合物是单个单位剂型。本文的某些实施方案提供了非肠溶包衣的组合物。本文的某些实施方案提供了作为立即释放口服组合物的组合物。
[0014]
在一个方面提供了一种治疗患有急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征的人的方法，其中所述方法包括向所述人施用(i)口服施用的包含5-氮杂胞苷的药物组合物以及(ii)至少一种另外的治疗剂。
[0015]
在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂包括fms样酪氨酸激酶3(flt3)抑制剂、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)抑制剂、异柠檬酸脱氢酶2(idh1)抑制剂和/或b细胞淋巴瘤2
(bcl2)抑制剂。
[0016]
在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂包括吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布和/或维奈托克。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是吉瑞替尼或米哚妥林。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是吉瑞替尼。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是维奈托克。
[0017]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂依序施用，其中首先施用所述5-氮杂胞苷。
[0018]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂共同配制为单个单位剂型。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂配制成单独的剂型。
[0019]
在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂肠胃外施用。在一些实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂口服施用。
[0020]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以如下剂量口服施用：约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、或约600mg。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷剂量以如下剂量口服施用：50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg、370mg、380mg、390mg、400mg、410mg、420mg、430mg、440mg、450mg、460mg、470mg、480mg、490mg、500mg、510mg、520mg、530mg、540mg、550mg、560mg、570mg、580mg或600mg。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以200至300mg的剂量口服施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期的前七天、十四天或二十一天内每天施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷每天一次或两次施用至所述人。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷每天一次施用至所述人。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以胶囊或片剂的形式施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以非肠溶包衣片剂的形式施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以立即释放口服组合物的形式施用。
[0021]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约200mg的剂量施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约300mg的剂量施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约200mg的剂量施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约300mg的剂量施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约200mg的剂量施用7天。在一些实
施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约300mg的剂量施用7天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天200mg的剂量施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天300mg的剂量施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天200mg的剂量施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天300mg的剂量施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天200mg的剂量施用7天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天300mg的剂量施用7天。
[0022]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷(a)在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或大于14天内每天施用，任选地接着是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或大于14天的治疗给药假期；(b)在14天或更多天内每天施用，任选地接着是7天或更多天的治疗给药假期；(c)施用21天或更多天，任选地接着是7天或更多天的治疗给药假期；(d)施用14天，任选地接着是14天的治疗给药假期；(e)施用21天或更多天，接着是7天或更多天的治疗给药假期；(f)施用14天，接着是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的至少一个。
[0023]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以(a)每天约300mg的剂量施用14天，接着是14天的治疗给药假期；(b)每天约200mg的剂量施用14天，接着是治疗给药假期为14天；(c)每天约300mg的剂量施用21天，接着是7天的治疗给药假期；(d)每天约200mg的剂量施用，接着是7天的治疗给药假期；(e)每天300mg的剂量施用14天，接着是14天的治疗给药假期；(f)每天200mg的剂量施用14天，接着是14天的治疗给药假期；(g)每天300mg的剂量施用21天，接着是7天的治疗给药假期；或(h)每天200mg的剂量施用，接着是7天的治疗给药假期。在一些实施方案中，重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中的至少一个。
[0024]
在一些实施方案中，使用如下治疗周期施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中7天每天施用5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，使用如下治疗周期施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中14天每天施用5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，使用如下治疗周期施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中21天每天施用5-氮杂胞苷。
[0025]
在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂提供了治疗急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征的协同作用。
[0026]
在一些实施方案中，所述急性髓性白血病的特征在于由fms样酪氨酸激酶-3内部串联重复(flt3-itd)突变引起。在一些实施方案中，在所述至少一种另外的治疗剂之前施用所述5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增强髓细胞白血病1(mcl-1)降解。
[0027]
在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增加中值存活期。在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
[0028]
在一些实施方案中，所述急性髓性白血病对用至少一种另外的治疗剂治疗具有耐
药性。在一些实施方案中，所述急性髓性白血病对用fms样酪氨酸激酶-3(flt3抑制剂)治疗有反应。在一些实施方案中，所述急性髓性白血病的特征在于具有mcl-1的过表达。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷通过下调mcl-1的表达引发癌细胞由所述至少一种另外的治疗剂介导的细胞凋亡。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增强mcl-1降解。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷改变细胞代谢。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷导致细胞周期停滞。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷抑制氧化磷酸化。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷增加转录激活因子3(atf3)的表达。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷降低硬脂酰-coa去饱和酶(scd)的表达。
[0029]
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述人每天施用所述5-氮杂胞苷，持续1、2或3天；(b)向所述人施用所述至少一种另外的治疗剂，持续一天或多天；以及(c)任选地重复步骤(a)和(b)。
[0030]
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述人每天施用所述5-氮杂胞苷，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天；(b)向所述人施用所述至少一种另外的治疗剂，持续一天或多天；以及(c)任选地重复步骤(a)和(b)。
[0031]
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述人每天施用所述5-氮杂胞苷，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(b)向所述人施用所述至少一种另外的治疗剂，持续一天或多天；以及(c)任选地重复步骤(a)和(b)。
[0032]
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述人每天施用所述5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天；(b)向所述人每天并行施用所述至少一种治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天；以及(c)任选地重复步骤(a)和(b)。在一些实施方案中，其中施用所述至少一种另外的治疗剂包括施用吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布或维奈托克。
[0033]
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)向所述人每天施用所述5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(b)向所述人每天并行施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天；以及(c)任选地重复步骤(a)和(b)。在一些实施方案中，其中施用所述至少一种另外的治疗剂包括施用吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布或维奈托克。
[0034]
在一些实施方案中，所述方法包括以下连续步骤：(a)向所述人施用所述5-氮杂胞苷，在28天周期中持续7天；(b)向所述人施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1天；(c)向所述人施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续6天；以及(d)在7天的休药期之后重复步骤(a)至(c)。
[0035]
在一些实施方案中，所述方法包括以下连续步骤：(a)向所述人每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(b)向所述人每天施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(c)向所述人每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；以及(d)在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天的休药期之后任选地重
复步骤(a)和(c)。
[0036]
在一些实施方案中，所述人患有急性髓性白血病。在一些实施方案中，所述人患有骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，所述骨髓增生异常综合征是由修订的国际预后评分系统(ipss-r)定义的高和非常高风险骨髓增生异常综合征。
附图说明
[0037]
图1表示5-氮杂胞苷与吉瑞替尼的组合以及5-氮杂胞苷与米哚妥林的组合的最大ec
50
倍数转变；两种情况均采用细胞系mv4-11和molm-13。显示了来自三种不同给药计划表的结果：(i)首先施用5-氮杂胞苷(黑色条)；(ii)并行施用两种药剂(浅灰色条)；以及(iii)其次施用5-氮杂胞苷(中间灰色条)。
[0038]
图2代表以下三种不同的给药时间表：(i)在flt3抑制剂(flt3i)之前以一定间隔首先施用5-氮杂胞苷(aza)；(ii)并行施用两种药剂(5-氮杂胞苷和flt3i)；以及(iii)在施用flt3i之后其次以一定间隔施用5-氮杂胞苷。所述flt3抑制剂可以是任何合适的flt3抑制剂，包括米哚妥林或吉瑞替尼。
[0039]
图3a-图3d表示在细胞系mv4-11(图3a)和molm-13(图3c)的情况下5-氮杂胞苷与维奈托克的组合的最大ec
50
倍数转变。显示了来自如以下图例所示的三种不同给药时间表的结果：(i)首先施用5-氮杂胞苷(黑色条)；(ii)并行施用两种药剂(浅灰色条)；以及(iii)其次施用5-氮杂胞苷(中间灰色条)。示出了在细胞系mv4-11(图3b)和molm-13(图3d)的情况下对于三种不同给药时间表，与维奈托克的组合施用的5-氮杂胞苷的协同指数。
[0040]
图4a-图4c表示反应面分析，其显示了当首先施用5-氮杂胞苷时在mv4-11细胞中5-氮杂胞苷与维奈托克的协同作用(图4a)，在同时施用的情况下相对较低的协同作用(图4b)以及首先施用维奈托克的情况下的协同作用(图4c)。反应面方法(rsm)是一种用于探讨若干个解释变量与一个或多个反应变量之间的关系的熟知的统计方法。rsm使用一系列设计的实验来获得最佳反应，目前情况下所述最佳反应是5-氮杂胞苷与维奈托克的协同作用。
[0041]
图5描绘了蛋白质印迹，其显示(a)5-氮杂胞苷和米哚妥林(“氮杂胞苷 0.3μm米哚妥林”)以及(b)5-氮杂胞苷和吉瑞替尼(“氮杂胞苷 0.3μm吉瑞替尼”)增强mv4-11细胞系中的mcl-1降解。
[0042]
图6描绘了蛋白质印迹，其显示5-氮杂胞苷和维奈托克处理降低flt3itdmv4-11细胞中的mcl-1水平。
[0043]
图7a-图7c用存活百分比(y轴)与第0天至第70天(x轴)的图描绘了在molm-13异种移植物模型中的5-氮杂胞苷组合的体内评估。图7a显示了5-氮杂胞苷和米哚妥林的组合的结果，图7b显示了与维奈托克组合的5-氮杂胞苷的结果，并且图7c显示了5-氮杂胞苷和吉瑞替尼的组合的结果。图7a-图7c中所示的实验的给药如下：(i)5-氮杂胞苷(低暴露，延长持续时间，leed)：1mg/kg腹膜间(ip)，每天一次持续五天，三倍(qdx 5x3)；(ii)5-氮杂胞苷(高暴露，有限持续时间，held)：3mg/kg腹膜间(ip)，每天一次持续五天(qdx5)；(iii)米哚妥林(100mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))；(iv)吉瑞替尼(4mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))；以及(v)维奈托克(100mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))。p值(相对于最佳的单一药剂)*p《0.05；**p《0.001；***p《0.0001。
[0044]
图8a、图8b和图8c描绘了22aml细胞系对作为单一药剂的5-氮杂胞苷(aza)和维奈托克(分别为图8a和图8b)的敏感性，以及对5-氮杂胞苷和嘌呤醛糖的组合的敏感性(图8c)。
[0045]
图9a-图9f显示了在开始用5-氮杂胞苷和维奈托克处理之后七天的mv4-11细胞(图9a-图9c)和molm-13细胞(图9d-图9f)的细胞存活率以及相应协同指数(si)。测试了以下时间表：在第1、2和3天施用5-氮杂胞苷，接着在第4天施用维奈托克(首先施用5-氮杂胞苷(aza))(图9a和图9d)；在第1天共同施用5-氮杂胞苷和维奈托克，接着在第2天和第3天施用5-氮杂胞苷(同时)(图9b和图9e)；以及在第1天施用维奈托克，接着在第2、3和4天施用5-氮杂胞苷(首先施用维奈托克)(图9c和图9f)。
[0046]
图10a、图10b和图10c描绘了mcl-1表达与5-氮杂胞苷和维奈托克组合在表达野生型flt3、flt3-itd或flt3(d835y)突变的一组工程化baf3细胞系中的协同作用的程度的相关性。
[0047]
图11描绘了在一组20aml细胞系中如通过rnaseq测量的mcl1rna水平与协同指数的相关性(r2＝-0.5607，p＝0.0101)。
[0048]
图12a-图12h描绘了在四种不同的aml细胞系中5-氮杂胞苷介导的mcl-1降解的程度：kg1α(图12a)、mv4-11(图12b)、thp-1(图12c)和oci-aml2(图12d)。结果显示出在kg1α(图12e)和mv4-11(图12f)细胞系的情况下5-氮杂胞苷-维奈托克协同活性(协同指数(si)分别为70和35.5)以及在thp-1(图12g)和oci-aml-2(图12h)细胞系的情况下很少或没有协同活性(si分别为20.2和10.8)。对于kg1α(图12a)和mv4-11(图12b)细胞系，其中5-氮杂胞苷-维奈托克具有最大的协同作用(图12e和图12f)，5-氮杂胞苷导致mcl-1降解最快，其在处理后6小时开始。相比之下，对于thp-1(图12g)，其中5-氮杂胞苷-维奈托克仅提供较小的协同活性，显示出5-氮杂胞苷介导的mcl-1降解较晚，在16小时处开始且到24小时不完全降解(图12c)。对于oci-aml2(图12d)，其中5-氮杂胞苷-维奈托克具有最低的协同作用(图12h)，5-氮杂胞苷处理未导致mcl-1的任何降解。
[0049]
图13a描绘了蛋白质印迹，其评价了胱天蛋白酶3的降解。将细胞用z-vad-fmk(一种泛胱天蛋白酶抑制剂)处理，并测量通过5-氮杂胞苷导致的mcl-1降解的程度。图13b显示了通过5-氮杂胞苷导致的mcl-1降解的条形图，其中将细胞用20μmz-vad-fmk处理1小时，然后5-氮杂胞苷处理另外16小时。胱天蛋白酶抑制在mv4-11细胞中部分消除通过5-氮杂胞苷导致的mcl-1降解，这表明了其他不依赖于胱天蛋白酶的mcl-1降解机制。
[0050]
图14a和图14b描绘了对用pbs(媒介物)、1μm 5-氮杂胞苷处理24小时(图14a)，或用1μm 5-氮杂胞苷处理48小时(图14b)的mv4-11细胞进行的rnaseq的结果。图14a和图14b显示了在24小时(图14a)和48小时(图14b)处显著修饰的基因的火山图，显示出在24小时处5-氮杂胞苷诱导的133个差异表达的基因和在48小时处226个差异表达的基因。对5-氮杂胞苷诱导的差异表达的基因进一步分析后，鉴定出先前已显示出调节mcl1表达的两个基因：转录激活因子3(atf3)和硬脂酰-coa去饱和酶(scd)。在5-氮杂胞苷处理后48小时atf3表达增加两倍。通过5-氮杂胞苷处理在48小时处使scd(硬脂酰-coa去饱和酶)即脂质代谢和mcl1的调节物的表达降低了2.5倍。在使用实时pcr的单独实验中对atf3(图14c)和scd(图14d)表达的改变进行了验证。atf3表达以时间和浓度依赖性方式增加，因为0.3μm 5-氮杂胞苷处理不足以在24或48小时诱导atf3表达(图14c)。类似地，当用3μm 5-氮杂胞苷处理时
scd表达在24小时内迅速降低，但其在此时间点不受低浓度的5-氮杂胞苷的影响(图14d)。
[0051]
图15a-图15c显示了在mv4-11细胞中atf3和/或scd基因的sirna敲低以评估其协同功能的结果。mv4-11细胞未进行转染或用atf3、scd或对照(加扰)sirna转染。作为对照，将细胞用sirna转染并在转染后72小时收集rna并进行qpcr(图15a)。在用加扰sirna处理的细胞中，观察到atf3(图15b)或scd(图15c)表达没有变化。转染后，在第1-3天每天用多种浓度的5-氮杂胞苷处理细胞。在第4天，用维奈托克对细胞给药，接着在处理开始后7使用进行细胞活力测试。使用combenefit和最高单一药剂分析来计算5-氮杂胞苷-维奈托克协同(图15d-图15g)。图15d＝未转染的细胞；图15e＝加扰rnai；图15f＝atf3敲低；以及图15g＝scd敲低。
[0052]
图16a、图16b、图16c、图16d、图16e和图16f描绘了关于5-氮杂胞苷和维奈托克以对应于可注射5-氮杂胞苷(held)或口服5-氮杂胞苷(leed)的剂量和时间表是否在体内具有协同活性的评价的结果。显示出5-氮杂胞苷-维奈托克协同的mv4-11(图16a-图16c)和molm-13(图16d-图16f)两种细胞系用于在免疫缺陷动物中产生弥散性aml异种移植小鼠。体外维奈托克使两种细胞系对维奈托克敏化(图16a和图16d)并与5-氮杂胞苷起协同作用(图16b和图16e)。为了对口服5-氮杂胞苷(leed)方案建模，将小鼠用1mg/kg 5-氮杂胞苷处理15天(低暴露，延长持续时间)。可替代地，为了使用相同的累积剂量但用可注射的5-氮杂胞苷(held)方案，将小鼠用3mg/ml 5-氮杂胞苷处理5天(高暴露，有限持续时间)。
[0053]
图17a、图17b、图17c、图17d、图17e、图17f、图17g、图17h、图17i、图17j和图17k描绘了关于用5-氮杂胞苷和flt3抑制剂共同治疗是否在aml细胞中具有协同作用的研究的结果。图17a-图17d显示了使用mv4-11细胞的实验的结果。图17e-图17h显示了使用molm-13细胞的实验的结果。图17a、图17b、图17e和图17f显示了用5-氮杂胞苷和米哚妥林治疗的结果。图17c、图17d、图17g和图17h显示了用5-氮杂胞苷和吉瑞替尼治疗的结果。将细胞在第1-3天用5-氮杂胞苷的每日剂量处理，然后在第4天用flt-3抑制剂(米哚妥林或吉瑞替尼)处理。在第7天收集细胞，并通过评估细胞活力。米哚妥林使mv4-11对5-氮杂胞苷敏化(图17a)，并显示出与5-氮杂胞苷的协同活性(图17b)。在用5-氮杂胞苷和吉瑞替尼(图17c和图17d)处理的mv4-11细胞中以及在用5-氮杂胞苷和米哚妥林(图17e和图17f)或吉瑞替尼(图17g和图17h)处理的molm-13细胞中观察到类似的作用。图17i显示了在molm-13细胞中对于施用媒介物、5-氮杂胞苷(leed)、5-氮杂胞苷(held)、米哚妥林、5-氮杂胞苷(leed)和米哚妥林以及5-氮杂胞苷(held)和米哚妥林的存活百分比(y轴)与第1-70天的结果。图17j显示了在mv4-11细胞中对于施用媒介物、5-氮杂胞苷(leed)、5-氮杂胞苷(held)、米哚妥林、5-氮杂胞苷(leed)和米哚妥林以及5-氮杂胞苷(held)和米哚妥林的存活百分比(y轴)与第1-91天的结果。图17k显示了在molm-13细胞中对于施用媒介物、5-氮杂胞苷(leed)、5-氮杂胞苷(held)、吉瑞替尼、5-氮杂胞苷(leed)和吉瑞替尼以及5-氮杂胞苷(held)和吉瑞替尼的存活百分比(y轴)与第1-70天的结果。
[0054]
图18描绘了实施例3的总体研究设计的结果。
具体实施方式
i.概述
[0055]
本公开文本部分地基于令人惊讶的发现，即5-氮杂胞苷与用于治疗癌症的其他药
剂组合地引发癌细胞系的细胞凋亡。特别地，发现5-氮杂胞苷降低髓细胞白血病1(mcl-1)的水平，从而导致癌细胞对fms样酪氨酸激酶3(flt3)或维奈托克活性有反应。低基线水平的mcl-1与对治疗癌症的更好的协同反应相关，因为当基线水平已经降低时，可以更容易地降低mcl-1水平低于特定阈值。因此，令人惊讶地发现，5-氮杂胞苷与其他治疗剂(如flt3抑制剂或维奈托克)的组合比单独的每种药剂更多地降低mcl-1水平。
[0056]
本文公开的方法的另一个方面是将5-氮杂胞苷与也口服施用的其他药剂组合口服施用。因此，与本公开文本的其他口服药剂组合的5-氮杂胞苷口服给药方案产生更好的患者体验以及降低医院感染的风险，所述医院感染可能对具有受损的免疫系统的癌症患者特别危险。
[0057]
本文公开的方法的又另一方面是将5-氮杂胞苷以相对较低剂量在延长的时间段(例如1mg/kg，每日一次持续十五天(qdx15)；以及1mg/kg，每日一次持续五天，三倍(qdx 5x3))与一种或多种药剂组合口服给予。在本公开文本之前，通过以相对较高的剂量注射施用5-氮杂胞苷(例如，皮下或静脉内75mg/m2，每日一次持续七天，每四周一次)的根本原因是因为人们认为高剂量的化疗剂如5-氮杂胞苷将导致更大肿瘤细胞死亡，因此导致更长的患者存活期。本公开文本与这种“传统观点”相反。特别地，令人惊讶地发现，与一种或多种药剂组合的在延长给药时间段内相对较低口服剂量的5-氮杂胞苷导致在治疗aml和/或mds方面的治疗功效。尽管将较低剂量的5-氮杂胞苷与其他治疗剂组合施用，但所述组合疗法令人惊讶地提供了在治疗aml和/或mds方面的治疗功效。
[0058]
关于细胞分化，不受理论束缚，假设5-氮杂胞苷剂量的降低可能导致癌细胞的去甲基化。认为触发分化的化疗药物使来自骨髓的原始细胞转化至循环中并使它们变成功能性细胞并降低其寿命。此外，认为暴露于5-氮杂胞苷会将原始细胞转化成终端分化的免疫细胞，从而导致杀伤肿瘤细胞(造血分化途径)；在原始细胞被下推至分化谱系后，它们最终杀伤肿瘤细胞。总之，认为在较长的时间端内给予的较低剂量的5-氮杂胞苷与一种或多种其他治疗剂如flt3抑制剂或维奈托克导致更大的分化和最终更明显的肿瘤细胞死亡。
[0059]
此外，如下所述的例子中详述，令人惊讶地发现在一些情况下，发现在用5-氮杂胞苷和维奈托克的组合处理之后对维奈托克活性具有耐药性的aml细胞对维奈托克有反应，其中首先施用5-氮杂胞苷。此外，5-氮杂胞苷和flt3抑制剂或维奈托克的组合提供了协同作用并且比单独的每种药剂更多地降低mcl-1蛋白水平。还发现，mcl-1表达水平与5-氮杂胞苷-维奈托克组合的协同相关联(例如，mcl-1表达水平越低，协同作用越大)。
[0060]
在一个方面，本公开文本涉及通过向人施用(i)口服施用的包含5-氮杂胞苷的药物组合物；以及(ii)至少一种另外的治疗剂治疗患有急性髓性白血病(aml)的人的方法。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布和/或维奈托克。本文还公开了(i)口服施用的包含5-氮杂胞苷的药物组合物以及(ii)用于治疗人的aml的至少一种另外的治疗剂。
[0061]
在一些实施方案中，某些组合在治疗特定疾病或障碍方面协同作用，所述特定疾病或障碍包括例如多种类型的癌症以及与不期望的血管生成或异常细胞增殖相关或以其为特征的某些疾病和病症。
[0062]
急性髓性白血病(aml)也称为急性骨髓性白血病，其是一种侵略性、异质性、髓性恶性肿瘤。根据美国癌症协会，aml是在成年人中诊断的最常见的白血病类型，并且占所有
成年白血病病例的32％。据估计，2020年在美利坚合众国(美国)将有大约19,940人被诊断为aml，其中估计11,180名患者死于所述疾病。所述疾病在老年人中尤其难以治疗，老年人占患者的大多数；因此，五年总存活率仅为约29％。美国国家癌症研究所(national cancer institute)，seer cancer stat facts：白血病-急性髓性白血病(aml)，https://seer.cancer.gov/statfacts/html/amyl.html(访问于2020年6月10日)。自20世纪70年代以来，初始标准疗法对于那些足够合适接受它的人而言由“7 3”方案组成，所述方案包括七天的连续输注阿糖胞苷和三天的蒽环霉素。rai等人blood 1981:58:1203-1212。在接下来的35年里，试图增加aml治疗的安全性和功效的许多临床试验已经在标准照护中进行了微小改变。然而，近期详细描述了aml的分子个体发生的数据已经阐明了因果途径，这已导致开发靶向药物疗法的努力。e.winer和r.stone,ther.adv.hematol.,10:pmc6624910(2019年7月)。
[0063]
对于本文所述的组合治疗有长久的切身需要，因为aml具有高复发率。另外，复发性和难治性aml是一种非常难以治疗的疾病，并且可能由多种异常信号传导途径驱动，所述多种异常信号传导途径给予白血病细胞在克服任何被抑制的单一途径方面的优势。因此，非常需要用于治疗aml患者的成功的组合治疗。
[0064]
在本文所述的治疗方法的一个方面，待治疗的患者为约60岁或更大。在本文所述的治疗方法的另一个方面，待治疗的患者为约65岁或更大、约70岁或更大、约75岁或更大、或约80岁或更大。在另一个方面，所述患者是复发性aml患者。在另一个方面，所述患者是难治性aml患者。待治疗的患者也可以是小于约60岁、小于约55岁、小于约50岁、小于约45岁或小于约40岁。在其他方面，待治疗的患者具有flt3突变，flt3-itd或flt3-tkd。在一些方面，待治疗的患者具有复发性aml突变。示例性aml突变包括但不限于与fms相关的酪氨酸激酶3(flt3)、kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(kras)、神经母细胞瘤ras病毒(v-ras)致癌基因同源物(nras)、原癌基因c-kit(kit)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11(ptpn11)、神经纤维瘤蛋白1(nf1)、dna甲基转移酶3a(dnmt3a)、异柠檬酸脱氢酶1(idh1)、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)、10/11易位蛋白-2(tet2)、另外的性梳样蛋白1(asxl1)、zeste同源物的增强子2(ezh2)、混合谱系白血病1/组蛋白-赖氨酸n-甲基转移酶2a(mll/kmt2a)、核磷蛋白(npm1)、ccaat增强子结合蛋白α(cebpa)、runt相关转录因子1(runx1)、gata结合因子2(gata2)、肿瘤蛋白p53(tp53)、富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子2(srsf2)、u2小核rna辅助因子1(u2af1)、剪接因子3b亚基1(sf3b1)、锌指(ccch型)、rna结合基序和富含丝氨酸/精氨酸的蛋白2(zrsr2)、rad21黏连蛋白复合组分(rad21)、基质抗原1(stag1)、基质抗原2(stag2)、染色体结构维持蛋白1a(smc1a)以及染色体结构维持蛋白3(smc3)。
[0065]
在另一个方面，本公开文本涉及通过向人施用(i)口服施用的包含5-氮杂胞苷的药物组合物；以及(ii)至少一种另外的治疗剂治疗患有骨髓增生异常综合征(mds)的人的方法。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括吉瑞替尼和/或维奈托克。本文还公开了(i)口服施用的包含5-氮杂胞苷的药物组合物以及(ii)用于治疗人的mds的至少一种另外的治疗剂。
[0066]
在一些实施方案中，所述mds是较高风险或高风险mds。根据修订的国际评分系统(ipss-r)，本公开文本的较高风险mds被定义为高或非常高的风险(voso m.t.等人,j clin oncol.2013；31(21):2671-2677；以及greenberg p.l.等人,blood.2012,120(12):2454
–
2465)，其中这些患者分别具有1.6和0.8年的中值存活期。a.实验和临床研究方案的概述
[0067]
实施例2详细描述了一种临床研究，其分析了药物暴露与功效、安全性、药效动力学的关系，包括确定aml患者中的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。还将确定治疗后在血液和/或骨髓中的最小残留病。所述研究群体由第一次复发、1或2种标准诱导治疗难治的aml患者或不是接受强化ic的候选人的新诊断的aml患者组成。当与艾伏尼布、恩西地平、维奈托克或flt3抑制剂(如吉瑞替尼)组合给予(在具有flt3itd或tkd突变的aml患者中)时，待测试的药物组合包含口服5-氮杂胞苷。
[0068]
异柠檬酸脱氢酶(idh)是柠檬酸循环中的关键酶。突变形式的idh产生高水平的2-羟戊二酸盐的(r)-对映体(r-2-hg)，并且可以有助于肿瘤的生长。idh1催化细胞质中的这种反应，而idh2催化线粒体中的这种反应。艾伏尼布和恩西地平是idh抑制剂。
[0069]
艾伏尼布是idh1的小分子抑制剂。在诊断为患有神经胶质瘤、急性髓性白血病(aml)，胆管癌和软骨肉瘤的患者的肿瘤中，观察到在异柠檬酸脱氢酶(idh)1和2的保守活性位点中的体细胞突变。通过这些新突变，这些酶展现出新的新生变形行为，这导致将α-酮戊二酸盐还原为肿瘤代谢物r-2-羟戊二酸盐。艾伏尼布竞争性地抑制α-酮戊二酸盐依赖性酶，最终导致表观遗传改变和造血分化受损。
[0070]
在体外研究中，艾伏尼布显示出对α-酮戊二酸(
ɑ-kg)底物和nadph辅因子的非竞争性抑制行为。这被认为导致艾伏尼布是突变的异柠檬酸脱氢酶1(midh1)-r132h同二聚体的快速平衡抑制剂。
[0071]
恩西地平是异柠檬酸脱氢酶2(idh2)基因的小分子抑制剂。如上所述，突变形式的idh产生高水平的r-2-hg，其中idh1催化细胞质中的这种反应并且idh2催化线粒体中的这种反应。恩西地平通过降低线粒体中的(r)-2-hg总水平来破坏该循环。
[0072]
维奈托克(和)是bh3(bcl-2同源结构域3)-模拟物，因为其阻断抗凋亡b细胞淋巴瘤-2(bcl-2)蛋白，从而导致慢性淋巴细胞性白血病(cll)细胞的程序性细胞死亡。一些淋巴恶性肿瘤中bcl-2的过表达有时显示出与增加的化学疗法耐药性有关。
[0073]
flt3抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂(tki)。与其他酪氨酸激酶抑制剂一样，flt3抑制剂竞争激酶的活性结构域中的腺苷三磷酸(atp)结合位点，这抑制所述蛋白质被磷酸化的能力，随后降低所述蛋白质的活性。flt3突变是患有急性髓性白血病(aml)的患者中最常见的发现之一。flt3/itd基因发现于大约30％的具有正常细胞遗传学的aml患者中。flt3基因主要表达于人造血祖细胞和树突状细胞中，并且在白血病细胞增殖、分化和存活中发挥关键作用。flt3/itd基因的组成型激活触发多个下游信号级联放大，如stat5、ras、mek和pi3k/akt途径，并最终导致抑制白血病细胞的细胞凋亡和分化，包括白血病细胞增殖的调节异常。所评价的flt3抑制剂包括米哚妥林和吉瑞替尼米哚妥林是星形孢菌素的半合成衍生物，即来自链霉菌属星形孢菌(streptomyces staurosporeus)的生物碱，并且有抗致癌cd135(fms样酪氨酸激酶3受体，flt3)活性。吉瑞替尼用作axl受体酪氨酸激酶的抑制剂。
[0074]
实施例3详细描述了一种1b/2期临床研究，其评价了与生物标记物定向疗法组合的口服5-氮杂胞苷在患有急性髓性白血病(aml)或较高风险骨髓增生异常综合征(hr-mds)
的患者中的安全性、耐受性和初步功效。所述研究群体由以下组成：没有资格进行强化诱导化学疗法的新诊断的aml患者和复发性/难治性(r/r)am患者以及患有原发性或继发性mds的受试者的治疗，所述受试者是修订的国际预后评分系统(ipss-r)高和非常高风险的。当与维奈托克待或吉瑞替尼组合给予时，待测试的药物组合包含口服5-氮杂胞苷。b.5-氮杂胞苷
[0075]
5-氮杂胞苷(国家服务中心名称nsc-102816；cas登记号320-67-2)也称为阿扎胞苷，缩写为aza，或4-氨基-l-b-d-呋喃核糖基-l,3,5-三嗪-2(1h)-酮。市售的(注射用5-氮杂胞苷)含有5-氮杂胞苷，并且用于皮下或静脉使用。5-氮杂胞苷是胞嘧啶的嘧啶核苷类似物。5-氮杂胞苷具有以下结构：5-氮杂胞苷。
[0076]
在其掺入复制dna中后，5-氮杂胞苷与dna甲基转移酶形成共价复合物。dna甲基转移酶负责从头dna甲基化，并在复制dna的子代dna链中负责产生建立的甲基化模式。通过5-氮杂胞苷导致的dna甲基转移酶抑制导致dna低甲基化，从而通过重新表达涉及正常细胞周期调节、分化和死亡的基因来恢复对形态发育异常、未成熟的造血细胞和癌细胞的正常功能。这些胞苷类似物的细胞毒性作用导致对正常的细胞生长控制机制不再有反应的包括癌细胞在内的快速分裂细胞的死亡。5-氮杂胞苷还掺入rna中。5-氮杂胞苷的细胞毒性作用可能由多种机制产生，包括抑制dna、rna和蛋白质合成，掺入rna和dna中以及激活dna损害途径。
[0077]
在临床试验中已经测试了可注射的5-氮杂胞苷，并且其例如像在治疗骨髓增生异常综合征(mds)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞白血病(all)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)中显示出显著抗肿瘤活性。参见例如，aparicio等人,curr.opin.invest.drugs 3(4):627-33(2002)。
[0078]
5-氮杂胞苷被批准用于皮下(sc)或静脉内(iv)施用以治疗患有以下法国-美国-英国(fab)骨髓增生异常综合征亚型的患者：难治性贫血(ra)或难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞(如果伴有嗜中性粒细胞减少症或血小板减少症或需要输血)、难治性贫血伴过多原始细胞(raeb)、难治性贫血伴转化中过多原始细胞(raeb-t)以及慢性骨髓单核细胞性白血病(cmmol)。已在临床试验如nct00761722、nct01519011、nct00528982和nct01757535中研究了口服给药。使用5-氮杂胞苷的口服配制品和治疗方法披露于美国专利号8,846,628中，将其通过引用以其整体并入。
[0079]
在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷口服施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷以胶囊或片剂的形式施用。在一些实施方案中，所述片剂是非肠溶包衣片剂。在一些实施方案
中，将所述5-氮杂胞苷以如下剂量口服施用：约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg或约600mg。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约200至约300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷剂量以如下剂量口服施用：50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、310mg、320mg、330mg、340mg、350mg、360mg、370mg、380mg、390mg、400mg、410mg、420mg、430mg、440mg、450mg、460mg、470mg、480mg、490mg、500mg、510mg、520mg、530mg、540mg、550mg、560mg、570mg、580mg或600mg。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以200至300mg的剂量口服施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷在28天周期的前七天、十四天或二十一天内每天口服施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷在28天周期的前十四天每天口服施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷每天一次施用至所述受试者。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷每天两次施用至所述受试者。
[0080]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约200mg的剂量口服施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天200mg的剂量口服施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约300mg的剂量口服施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天300mg的剂量口服施用14天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约200mg的剂量口服施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天200mg的剂量口服施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天约300mg的剂量口服施用21天。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在28天周期中以每天300mg的剂量口服施用21天。
[0081]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或大于14天内每天口服施用，任选地接着是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或大于14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在14天或更多天内每天口服施用，任选地接着是7天或更多天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在21天或更多天内口服施用，任选地接着是7天或更多天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在14天内口服施用，任选地接着是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在21天或更多天内口服施用，接着是7天或更多天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷在14天内口服施用，接着是14天的治疗给药假期。
[0082]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天约300mg的剂量口服施用14天，接着
是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天300mg的剂量口服施用14天，接着是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天约200mg的剂量口服施用14天，接着是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天200mg的剂量口服施用14天，接着是14天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天约300mg的剂量口服施用21天，接着是7天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天300mg的剂量口服施用21天，接着是7天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天约200mg的剂量口服施用，接着是7天的治疗给药假期。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以每天200mg的剂量口服施用，接着是7天的治疗给药假期。
[0083]
在一些实施方案中，使用如下治疗周期口服施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中7天每天施用5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，使用如下治疗周期口服施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中14天每天施用5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，使用如下治疗周期口服施用所述5-氮杂胞苷，所述治疗周期包括在28天周期中21天每天施用5-氮杂胞苷。
[0084]
5-氮杂胞苷对细胞活力和细胞的表观遗传重新编程产生影响。taylor和jones,cell 20(1):85-93(1980)。在高剂量下，认为5-氮杂胞苷产生了主要为急性的细胞毒性作用(khan等人,experimental hematology 36(2):149-57,2008)，而在低剂量下，虽然进行了分化但其抑制肿瘤细胞的克隆形成(tsai等人,cancer cell,21(3):430-46,2012)。
[0085]
与美国专利号8,846,628中描述的5-氮杂胞苷的口服非肠溶包衣配制品(包括cc-486)相比，市售的产品即5-氮杂胞苷的可注射配制品以相对较高的剂量施用且持续较短的持续时间。临床研究揭示，与相比，cc-486诱导更可持续的去甲基化作用(laille等人,plosone 10(8):e0135520,2015)，但cc-486的14或21天方案的累积暴露低于施用5天的(garcia-manero等人,leukemia 30(4):889-96,2016)。
[0086]
为了检查随暴露于5-氮杂胞苷的持续时间变化的细胞毒性和表观遗传作用的差异，将可注射5-氮杂胞苷的高暴露、有限持续时间(held)施用与口服施用的5-氮杂胞苷的低暴露、延长持续时间(leed)施用进行比较。为了在非临床系统中模拟可注射和口服氮杂胞苷给药，总5-氮杂胞苷暴露在不同的暴露持续时间内保持不变。在一些实施方案中，为了对5-氮杂胞苷的口服施用建模，将5-氮杂胞苷在延长持续时间内以低暴露(leed)递送：以1mg/kg的剂量，每天一次持续十五天(qdx15)。为了对通过5-氮杂胞苷的静脉内或皮下施用所产生的相同累积剂量建模，将5-氮杂胞苷在有限持续时间内以高暴露(held)施用：以3mg/kg的剂量，每天一次持续五天(qdx5)。
[0087]
在一些实施方案中，与其他药剂组合的5-氮杂胞苷的leed施用提供了持续的药效动力学作用和/或改善的患者依从性。持续的药效动力学作用可以包括5-氮杂胞苷引发的任何变化，其包括例如mcl-1降解和/或atf3或scd基因表达的变化。在一些实施方案中，与和其他药剂组合的5-氮杂胞苷的held相比，与其他药剂组合的5-氮杂胞苷的leed提供了总体dna甲基化的降低(例如，由增加的核酸掺入所致)，其持续至治疗周期(即，28天周期)的结束。在一些实施方案中，与其他药剂组合的5-氮杂胞苷的leed提供了在28天周期的第21天达到最大值的分化标记物上调，并且具有以逐渐丧失活力直至28天周期的第28天为特征的细胞死亡。在一些实施方案中，与其他药剂组合的5-氮杂胞苷的held提供了在28天周期
的第7天达到最大值的分化标记物上调，并且具有以在28天周期中的第14天达到最大值随后恢复为特征的细胞死亡。在一些实施方案中，与和其他药剂组合的5-氮杂胞苷的held相比，与其他药剂组合的5-氮杂酰胺的leed提供了持续整个治疗周期(即，28天周期)的髓样分化标记物的更高表达，所述髓样分化标记物包括但不限于cd11b、cd14、cd86、hla-dr和mertk。在一些实施方案中，与和其他药剂组合的5-氮杂胞苷的held相比，与其他药剂组合的5-氮杂胞苷的leed提供了更明显的表观遗传变化和更广泛的分化。ii.药物配制品a.概述
[0088]
本文的实施方案包括包含5-氮杂胞苷和任选渗透增强剂的药物配制品和组合物，其中所述配制品和组合物被制备用于口服施用。在特定实施方案中，所述配制品和组合物被制备用于基本上在胃中释放5-氮杂胞苷。在具体实施方案中，5-氮杂胞苷和所述药物配制品和组合物用于治疗与异常细胞增殖相关的疾病和障碍，其中5-氮杂胞苷、所述配制品和组合物被制备用于口服施用，优选用于基本上在胃中释放5-氮杂胞苷。特定实施方案涉及5-氮杂胞苷用于制备治疗特定医学适应症的如本文提供的药物配制品和组合物的用途。本文提供的包含5-氮杂胞苷的药物配制品和组合物旨在用于将5-氮杂胞苷口服递送至有需要的受试者。口服递送形式包括但不限于片剂、胶囊、囊片、溶液、混悬剂和糖浆。
[0089]
本文的特定实施方案提供了作为片剂或胶囊的固体口服剂型。在某些实施方案中，所述配制品是含有5-氮杂胞苷的片剂。在某些实施方案中，所述配制品是含有5-氮杂胞苷的胶囊。在某些实施方案中，本文提供的片剂或胶囊任选地包含一种或多种赋形剂，例如像助流剂、稀释剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、造粒剂、粘合剂、聚合物和涂层剂。在某些实施方案中，本文的实施方案包括5-氮杂胞苷用于制备治疗与异常细胞增殖相关的疾病的药物组合物的用途，其中所述组合物被制备用于口服施用。本文提供的某些剂型的药代动力学特征
[0090]
在某些实施方案中，包含5-氮杂胞苷的配制品在口服施用后实现活性药物成分(api)的立即释放。在特定实施方案中，包含5-氮杂胞苷的配制品包含治疗有效量的5-氮杂胞苷(和任选一种或多种赋形剂)并在口服施用后实现api的立即释放。
[0091]
在某些实施方案中，包含5-氮杂胞苷的配制品在口服施用后基本上在胃中释放api。在某些实施方案中，所述配制品在口服施用后实现5-氮杂胞苷的立即释放。在某些实施方案中，所述配制品还包含药物释放控制组分，其能够基本上在胃中释放5-氮杂胞苷。在某些实施方案中，所述配制品任选地还包含药物释放控制组分，其中调节所述药物释放控制组分，使得5-氮杂胞苷的释放基本上发生在胃中。在特定实施方案中，调节所述药物释放控制组分，使得5-氮杂胞苷的释放是立即的并且基本上发生在胃中。在特定实施方案中，调节药物释放控制组分，使得5-氮杂胞苷的释放是持续的并且基本上发生在胃中。在某些实施方案中，5-氮杂胞苷的配制品在口服施用后基本上在胃中释放api并且随后在肠中释放api的其余部分。
[0092]
本领域技术人员可评估药物配制品在受试者中的口服生物利用度的方法在本领域中是已知的。此类方法包括例如比较多种药代动力学参数，例如但不限于最大血浆浓度(“cmax”)、达到最大血浆浓度的时间(“tmax”)或曲线下面积(“auc”)测定。
[0093]
本文的特定实施方案提供了包含5-氮杂胞苷的药物配制品(例如，立即释放口服
配制品和/或基本上在胃中释放api的配制品)，其在口服施用了所述配制品的受试者(例如，人)中实现特定auc值(例如，auc(0-t)或auc(0-∞))。特定实施方案提供了口服配制品，其实现了如下auc值：至少25ng-hr/ml、至少50ng-hr/ml、至少75ng-hr/ml、至少100ng-hr/ml、至少150ng-hr/ml、至少200ng-hr/ml、至少250ng-hr/ml、至少300ng-hr/ml、至少350ng-hr/ml、至少400ng-hr/ml、至少450ng-hr/ml、至少500ng-hr/ml、至少550ng-hr/ml、至少600ng-hr/ml、至少650ng-hr/ml、至少700ng-hr/ml、至少750ng-hr/ml、至少800ng-hr/ml、至少850ng-hr/ml、至少900ng-hr/ml、至少950ng-hr/ml、至少1000ng-hr/ml、至少1100ng-hr/ml、至少1200ng-hr/ml、至少1300ng-hr/ml、至少1400ng-hr/ml、至少1500ng-hr/ml、至少1600ng-hr/ml、至少1700ng-hr/ml、至少1800ng-hr/ml、至少1900ng-hr/ml、至少2000ng-hr/ml、至少2250ng-hr/ml或至少2500ng-hr/ml。在特定实施方案中，所述auc测定是从获得自给药后的人患者的血液样品的时间浓度药代动力学曲线获得的。
[0094]
本文的特定实施方案提供了包含5-氮杂胞苷的药物配制品(例如，立即释放口服配制品和/或基本上在胃中释放api的配制品)，其在口服施用了所述配制品的受试者中实现特定最大血浆浓度(“cmax”)。特定实施方案提供了口服配制品，其实现了5-氮杂胞苷的如下cmax：至少25ng/ml、至少50ng/ml、至少75ng/ml、至少100ng/ml、至少150ng/ml、至少200ng/ml、至少250ng/ml、至少300ng/ml、至少350ng/ml、至少400ng/ml、至少450ng/ml、至少500ng/ml、至少550ng/ml、至少600ng/ml、至少650ng/ml、至少700ng/ml、至少750ng/ml、至少800ng/ml、至少850ng/ml、至少900ng/ml、至少950ng/ml、至少1000ng/ml、至少1100ng/ml、至少1200ng/ml、至少1300ng/ml、至少1400ng/ml、至少1500ng/ml、至少1600ng/ml、至少1700ng/ml、至少1800ng/ml、至少1900ng/ml、至少2000ng/ml、至少2250ng/ml或至少2500ng/ml。本文的特定实施方案提供了包含5-氮杂胞苷的药物配制品(例如，立即释放口服配制品和/或基本上在胃中释放api的配制品)，其在口服施用了所述配制品的受试者中实现特定的达到最大血浆浓度的时间(“tmax”)。特定实施方案提供了口服配制品，其实现了5-氮杂胞苷的如下tmax：少于10分钟、少于15分钟、少于20分钟、少于25分钟、少于30分钟、少于35分钟、少于40分钟、少于45分钟、少于50分钟、少于55分钟、少于60分钟、少于65分钟、少于70分钟、少于75分钟、少于80分钟、少于85分钟、少于90分钟、少于95分钟、少于100分钟、少于105分钟、少于110分钟、少于115分钟、少于120分钟、少于130分钟、少于140分钟、少于150分钟、少于160分钟、少于170分钟、少于180分钟、少于190分钟、少于200分钟、少于210分钟、少于220分钟、少于230分钟或少于240分钟。在特定实施方案中，所述tmax值是从口服施用所述配制品的时间开始测量的。本文提供的某些剂型的设计
[0095]
本文提供了如下剂型，其被设计成在口服施用后最大化5-氮杂胞苷的吸收和/或有效递送，例如以用于基本上在胃中释放。因此，本文的某些实施方案提供了使用药物赋形剂的5-氮杂胞苷(例如像5-氮杂胞苷)的固体口服剂型，所述药物赋形剂在口服施用后实现api例如基本上在胃中的立即释放。特定的立即释放配制品包含特定量的5-氮杂胞苷和任选一种或多种赋形剂。在某些实施方案中，所述配制品是立即释放片剂或立即释放胶囊(例如像hpmc胶囊)。
[0096]
本文提供了制备本文提供的配制品的方法，其包括本文提供的5-氮杂胞苷(例如，立即释放口服配制品和/或基本上在胃中释放api的配制品)。在特定实施方案中，本文提供
的配制品是使用药物配制领域中的技术人员已知的如例如在相关的教科书中所述的常规方法制备的。参见例如，remington,the science and practice of pharmacy,第20版,lippincott williams&wilkins,(2000)；ansel等人,pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第7版,lippincott williams&wilkins,(1999)；gibson,pharmaceutical preformulation and formulation,crc press(2001)。
[0097]
在某些实施方案中，所述配制品是片剂，其中所述片剂是使用标准、公认的片剂加工程序和设备制造的。在某些实施方案中，用于形成片剂的方法是对包含单独或与一种或多种赋形剂(例如像载体、添加剂、聚合物等等)组合的5-氮杂胞苷的粉末状、结晶和/或颗粒组合物直接压制。在某些实施方案中，作为直接压制的替代方案，使用湿法造粒或干法造粒过程制备片剂。在某些实施方案中，所述片剂是使用潮湿或其他易处理的材料开始模塑的而非压制的。在某些实施方案中，使用压制和造粒技术。
[0098]
在某些实施方案中，5-氮杂胞苷的压制片剂是薄膜包衣的。在一些实施方案中，薄膜包衣的片剂是用聚合物薄层包衣的压制片剂，所述聚合物薄层能够在片剂上形成皮肤状膜。所述膜通常是有色的，并且具有更持久、不占体积以及涂覆耗时较少的优点。通过其组成，包衣可以被设计成在胃肠道内的所需位置处破裂并暴露核心片剂。将塑料状材料的紧致薄包衣置于压制片剂上的薄膜包衣过程可以产生具有与原始压制片剂基本相同的重量、形状和大小的包衣片剂。在一些实施方案中，薄膜包衣是有色的以使片剂具有吸引力和特色。在一些实施方案中，薄膜包衣溶液是非水性的或水性的。在特定实施方案中，所述非水性溶液任选地含有一种或多种以下类型的材料以向片剂提供所需的包衣：(1)成膜剂，其能够产生在常规包衣条件下可重现的光滑薄膜，例如像乙酸邻苯二甲酸纤维素；(2)合金物质，其提供水溶性或对膜的渗透性以确保被体液渗透以及药物的治疗可用性，例如像聚乙二醇；(3)增塑剂，其用于产生包衣的柔性和弹性从而提供持久性，例如像蓖麻油；(4)表面活性剂，其用于增强涂覆期间的膜的铺展性，例如像聚氧乙烯脱水山梨糖醇衍生物；(5)不透明剂和着色剂，其用于使包衣片剂的外观具有吸引力和特色，例如像作为遮光剂的二氧化钛以及作为着色剂的fd&c或d&c染料；(6)甜味剂、香料或芳香剂，其用于增强片剂对受试者的可接受性，例如像作为甜味剂的糖精，以及作为香料和芳香剂的香草醛；(7)光泽剂，其用于在没有单独抛光操作的情况下为片剂提供光泽，例如像蜂蜡；(8)挥发性溶剂，其用于允许其他组分在片剂上散布，同时允许快速蒸发以允许有效而快速的操作，例如像醇-丙酮混合物。在某些实施方案中，水性薄膜包衣配制品含有以下中的一种或多种：(1)成膜聚合物，例如像纤维素醚聚合物，如羟丙基甲基-纤维素、羟丙基纤维素和甲基纤维素；(2)增塑剂，例如像甘油、丙二醇、聚乙二醇、邻苯二甲酸二乙酯和次乙酸二丁酯；(3)着色剂和遮光剂，例如像fd&c或d&c色淀和氧化铁颜料；或(4)媒介物，例如像水。
[0099]
在某些实施方案中，药物配制品是5-氮杂胞苷的立即释放片剂。在某些实施方案中，立即释放片剂被设计为例如在不存在任何特殊速率控制特征如特殊包衣和其他技术的情况下崩解和释放api。
[0100]
在某些实施方案中，本文提供的药物配制品含有用于形成“药物核心”的5-氮杂胞苷以及任选一种或多种赋形剂。任选的赋形剂包括例如，例如在本领域中已知的稀释剂(填充剂)、润滑剂、崩解剂、填料、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、调味剂、粘合剂、赋形剂支持物、助流剂、渗透增强赋形剂、增塑剂等。
[0101]
可以使用一种或多种稀释剂例如以增加体积，使得最终提供合适大小的片剂。稀释剂还包括例如藻酸铵、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、醋酸纤维素、可压缩糖、糖粉(confectioner’s sugar)、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、赤藓糖醇、乙基纤维素、果糖、富马酸、硬脂酸棕榈酸甘油酯、异麦芽酮糖醇、高岭土、乳糖醇(lacitol)、乳糖、甘露醇、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、麦芽糖、中链甘油三酯、微晶纤维素、微晶纤维素、微晶硅化纤维素、粉末状纤维素、聚葡萄糖、聚甲基丙烯酸酯、西甲硅油、藻酸钠、氯化钠、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、磺基丁基醚-β-环糊精、滑石、黄蓍胶、海藻糖和木糖醇。在一些实施方案中，所述稀释剂包括甘露醇和微晶硅化纤维素。稀释剂可以以用于获得所需的片剂体积的计算量使用。在一些实施方案中，稀释剂以如下量使用：约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约22％或更多、约24％或更多、约26％或更多、约28％或更多、约30％或更多、约32％或更多、约34％或更多、约36％或更多、约38％或更多、约40％或更多、约42％或更多、约44％或更多、约46％或更多、约48％或更多、约50％或更多。在一些实施方案中，所述配制品中使用的稀释剂在药物核心的约20％与约40％w/w之间。
[0102]
可以使用一种或多种润滑剂，例如以促进片剂制造。合适的润滑剂的例子包括例如植物油(如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及可可属的油)、甘油、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸。在某些实施方案中，如果存在的话，硬脂酸盐不超过含药物的核心的约2重量％。在特定实施方案中，所述润滑剂是硬脂酸镁。在某些实施方案中，所述润滑剂是相对于药物核心以如下量存在：药物核心的约0.2％w/w、药物核心的约0.4％w/w、药物核心的约0.6％w/w、药物核心的约0.8％w/w、药物核心的约1.0％w/w、药物核心的约1.2％w/w、药物核心的约1.4％w/w、药物核心的约1.6％w/w、药物核心的约1.8％w/w、药物核心的约2.0％w/w、药物核心的约2.2％w/w、药物核心的约2.4％w/w、药物核心的约2.6％w/w、药物核心的约2.8％w/w、药物核心的约3.0％w/w、药物核心的约3.5％w/w、药物核心的约4％w/w、药物核心的约4.5％w/w或药物核心的约5％w/w。在一些实施方案中，所述润滑剂以如下量存在：在药物核心的约0.5％与约5％w/w之间或在药物核心的约1％与约3％w/w之间。
[0103]
可以使用一种或多种崩解剂，例如以促进片剂的崩解，并且可以是例如淀粉、粘土、纤维素、藻胶、树胶或交联聚合物。崩解剂还包括例如藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如，ac-di-sol，primellose)、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮(例如，kollidon，polyplasdone)、瓜尔胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉末状纤维素、预胶质化淀粉、藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠(例如，explotab)和淀粉。在一些实施方案中，所述崩解剂是交联羧甲基纤维素钠。在某些实施方案中，所述崩解剂是相对于药物核心以如下量存在：药物核心的约1％w/w、药物核心的约2％w/w、药物核心的约3％w/w、药物核心的约4％w/w、药物核心的约5％w/w、药物核心的约6％w/w、药物核心的约7％w/w、药物核心的约8％w/w、药物核心的约9％w/w或药物核心的约10％w/w。在一些实施方案中，所述崩解剂以如下量存在：大约在药物核心的约1％与约10％w/w之间、在药物核心的约2％与约8％w/w之间。b.5-氮杂胞苷与至少一种另外的治疗剂
[0104]
在特定实施方案中，本文提供的5-氮杂胞苷组合物还包含一种、两种或更多种其他药理学活性物质(本文中也称为“另外的治疗剂”、“第二活性剂”等)。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷组合物是口服配制品。在一些实施方案中，具有至少一种另外的治疗剂的
5-氮杂胞苷口服组合物用于治疗本文公开的任何疾病或障碍。在特定实施方案中，本文提供的口服配制品包含治疗有效量的一种或多种另外的治疗剂。在特定实施方案中，使用共同配制活性药物成分的方法将5-氮杂胞苷和一种或多种另外的治疗剂以相同的剂型共同配制在一起，所述方法包括本文公开的方法和本领域已知的方法。在其他实施方案中，将5-氮杂胞苷和一种或多种另外的治疗剂以单独的剂型共同施用。在一些实施方案中，某些组合在治疗特定疾病或障碍方面协同作用，所述特定疾病或障碍包括例如多种类型的癌症以及与不期望的血管生成或异常细胞增殖相关或以其为特征的某些疾病和病症。
[0105]
另外的治疗剂的例子包括但不限于吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布和维奈托克。
[0106]
另外的治疗剂的例子包括但不限于flt3抑制剂、idh2抑制剂、idh1抑制剂和bcl2抑制剂。第一代flt3抑制剂的例子包括但不限于米哚妥林、来他替尼、舒尼替尼和索拉非尼第二代flt3抑制剂的例子包括但不限于奎扎替尼、克莱拉尼(crenolanib)、培西达替尼(pexidartinib，plx3397)和吉瑞替尼(asp2215)比，它们比第一代抑制剂更有效且更具选择性。包括idh1和/或idh2抑制剂在内的idh抑制剂的例子包括但不限于艾伏尼布和恩西地平。bcl2抑制剂的例子包括但不限于维奈托克(abt-199)、纳维托克(navitoclax，abt-263)、abt-737(4-[4-[[2-(4-氯苯基)苯基]甲基]哌嗪-1-基]-n-[4-[[(2r)-4-(二甲基氨基)-1-苯基磺酰基丁烷-2-基]氨基]-3-硝基苯基]磺酰基苯甲酰胺)、奥巴托克甲磺酸盐(gx15-070)、tw-37(n-[4-(2-叔丁基苯基)磺酰基苯基]-2,3,4-三羟基-5-[(2-丙烷-2-基苯基)甲基]苯甲酰胺)、at101((r)-(-)-棉子酚)、ha14-1(2-氨基-6-溴-α-氰基-3-(乙氧基羰基)-4h-1-苯并吡喃-4-乙酸乙酯)以及沙布托克(sabutoclax)。c.5-氮杂胞苷与作为所述至少一种另外的治疗剂的维奈托克的组合对于治疗疾病具有令人惊讶的安全性和有效性
[0107]
在一些实施方案中，包含5-氮杂胞苷的口服药物组合物与作为另外的治疗剂的维奈托克一起使用。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷口服组合物与维奈托克一起用于安全且有效地治疗本文公开的任何疾病或障碍。
[0108]
维奈托克是bcl-2的选择性抑制剂，并且作为呈片剂形式的venclexta
tm
销售。维奈托克在美国被指示：(i)用于治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(cll)或小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)的成年患者；(ii)与可注射的5-氮杂胞苷或地西他滨或低剂量阿糖胞苷组合用于治疗75岁或更大的成年人或患有妨碍使用强化诱导化学疗法的共病的成年人中的新诊断的急性髓性白血病(aml)。在一些实施方案中，患者连续10天每天皮下接受一次20mg/m2的阿糖胞苷，每4周一次，作为低剂量阿糖胞苷。
[0109]
根据每周斜升时间表开始使用维奈托克的疗法，其在若干天或周的特定时间段内达到推荐每日剂量。对于治疗cll和sll，将维奈托克在第1周内以20mg的每日剂量施用，在第2周内以50mg的每日剂量施用，在第3周内以100mg的每日剂量施用，在第4周内以200mg的每日剂量施用以及在第5周内及以后以400mg的每日剂量施用。对于用具有另一种药剂(如可注射5-氮杂胞苷)的组合疗法治疗aml，将维奈托克在第1天以100mg的每日剂量施用，在第2天以200mg的每日剂量施用以及在第3天及以后以400mg的每日剂量施用。将(注射用5-氮杂胞苷)在28天周期中施用，其在维奈托克治疗的第1天开始，在每个周期的第1-7天以75mg/m2的剂量iv或皮下注射。
[0110]
在一些实施方案中，将维奈托克口服施用。在一些实施方案中，将所述维奈托克以片剂的形式施用。在一些实施方案中，将维奈托克每天施用。在一些实施方案中，将维奈托克以约20mg至约400mg，如约20mg、约50mg、约100mg、约200mg或约400mg的剂量施用。在一些实施方案中，将维奈托克以约400mg的剂量施用。
[0111]
在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和维奈托克伴随施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和维奈托克依序施用。在一些实施方案中，其中将5-氮杂胞苷和维奈托克依序施用，首先施用所述5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和维奈托克作为单独的剂型施用，所述单独的剂型如适合于静脉内或皮下使用的注射剂和/或用于口服使用的片剂或胶囊。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和维奈托克作为单个单位剂型共同配制，所述单个单位剂型如适合于静脉内或皮下使用的注射剂或用于口服使用的片剂或胶囊。d.5-氮杂胞苷与作为所述至少一种另外的治疗剂的吉瑞替尼的组合对于治疗疾病具有令人惊讶的安全性和有效性
[0112]
在一些实施方案中，包含5-氮杂胞苷的口服药物组合物与作为另外的治疗剂的吉瑞替尼一起使用。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷口服组合物与吉瑞替尼一起用于安全且有效地治疗本文公开的任何疾病或障碍。
[0113]
吉瑞替尼是酪氨酸激酶抑制剂，并且作为呈片剂形式的销售。吉瑞替尼在美国被指示用于治疗成年患者，所述成年患者患有复发性或难治性急性髓性白血病(aml)伴有如通过fda批准的测试检测到的flt3突变。吉瑞替尼的推荐起始剂量为每天一次口服120mg，与或不与食物一起。
[0114]
在一些实施方案中，将吉瑞替尼口服施用。在一些实施方案中，将吉瑞替尼以片剂的形式施用。在一些实施方案中，将吉瑞替尼每天施用。在一些实施方案中，将吉瑞替尼以如下剂量施用：约20mg至约400mg、约40mg至约400mg、约40mg至约200mg，如约20mg、约40mg、约50mg、约80mg、约100mg、约120mg、约160mg、约200mg或约400mg。在一些实施方案中，将吉瑞替尼以约120mg的剂量施用。
[0115]
在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和吉瑞替尼伴随施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和吉瑞替尼依序施用。在一些实施方案中，其中将5-氮杂胞苷和吉瑞替尼依序施用，首先施用所述5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和吉瑞替尼作为单独的剂型施用，所述单独的剂型如适合于静脉内或皮下使用的注射剂和/或用于口服使用的片剂或胶囊。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和吉瑞替尼作为单个单位剂型共同配制，所述单个单位剂型如适合于静脉内或皮下使用的注射剂或用于口服使用的片剂或胶囊。e.5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂的使用方法
[0116]
如本文所述，本文的某些实施方案提供了治疗患有急性髓性白血病(aml)的受试者的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用(i)包含5-氮杂胞苷的药物组合物；以及(ii)至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，将包含5-氮杂胞苷的药物组合物口服施用。同样在一些实施方案中，将包含如本文所述的5-氮杂胞苷的药物组合物与用于治疗在受试者(包括人患者)中的aml的至少一种另外的治疗剂一起使用。
[0117]
在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和一种或多种治疗剂共同施用至受试者以产生协同治疗作用。所述共同施用的药剂可以是口服或通过注射给药的癌症治疗剂。
[0118]
在某些实施方案中，本文提供的用于治疗与异常细胞增殖相关的障碍的方法包括
口服施用包含治疗有效量的5-氮杂胞苷的配制品。本文公开了与本文提供的方法有关的特定治疗适应症。在某些实施方案中，药物配制品中的治疗有效量的5-氮杂胞苷是如本文所公开的量。在某些实施方案中，药物配制品中的5-氮杂胞苷的精确治疗有效量将根据例如受试者的年龄、体重、疾病和/或病症而变化。
[0119]
在特定实施方案中，与异常细胞增殖相关的障碍包括但不限于骨髓增生异常综合征(mds)、急性髓性白血病(aml)、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性髓性白血病(cml)、白血病、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(nhl)和霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤(mm)、肉瘤、黑色素瘤、癌、腺癌、脊索瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、胃癌、头颈癌以及前列腺癌。在特定实施方案中，与异常细胞增殖相关的障碍是淋巴瘤。在特定实施方案中，所述淋巴瘤是血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤。在特定实施方案中，与异常细胞增殖相关的障碍是mds。在特定实施方案中，与异常细胞增殖相关的障碍是aml。
[0120]
本文的特定实施方案提供了通过口服施用本文提供的药物组合物的治疗患有本文提供的疾病或障碍的受试者的方法，其中所述治疗导致患者的改善的存活。在某些实施方案中，与一个或多个标准护理方案相比，测量到改善的存活。本文的特定实施方案提供了通过口服施用本文提供的药物组合物的治疗患有本文提供的疾病或障碍的受试者的方法，其中所述治疗提供了对于治疗所述疾病或障碍的改善的有效性。在特定实施方案中，如由美国食品和药物管理局(fda)推荐的，使用对于癌症临床试验的一个或多个终点测量改善的有效性。例如，fda提供了用于批准癌症药物和生物制剂的关于临床试验终点的工业指南(http://www.fda.gov/cber/gdlns/clintrialend.htm)。fda终点包括但不限于总存活期、基于肿瘤评估的终点如(i)无疾病存活期、(ii)客观反应率、(iii)进展时间和无进展存活期以及(iv)治疗失败时间。涉及症状终点的终点可以包括特定症状终点，如(i)癌症症状进展时间和(ii)综合症状终点。从血液或体液测定的生物标记物也可用于确定疾病的管理。在一些实施方案中，所述改善可以是约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。
[0121]
需要治疗的受试者可以是具有增加的aml风险的患者群体的成员。例如，若干种遗传性遗传障碍和免疫缺陷状态与增加的aml风险有关。这些包括具有导致随机染色体断裂的dna稳定性缺陷的障碍，如布伦氏综合征、范科尼氏贫血、李法美尼家族、共济失调毛细血管扩张和x连锁无丙种球蛋白血症。
[0122]
在某些实施方案中，本文提供的方法包括通过将包含5-氮杂胞苷的药物组合物与一种或多种另外的药剂的组合施用至有需要的受试者来治疗急性早幼粒细胞性白血病(apml)。apml是罕见的aml亚型，并且有时被称为aml m31。这种亚型的特征在于含有15；17染色体易位的早幼粒细胞原始细胞。这种易位导致产生由视黄酸受体和序列pml构成的融合转录物。
[0123]
在一些实施方案中，本文所述的方法用于治疗特定类型的急性髓性白血病。说明性类型的急性髓性白血病包括但不限于急性髓性白血病伴复发性遗传异常、急性髓性白血病伴骨髓增生异常有关的变化、疗法相关的骨髓肿瘤、骨髓肉瘤、与唐氏综合征有关的骨髓增殖、原始浆细胞样树突状细胞肿瘤和/或急性早幼粒细胞性白血病。
[0124]
在一些实施方案中，aml的特征在于由以下突变中的任一种引起：fms相关的酪氨酸激酶3(flt3)、kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(kras)、神经母细胞瘤ras病毒(v-ras)致癌基因同源物(nras)、原癌基因c-kit(kit)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11(ptpn11)、神经纤维瘤蛋白1(nf1)、dna甲基转移酶3a(dnmt3a)、异柠檬酸脱氢酶1(idh1)、异柠檬酸脱氢酶2(idh2)、10/11易位蛋白-2(tet2)、另外的性梳样蛋白1(asxl1)、zeste同源物的增强子2(ezh2)、混合谱系白血病1/组蛋白-赖氨酸n-甲基转移酶2a(mll/kmt2a)、核磷蛋白(npm1)、ccaat增强子结合蛋白α(cebpa)、runt相关转录因子1(runx1)、gata结合因子2(gata2)、肿瘤蛋白p53(tp53)、富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子2(srsf2)、u2小核rna辅助因子1(u2af1)、剪接因子3b亚基1(sf3b1)、锌指(ccch型)、rna结合基序和富含丝氨酸/精氨酸的蛋白2(zrsr2)、rad21黏连蛋白复合组分(rad21)、基质抗原1(stag1)、基质抗原2(stag2)、染色体结构维持蛋白1a(smc1a)以及染色体结构维持蛋白3(smc3)。
[0125]
在一些实施方案中，所述aml的特征在于由flt3-itd突变引起。在一些实施方案中，所述aml对单独用所述至少一种另外的治疗剂治疗具有耐药性。在一些实施方案中，在所述至少一种另外的治疗剂之前施用所述5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，所述aml对用flt3抑制剂治疗有反应。在一些实施方案中，所述aml的特征在于具有mcl-1的过表达。
[0126]
在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷通过下调mcl-1的表达引发癌细胞由所述至少一种另外的治疗剂介导的细胞凋亡。在一些实施方案中，下调mcl-1的表达由胱天蛋白酶依赖性和非依赖性机制介导。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增强mcl-1降解。
[0127]
在某些实施方案中，本文提供的方法包括通过将包含5-氮杂胞苷的药物组合物与一种或多种另外的药剂的组合施用至有需要的受试者来治疗淋巴瘤。淋巴瘤的类型包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病。淋巴瘤的例子包括但不限于弥漫性大b细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、周围t细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤和血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤。
[0128]
在某些实施方案中，本文提供的方法包括通过将包含5-氮杂胞苷的药物组合物与一种或多种另外的药剂的组合施用至有需要的受试者来治疗骨髓增生异常综合征。mds还可以通过使用修订的国际预后评分系统(ipss-r)进行分类，基于死亡风险以及转变为急性髓性白血病(aml)的风险，所述系统将患者分为从非常低风险至非常高风险的5组中的1组。根据修订的国际评分系统(ipss-r)，本公开文本中使用的较高风险mds被定义为高或非常高风险。greenberg,p.l.等人,blood 2012年9月20日；120(12):2454
–
2465。ipss-r的评分系统是基于以下因素：骨髓中的原始细胞(非常早期形式的血细胞)的百分比、细胞中染色体异常的类型和数量、患者血液中红细胞(测量为血红蛋白)的水平、患者血液中的血小板水平以及患者血液中的嗜中性粒细胞(一种白细胞类型)的水平。每个因素被分配一个得分，并且得分的总和用于将mds患者分配至以下五个风险组之一：非常低(风险得分≤1.5)；低风险(风险得分》1.5-3)；中等风险(风险得分》3-4.5)；高风险(风险得分》4.5-6)；以及非常高风险(风险得分》6)。约13％的mds患者被分类为高风险，其平均总存活期为1.6年，而约10％的mds患者被分类为非常高风险，其平均总存活期为0.8年。在一些实施方案中，所述
mds是被分类为如由ipss-r定义的高风险或非常高风险的mds。f.5-氮杂胞苷和另外的治疗剂的给药方案
[0129]
本文的某些实施方案提供了治疗本文公开的疾病或障碍(例如，涉及异常细胞增殖的疾病或障碍)的方法，其中所述方法包括将本文公开的口服配制品(例如像包含5-氮杂胞苷的口服配制品)与一种或多种另外的治疗剂(例如像，癌症治疗剂)共同施用以产生协同治疗作用。在整个说明书中公开了可用于本文公开的方法中的特定的共同施用的治疗剂。在特定实施方案中，将所述另外的治疗剂以治疗有效量的量共同施用。在特定实施方案中，将所述另外的治疗剂以与其共同施用的5-氮杂胞苷剂型分开的剂型共同施用。在特定实施方案中，将所述另外的治疗剂与和其共同施用的5-氮杂胞苷一起以剂型(例如，单个单位剂型)共同施用。在此类情况下，使用共同配制活性药物成分的方法将5-氮杂胞苷(例如，阿扎胞苷)和一种或多种另外的治疗剂以相同的剂型共同配制在一起，所述方法包括本文公开的方法和本领域已知的方法。
[0130]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的人的方法，其中所述方法包括向所述人施用包含5-氮杂胞苷的药物组合物；并且其中所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。
[0131]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有骨髓增生异常综合征的人的方法，其中所述方法包括向所述人施用包含5-氮杂胞苷的药物组合物；并且其中所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。
[0132]
在本文提供的一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自吉瑞替尼、米哚妥林、奎扎替尼、恩西地平、艾伏尼布或维奈托克。
[0133]
在本文提供的一些实施方案中，所述另外的治疗剂是flt3抑制剂。在一个实施方案中，所述flt3抑制剂是吉瑞替尼、米哚妥林或奎扎替尼。
[0134]
在本文提供的一些实施方案中，所述另外的治疗剂是idh2抑制剂。在一个实施方案中，所述idh2抑制剂是恩西地平。
[0135]
在本文提供的一些实施方案中，所述另外的治疗剂是idh1抑制剂。在一个实施方案中，所述idh1抑制剂是艾伏尼布。
[0136]
在本文提供的一些实施方案中，所述另外的治疗剂是bcl2抑制剂。在一个实施方案中，所述bcl2抑制剂是维奈托克。
[0137]
在本文提供的一个实施方案中，将包含5-氮杂胞苷的药物组合物口服施用。
[0138]
在本文提供的一个实施方案中，包含5-氮杂胞苷的药物组合物是胶囊。
[0139]
在本文提供的一个实施方案中，包含5-氮杂胞苷的药物组合物是片剂。
[0140]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂伴随施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂依序施用，其中首先施用所述5-氮杂胞苷。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂共同配制为单个单位剂型。在一些实施方案中，将所述另外的治疗剂肠胃外施用。在一些实施方案中，将所述另外的治疗剂口服施用。
[0141]
在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷口服施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以如下剂量口服施用：约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg或600mg。在一些
实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以约300mg的剂量施用。在一些实施方案中，将5-氮杂胞苷在周期的前七天、十四天或二十一天内口服施用。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷每天一次或两次施用至所述受试者。在一些实施方案中，将所述5-氮杂胞苷以胶囊或片剂的形式施用。在一些实施方案中，所述片剂是非肠溶包衣片剂。
[0142]
在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是吉瑞替尼。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是米哚妥林。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是维奈托克。
[0143]
在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂提供了治疗本文所公开的疾病的协同作用。可以通过使用最高单一药剂(hsa)模型和combenefit包来测量协同(di veroli等人,bioinformatics.2016年9月15日；32(18):2866-8)。具体地，使用以下项确定两种药物之间的协同相互作用：(a)从其ec
50
确定的剂量反应曲线的转变(即效力转变)的展示和/或最大抑制作用的增强；(b)反应面分析(在浓度矩阵上实现两种药物之间的协同，加性或拮抗的可视化)；以及(c)组合指数得分(使用软件应用程序combenefit推导出)。通过经验确定协同指数变得显著的位置的范围，并所述范围是基于数据的方差和ec
50
的效力转变的确认。换言之，剂量反应曲线没有清晰转变的组合指数不会构成协同相互作用。如本文所用，协同作用被定义为ec
50
转变在大约大于4处和/或协同指数大于约20，如通过hsa模型和combenefit pakage所测量。阴性细胞系用作对照以设定相对“阈值”。换言之，来自阴性对照细胞系的ec
50
和最大抑制作用提供基线效力结果，并将药物组合的ec
50
和最大抑制作用的转变与来自阴性对照细胞系的结果进行比较，以确定药物组合是否提供协同作用。
[0144]
在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷通过下调mcl-1的表达引发癌细胞由所述至少一种另外的治疗剂介导的细胞凋亡。在一些实施方案中，下调mcl-1的表达由胱天蛋白酶依赖性和非依赖性机制介导。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增强mcl-1降解。
[0145]
在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷改变细胞代谢。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷导致细胞周期停滞。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷抑制氧化磷酸化。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷增加atf3(转录激活因子3)的表达。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷降低scd(硬脂酰-coa去饱和酶)的表达。
[0146]
在一些实施方案中，(1)口服施用的5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂的治疗作用优于(2)单独的5-氮杂胞苷的治疗作用、(3)单独的所述至少一种另外的治疗剂和/或(4)静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和所述至少一种另外的治疗剂的组合。
[0147]
在一些实施方案中，与单独的5-氮杂胞苷相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增加了中值存活期。在一些实施方案中，与单独的所述5-氮杂胞苷相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床公认的技术所测量。
[0148]
在一些实施方案中，与单独的5-氮杂胞苷相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克增加中值存活期。在一些实施方案中，与单独的5-氮杂胞苷相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克使
中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床公认的技术所测量。
[0149]
在一些实施方案中，与单独的至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增加了中值存活期。在一些实施方案中，与单独的至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床公认的技术所测量。
[0150]
在一些实施方案中，与单独的维奈托克相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克增加中值存活期。在一些实施方案中，与单独的维奈托克相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床公认的技术所测量。
[0151]
在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂增加中值存活期。在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂相比，所述5-氮杂胞苷和至少一种另外的治疗剂使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床上公认的技术所测量。
[0152]
在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和维奈托克相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克增加了中值存活期。在一些实施方案中，与静脉内或皮下施用的5-氮杂胞苷和维奈托克相比，所述5-氮杂胞苷和维奈托克使中值存活期增加约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％，如通过任何临床公认的技术所测量。
[0153]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括：(i)向所述受试者施用5-氮杂胞苷，持续1、2或3天；以及(ii)将所述至少一种另外的治疗剂施用至所述受试者，持续一天或多天。在本文提供的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(i)和(ii)。
[0154]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括：(i)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天；(ii)向所述人施用所述至少一种另外的治疗剂，持续一天或多天；以及(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)。
[0155]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括：(i)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；以及(ii)向所述受试者施用所述至少一种另外的治疗剂，持续一天或多天。在本文提供的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(i)和(ii)。
[0156]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括：(i)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天；(ii)向所述受试者每天并行施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天；以及(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)。
[0157]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括：(i)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(ii)向所述受试者每天并行施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天；以及(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)。
[0158]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括以下连续步骤：(i)向所述受试者施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续7天；(ii)向所述受试者施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1天；(iii)向所述受试者施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续6天；以及(iv)在7天的休药期之后重复步骤(i)至(iii)。
[0159]
在本文提供的一个实施方案中，所述方法包括以下连续步骤：(i)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(ii)向所述受试者每天施用所述至少一种另外的治疗剂，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；(iii)向所述受试者每天施用5-氮杂胞苷，在28天周期中持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天；以及(iv)在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天的休药期之后重复步骤(i)至(iii)。
[0160]
在本文提供的一个实施方案中，5-氮杂胞苷的药物组合物包含约50mg、约75mg、约100mg、约100mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约360mg、约370mg、约400mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约550mg或约600mg的5-氮杂胞苷。
[0161]
在本文提供的一个实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂肠胃外施用。
[0162]
在本文提供的一个实施方案中，将所述至少一种另外的治疗剂口服施用。
[0163]
在本文提供的一个实施方案中，所述受试者是人。
[0164]
通过引用并入：在整个此说明书中引用的所有公开内容(例如，专利、出版物和网页)通过引用以其整体并入。另外，以下公开内容也通过引用以其整体并入本文：(1)skikne等人,leukemia,2008,22,1680-84的2008 asco海报摘要。iii.定义
[0165]
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文提及的所有出版物和专利通过在本文引用以其整体并入本文。
[0166]
除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，不定冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和定冠词“所述”包括复数以及单数指代物。
[0167]
术语“约”或“大约”意指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分地取决于如何测量或确定所述值。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％内。
[0168]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“治疗(treat)”和“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指根除或改善疾病或障碍或与疾病或障碍相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，所述术语是指通过向患有这种疾病或障碍的受试者施用一种或多种预防或治疗剂使所述疾病或障碍的扩散或恶化最小化。在一些实施方案中，所述术语是指在特定
疾病的症状发作后，在有或没有一种或多种另外的活性剂的情况下施用本文提供的化合物或剂型。
[0169]
如本文所用，通过施用特定药物组合物导致的特定障碍的症状的改善是指任何可归因于所述组合物的施用或与之相关的任何减轻，无论是永久性或暂时性、持久的或短暂的。
[0170]
如本文所用，除非另有说明，否则术语化合物的“治疗有效量”和“有效量”意指足以提供疾病或障碍的治疗或管理方面的治疗益处的量，或者足以延迟或最小化一个或多个与所述疾病或障碍相关的症状的量。化合物的“治疗有效量”和“有效量”意指单独或与一种或多种其他药剂组合的治疗剂的量，其在治疗或管理所述疾病或障碍方面提供了治疗益处。术语“治疗有效量”和“有效量”可以包括改善总体疗法的量，减轻或避免疾病或障碍的症状或原因，或增强另一种治疗剂的治疗作用。
[0171]
如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。如本文所用，“赘生性”是指任何形式的失调或未调节的细胞生长(无论是恶性的或良性的)，其导致组织生长异常。因此，“赘生性细胞”包括具有失调或未调节的细胞生长的恶性和良性细胞。
[0172]
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于血液携带(例如，淋巴瘤、白血病)和实体瘤。
[0173]
如本文所用的术语“组合物”、“配制品”和“剂型”旨在包括这样的组合物，其包含一种或多种指定成分(如果指示的话，以指定的量)以及直接或间接地从指定量的一种或多种指定成分的组合产生的任何一种或多种产品。“药学”或“药学上可接受的”意指所述组合物、配制品或剂型中的任何一种或多种稀释剂、一种或多种赋形剂或一种或多种载体与其他一种或多种成分相容，而不是对其接受者有害。除非另有说明，否则术语“组合物”、“配制品”和“剂型”可互换使用。
[0174]
当在本文中关于本文提供的组合物、配制品或剂型使用时，术语“立即释放”意指所述组合物、配制品或剂型不包含这样的组分(例如，包衣)，其用于在口服施用后在空间和/或时间上延迟部分或全部api从所述组合物、配制品或剂型在胃以外释放。在某些实施方案中，立即释放组合物、配制品或剂型是在口服施用后基本上在胃中释放api的立即释放组合物、配制品或剂型。在具体实施方案中，立即释放组合物、配制品或剂型是不延迟释放的立即释放组合物、配制品或剂型。在具体实施方案中，立即释放组合物、配制品或剂型是不包含肠溶包衣的立即释放组合物、配制品或剂型。
[0175]
当在本文中使用时，术语“非肠溶包衣”是指不包含如下包衣的药物组合物、配制品或剂型，所述包衣旨在在胃以外(例如，在肠中)释放一种或多种活性成分。在某些实施方案中，设计非肠溶包衣的组合物、配制品或剂型以基本上在胃中释放一种或多种活性成分。
[0176]
当在本文中关于本文提供的组合物、配制品或剂型使用时，术语“基本上在胃中”意指至少约99％、至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％或至少约10％的5-氮杂胞苷在胃中释放。如本文所用的术语“在胃中释放”及相关术语是指这样的过程，5-氮杂胞苷通过所述过程能够被胃内层的细胞吸收或跨越所述细胞进行转运，然后被身体利用。
[0177]
术语“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等。在特定实施方案中，所述受试者是人。实施例实施例1材料与方法：细胞、培养条件和试剂
[0178]
aml细胞系购自美国菌种保藏中心(atcc)或者从celgene主细胞库获得。将细胞在补充有10％或20％胎牛血清和10mm l-谷氨酰胺的rpmi 1640培养基中在37℃下具有5％co2的加湿气氛中培养。通过kyinno(中国北京)产生baf3-flt3wt、baf3-flt3itd、baf3-flt3d538y。使细胞在具有10％fbs与0.5μg/ml嘌呤霉素的rpmi中生长。将指数生长的细胞用于所有体外研究。从celgene化合物收集库获得5-氮杂胞苷(在dmso中的10mm)。吉瑞替尼(asp2215)、米哚妥林(pkc412)、维奈托克(abt-199)、奎扎替尼(ac220)即泛胱天蛋白酶抑制剂z-vad-fmk购自selleckchem(得克萨斯州休斯顿)，并在dmso中重建为10mm原液。细胞活力测定
[0179]
将细胞以2000个细胞/孔铺板于384孔板(coming目录号3764)中的50μl培养基中。根据制造商的说明书，使用cell titer-glow(promega，威斯康星州麦迪逊)测量计算为dmso对照孔％的相对细胞数。在使用envvsion读板器(perkinelmer)在指示的时间处量化发光值。将细胞每天用5-氮杂胞苷处理，持续三天，和/或用米哚妥林、吉瑞替尼或维奈托克处理一次。将根据对5-氮杂胞苷的敏感性滴定的六种5-氮杂胞苷剂量与评价的第二种药物的六种剂量组合，得到54种可能的组合，对于每个实验一式二份地评价每种组合。prism 7.03版(prism software corporation)用于计算ec
50
值。组合作用的数据分析
[0180]
将细胞存活率作为药物浓度的函数绘图，并用于使用graphpad prism软件(加利福尼亚州圣地亚哥)计算ec
50
值。协同指数由最高单一药剂模型和combenefit软件(combenefit：用于药物组合的分析和可视化的交互式平台(di veroli等人,bioinformatics.2016年9月15日；32(18):2866-8))计算。蛋白质印迹
[0181]
在用5-氮杂胞苷和/或抑制剂以指示剂量/次数处理后，使用含有1mm pmsf的裂解缓冲液(cell signaling,#9803,cell signaling technologies，马萨诸塞州丹佛市)收获蛋白质。使用二喹啉甲酸(bca)试剂盒(piece/thermo fisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆)量化裂解物。在4％-12％sds-page凝胶上分解20至30μg蛋白质，将其转移到pvdf膜(通过湿转移80v/90分钟)，并用oddysey tbs阻断缓冲液封闭1小时，然后使用制造商推荐的稀释液在4℃下用适当的一抗进行探测过夜。将膜洗涤三次，总共30分钟，然后在室温下在黑暗中与二抗一起孵育1小时。在另外三次洗涤后，使用odyssey红外成像系统和伴侣软件(li-cor biosciences，美国内布拉斯加州林肯)扫描免疫印迹膜，并根据制造商的说明书来量化带强度。将在处理的样品中目的蛋白质与加载对照的比率针对未处理细胞中的相应比率进行归一化。用于免疫印迹的抗体从以下来源购买：来自santa cruz biotechnology(美国得克萨斯州达拉斯)的bcl-2(sc-7382)、mcl1-(sc-819)，来自cell signaling technology的
bim(2819)、胱天蛋白酶-3(9664)；来自sigma-aldrich的β-肌动蛋白(a2228)；来自abcam的dnmti(abl88453)；购自li-cor biosciences(内布拉斯加州林肯)的irdye 680山羊抗兔irdye 800山羊抗小鼠二抗(#925-68073和#925-32212)。rnaseq分析
[0182]
将mv4-11细胞用pbs或1μm的5-氮杂胞苷处理24小时或每天用1μm的5-氮杂胞苷一式三份地处理48小时。处理后，回收细胞，将其在pbs中洗涤一次，并作为细胞沉淀急速冷冻。将细胞沉淀送至canopy biosciences，以用于rna提取和文库制备和测序。根据制造商的说明书，使用qiagen rneasy mini kit提取rna。改进的方案用于保存mirna种类。使用200ng总rna和nebnext ultra ii定向文库制备试剂盒制备总rna seq文库。使用基于rna酶-h的方法(new england biolabs，马萨诸塞州伊普斯威奇)进行rrna耗尽。使用标准方法通过rnaseq量化其他细胞系中的mcl1rna水平。
[0183]
使用illumina hiseq对文库进行多路化和测序。然后将所有基因计数输入r/bioconductor package edger，并且计算tmm归一化大小因子以针对文库大小的差异调整样品。大于每一百万一个计数的核糖体基因和在最小的群体大小减一样品(group size minus one sample)中不表达的基因不进行进一步分析。然后进行差异表达分析以分析条件之间的差异，并仅过滤benjamini-hochberg错误发现率调整后p值小于或等于0.05的那些基因的结果。按以下方式检测已知基因本体(go)项和kegg途径中的全局扰动：使用r/bioconductor package gage以测试limma在每个项中报告的报告log 2变化倍数相对于相应项之外发现的所有基因的背景log 2变化倍数而言的表达变化。r/bioconductor package热图和pathview用于显示每个go项或kegg途径(分别)的样品组中的热图或注释的kegg图，其中benjamini-hochberg错误发现率调整后的p值小于或等于0.05。为了找到差异表达的基因，将原始计数用r/bioconductor package deseq2进行方差稳定。
[0184]
为了验证atf3和scd表达，将mv4-11细胞用pbs或0.3μm 5-氮杂胞苷、1μm5-氮杂胞苷或3μm 5-氮杂胞苷处理24小时和48小时。此时，回收细胞，并根据制造商的说明书，使用qiagen rneasy试剂盒提取rna。使用superscript vilo cdna合成试剂盒进行逆转录。经过验证的taqman探针和taqman fast advanced master mix与viia 7 real-time pcr system(invitrogen/thermofisher scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)一起用于定量atf3、scd和18s mrna的转录物。干扰rna基因沉默
[0185]
根据制造商的建议的方案，使用lipofectamine 2000将atf3、scd或对照silencer select sirna(16nm sirna，invitrogen)转染至mv4-11细胞中。未处理的细胞在没有sirna的情况下进行模拟转染。然后用不同浓度的5-氮杂胞苷每天处理细胞，持续3天。在第4天，用维奈托克处理细胞，然后根据制造商的方案使用cell titer glo在第7天进行细胞活力的检测。使用combenefit计算协同，并使用最高单一药剂分析进行比较。
[0186]
在转染后72小时内对sirna转染的细胞(未进行5-氮杂胞苷或维奈托克处理)进行基因敲低的确认。使用qiagen rneasy试剂盒提取rna，并使用superscript vilo cdna合成试剂盒进行逆转录。经过验证的taqman探针和taqman fast advanced master mix与viia 7 real-time pcr system(invitrogen/thermofisher scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)一起用于定量atf3、scd和18s mrna的转录物。
在leed 5-氮杂胞苷和held 5-氮杂胞苷给药的情况下的5-氮杂胞苷组合的体内分析
[0187]
如在整个实施例中所使用的，leed是指将5-氮杂胞苷在延长持续时间内以低暴露(leed)递送：1mg/kg，每天一次持续十五天(qdx15)。为了递送相同的5-氮杂胞苷累积剂量，将5-氮杂胞苷在有限持续时间内以高暴露(held)施用：3mg/kg，每天一次持续五天(qdx5)。leed模型是口服施用aza，而held模型是静脉内或皮下施用aza。
[0188]
在查尔斯河实验室(北卡罗来纳州morissville)用八周大且在研究第1天体重(bw)范围为17.6至28.4克的雌性nod/scid小鼠(nod.cb17-prkdcscid/ncrcrl，查尔斯河)进行实验。给动物随意饲喂水(反渗透，1ppm cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的nih 31改良和辐照的lab将小鼠安置在20℃-22℃(68
°
f-72
°
f)和40％-60％湿度下进行12小时光照循环的静态微型隔离器中经辐照的enrich-o’cobs
tm
实验室动物床上。
[0189]
celgene提供了leed 5-氮杂胞苷(批号sool10)、held 5-氮杂胞苷(批号sool10和sool13)、米哚妥林(medchemexpress，新泽西州蒙茅斯章克申)、吉瑞替尼(sigma aldrich，密苏里州圣路易)和维奈托克(abt-199，sigma aldrich，密苏里州圣路易)。本研究中使用的媒介物是po(口服)给药的在去离子(di)水中的6％44/14(gattefoss
é
，新泽西州帕拉默斯)(这是一种蜡质固体，需要水浴加热至44℃以进行熔化)和ip(腹膜内)给药的磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在给药的每一天中，将适量的leed或held 5-氮杂胞苷重悬于pbs中，以分别得到0.1mg/ml或0.3mg/ml的给药悬浮液。在给药的每一天中，将适量的米哚妥林溶解在6％gelucire 44/14中，以得到10mg/ml的给药溶液。在给药的每一天中，将适量的吉瑞替尼溶解在di水中的0.5％甲基纤维素中，以得到0.4mg/ml的给药溶液。每周，将适量的维奈托克溶解在10％乙醇:30％peg400:60％phosal 50丙二醇中，以得到10mg/ml的给药溶液。在对数阶段生长期间收获用于接种的细胞，并以5x107个细胞/ml的浓度重悬于pbs中。测试小鼠通过尾静脉注射每次接受5x106个molm-13细胞或107个mv4-11细胞(0.2ml细胞悬浮液)。肿瘤细胞接种后三天开始给药，将其指定为研究第1天。nod/scid小鼠(n＝9-12只/组)根据体重随机化并进行给药。腹膜内(ip)施用磷酸盐缓冲盐水、leed 5-氮杂胞苷和held 5-氮杂胞苷，而po施用米哚妥林、吉瑞替尼和维奈托克。媒介物均为ip和po两种施用方式。用于所有治疗的给药体积都是10ml/kg，根据每个单独动物的重量而改变。
[0190]
单独地监测动物由于白血病的进展所致的垂死终点。由于肿瘤进展所致的完全后肢瘫痪、严重的眼球突出或垂死状态被认为足以实施安乐死。垂死的动物被定义为无法进食食物和水的病态动物。这些死亡被分类为存活研究的死亡。记录死于其疾病或由于广泛的肿瘤进展而被实施安乐死的每只小鼠以天为单位的到达终点的时间(tte)。在研究结束时未到达终点的动物被实施安乐死，并且被分配等于最后一天的tte值。被分类为死于治疗相关(tr)原因的动物被分配等于死亡日的tte值。被分类为死于非治疗相关(ntr)原因或用于在终点之前采样的动物不进行tte计算和所有进一步分析。为每个组计算中值tte值。经处理的小鼠的中值tte表示为对照小鼠的中值tte的百分比(t/c％)，并且寿命增加(ils)计算为：ils＝t/c％-100％，其中t＝经处理的中值tte，c＝对照中值tte。因此，如果t＝c，则ils＝0％。
[0191]
在第1-5天每天将动物称重，然后每周两次，直到研究完成。频繁观察小鼠的任何
不利的治疗相关(tr)副作用的明显迹象，并且在观察到时记录临床迹象。根据方案监测单独体重减轻，并且任何超过可接受的体重减轻限制的动物都被实施安乐死。按照方案也监测组平均体重减轻。在任何超过可接受的平均体重减轻的限制的组中停止给药。如果恢复平均体重，则可以在该组中恢复给药，但以较低的剂量或较不频繁的给药时间表给药。最大耐受剂量的可接受的毒性被定义为在研究期间小于20％的组平均体重减轻并且在十只处理的动物中不超过一只tr死亡。如果归因于临床体征和/或尸检所证实的治疗副作用，则死亡被归类为tr，或者如果由于给药期间或在最后一次剂量的14天内由于未知原因，也可以被归类为tr。如果没有证据表明死亡与治疗副作用或肿瘤进展有关，则死亡被归类为ntr。可以基于死亡原因进一步表征非治疗相关的死亡。如果由于事故或人为错误导致死亡则可能将死亡归类为ntra。如果死亡的原因未知，并且没有可用的证据表明死亡与治疗副作用、转移、事故或人为错误有关，则可以将死亡归类为ntru，但由于这些病因的死亡则不能被排除。基于tte值，通过kaplan-meier方法分析存活率。对数秩(mantel-cox)和gehan-breslow-wilcoxon检验确定了基于tte值的两组总体存活经验(存活曲线)之间的差异的显著性。结果5-氮杂胞苷与米哚妥林、吉瑞替尼或维奈托克的组合
[0192]
图1-图7提供了关于实验的各种信息和数据。例如，图1是条形图，其表示5-氮杂胞苷与吉瑞替尼的组合以及5-氮杂胞苷与米哚妥林的组合的最大ec
50
倍数转变；两种情况均采用细胞系mv4-11和molm-13。显示了来自三种不同给药计划表的结果：(i)首先施用5-氮杂胞苷(黑色条)；(ii)并行施用所述两种药剂(浅灰色条)；以及(iii)其次施用5-氮杂胞苷(中间灰色条)。图2代表以下三种不同的给药时间表：(i)在flt3抑制剂(flt3i)之前以一定间隔首先施用5-氮杂胞苷(aza)；(ii)并行施用两种药剂(5-氮杂胞苷和flt3i)；以及(iii)在施用flt3i之后其次以一定间隔施用5-氮杂胞苷；其中flt3i可以是任何合适的flt3抑制剂，如米哚妥林或吉瑞替尼。图3a-图3d表示在细胞系mv4-11(图3a)和molm-13(图3c)的情况下5-氮杂胞苷与维奈托克的组合的最大ec
50
倍数转变。显示了三种不同给药计划表：(i)首先施用5-氮杂胞苷(黑色条)；(ii)并行施用两种药剂(浅灰色条)；以及(iii)其次施用5-氮杂胞苷(中间灰色条)。示出了在细胞系mv4-11(图3b)和molm-13(图3d)的情况下对于三种不同给药时间表，与维奈托克的组合施用的5-氮杂胞苷的协同指数。
[0193]
图4a-图4c表示反应面分析，其显示了当首先施用5-氮杂胞苷时在mv4-11细胞中5-氮杂胞苷与维奈托克的协同(图4a)，在同时施用的情况下相对较低的协同作用(图4b)以及首先施用维奈托克的情况下的协同作用(图4c)。反应面方法(rsm)探讨了若干个解释变量与一个或多个反应变量之间的统计关系。rsm使用一系列设计的实验来获得最佳反应，目前情况下所述最佳反应是5-氮杂胞苷与维奈托克的协同作用。
[0194]
图5描绘了蛋白质印迹，其显示(a)5-氮杂胞苷和米哚妥林(“氮杂胞苷 0.3μm米哚妥林”)以及(b)5-氮杂胞苷和吉瑞替尼(“氮杂胞苷 0.3μm吉瑞替尼”)增强mv4-11细胞系中的mcl-1降解。另外，图6描绘了蛋白质印迹，其显示5-氮杂胞苷和维奈托克处理降低flt3itd mv4-11细胞中的mcl-1水平。
[0195]
最后，图7a-图7c用存活百分比(y轴)与第0天至第70天(x轴)的图描绘了在molm-13异种移植物模型中的5-氮杂胞苷组合的体内评估。图7a-图7c中所示的实验的给药如下：
(i)5-氮杂胞苷(低暴露，延长持续时间，leed)：1mg/kg腹膜间(ip)，每天一次持续五天，三倍(qdx 5x3)；(ii)5-氮杂胞苷(高暴露，有限持续时间，held)：3mg/kg腹膜间(ip)，每天一次持续五天(qdx5)；(iii)米哚妥林(100mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))；(iv)吉瑞替尼(4mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))；以及(v)维奈托克(100mg/kg口服(po)，每天一次持续二十一天(qdx21))。p值(相对于最佳的单一药剂)*p《0.05；**p《0.001；***p《0.0001。图7a显示了5-氮杂胞苷和米哚妥林的组合的结果，图7b显示了与维奈托克组合的5-氮杂胞苷的结果，并且图7c显示了5-氮杂胞苷和吉瑞替尼的组合的结果。对于图7a，测试的组合物是媒介物、5-氮杂胞苷(低暴露，延长持续时间，leed，时间表为1mg/kg 5-氮杂胞苷每天一次，持续15天(qdx15))、5-氮杂胞苷(高暴露，有限持续时间，held，时间表为3mg/kg 5-氮杂胞苷每天一次，持续五天(qdx5))、米哚妥林(100/kg，每天一次，持续二十八天(qdx28))、leed 米哚妥林以及held 米哚妥林。对于图7b，测试的组合物是媒介物、5-氮杂胞苷(leed)、5-氮杂胞苷(held)、维奈托克、leed 维奈托克和held 维奈托克。对于图7c，测试的组合物是媒介物、5-氮杂胞苷(leed)、5-氮杂胞苷(held)、吉瑞替尼、leed 吉瑞替尼以及held 吉瑞替尼。与单独的媒介物相比，leed和held 5-氮杂胞苷给药二者均导致统计上显著的存活率增加(leed相比于媒介物，通过gehan-beslow-wilcoxon检验，p＝0.003；held相比于媒介物，通过gehan-beslow-wilcoxon检验，p＝0.003)。与单独的媒介物相比，单独或与leed或held5-氮杂胞苷组合的米哚妥林显著地增加存活率(米哚妥林相比于媒介物，p＝0.027；leed 米哚妥林相比于媒介物，p＝0.012；held 米哚妥林相比于媒介物，p＝0.003)。分别与leed或held 5-氮杂胞苷相比，与米哚妥林组合的held 5-氮杂胞苷给药显著地增加存活率(leed 米哚妥林相比于leed，p＝0.028；held 米哚妥林相比于held，p＝0.039)。在与米哚妥林组合的leed或held与单独的米哚妥林处理之间未观察到存活率的显著变化。与媒介物或单一药剂相比，在与米哚妥林组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下中值存活增加率(leed 米哚妥林＝45天，held 米哚妥林＝43天，媒介物＝19天，米哚妥林＝34天，leed＝36天，held＝32天)(图7a)。与单独的媒介物相比，单独或与leed或held 5-氮杂胞苷组合的吉瑞替尼显著地增加存活率(吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003；leed 吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003；held 吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003)。与单独的leed或held 5-氮杂胞苷相比，与吉瑞替尼组合的低暴露、延长持续时间或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 吉瑞替尼相比于leed，p＝0.019；leed 吉瑞替尼相比于held，p＝0.004；held 吉瑞替尼相比于leed，p＝0.008；held 吉瑞替尼相比于held，p＝0.003)。另外，与单独的吉瑞替尼相比，与吉瑞替尼组合的leed或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 吉瑞替尼相比于吉瑞替尼，p《0.001；held 吉瑞替尼相比于吉瑞替尼，p《0.001)。与单独的媒介物相比，单独或与leed或held 5-氮杂胞苷组合的维奈托克显著地增加存活率(维奈托克相比于媒介物，p＝0.003；leed 维奈托克相比于媒介物，p＝0.002；held 维奈托克相比于媒介物，p＝0.004)(图7b)。与单独的leed或held5-氮杂胞苷相比，与维奈托克组合的低暴露、延长持续时间或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 维奈托克相比于leed，p＝0.001；leed 维奈托克相比于held，p《0.001；held 维奈托克相比于leed，p＝《0.001；held 维奈托克相比于held，p＝《0.001)。另外，与单独的维奈托克相比，与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 维奈托克相比于维奈托克，p《0.001；held 维奈托克相比于维奈托克，p《0.001)。
与维奈托克组合的低暴露、延长持续时间和与维奈托克组合的held并非显著不同。与媒介物或单一药剂相比，在与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 维奈托克＝46天，held 维奈托克＝45天，媒介物＝19天，维奈托克＝29天，leed＝36天，held＝32天)。与媒介物或单一药剂相比，在与吉瑞替尼组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 吉瑞替尼＝45天，held 吉瑞替尼＝43天，媒介物＝19天，吉瑞替尼＝34天，leed＝36天，held＝32天)(图7c)。
[0196]
图8a、图8b和图8c显示了22aml细胞系对作为单一药剂的5-氮杂胞苷(aza)和维奈托克(分别为图8a和图8b)的敏感性，以及对5-氮杂胞苷和嘌呤醛糖的组合的敏感性(图8c)。图8a显示了5-氮杂胞苷在大多数细胞系中显示出细胞毒性作用，其中ec
50
值范围为0.15μm至2.5μm。相比之下，图8b显示了11/22个所检查的aml细胞系对维奈托克免肝(ec
50
《10μm)。图8c显示了使用表面反应分析和最高单一药剂模型所得的5-氮杂胞苷与维奈托克的组合活性，其中10/22个细胞系显示出高于任意阈值20的协同活性。值得注意的是，对维奈托克具有耐药性的三种细胞系(kasumi-1、kasumi-2和nomo-1)显示出在与5-氮杂胞苷共同处理的情况下对维奈托克耐药性的逆转。携带flt3-itd(aml中的复发突变)的细胞系也显示出5-氮杂胞苷和维奈托克的协同活性。
[0197]
这些结果令人惊讶地证明，5-氮杂胞苷与维奈托克的组合在aml细胞系中，特别是在对维奈托克具有耐药性的aml细胞系中提供了协同作用。结果支持5-氮杂胞苷与维奈托克的组合对于治疗aml患者是安全且有效的。
[0198]
还研究了5-氮杂胞苷和维奈托克施用的具体时间表是否对由5-氮杂胞苷和维奈托克提供的协同作用具有影响。图9a-图9f显示了在开始用5-氮杂胞苷和维奈托克处理之后七天的mv4-11细胞(图9a-图9c)和molm-13细胞(图9d-图9f)的细胞存活。测试了以下时间表：在第1、2和3天施用5-氮杂胞苷，接着在第4天施用维奈托克(首先施用5-氮杂胞苷(aza))(图9a和图9d)；在第1天共同施用5-氮杂胞苷和维奈托克，接着在第2天和第3天施用5-氮杂胞苷(同时)(图9b和图9e)；以及在第1天施用维奈托克，接着在第2、3和4天施用5-氮杂胞苷(首先施用维奈托克)(图9c和图9f)。结果表明，对于两种细胞系，首先施用5-氮杂胞苷的方案提供了最大的协同作用。这些结果表明，5-氮杂胞苷可引发维奈托克对aml细胞的活性。
[0199]
维奈托克耐药性的一个因素是细胞凋亡调节物mcl-1的表达，其在flt3突变的aml中上调，并在5-氮杂胞苷处理后下调。为了检查mcl-1水平是否与5-氮杂胞苷和维奈托克的组合的协同作用的程度相关，检查了一组表达野生型flt3、flt3-itd或flt3(d835y)突变的工程化baf3细胞系。工程化baf3细胞系增殖也与il-3增殖无关。图10a显示了这些工程化baf3细胞系对维奈托克具有耐药性(ec
50
＞1μm)，但对flt3抑制剂(如吉瑞替尼、米哚妥林和奎扎替尼)敏感。示于图10a中的数据也示于下表1中。表1表达不同flt3的baf3细胞(ec50，nm) baf-flt3(wt)baf-flt3-itdbaf-flt3(d835y)aza189598456吉瑞替尼41.81.8米哚妥林235.55.4
奎扎替尼30.0089.5维奈托克＞10000＞100004332
[0200]
图10b示出在所有细胞系中都检测到mcl-1，其中在flt-itd突变细胞系中观察到最高表达水平，其次是flt3(d835y)。5-氮杂胞苷与维奈托克的组合显示出协同作用，其中在表达最低水平mcl-1的flt3(野生型)中观察到的协同指数最高，其次是flt3(d835y)(中间mcl-1水平)和flt3-itd(最高mcl-1)(图10c)。这些结果表明mcl-1表达可能是5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用的决定因素。
[0201]
为了进一步探索mcl-1与5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用之间的关系，进一步在一组20种aml细胞系中探索了mcl1 rna水平与5-氮杂胞苷-维奈托克协同指数之间的关系。图11显示了在一组20种aml细胞系中与协同指数直接相关的mcl1rna水平(r2＝-0.5607，p＝0.0101)。这些结果显示，mcl-1可能是aza引发维奈托克诱导的细胞凋亡的关键调节物，特别是5-氮杂胞苷可以将mcl-1降低至某个阈值之下，以允许维奈托克介导的细胞凋亡。
[0202]
接下来，探索了以下四种不同aml细胞系中5-氮杂胞苷介导的mcl-1降解的程度：kg1α(图12a)、mv4-11(图12b)、thp-1(图12c)和oci-aml-2(图12d)。结果显示出在kg1α(图12e)和mv4-11(图12f)细胞系的情况下5-氮杂胞苷-维奈托克协同活性(协同指数(si)分别为70和35.5)以及在thp-1(图12g)和oci-aml-2(图12h)细胞系的情况下很少或没有协同活性(si分别为20.2和10.8)。对于kg1α(图12a)和mv4-11(图12b)细胞系，其中5-氮杂胞苷-维奈托克具有最大的协同作用(图12e和图12f)，5-氮杂胞苷导致mcl-1降解最快，其在处理后6小时开始。相比之下，对于thp-1(图12c)，其中5-氮杂胞苷-维奈托克仅提供较小的协同活性，显示出5-氮杂胞苷介导的mcl-1降解较晚，在16小时处开始且到24小时不完全降解(图12g)。对于oci-aml2(图12d)，其中5-氮杂胞苷-维奈托克具有最低的协同作用(图12h)，5-氮杂胞苷处理未导致mcl-1的任何降解。这些结果支持这样的假设，即5-氮杂胞苷通过降低mcl-1水平来将细胞准备好以用于维奈托克介导的细胞凋亡。
[0203]
5-氮杂胞苷下调mcl-1的一种可能机制是通过诱导胱天蛋白酶激活。胱天蛋白酶激活可以通过在蛋白质印迹中评价胱天蛋白酶3的降解来测定(图13a)。为了查明这种作用是否依赖于胱天蛋白酶，用泛胱天蛋白酶抑制剂z-vad-fmk处理细胞，并测量5-氮杂胞苷对mcl-1的降解程度(图13b)。特别地，图13b显示了通过5-氮杂胞苷导致的mcl-1降解的条形图，其中将细胞用20μm z-vad-fmk处理1小时，然后5-氮杂胞苷处理另外16小时。胱天蛋白酶抑制在mv4-11细胞中部分消除通过5-氮杂胞苷导致的mcl-1降解，这表明了其他不依赖于胱天蛋白酶的mcl-1降解机制。发现z-vad-fmk部分地消除了5-氮杂胞苷降解mcl-1的能力，表明该过程是由胱天蛋白酶依赖性和独立机制介导的。
[0204]
为了进一步了解5-氮杂胞苷如何引发维奈托克用于急性细胞凋亡，对用pbs(媒介物)、1μm aza处理24小时(图14a)或1μm aza处理48小时(图14b)的mv4-11细胞进行rnaseq。表2是图14a中rnaseq数据的途径分析，并示出5-氮杂胞苷处理后的分析，这是基于kegg途径对5-氮杂胞苷显著诱导或抑制的基因进行的分类。表2在24h处显著kegg途径(在48h处无显著性)
[0205]
处理48小时后，在5-氮杂胞苷调节的kegg途径中未观察到显著差异。然而，在5-氮杂胞苷处理24小时后差异调节的前几个kegg途径是“核糖体”、“氧化磷酸化”、“代谢途径”和“细胞周期”。这些结果支持了这样的假设，即5-氮杂胞苷在改变细胞代谢、引起细胞周期停滞、抑制氧化磷酸化方面发挥作用，这于先前在用5-氮杂胞苷 维奈托克组合治疗的患者中观察到。
[0206]
在24小时(图14a)和48小时(图14b)处显著修饰的基因的火山图显示了在24小时处5-氮杂胞苷诱导的133个差异表达的基因和在48小时处226个差异表达的基因。对5-氮杂胞苷诱导的差异表达的基因进一步分析后，鉴定出先前已显示出调节mcl1表达的两个基因：转录激活因子3(atf3)和硬脂酰-coa去饱和酶(scd)。atf3是一种应激反应转录因子，显示其可调节mcl-1以及免疫和代谢基因。在5-氮杂胞苷处理后48小时atf3表达增加两倍。在另一方面，5-氮杂胞苷处理后48小时，脂质代谢和mcl1的调节物scd的表达降低2.5倍在使用实时pcr的单独实验中对atf3(图14c)和scd(图14d)表达的改变进行了验证。atf3表达以时间和浓度依赖性方式增加，因为0.3μm 5-氮杂胞苷处理不足以在24或48小时诱导atf3表达(图14c)。类似地，当用3μm 5-氮杂胞苷处理时scd表达在24小时内迅速降低，但其在此时间点不受低浓度的5-氮杂胞苷的影响(图14d)。
[0207]
鉴于它们与调节mcl1表达的联系，假设atf3和/或scd可促成5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用。为了进一步探索这一点，在mv4-11细胞中利用sirna敲低这些基因来评估它们的协同作用。mv4-11细胞未进行转染或用atf3、scd或对照(加扰)sirna转染。作为对照，将
细胞用sirna转染并在转染后72小时收集rna并进行qpcr。(图15a)这证实当将细胞分别用atf3或scd sirna转染时，sirna敲低降低但没有完全消除atf3或scd的mrna表达。此外，在用加扰sirna处理的细胞中，观察到atf3(图15b)或scd(图15c)表达没有变化。转染后，在第1-3天每天用多种浓度的5-氮杂胞苷处理细胞。在第4天，用维奈托克对细胞给药，接着在处理开始后7使用进行细胞活力测试。使用combenefit和最高单一药剂分析来计算5-氮杂胞苷-维奈托克协同(图15d-图15g)。在未转染的细胞中证实了5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用(协同指数＝43)(图15d)，并且所述协同不受转染本身影响，因为转染乱序sirna的细胞(图15e)具有协同指数46。当atf3被敲低时(图15f)，5-氮杂胞苷-维奈托克具有降低的协同作用(协同指数＝19)。另一方面，当scd(图15g)被敲低时，5-氮杂胞苷-维奈托克具有增加的协同(协同指数＝60)。该数据表明，5-氮杂胞苷诱导的atf3增加和scd减少在5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用中起至少部分的作用。
[0208]
接下来在与注射用5-氮杂胞苷(held)或口服5-氮杂胞苷(leed)相对应的剂量和时间表下，评价5-氮杂胞苷和维奈托克在体内是否具有协同活性。两种示出5-氮杂胞苷-维奈托克协同作用(图8c)的细胞系mv4-11(图16a-图16c)和molm-13(图16d-图16f)用于在免疫缺陷动物中产生播散性aml异种移植小鼠。体外维奈托克使两种细胞系对维奈托克敏化(图16a和图16d)并与5-氮杂胞苷起协同作用(图16b和图16e)。为了对口服5-氮杂胞苷(leed)方案建模，将小鼠用1mg/kg 5-氮杂胞苷处理15天(低暴露，延长持续时间)。可替代地，为了使用相同的累积剂量但用可注射的5-氮杂胞苷(held)方案，将小鼠用3mg/ml 5-氮杂胞苷处理5天(高暴露，有限持续时间)。
[0209]
对于mv4-11植入，对雌性ncg小鼠通过尾静脉注射0.2ml细胞悬浮液中的1x107个细胞。第1天被指定为植入后十四天。在第1天，根据体重将小鼠分到处理组中，并按如下方式开始给药：用媒介物、高剂量5-氮杂胞苷(held，3mg/kg，每日一次，持续五天(qdx5))、低剂量5-氮杂胞苷(leed，1mg/kg，每日一次，持续五天，三次(qdx5x3))、维奈托克(100mg/kg，每天一次，持续二十一天(qdx21))、held 维奈托克、或leed 维奈托克处理小鼠。在初始处理后，监测小鼠的体重减轻和垂死状态长达56天，以确定小鼠何时死于肿瘤负荷。与单独的媒介物相比，单独的或者与leed或held 5-氮杂胞苷组合的维奈托克显著增加存活率(维奈托克相比于媒介物，p＝0.0493；leed 维奈托克相比于媒介物，p＝0.0123；held 维奈托克相比于媒介物，p＝0.04)。与单独的5-氮杂胞苷相比，与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷显著增加存活率(leed 维奈托克相比于leed，p＝0.001；held 维奈托克相比于held，p＝0.0004)。然而，只有leed 5-氮杂胞苷显著优于单独的维奈托克(leed 维奈托克相比维奈托克，p＝0.0378)。另外，与单一药剂相比，与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷确实增加了中值存活期(leed 维奈托克＝38，held 维奈托克＝37，媒介物＝29.5，held＝35，leed＝35，维奈托克＝35.5)。(图16c)
[0210]
用第二种flt3-itd细胞系molm-13重复这些实验。简而言之，将5x106个molm-13细胞注射到每组12只nod/sci小鼠中。肿瘤细胞接种后三天，将小鼠用与mv4-11细胞相同的给药方案处理。在初始处理后，监测小鼠的体重减轻和垂死状态长达70天，以确定小鼠何时死于疾病负荷。与单独的媒介物相比，单独的和与leed或held 5-氮杂胞苷组合的维奈托克显著增加存活率(维奈托克相比于媒介物，p＝0.003；leed 维奈托克相比于媒介物，p＝0.002；held 维奈托克相比于媒介物，p＝0.004)。与单独的leed或held 5-氮杂胞苷相比，
与维奈托克组合的低暴露、延长持续时间或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 维奈托克相比于leed，p＝0.001；leed 维奈托克相比于held，p《0.001；held 维奈托克相比于leed，p＝《0.001；held 维奈托克相比于held，p＝《0.001)。此外，与单独的维奈托克相比，与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 维奈托克相比于维奈托克，p《0.001；held 维奈托克相比于维奈托克，p《0.001)。与媒介物或单一药剂相比，在与维奈托克组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 维奈托克＝46天，held 维奈托克＝45天，媒介物＝19天，维奈托克＝29天，leed＝36天，held＝32天)。(图16f)总之，这些结果表明，具有flt3-itd突变的患者可能受益于5-氮杂胞苷 维奈托克组合疗法。5-氮杂胞苷与flt-3抑制剂的组合
[0211]
flt3突变发生在约30％的aml患者中，并且与预后不良相关。广效flt-3抑制剂米哚妥林和选择性flt3抑制剂吉瑞替尼已被批准用于治疗aml。为了研究5-氮杂胞苷和flt3抑制剂的共同治疗是否在aml细胞中具有协同效应，用5-氮杂胞苷 米哚妥林或5-氮杂胞苷 吉瑞替尼处理两种flt3-itd细胞系，即mv4-11和molm-13细胞。将细胞在第1-3天用5-氮杂胞苷的每日剂量处理，然后在第4天用flt-3抑制剂(米哚妥林或吉瑞替尼)处理。在第7天收集细胞，并通过celltiter-评估细胞活力。米哚妥林使mv4-11对5-氮杂胞苷敏化(图17a)，并显示出与5-氮杂胞苷的协同活性(图17b)。在用5-氮杂胞苷和吉瑞替尼(图17c和图17d)处理的mv4-11细胞中以及在用5-氮杂胞苷和米哚妥林(图17e和图17f)或吉瑞替尼(图17g和图17h)处理的molm-13细胞中观察到类似的作用。
[0212]
接下来检查了flt3抑制剂与5-氮杂胞苷之间的协同活性，所述5-氮杂胞苷是使用类似于注射(高暴露有限持续时间或held方案)或口服(低暴露延长持续时间，leed)的剂量和时间表施用的。使用基于molm-13和mv4-11细胞系的两种播散性aml异种移植模型。使用held方案(每日3mg/kg，持续5天)或leed(1mg/kg，每日一次，持续十五天(qdx15))用5-氮杂胞苷处理小鼠。作为单一药剂，每日以100mg/kg施用flt3抑制剂米哚妥林持续21天以及以4mg/kg施用吉瑞替尼(qdx21)，或与held或leed 5-氮杂胞苷方案一起施用。在molm-13异种移植模型中，与单独的媒介物相比，单独的以及与leed或held 5-氮杂胞苷组合的米哚妥林显著增加存活率(米哚妥林相比媒介物，p＝0.027；leed 米哚妥林相比媒介物，p＝0.012；held 米哚妥林相比媒介物，p＝0.003)(图17i)。与leed或held 5-氮杂胞苷相比，与米哚妥林组合的低暴露延长持续时间或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 米哚妥林相比于leed，p＝0.028；held 米哚妥林相比于held，p＝0.039)。在与米哚妥林组合的leed或held与单独的米哚妥林处理之间未观察到存活率的显著变化。与媒介物或单一药剂相比，在与米哚妥林组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 米哚妥林＝45天，held 米哚妥林＝43天，媒介物＝19天，米哚妥林＝34天，leed＝36天，held＝32天(图17i)。
[0213]
在mv4-11异种移植物模型中，与单独的媒介物相比，单独以及与leed或held 5-氮杂胞苷组合的米哚妥林增加存活率(米哚妥林相比于媒介物，p＝0.0067；leed 米哚妥林相比于媒介物，p＝0.0084；held 米哚妥林相比于媒介物，p＝0.0625)。与单独的leed或held 5-氮杂胞苷相比，与米哚妥林组合的leed或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 米哚妥林相比于leed，p＝《0.0001；held 米哚妥林相比于held，p＝0.0015)。另外，与单独
的米哚妥林相比，与米哚妥林组合的leed或held5-氮杂胞苷并没有显著增加存活率(leed 米哚妥林相比于米哚妥林，p＝0.1704；held 米哚妥林相比于米哚妥林，p＝0.8308)。与媒介物或单一药剂held或leed相比，在与米哚妥林组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 米哚妥林＝64.5，held 米哚妥林＝59.5，媒介物＝29.5，leed＝35，held＝35，米哚妥林＝57)(图17j)。
[0214]
在molm-13异种移植物模型中，与单独的媒介物相比，单独或与leed或held 5-氮杂胞苷组合的吉瑞替尼显著地增加存活率(吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003；leed 吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003；held 吉瑞替尼相比于媒介物，p＝0.003)。与单独的leed或held 5-氮杂胞苷相比，与吉瑞替尼组合的低暴露、延长持续时间或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 吉瑞替尼相比于leed，p＝0.019；leed 吉瑞替尼相比于held，p＝0.004；held 吉瑞替尼相比于leed，p＝0.008；held 吉瑞替尼相比于held，p＝0.003)。另外，与单独的吉瑞替尼相比，与吉瑞替尼组合的leed或held 5-氮杂胞苷给药显著增加存活率(leed 吉瑞替尼相比于吉瑞替尼，p《0.001；held 吉瑞替尼相比于吉瑞替尼，p《0.001)。与媒介物或单一药剂相比，在与吉瑞替尼组合的leed或held 5-氮杂胞苷的情况下增加中值存活期(leed 吉瑞替尼＝45天，held 吉瑞替尼＝43天，媒介物＝19天，吉瑞替尼＝34天，leed＝36天，held＝32天)(图17k)。
[0215]
总之，这些结果表明与flt3抑制剂组合的leed或held 5-氮杂胞苷在杀伤aml细胞方面比单独的单一药剂5-氮杂胞苷或flt3抑制剂显著更有效。实施例2
[0216]
研究目标：研究的主要目标如下。
[0217]
组合组a(口服5-氮杂胞苷 艾伏尼布组)：目标是：(1)确定在与艾伏尼布组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有idh1突变的aml患者中的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。(2)确定在与艾伏尼布组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有idh1突变的aml患者中的安全性和耐受性。
[0218]
组合组b(口服5-氮杂胞苷 恩西地平组)：目标是：(1)确定在与恩西地平组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有idh2突变的aml患者中的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。(2)确定在与恩西地平组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有idh2突变的aml患者中的安全性和耐受性。
[0219]
组合组c(口服5-氮杂胞苷 flt3组)：目标是：(1)确定在与flt3抑制剂组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有flt3itd或tkd突变的aml患者中的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。(2)确定在与flt3抑制剂组合给予时口服5-氮杂胞苷在具有flt3itd或tkd突变的aml患者中的安全性和耐受性。
[0220]
组合组d(口服5-氮杂胞苷 维奈托克组)：目标是：(1)确定在与维奈托克组合给予时口服5-氮杂胞苷在aml患者中的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。(2)确定在与维奈托克组合给予时口服5-氮杂胞苷在aml患者中的安全性和耐受性。
[0221]
次要目标如下：(1)表征口服5-氮杂胞苷与艾伏尼布、恩西地平、维奈托克和flt3抑制剂的组合在aml患者中的药代动力学(pk)；以及(2)评估口服5-氮杂胞苷与艾伏尼布、恩西地平、维奈托克和flt3抑制剂的组合在aml患者中的初步功效。
[0222]
探索目标如下：(1)探索在与艾伏尼布、恩西地平、维奈托克或flt3抑制剂一起施
用时口服5-氮杂胞苷的药物暴露与功效、安全性、药效动力学和/或其他探索终点的关系；(2)通过流式细胞术(或相关基因测序方法(例如，flt3、idh1/2变异等位基因频率(vaf))评价血液和/或骨髓中的微小残留病(mrd)。(3)研究口服5-氮杂胞苷以及每种组合配偶剂艾伏尼布、恩西地平、维奈托克或flt3抑制剂的相关药效动力学标记物，以完全理解在所评价的每种剂量/时间表下的药理学反应。(4)评价另外的探索性分子、细胞和/或代谢标记物，以在每个治疗组中实现与功效和/或耐药性的预后和/或预测关联
[0223]
研究终点显示在下表3中。
[0224]
研究设计这是一项开放标签、i期、多中心伞式试验，以评价与如下所列的生物标记物定向的新型疗法组合的作为骨架的口服5-氮杂胞苷的安全性和耐受性：组合组a：在具有idh1突变的aml患者中的口服5-氮杂胞苷 艾伏尼布，组合组b：在具有idh2突变的aml患者中的口服5-氮杂胞苷 恩西地平，组合组c：在具有flt3itd或tkd突变的aml患者中的口服5-氮杂胞苷 flt3抑制剂,以及组合组d：在aml患者中的口服5-氮杂胞苷 维奈托克。
[0225]
研究群体由第一次复发、1或2种标准诱导治疗难治的aml患者或不是接受强化ic的候选人的新诊断的aml患者组成。所述研究包括预筛选期、筛选期、治疗期和随访期。
[0226]
预筛选期所有患者将签署预筛选同意，用于收集和确定特定的aml突变结果。对于自复发以来最近可从骨髓抽吸物和/或外周血样品进行局部血液病理学和基因突变测试的患者(或对于新诊断的患者)，这些结果将用于筛选。对于没有进行局部血液病理学和基因突变测试的患者，将提供特定aml突变的转诊实验室测试。
[0227]
基于突变测试结果，患者将被分配到适当的组合组。没有特定aml突变(idh1/2或flt3野生型)的所有其他aml患者，或者如果特定突变组已满/关闭；以及符合所有资格标准的患者可以招募口服5-氮杂胞苷 维奈托克组合组(组d)，直到此组完成/关闭。
[0228]
注意：在有资格患者具有多种突变的罕见情况下，分配到可能的治疗组合将基于研究者和医学监查员的共同决定，并且记录在源文件中。例如：可以将具有idh1和flt3两种突变的患者分配到口服艾伏尼布或flt3治疗组。
[0229]
筛选期 在预筛选期并确认有资格进入研究的特定aml突变后，所有招募的患者将在筛选期内(即，在研究治疗开始前的28天内)进行筛选程序。这将有助于根据方案中定义的所有资格标准来确定研究资格。
[0230]
治疗期 在确认资格后，将在适当的组合组中招募患者并开始治疗。组合组和特定的给药水平将根据赞助商提供招募。
[0231]
应当在每个治疗周期的第1天开始研究治疗。治疗周期的持续时间为28天。访视窗口在第1和2周期为
±
1天；并且从第3周期开始，窗口为
±
3天。
[0232]
在治疗期内，将检查每个组合组和剂量水平的剂量确定。
[0233]
剂量确定 对于确定每个组合组在“剂量确定”期间的mtd/mad的主要目标，将使用改进的毒性概率区间(mtpi-2)方法。mtpi-2方法依赖于统计概率算法，使用在同一剂量水平下在先前和当前群组中治疗的所有患者计算得出，以确定未来的群组应当涉及剂量再次递增、保持当前剂量还是剂量递减。所测试的每种组合的计划剂量列于表4中。基于mtpi-2方法的剂量确定规则示于表5中。
[0234]
剂量审查小组(drt)将审查在每种剂量水平的第1周期内患者经历的所有不良事件(ae)，以确定在与艾伏尼布、恩西地平、flt3抑制剂和维奈托克组合施用时口服5-氮杂胞苷的安全性和耐受性。
[0235]
起始剂量水平基于目前在口服5-氮杂胞苷、艾伏尼布和flt3抑制剂的较大试验中使用的剂量；以及恩西地平、flt3抑制剂和维奈托克的组合药剂的批准剂量。可以由drt讨论和修改给药的中间剂量水平和调整。递减至剂量水平-1a或-1b将基于可用的安全性信息和毒性归因于口服5-氮杂胞苷(至水平-1a)或组合药剂(至水平-1b)。如果毒性归因于两种药物或无法评估，则可以在与drt讨论后开启两种剂量水平。在与celgene医学监查员讨论后，可以将口服5-氮杂胞苷的患者内剂量调整高达300mg qd持续21天。
[0236]
在新剂量水平下招募的第一组患者将以如由赞助商确定的交错方式开始治疗。
[0237]
一个周期被定义为28天。前两个周期将每周进行研究访视，然后从第3周期开始每两周(第1天和第15天)进行研究访视。对每个组合组完成剂量确定后，所有继续的患者将继续接受相同的剂量和治疗，直到中止。
[0238]
改进的毒性概率区间(mtpi-2)。在剂量确定期间，将使用改进的毒性概率区间(mtpi-2)方法设计来确定组合的最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)。mtd被定义为所评价的最高剂量水平，其在治疗的第一周期中不超过0.30的目标dlt概率。mtpi-2确定对于每个组合组中的每种剂量水平都是独立的。基于mtpi-2方法的剂量确定规则示于表5中。
目标毒性概率＝0.3，ε1＝0.05，ε2＝0.05*列指示所治疗的患者的数量。行指示具有dlt的患者的数量*e：递增至下一个更高的剂量；s：保持在同一剂量下；d：递减至先前更低的剂量；du：递减至先前更低的剂量，并且将永远不会在试验中再次使用当前的剂量。
[0239]
通常，使用mtpi-2方法的剂量探索规则包括以下内容：
·
剂量水平组内的每个群组将招募2-6名患者；(注意：应当在新剂量水平下的第一群组中招募至少3名患者并对他们进行治疗。
·
当评价至少3名患者在当前剂量水平下的dlt或他们经历dlt时，下一个群组将被招募并分配到根据表4的剂量水平。将使用在同一剂量水平下评价的所有患者(包括一个或多个先前的群组和当前的群组)确定下一个群组的剂量水平。
·
如果患者在dlt观察期内因为除研究药物相关毒性之外的原因没有接受研究药物的方案指定施用，则将招募另一名患者作为当前剂量水平下的替代者。
·
确定规则对于每个组合组中的每种剂量水平都是独立的。
·
当已经在预测为mtd的剂量水平下治疗至少10名患者或者剂量似乎毒性过大并且在当前的试验中不能确定mtd时，每种组合的剂量探索期将结束。
·
患者必须完成口服5-氮杂胞苷和组合药剂的计划总剂量的至少80％，或者在dlt观察期内经历dlt，以便考虑可评价dlt。剂量递增决定规则在统计方法部分中有定义。
[0240]
用于评价每种剂量水平的dlt观察期是当前剂量水平的治疗的第1周期(28天)，或者直到dlt，如果它发生更早的话。
[0241]
以下是组合组b(口服5-氮杂胞苷 恩西地平)的剂量探索程序的一个例子。四种预定剂量水平是：
·
剂量水平 1：口服5-氮杂胞苷300mg qd第1-21天 恩西地平100mg qd第1-28天；
·
起始剂量水平0：口服5-氮杂胞苷300mg qd第1-14天 恩西地平100mg qd第1-28天；
·
剂量水平-1a：口服5-氮杂胞苷200mg qd第1-14天 恩西地平100mg qd第1-28
天；
·
剂量水平-1b：口服5-氮杂胞苷300mg qd第1-14天 恩西地平50mg qd第1-28天；
·
剂量水平-2：口服5-氮杂胞苷200mg qd第1-14天 恩西地平50mg qd第1-28天。
[0242]
剂量探索将开始于招募3名患者并在起始剂量水平(剂量水平0)下进行治疗：口服5-氮杂胞苷300mg qd第1-14天 恩西地平100mg qd第1-28天。到3名患者的dlt观察期结束时，下一个群组将被招募并分配到基于dlt的数量和mtpi-2规则表(表5)确定的剂量水平：
·
如果3/3dlt-递减至剂量水平-1a或-1b(取决于归因药剂)，为此新剂量水平群组招募并分配3名患者。当前或更高的剂量毒性过大，并且不能再次进行探索。
·
如果2/3dlt-递减至剂量水平-1a或-1b，为此新剂量水平群组招募并分配3名患者。
·
如果1/3dlt-保持在同一剂量水平(剂量水平0)下，招募另外的2名患者(第二群组)。注意：剂量水平0下的患者的总数变为5。
·
如果0/3dlt-保持在同一剂量水平(剂量水平0)下并可选择递增(如果适用的话)，招募另外的2名患者(第二群组)。如果递增剂量，则为新剂量水平群组分配3名患者。
[0243]
如果启动新剂量水平，则重置mtpi-2规则表，并且与先前的剂量水平分开评价新的剂量群组水平。
[0244]
在剂量水平的第二群组的dlt观察期结束时，下一个群组(第三群组)将被招募并分配到基于dlt的数量和mtpi-2规则表(表4)确定的剂量水平。将使用在同一剂量水平下的所有患者及其dlt，包括当前的群组和任何一个或多个先前的群组。
[0245]
除了在每种剂量水平下的第一群组中需要至少3名患者，剂量水平的另外的群组的大小可以是灵活的。例如，如果根据mtpi-2规则，剂量水平在同一水平下继续，则群组大小的序列可以是3、2、2、3等。
[0246]
当已经在预测为mtd的剂量下治疗至少10名患者或者如果剂量似乎毒性过大并且在研究的当前组合组中不能确定mtd时，剂量探索将结束。
[0247]
在确定mtd/mad后，drt将审查在组合组(组a至e)中治疗的患者的所有安全性数据，以确定可以在扩展群组中使用的组合组的rp2d。
[0248]
治疗结束(eot)：治疗将继续直到记录的疾病进展、一个或多个不可接受的不良事件、阻止进一步施用治疗的间发疾患、研究者决定撤回患者、患者撤回同意、患者怀孕、不依从试验治疗或程序要求、或管理原因。
[0249]
在eot访视时，将使用
±
7天的访视窗口进行评价。如果eot在按时间表的访视期间发生，则还必须完成所有eot评估。
[0250]
随访期 在治疗结束后，将随访每名患者的ae监测持续28天。将治疗后随访因为除疾病进展之外的原因中止治疗的患者的疾病状态，直到疾病进展、开始非研究癌症治疗、撤回同意或失访。
[0251]
随访期在第一年将每28天进行评估，然后此后每3个月进行评估。
[0252]
另外，将通过电话联系随访所有患者的存活，直到死亡、撤回同意或试验结束，以先到者为准。
[0253]
研究群体/估计患者数 将在本研究中招募多达大约72名患者(4个组合组x每组18名患者)。
[0254]
对于每种组合组剂量水平，可以招募大约12名患者，以评价安全性、耐受性和初步功效。根据用于剂量确定的剂量水平，可以为每个组合组招募多达18名患者。
[0255]
在完成每个组合组的主要目标后，还可以为剂量扩展招募另外的患者。
[0256]
关键纳入标准 在研究中待招募的患者必须满足以下标准：1.在签署知情同意书(icf)时患者≥18岁。2.患者患有如由who分类定义的aml：a.第一次复发(即在已经实现对化学疗法的初始反应[cr/cri]后复发，早幼粒细胞白血病[apml]除外)；或者b.在1至2个初级诱导疗程后持续/难治(即，在1至2种先前的化学疗法方案后没有反应)；或者c.不是强化化学疗法的候选人的新诊断的aml患者3.患者在自上次进展/复发(或对于新诊断的患者，最近的测试)以来记录的骨髓抽吸物和/或外周血样品中必须具有以下aml特定突变：a.对于组合组a(idh1)：确认idh1突变b.对于组合组b(idh2)：确认idh2突变c.对于组合组c(flt3)：确认flt3突变(itd或tkd)d.对于组合组d(bcl-2)：可以将没有列出的任何特定突变或具有在以上关闭的组合组中的突变的患者招募到此口服5-氮杂胞苷 维奈托克组中。4.患者的东部肿瘤协作组(ecog)体能状态为0、1或25.患者具有足够的器官功能，定义为：
·
天冬氨酸转氨酶(ast)/血清谷草转氨酶(sgot)和丙氨酸转氨酶(alt)/血清谷丙转氨酶(sgpt)≤2.5x正常值上限(uln)，除非考虑是由于白血病器官受累
·
血清总胆红素≤1.5 x uln，除非考虑是由于吉尔伯特综合征(例如，ugt1a1中的基因突变)或白血病器官受累
·
基于肾脏病饮食改良(mdrd)肾小球滤过率(gfr)，肌酐清除率》30ml/min：gfr(ml/min/1.73m2)＝175
×
(血清肌酐)-1.154
×
(年龄)-0.203
×
(0.742，如果是女性的话)
×
(1.212，如果是非裔美国人的话)6.同意连续抽吸骨髓/活检。7.有生育能力的女性(fcbp)*必须：在开始研究疗法前，如由研究员验证的，两次妊娠测试呈阴性。她必须同意在研究过程期间以及在研究疗法结束后持续进行妊娠测试。即使患者践行真正禁欲*而不与异性性接触，这也适用。承诺在开始研究产品前-3天、在研究疗法期间(包括剂量中断)以及在中止治疗疗法后90天内或者更长时间(如果每种化合物和/或地方法规有要求的话)真正禁欲*而不与异性性接触(其必须每月审查并记录来源)或同意使用并能够遵守高效的避孕。对于组合组a：时间范围延长至上次研究治疗剂量后4(四)个月对于组合组b：时间范围延长至上次研究治疗剂量后4(四)个月对于组合组d：时间范围延长至上次研究治疗剂量后6(六)个月。8.男性患者在参与研究时、在剂量中断期间以及在研究产品中断后至少90天内或
更长时间(如果每种化合物和/或地方法规有要求的话)必须践行真正禁欲*(其必须每月审查)或同意在与怀孕的女性或有生育能力的女性性接触期间使用避孕套，即使他进行了成功的输精管结扎术。对于组合组a：时间范围延长至上次研究治疗剂量后4(四)个月对于组合组b：时间范围延长至上次研究治疗剂量后4(四)个月对于组合组d：时间范围延长至上次研究治疗剂量后6(六)个月。9.患者在进行任何研究相关评估/程序前必须理解并自愿签署icf。10.患者愿意并且能够遵守研究访视时间表和其他方案要求。
[0257]
排除标准以下任何一项的存在将排除招募患者：1.基于形态学、免疫表型、分子测定或核型，患者被怀疑或证明患有急性早幼粒细胞白血病2.患者患有继发于慢性骨髓性白血病的aml或者患者呈bcr-abl1t(9；22)(q34；q11)阳性。3.患者的白细胞计数》15,000个细胞/mcl(15x109/l)。注意：在抽取筛选血液前长达72小时允许使用羟基脲，以及在第1周期内有限使用羟基脲进行细胞减灭术(用于控制高白细胞计数)。4.在研究治疗开始前《28天，患者已经接受了全身抗癌疗法或放射疗法。注意：在研究治疗开始前允许使用羟基脲控制白细胞增多症。5.患者已经接受了采用低甲基化药剂的疗法治疗aml并且在一线疗法期间没有实现cr/cri/pr/mlfs/sd6.在研究治疗开始前，患者已经接受了研究药剂《30天或5个半衰期，以较长者为准7.患者在研究治疗开始前90天内进行了hsct，或在筛选时正在接受hsct后免疫抑制疗法，或者患有移植物抗宿主疾病(gvhd)。允许使用稳定剂量的口服类固醇后hsct或局部类固醇用于持续的皮肤gvhd。8.患者具有来自先前疗法的持久的临床上显著的非血液学毒性，尚未恢复到《2级9.患者患有或被怀疑患有中枢神经系统(cns)白血病。只有在筛选期间怀疑cns受累于白血病，才需要评价脑脊液。10.患者患有活跃的不受控制的全身真菌、细菌或病毒感染(定义为尽管有适当的抗生素、抗病毒疗法和/或其他治疗但仍然没有改善的持续的与感染相关的病征/症状)。患者应当至少72小时不发热。11.患者患有直接危及生命的严重的白血病并发症，如不受控制的出血、肺炎伴缺氧或休克、和/或弥散性血管内凝血12.患者具有除mds、mpn或aml之外的恶性肿瘤的既往病史，除非患者在研究治疗开始前≥1年内没有疾病。然而，具有以下病史/并发病症的患者是允许的：
·
皮肤的基底或鳞状细胞癌
·
宫颈原位癌
·
乳腺原位癌
·
前列腺癌的偶然组织学发现(使用肿瘤、结节、转移临床分期系统为t1a或t1b)13.患者已知具有人免疫缺陷病毒(hiv)血清阳性或活动性感染，或乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)活动性感染14.患者已知患有吞咽困难、短肠综合征、胃轻瘫或限制口服施用的药物的摄取或胃肠道吸收的其他病症15.患者患有不受控制的高血压(收缩压[bp]》180mmhg或舒张压bp》100mmhg)或在治疗前至少1个月内尚未稳定16.在签署icf前先前6个月内有显著活动性心脏病，包括：纽约心脏协会(nyha)iii或iv类充血性心力衰竭不稳定型心绞痛或需要手术或医疗干预的心绞痛；显著的心脏心律失常；和/或心肌梗塞17.患者是怀孕或哺乳期女性18.患者已知或怀疑对所分配的研究治疗的任何组分具有超敏性19.患者具有可阻碍患者参与研究的任何显著医学病症、实验室异常或精神疾患20.患者具有任何如果他/她参与研究会将患者置于不可接受的风险中的状况，包括实验室异常的存在21.患者具有任何混淆从研究中解释数据的能力的状况22.基于计划的组合组，患者的另外排除标准是：a.对于组合组a(idh1)：-患者在筛选时具有≥450ms的qtc间期(即，fridericia校正[qtcf])或其他增加qt延长或心律失常事件风险的因素(例如，心力衰竭、低钾血症、长qt间期综合征家族史)-患者正在使用已知延长qt间期的那些药物，除非患者可以在研究治疗开始前至少5个半衰期被转移至其他药物-患者在研究治疗开始前6个月内患有显著的活动性心脏病；急性冠脉综合征(acs)；和/或中风；或通过在研究治疗开始前28天内获得的超声心动图(echo)或多门控采集(muga)扫描测得左心室射血分数(lvef)《40％b.对于组合组b(idh2)：-正在使用乳腺癌耐药蛋白(bcrp)转运蛋白敏感性底物瑞舒伐他汀的患者应当从治疗中排除，除非患者可以在研究治疗开始前至少5个半衰期被转移至其他药物-正在使用具有狭窄的治疗范围的以下敏感性cyp底物药物的患者应当从治疗中排除，除非患者可以在研究治疗开始前至少5个半衰期被转移至其他药物：紫杉醇和多西紫杉醇(cyp2c8)、苯妥英(cyp2c9)、s-美芬妥英(cyp2c19)、硫利达嗪(cyp2d6)、茶碱和替扎尼定(cyp1a2)c.对于组合组c(非特定flt3)：患者在筛选时患有低钾血症和低镁血症(值低于正常值下限[lln])。患者具有3类或4类充血性心力衰竭nyha的病史，除非在进入研究前3个月内进行的筛选超声心动图得到≥45％的左心室射血分数。患者在筛选时的三次fridericia校正qt间期(qtcf)的平均值》450ms。
患者在筛选时患有长qt综合征。患者需要用伴随药物治疗，所述伴随药物是细胞色素p450(cyp)3a的强诱导剂。患者需要用伴随药物治疗，所述伴随药物是p糖蛋白(p-gp)的强抑制剂或诱导剂，除了被认为对患者护理绝对必需的药物。患者需要用伴随药物治疗，所述伴随药物靶向血清素5-羟色胺受体1(5ht1r)或5-羟色胺受体2b(5ht2br)或σ非特异性受体，除了被认为对患者护理绝对必需的药物。d.对于组合组d(bcl-2)：-在研究治疗开始前7天内接受强cyp3a抑制剂、中度cyp3a抑制剂、强cyp3a诱导剂、中度cyp3a诱导剂、强cyp2c8抑制剂、cyp2c8底物或oatp1b1/3底物-在研究治疗开始前14天内接受强cyp2c8诱导剂
[0258]
研究时间长度 预计研究的总时间长度为约30个月，包括招募、筛查、治疗和随访。对于单个患者，研究的预期持续时间为约8个月，包括筛选期阶段长达28天。
[0259]
试验结束被定义为最后一个患者完成治疗后随访的最后一次访视的日期，或从最后一个患者收到为主要、次要和/或探索性分析(如方案中预先规定的)所需的最后一个数据点的日期，以较晚的日期为准。
[0260]
关键功效评估的概述 对治疗的反应将通过研究人员根据欧洲白血病网(eln)aml反应标准(h等人,blood,2017年1月26日,129(4):424-47)来评估。还将根据iwg骨髓增生异常综合征hi标准(cheson，2006)来评估患有新诊断的aml的患者中的血液学改善(hi)。当研究治疗中止时，患者将接受治疗结束评价。治疗中止的原因将记录在电子病历报告表(ecrf)页面和源文件中。
[0261]
在基线时，需要骨髓抽吸和活检样品。连续血液和骨髓抽吸采样(如果需要的话，采用骨髓活检)将用于确定在周期2第1天开始对疗法的反应，并将每隔一个周期(周期4、周期6等)进行评估直至缓解(或如果没有缓解的话，直至eot)。在缓解时，需要另外的骨髓抽吸和活检。在缓解期间，应每4个月或在临床指示时收集抽吸物。在eot时，将收集另外的骨髓抽吸物。将基于报告的血液学实验室参数、外周血涂片、骨髓抽吸物和/或活检物根据2017eln标准来局部地评估反应。现场需要确保收集并储存外周血和bma/bmb样品，以用于在每次骨髓收集时进行探索性测试。
[0262]
在复发或进展之前停止研究治疗的患者将完成每月一次现场访视，直到确认复发或进展。对于因复发或进展而停止研究治疗的患者，可以通过现场访视或电话进行每月一次随访。患者将被追踪直至他们死亡、失去随访、撤回对于进一步数据收集的同意书或直至研究终止。
[0263]
关键安全性评估的概述 所有患者将在研究期间针对ae进行监测。不良事件将根据nci不良事件的常见术语标准(ctcae)第5版中概述的指导以严重程度进行分级。
[0264]
剂量限制毒性(dlt) 毒性严重程度将根据不良事件的常见术语标准(ctcae)第4.03版进行分级。剂量确定期间的dlt是基于dlt观察期期间发生的不良事件。对于本研究，dlt观察期被定义为第一个治疗周期(28天)，并且患者将在每个群组以剂量水平完成时进行评价。如果在第二个治疗周期中发生dlt事件，则没有新的患者可以开始治疗，直到由drt审查和讨论。如果事件在dlt评估期期间开始，则基于其持续时间被视为dlt的事件将被视为dlt。
[0265]
除非事件可由研究人员归因于清晰可确定的原因如潜在的疾患或疾病进展、其他并发疾患或伴随药物，否则任何以下事件将被视为dlt：
·
血液学dlt被定义为自先前周期第1天的42天内从4级血液学毒性中未恢复。出于dlt确定的目的，4级血液学毒性被定义为：(i)anc《0.5
×
109/l(等级≥4)和/或(ii)plt计数《25.0
×
109/l(等级≥4)如果按照研究人员判断的恢复的延迟是由于治疗诱导的毒性而不是aml的残留作用，则可以仅分配血液学dlt(骨髓样品可以被指示为记录这不是由于骨髓原始细胞《5％的aml所致)。-出于dlt确定的目的，从血液学毒性中恢复被定义为来自最低点的细胞计数增加了在最低点时观察到的自基线的降低的≥50％-在dlt评价期期间禁止使用g-csf或血小板输血。接受这些治疗的患者将被确定不可评价，并将被替换。-参与低血液学计数(3级和4级)的研究的患者，除非发生了临床上有意义的变化否则其将被视为可评价血液学dlt(自先前周期第1天的42天内计数未恢复以及强制性骨髓评估指示治疗诱导的骨髓毒性)。非血液学dlt被定义为在研究的第一周期期间发生的≥3级临床显著的非血液学不良事件或异常实验室值，其不能被研究人员归因于清晰可确定的原因如疾病进展、潜在的疾患、并发疾患或伴随药物，以下情况例外：3级疲劳3级恶心、呕吐或腹泻，其可在72小时内用标准止吐剂或抗神经药物管理至≤2级(或基线)对于idh1或idh2组合：3级或4级白细胞增多症或3级分化综合征(ds)，其可以用羟基脲和/或皮质类固醇管理至《3级3级肿瘤溶解综合征，除非由医疗管理控制
[0266]
对于在dlt观察期期间发生的可能需要中断口服5-氮杂胞苷和/或组合药剂二者的任何dlt，可以基于与celgene医学监查员的讨论在毒性等级返回至等级≤1或基线之后以降低的剂量再引入。后续周期的开始可能需要延迟以允许从dlt或任何其他不良事件恢复。为每个组合组提供剂量修改时间表作为指导。在疗法开始之前，由于疾病而患有嗜中性粒细胞或血小板减少症的患者不需要用于骨髓抑制的治疗中断。然而，研究人员可以基于患者的疾病状态、临床病症和共病使用临床判断来做出关于治疗修改的决定。这些患者中的研究治疗的剂量降低应在单独案例基础上考虑并与医学监查员讨论。
[0267]
口服5-氮杂胞苷和/或组合药剂的任何降低的剂量水平将由研究人员和celgene医学监查员(mm)共同定义。此后可以在研究人员和celgene mm的共同确定后增加剂量。关于具有dlt的单独患者的持续给药的所有决定都将由研究人员并视情况按照与celgene mm的讨论来进行医学管理。
[0268]
在dlt观察期期间，所有患者均被允许按照标准制度准则接受抗生素预防(禁忌药物除外)。
[0269]
评价标准 安全性评价包括但不限于捕获ae、临床实验室测试(血液学和化学)、体检、生命体征测量、心电图(ecg)测试，作为整个研究持续时间的安全性和耐受性的量度。
[0270]
对于每个组合组，剂量确定期间的剂量递增/递减将通过评估dlt来指导，并基于在给定剂量水平下经历dlt的患者的累积数量。
[0271]
研究治疗 将口服5-氮杂胞苷在28天治疗周期的第1-14天(或21天)每天口服施用一次。应吩咐患者在每天大约同一时间服用他们的每日剂量。每个剂量应与约240ml(8盎司)的室温水一起服用。口服5-氮杂胞苷可以空腹或与食物一起服用。
[0272]
将艾伏尼布在每个28天周期的第1-28天每天一次(qd)口服施用。应吩咐患者在每天大约同一时间
±
6小时服用他们的每日剂量。每个剂量应与一杯水一起服用，并在尽可能短的时间内服用。应吩咐患者整片吞服，而不要咀嚼片剂。
[0273]
将恩西地平在每个28天周期的第1-28天每天一次(qd)口服施用。应吩咐患者在每天大约同一时间
±
6小时服用他们的每日剂量。每个剂量应与一杯水一起服用，并在尽可能短的时间内服用。应吩咐患者整片吞服，而不要咀嚼片剂。要求在恩西地平施用前禁食2小时且在施用后禁食1小时。禁食期间允许喝水。
[0274]
将米哚妥林在每个28天周期的第1-28天每天两次(bid)口服施用。应吩咐患者在每天大约同一时间
±
y小时服用他们的剂量。每个剂量应与一餐和水一起服用，并在尽可能短的时间内服用。应吩咐患者整片吞服，而不要咀嚼片剂。
[0275]
将吉瑞替尼在每个28天周期的第1-28天每天一次(qd)口服施用。应吩咐患者在每天大约同一时间
±
y小时服用他们的每日剂量。每个剂量应与一餐和水一起服用，并在尽可能短的时间内服用。应吩咐患者整片吞服，而不要咀嚼片剂。
[0276]
将维奈托克在每个28天周期的第1-28天每天一次(qd)口服施用。对于周期1进行短暂的剂量斜升，其中在第1天给药100mg，第2天给药200mg，以及第3天给药400mg。应吩咐患者在每天大约同一时间
±
6小时服用他们的每日剂量。每个剂量应与一餐和水一起服用，并在尽可能短的时间内服用。应吩咐患者整片吞服，而不要咀嚼片剂。
[0277]
在剂量中断/修改的情况下，周期访视将以相同的时间表和时间继续(例如，周期3是在周期2后28天，等等)。如果发生药物中断，则其他研究药物可以以治疗时间表继续。
[0278]
统计方法 在剂量确定结束时，将选择最接近目标dlt率的各向同性(isotopically)转化的dlt率作为估计的mtd/mad。如果两种或更多种剂量平等地接近目标dlt率，那么在它们小于目标dlt率的情况下，则选择平局(tie)剂量中的最高剂量，或者在它们高于目标dlt率的情况下，则选择平局剂量中的最低剂量。
[0279]
统计分析将主要是描述性的。将制作对于倾向、人口统计和基线疾病特征、安全性、pk、pd和临床活性参数的表格。分类数据将通过频率分布(患者的数量和百分数)来概括，并且连续数据将通过描述性统计(平均值、标准偏差、中值、最小值和最大值)来概括。数据将通过剂量水平以及在适当的情况下在总体上进行概括。
[0280]
临床研究的结果将表明：(1)在最大耐受剂量(mtd)和/或最大施用剂量(mad)下与艾伏尼布组合的口服5-氮杂胞苷在具有idh1突变的aml患者中是安全的且耐受的；(2)在最大耐受剂量(mtd)和/或最大施用剂量(mad)下与恩西地平组合的口服5-氮杂胞苷在具有idh2突变的aml患者中是安全的且耐受的；(3)在最大耐受剂量(mtd)和/或最大施用剂量(mad)下与flt3抑制剂(如米哚妥林和吉瑞替尼)组合的口服5-氮杂胞苷在具有flt3itd或tkd突变的aml患者中是安全的且耐受的；和/或(4)在最大耐受剂量(mtd)和/或最大施用剂量(mad)下与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷在aml患者中是安全的且耐受的。
实施例3
[0281]
研究目标：研究的主要目标如下。
[0282]
剂量探索(1b期)：通过在患有aml或较高风险mds的患者中评价与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的安全性和耐受性，建立最大耐受剂量(mtd)或最大施用剂量(mad)和/或推荐的2期剂量(rp2d)。
[0283]
剂量扩展(2期)：在新诊断的患有aml或较高风险mds的患者中评估以rp2d与维奈托克组合给予时口服5-氮杂胞苷的功效。
[0284]
次要目标如下：
[0285]
剂量探索(1b期)：在患有aml或较高风险mds的患者中评估与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的初步功效。
[0286]
剂量扩展(2期)：在新诊断的患有aml或较高风险mds的患者中进一步评价以rp2d与维奈托克组合给予时口服5-氮杂胞苷的安全性和耐受性。
[0287]
所有部分(1b/2期)：表征与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的药代动力学(pk)。
[0288]
探索性目标如下：所有部分(1b/2期)：(1)表征药效动力学(pd)以了解与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的机制效应。(2)通过多色流式细胞术(mfc)和/或下一代测序(ngs)评价mrd反应率和mrd转化率。(3)通过评估骨髓抽吸物(bma)和外周血涂片(pbs)检查来探索mrd反应的持续时间。(4)研究pk、pd生物标记物和/或与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的临床结局之间的关系。(5)评价bm和血液中的分子和/或细胞标记物，这些标记物可以预测每个组合中口服5-氮杂胞苷的功效
[0289]
研究终点显示在下表6中。
[0290]
研究设计 这是一项开放标签、1b/2期、多中心、剂量确定、剂量扩展的伞形研究，将在2个单独的疾病群组aml和hr-mds中评价与生物标记物定向的新型疗法组合的作为骨架的口服5-氮杂胞苷的安全性、耐受性和初步功效。
[0291]
由于年龄≥75岁、或≥18岁伴有共病而无资格接受强化诱导化学疗法的新诊断的aml患者以及对于1种或2种标准诱导治疗复发或难治的≥18岁的aml患者将被招募入本研究。本研究将招募≥18岁的新诊断的hr-mds患者。
[0292]
该研究将包括2部分：1b期剂量探索和2期剂量扩展。
[0293]
1b期，剂量探索部分将评价与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的安全性、耐受性、初步功效，建立mtd/mad并确定rp2d。剂量探索部分将基于mtpi-2方法使用剂量确定规则。患者将被招募到以下组合组之一中：群组1 aml-a组：口服5-氮杂胞苷 维奈托克，用于具有所有突变的新诊断的aml-b组：口服5-氮杂胞苷 吉瑞替尼，用于具有flt3 itd或tkd的新诊断的或r/raml群组2hr-mds-c组：口服5-氮杂胞苷 维奈托克，用于新诊断的高和非常高风险(按照ipss-r)的mds患者
[0294]
2期，剂量扩展部分将进一步评价与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷在rp2d下的安全性、pk/pd和功效。患者将被招募到以下之一中：群组1 aml：口服5-氮杂胞苷 维奈托克，用于具有所有突变的新诊断的aml群组2 hr-mds：口服5-氮杂胞苷 维奈托克，用于按照修订的国际预后评分系统(ipss-r)的新诊断的hr-mds
[0295]
该研究由筛选期、治疗期(剂量探索和剂量扩展)和随访期组成。研究设计展示于图18中。
[0296]
在本研究的一个实施方案中，包括另外的治疗组，如实施例2中描述的那些。例如，另外的治疗组可以包括在具有idh1突变的aml患者中的口服5-氮杂胞苷 艾伏尼布(组合组a)，和/或在具有idh2突变的aml患者中的口服5-氮杂胞苷 恩西地平(组合组b)。
[0297]
剂量探索期该研究的剂量探索部分的目标是鉴定与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷在28天周期中的mtd/mad(如果达到的话)和/或rp2d。设计剂量探索部分以评价与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷的5个剂量水平(表7)，并将在每个剂量水平中招募3至9名患者。大约9至18名患者将被招募到每个组合组中。表7：按组合组和疾病群组的剂量水平
[0298]
在每个剂量水平中，将评估剂量限制性毒性(dlt)的对应dlt期，所述dlt期定义为在用口服5-氮杂胞苷开始治疗后的前28天(第1周期)。所有最佳决策的预先计算的决策表将用于指导剂量和/或时间表的选择。对于有待用于剂量扩展的剂量水平，应在剂量递增期间对至少6名患者进行dlt评价，以申明可耐受的剂量水平。
[0299]
对于被认为dlt可评价的患者，患者必须在接受至少一个剂量的口服5-氮杂胞苷后已具有第1周期dlt，或者已在没有dlt的情况下完成第1周期。如果患者在完成第一个治疗周期的口服5-氮杂胞苷(28天周期中11/14或16/21天)以及组合药剂(维奈托克11/14、16/21或22/28天；或吉瑞替尼22/28天)的计划剂量的80％之前因毒性以外的原因(即个人
原因或疾病进展)退出研究，则该患者将不被视为已完成治疗周期并将被替换。
[0300]
在对口服5-氮杂胞苷与维奈托克或吉瑞替尼的5个计划剂量水平的评价完成之后，将确定mtd和/或rp2d，并且剂量扩展部分将开放。
[0301]
在剂量探索部分期间，研究者将基于安全性、pk和pd数据、和初步功效信息的综合评估来推荐剂量递增/递减决策和口服5-氮杂胞苷的组合rp2d以用于剂量扩展。剂量确定决策规则将由mtpi-2设计指导(guo等人,contemp clin trials,2017年7月:58:23-33)，并且30％的目标dlt率将用于向src提出关于下一名招募患者的剂量水平的建议。
[0302]
剂量扩展期 一旦确定口服5-氮杂胞苷和维奈托克组合疗法的mtd和/或rp2d，则将招募大约61名新诊断的aml患者和54名新诊断的mds患者到两个单独的疾病群组。剂量扩展部分将进一步评价口服5-氮杂胞苷与维奈托克的施用组合rp2d的安全性和功效。
[0303]
对每个组合组完成剂量确定后，所有持续的患者将继续接受相同的剂量和治疗，直至中止。
[0304]
按剂量修改指南，基于观察到的安全性，可能会发生剂量减少
[0305]
研究持续时间 整个研究的预期持续时间为大约4年，其中包括大约24个月的总体招募期(1b期12个月，2期12个月)，以及每名患者大约2年持续时间：28天的筛选期、大约12个月的治疗期和最后一次给药后1年的随访期。研究的实际持续时间将取决于患者的中值治疗持续时间和随访。
[0306]
试验结束 试验结束被定义为最后一名患者完成治疗后随访的最后一次访视的日期，或从最后一名患者收到为主要、次要和/或探索性分析(如方案中预先规定的)所需的最后一个数据点的日期，以较晚的日期为准。
[0307]
研究群体/估计患者数量 计划招募大约169名患者。1b期剂量探索部分将招募最多大约54名患者(36aml，18mds)。每个组合组招募大约18名患者，以评价安全性、耐受性和初步功效。2期剂量扩展部分将招募大约115名患者(61aml，54mds)。
[0308]
关键纳入标准 患者必须满足招募入研究的以下标准：1.签署知情同意书(icf)时患者≥18岁。2.aml群组：确认由更新的2016年世界卫生组织(who)分类所定义的关于aml的以下项。a.第一次复发(即，在对强化诱导化学疗法已实现初始反应[cr/cri/crp]后复发，急性早幼粒细胞白血病[apml]除外)；或者b.在1至2次强化诱导历程后持续/难治(即1至2个先前化学疗法方案后没有反应)；或者c.由于年龄≥75岁、或≥18岁伴有任一以下共病而不是强化诱导化学疗法候选者的新诊断的aml：-东部肿瘤协作组(ecog)体能状态为2-需要治疗的充血性心力衰竭(chf)的心脏史，或射血分数≤50％，或通过多门控采集(muga)或超声心动图(echo)确定的慢性稳定型心绞痛-通过cockcroft-gault公式计算的肌酐清除率≥30ml/min至《45ml/min-中度肝功能损害，其中总胆红素》1.5至≤3.0x正常值上限(uln)-研究者判断为与强化化学疗法不相容的任何其他共病必须在筛选期间和研究招
募之前由发起者进行审查。d.新诊断的aml的中间或差风险状态细胞遗传学(附录e)e.自从如通过批准的机构实验室测试所检测到的最后一次进展/复发(或最近对于新诊断者的测试)以来记录的在骨髓抽吸和/或外周血样品中的经确认aml特异性突变：-a组：所有突变-b组：flt3(itd或tkd)3.mds群组：f.确认先前未经治疗的原发性或继发性mds的诊断，如who分类所定义。在接受第一次ip给药之前需要病理审查结果。g.按照ipss-r高或非常高风险确认mds风险分类。在接受第一次ip给药之前需要病理审查结果。4.东部肿瘤协作组(ecog)体能状态为0、1或25.患者必须具有以下基线实验室值：h.白细胞(wbc)计数≤25x109/l。允许羟基脲或白细胞单采术满足此标准。注意：在开始治疗之前长达24小时羟基脲是允许的，并且仅在第1周期期间有限地使用以用于细胞减少(以控制高白细胞计数)。i.钾和镁在正常限值内或可通过补充剂纠正。j.尿酸≤7.5mg/dl(446μmol/l)。允许使用降尿酸剂(例如别嘌呤醇、拉布立酶)进行先前和/或并行治疗。拉布立酶在基线葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)缺乏的患者中是禁忌的。k.国际归一化比率(inr)《1.5 x uln，并且活化部分凝血活酶时间(aptt)《1.5 x uln。6.足够的器官功能，定义为：l.肾功能：肌酐清除率≥30ml/min，通过cockcroft-gault公式计算或通过24小时尿液收集测量m.肝功能：天冬氨酸转氨酶(ast)、alt≤3.0 x uln、胆红素≤1.5x uln，除非由于吉尔伯特综合征或白血病器官受累。《75岁的患者可具有≤3.0 x uln的胆红素。n.左心室射血分数(lvef)》40％，通过多门控采集(muga)或(超声心动图)echo得出(关于每个组合组中任何另外的lvef要求参见排除标准#22)7.同意连续骨髓抽吸/活检8.有生育能力的女性(fcbp)*必须：o.在开始研究疗法前，如由研究员验证的，两次妊娠测试呈阴性。她必须同意在研究过程期间以及在研究疗法结束后持续进行妊娠测试。即使患者践行真正禁欲而不与异性性接触，这也适用。p.承诺在研究治疗期间(包括剂量中断)以及在研究治疗中止后90天内或更长时间(如果为每种化合物和/或局部规定所需要的话)，真正禁欲而不与异性性接触(必须每月审查并记录来源)或同意使用并能够遵守不中断的有效避孕。q.对于组合a组和c组：时间范围延长至最后一次研究治疗给药后6个月。9.男性患者在参与研究时、在剂量中断期间以及在研究产品中断后至少90天内或
更长时间(如果每种化合物和/或地方法规有要求的话)必须践行真正禁欲*(其必须每月审查)或同意在与怀孕的女性或有生育能力的女性性接触期间使用避孕套，即使他进行了成功的输精管结扎术。r.对于组合a组和c组：时间范围延长至最后一次研究治疗给药后6个月。10.在进行任何与研究相关的评估/程序之前，患者必须理解并自愿签署icf。11.患者愿意并且能够遵守研究访视时间表和其他方案要求。
[0309]
排除标准 任一以下项的存在将排除患者被招募：1.基于形态学、免疫表型、分子测定或核型，患者被怀疑或证明患有急性早幼粒细胞白血病(apml)。2.患者患有继发于慢性骨髓性白血病的aml或者患者呈bcr-abl1t(9；22)(q34；q11)阳性。3.在研究治疗开始前《28天，患者已经接受了全身抗癌疗法或放射疗法。注意：在研究治疗开始前允许使用羟基脲控制白细胞增多症。4.患者已接受过针对aml的低甲基化剂(hma)疗法，或针对mds的大于2个周期的hma5.患者已在研究治疗开始前《28天或5个半衰期(以较长者为准)接受过研究药剂6.患者在研究治疗开始前90天内已经历造血干细胞移植(hsct)，或在筛选时经历hsct后免疫抑制疗法，或具有移植物抗宿主病(gvhd)。允许使用稳定剂量的口服类固醇后hsct或局部类固醇用于持续的皮肤gvhd。7.患者具有来自先前疗法的持久的临床上显著的非血液学毒性，尚未恢复到《2级8.患者患有或被怀疑患有中枢神经系统(cns)白血病。只有在筛选期间怀疑cns受累于白血病，才需要评价脑脊液。9.患者患有活跃的不受控制的全身真菌、细菌或病毒感染(定义为尽管有适当的抗生素、抗病毒疗法和/或其他治疗但仍然没有改善的持续的与感染相关的病征/症状)。患者应当至少72小时不发热。10.患者患有直接危及生命的严重的白血病并发症，如不受控制的出血、肺炎伴缺氧或休克、和/或弥散性血管内凝血11.患者具有除mds、mpn或aml之外的恶性肿瘤的既往病史，除非患者在研究治疗开始前≥1年内没有疾病。然而，具有以下病史/并发病症的患者是允许的：
·
皮肤的基底或鳞状细胞癌
·
宫颈原位癌
·
乳腺原位癌
·
前列腺癌的偶然组织学发现(使用肿瘤、结节、转移临床分期系统为t1a或t1b)12.患者已知具有人免疫缺陷病毒(hiv)血清阳性或活动性感染，或乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)活动性感染13.患者已知患有吞咽困难、短肠综合征、胃轻瘫或限制口服施用的药物的摄取或胃肠道吸收的其他病症14.患者患有不受控制的高血压(收缩压[bp]》180mmhg或舒张压bp》100mmhg)或在治疗前至少1个月内尚未稳定
15.在签署icf之前先前6个月内有显著活动性心脏病，包括：
·
纽约心脏协会(nyha)iii或iv类充血性心力衰竭(见附录j)
·
不稳定型心绞痛或需要手术或医疗干预的心绞痛；
·
显著的心脏心律失常；和/或
·
心肌梗塞16.患者是怀孕或哺乳期的女性17.患者已知或怀疑对所分配的研究治疗的任何组分具有超敏性18.患者具有可阻碍患者参与研究的任何显著医学病症、实验室异常或精神疾患19.患者具有任何如果他/她参与研究会将患者置于不可接受的风险中的状况，包括实验室异常的存在20.在研究治疗开始前28天内的任何研究疗法21.患者具有任何混淆从研究中解释数据的能力的状况22.基于计划的组合组，患者的另外排除标准是：
·
组合a组(aml所有突变)和c组(hr-mds)：-在研究治疗开始前7天内接受强cyp3a抑制剂、中度cyp3a抑制剂、强cyp3a诱导剂、中度cyp3a诱导剂、强cyp2c8抑制剂、cyp2c8底物或oatp1b1/3底物。-在研究治疗开始前14天内接受强cyp2c8诱导剂-在研究治疗开始前接受活减毒疫苗。
·
组合b组(非特定flt3)：-患者在筛选时具有≥450ms的心率校正qt间期(qtc)间期(即fridericia校正[qtcf])或其他增加qt延长或心律失常事件风险的因素(例如，心力衰竭、低钾血症、长qt间期综合征家族史)-患者正在使用已知延长qt间期的那些药物(禁止药物列表将在方案中提供)，除非患者可以在研究治疗开始前至少5个半衰期被转移至其他药物-患者有持续心室心动过速的病史或存在；任何室颤或尖端扭转的病史；定义为心率(hr)《50bpm的心动过缓；右束支传导阻滞 左前分支阻滞(双支阻滞)；射血分数≤45％，通过muga或echo在第1周期第1天的14天内评估-患者正在使用作为p-糖蛋白(p-gp)底物和强cyp3a4抑制剂的药物，以及前7天内的诱导剂。-患者在筛选时患有低钾血症和低镁血症(值低于正常值下限[lln])。-患者在筛选时患有长qt综合征。-患者需要用伴随药物治疗，所述伴随药物是p-gp的强抑制剂或诱导剂，除了被认为对患者护理绝对必需的药物。-患者需要用伴随药物治疗，所述伴随药物靶向血清素5-羟色胺受体1(5ht1r)或5-羟色胺受体2b(5ht2br)或σ非特异性受体，除了被认为对患者护理绝对必需的药物。23.患者具有可阻碍患者参与研究的任何显著医学病症、实验室异常或精神疾患。24.患者具有任何如果他/她参与研究会将患者置于不可接受的风险中的状况，包括实验室异常的存在。25.患者具有任何混淆从研究中解释数据的能力的状况。
[0310]
治疗期 一旦验证所有的纳入/排除标准且患者被视为有资格，则招募患者。患者必须在招募入3天内开始治疗。对于所有后续访视，允许
±
3天的管理窗口。
[0311]
在第一次维奈托克给药前(即，在斜升前)，患者将接受预防性措施，包括足够的水化和抗高尿酸剂，其将在斜升期期间继续(即，在斜升之前并继续，直至达到最后一次给药后或更长时间，按临床指示)。治疗周期的持续时间是28天。研究产品
[0312]
该研究将使用作为200mg和300mg片剂的口服5-氮杂胞苷用于口服施用。每个片剂均使用通常被认为安全且在市售药品中使用的赋形剂配制。
[0313]
维奈托克的市售形式将以10mg、50mg和100mg片剂用于口服施用。
[0314]
吉瑞替尼的市售形式将以40mg片剂用于口服施用。
[0315]
治疗施用和时间表 对于剂量探索(1b期)，在筛选后，有资格的患者将被分配为在28天治疗周期中第1-14(或21)天每日一次口服(po)接受5-氮杂胞苷300mg以及维奈托克或吉瑞替尼，如本实施例所述。
[0316]
为了允许有从治疗中受益的最佳机会，并且鉴于口服5-氮杂胞苷的作用机制以及维奈托克或吉瑞替尼组合的中值反应时间，患者应当用维奈托克治疗至少3个周期或用吉瑞替尼治疗至少6个周期，但患者将在以下情况下较早中止治疗：他们证明记录的从cr或pr复发、疾病进展、不可接受的ae、阻止进一步施用治疗的间发疾患、调查者决定撤回患者、撤回同意、不依从试验治疗或程序要求、死亡或管理原因。
[0317]
在28天周期中第1-14(或21)天，每日一次po给予口服5-氮杂胞苷，持续14(或21)天。每天将在大约相同的时间以大约240ml(8盎司)的室温水伴随或不伴随食物施用口服5-氮杂胞苷。
[0318]
在该研究的1b期剂量探索部分中，口服5-氮杂胞苷的起始剂量水平将是在每个28天周期的第1-14(或21)天300mg x 14天po qd。根据dlt的数量，剂量可以降低至200mg x 14天；或者如果耐受，剂量可以保持相同或以天增加治疗持续时间至300mg x 21天。
[0319]
当在同一天施用口服5-氮杂胞苷、维奈托克或吉瑞替尼时，将首先施用口服5-氮杂胞苷，随后施用维奈托克或吉瑞替尼。
[0320]
对于aml患者，将根据批准的标签(2019)在每个28天周期的第1至28天qd口服施用维奈托克。用于hr-mds的维奈托克给药在每个28天周期的第1至14天。对于第1周期进行短暂的剂量斜升，其中在第1天起始给药100mg，第2天给药200mg，以及第3天及以后给药400mg。随后几天将以400mg施用维奈托克。
[0321]
在该研究的1b期剂量探索部分中，维奈托克起始剂量水平将是在28天周期中对于aml患者为400mg po qd x 28天(a组)，而对于mds患者为400mg po qd x 14天(c组)。根据经历的dlt的数量并且如果与维奈托克有关，则可以在28天周期中通过将治疗持续时间降低至400mg po qd x 21天(a组)或通过将剂量降低至200mg po qd x 14天(c组)来递减维奈托克剂量。在2期剂量扩展中，rp2d将被给予患者。在2期剂量扩展部分中，维奈托克的rp2d将在28天周期中继续相同的时间表和时间安排(即，第3周期在第2周期后28天，等)。
[0322]
患者将在第1周期的维奈托克剂量斜升期间住院，持续至少8天(从第1天至第8
天)。这种住院治疗需要符合方案进行，且不构成严重不良事件。应指导患者在每天大约相同的时间 8小时使用他们的每日剂量。
[0323]
将在每个28天周期的第1-28天每天一次(qd)以120mg的推荐起始剂量口服施用吉瑞替尼应吩咐患者在每天大约同一时间服用他们的每日剂量。
[0324]
安全性随访 所有患者将在最后一次研究产品(ip)给药或eot访视后针对ae报告和伴随用药信息以及新的疾病疗法被追踪28天(以较晚者为准)。对于非fcbp，28天(
±
3天)安全性随访联系可以通过电话进行。对于fcbp，将在诊所完成28天的安全性随访以用于妊娠测试要求。此外，此后在任何时间使研究者知晓怀疑与ip有关的任何sae。
[0325]
存活随访 在治疗访视结束后，每4周所有患者将被追踪用于存活随访，在最后一次给药后持续长达1年或直到死亡、失访或试验结束，以先发生者为准。应以相同的时间表收集aml或mds的新疾病疗法。
[0326]
功效评估 连续血液和骨髓bm取样将用于确定从第2周期第1天开始对研究药物疗法的反应。
[0327]
在基线时，需要骨髓抽吸(bma)样品。如果抽吸物不可用，则必须收集活检物，并且可以根据机构惯例在收集抽吸物之外还收集活检物。筛选时还需要来自bma的细胞遗传学和分子谱分析(除非它们可以从患者过去90天的医疗记录中输入)。全血细胞计数、外周血涂片(pbs)和bma将用于确定具体时间点对疗法的反应。可在周期结束前最多4天即第25至28天获得样品。
[0328]
研究者将使用当地实验室结果，根据按疾病标准的以下指南，基于报告的血液学实验室参数、外周血涂片(pbs)、骨髓抽吸物(bma)和/或活检物评估对治疗的反应：
·
aml将根据修改的欧洲白血病网络(eln)aml反应标准(即修改为包括伴随部分血液学恢复的完全缓解(crh)和血液学反应)(h等人,blood,2017年1月26日,129(4):424-47)和iwg的aml反应标准(cheson b.d.等人,j clin oncol.2003,21(24):4642-92003)来评估。还将根据iwg mds hi标准(cheson b.d.等人,blood 2006；108(2):419
–
425)评估血液学改善(hi)。
·
将根据iwg的mds反应标准(cheson b.d.等人,blood 2006；108(2):419-425)评估mds治疗。
[0329]
将评价血液学反应，因为具有先前血液学障碍的患者可能被招募到了研究中。输注依赖性定义为在研究治疗前8周内已接受了≥2个单位的rbc和/或血小板。输注非依赖性定义为8周的时间段内没有输注。
[0330]
对于aml，疾病进展将被定义为从基线的以下变化之一：
·
对于基线时具有5％至70％骨髓(bm)原始细胞的患者：bm原始细胞计数百分比从基线增加》50％至≥20％；或
·
对于基线时具有》70％bm原始细胞的患者：外周血中的绝对原始细胞计数从基线加倍至≥10x109/l(10,000/μl)；或
·
自上次反应评估以来新的髓外疾病
·
具有以下至少一项的血液学改善后进展/复发：-从粒细胞或血小板中的最大反应水平减缩至少50％-hgb降低≥1.5g/dl-输注依赖性
[0331]
对于hr mds，疾病进展将被定义为从基线的以下变化之一：
·
低于5％的原始细胞：原始细胞增加≥50％至》5％原始细胞
·
5％-10％的原始细胞：原始细胞增加≥50％至》10％原始细胞
·
10％-20％的原始细胞：原始细胞增加≥50％至》20％原始细胞
·
20％-30％的原始细胞：原始细胞增加≥50％至》30％原始细胞
[0332]
任一以下项：
·
从粒细胞或血小板中的最大缓解/反应水平减缩至少50％
·
hgb浓度降低≥2g/dl
·
输注依赖性
[0333]
通过相隔至少1个月的2个连续反应评估确认疾病进展。疾病进展的日期被定义为满足上述状况之一的首次日期。在没有疾病进展(如上定义)或不可接受的毒性的情况下，如果患者获得益处，则根据研究者的判断，患者可以继续接受治疗。
[0334]
骨髓抽吸和针芯取样(活检)应根据护理标准进行，并在当地中心的实验室根据国际血液学标准化委员会(icsh)指南(lee,j.h.等人,j clin oncol.2017,35(24):2754-2763)进行分析。
[0335]
当研究治疗中止时，患者将接受治疗结束评价。治疗中止的原因将记录在ecrf页面和源文件中。在复发或进展之前中止研究治疗的患者将完成现场访视。对于因复发或进展而中止研究治疗的患者，可通过现场访视或电话进行存活随访。患者将在最后一次给药后被追踪长达1年，或直到他们死亡、失访、或从最后一次给药日期起一年内撤回进一步数据收集的同意。
[0336]
对于急性髓性白血病，将通过最佳总体反应类别总结反应标准：
·
cr/crh率和总反应率orr。orr包括完全缓解(cr)(即cr、cri crp)、形态学无白血病状态(mlfs)和部分缓解(pr)的所有反应。crh＝伴部分血液学恢复的完全缓解。cri＝伴不完全血液学恢复的cr。crp＝c反应蛋白。
·
微小残留病(mrd)反应率和mrd转化率也将作为功效变量被评估。微小残留病评估(通过mfc和/或下一代测序(ngs)评估)将与功效评估同时进行，并将集中评估前者。站点将确保收集并储存外周血和bma/骨髓活检(bmb)样品，以用于在每次bm收集时进行探索性测试。
·
将总结其他临床活性度量，包括总存活期(os)、无事件存活期(efs)、rfs、反应时间(cr、cri、crp、pr、mlfs)、反应持续时间(cr、crh和orr)、血液学改善率和1年存活率。
[0337]
对于髓性增生异常综合征，将通过最佳总体反应类别总结反应标准：
·
cr、pr、mcr
·
将总结其他临床活性度量，包括os，efs，rfs，cr、pr和mcr的反应时间和反应持续时间、血液学改善率和1年存活率。
[0338]
临床研究的结果显示在最大耐受剂量(mtd)、最大施用剂量(mad)和/或推荐2期剂量(rp2d)下的与维奈托克或吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷在患有aml或较高风险mds的患者中是安全且可耐受的，这些患者包括：(1)用与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷治疗的患有具有所有突变的新诊断aml的患者；(2)用与吉瑞替尼组合的口服5-氮杂胞苷治疗的患
有具有flt3itd或tkd突变的新诊断或复发和/或难治性aml的患者；以及(3)用与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷治疗的患有新诊断的高和极高风险mds的患者。
[0339]
另外，临床研究的结果还显示，口服5-氮杂胞苷在以rp2d与维奈托克组合给予时，在新诊断的aml或较高风险mds患者中是有效的，这些患者包括：(1)用与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷治疗的患有具有所有突变的新诊断aml的患者；以及(2)用与维奈托克组合的口服5-氮杂胞苷治疗的根据修订的国际预后评分系统(ipss-r)新诊断为hr-mds的患者。*****
[0340]
已经结合某些实施方案和实施例描述了本公开文本；然而，所要求保护的本发明不应限制于这些具体实施方案和实施例。
[0341]
尽管已经说明和描述了某些实施方案，但是应当理解，可以根据本领域的普通技术人员之一的知识在其中进行改变和修改，而不背离在如以下权利要求中所限定的其更宽的范围内的技术。
[0342]
可以在不存在本文没有明确公开的任一种要素和多种要素、任何一种限制或多种限制的情况下适当地实践本文说明性描述的实施方案。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当以广阔且无限制的方式来理解。另外，本文所采用的术语和表达已经用作描述性而非限制性的术语，并且不旨在使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效形式，但是应认识到在所要求保护的技术的范围内各种修改均是可能的。另外，短语“基本上由
……
组成”将被理解为包括那些具体叙述的要素和那些实质上不影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的另外要素。短语“由
……
组成”排除未指定的任何要素。
[0343]
本公开文本不受限于本技术中所述的特定实施方案。如对本领域技术人员将清楚的，可以在不背离其精神和范围的情况下，进行许多修改和变化。根据前述描述，除了本文中列举的方法和组合物之外，在本公开文本范围内的功能上等效的方法和组合物对于本领域技术人员而言将清楚。此类修改和变化旨在落于所附权利要求的范围内。本公开文本仅受限于所附权利要求的术语以及这些权利要求有权要求的等效物的全部范围。应当理解，本公开文本不受限于特定方法、试剂、化合物或组合物，其当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
[0344]
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
[0345]
如本领域技术人员应理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文所公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围(包括端点)的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围都可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。
[0346]
将本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并
入本文，如同具体且单独地指示将每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件通过引用以其整体并入一样。在通过引用并入的文本中包含的定义与本公开文本中的定义相抵触的程度上，将其排除。
[0347]
在以下权利要求中阐述了其他实施方案。