c-Abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用

c-abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用
技术领域
1.本发明实施例涉及化学药物领域，特别涉及c-abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。


背景技术：

2.肌萎缩性侧索硬化症(als)是一种致命的神经退行性疾病，与进行性肌肉失神经支配、虚弱、萎缩、痉挛、瘫痪和最终死亡有关。大约90％的肌萎缩性侧索硬化症病例为散发性(sals)，只有10％为家族性肌萎缩性侧索硬化症(fals)。
3.发明人发现现有技术中至少存在如下问题：现有的获批上市的用于治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物仅有利鲁唑和依达拉奉，然而，利鲁唑针对的靶点为谷氨酸、依达拉奉通过清除脑内自由基实现治疗，这两种药物的预防和治疗肌萎缩性侧索硬化症效果不甚理想，无法较为彻底地治愈实现肌萎缩性侧索硬化症。因此，本领域十分有必要寻找一种新的肌萎缩性侧索硬化症治疗策略。


技术实现要素：

4.本发明实施方式的目的在于提供一种c-abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。
5.为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了c-abl蛋白作为靶标在筛选预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。
6.本发明的第二方面提供了c-abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。
7.在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂通过诱导肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白或其突变体的降解实现预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
8.在一些优选的方案中，肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白包括tdp-43、tdp-25、tdp-35、tdp-a315t、sod1或sod1 g93a。
9.在一些优选的方案中，所述诱导肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白或其突变体的降解通过下述任一种或几种方式：
10.促进自噬相关基因转录，并吞噬所述肌萎缩性侧索硬化症致病基因表达的蛋白或其突变体；和
11.激活溶酶体分解所述肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白及其突变体；和
12.促进自噬蛋白表达，并吞噬所述肌萎缩性侧索硬化症致病基因表达的蛋白及其突变体。
13.在一些优选的方案中，所述自噬蛋白包括：p62蛋白和/或lc3c蛋白。
14.在一些优选的方案中，所述自噬相关基因为转录行为受tfeb调控的基因，优选地，
所述自噬相关基因为lamp1、map1lc3和sqstm1。
15.在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂包括sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体。
16.本发明的第三方面提供了sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体的用途，用于：
17.(1)制备c-abl抑制剂；和/或
18.(2)治疗性地或体外非治疗性地抑制c-abl蛋白；和/或
19.(3)制备tdp-43抑制剂；和/或
20.(4)治疗性地或体外非治疗性地抑制tdp-43蛋白或其突变体，或者降低tdp-43或其突变体的聚集物水平；和/或
21.(5)制备sod1 g93a抑制剂；和/或
22.(6)治疗性地或体外非治疗性地抑制sod1 g93a蛋白或其突变体，或者降低sod1g93a的聚集物水平；和/或
23.(7)制备tfeb入核促进剂或者自噬相关基因转录促进剂；和/或
24.(8)治疗性地或体外非治疗性地促进tfeb入核，并促进自噬相关基因的转录；和/或
25.(9)制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物；和/或
26.(10)预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
27.本发明的第四方面提供了一种预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症的方法，所述方法包括步骤：向治疗对象施用预防和/或治疗有效量的c-abl抑制剂。
28.在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂包括sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体。
29.本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
30.(1)本发明提供了c-abl抑制剂在制备有效预防和/或治疗神经退行性疾病药物的新用途，尤其是肌萎缩性侧索硬化症；
31.(2)本发明提供的c-abl抑制剂可诱导肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白及其突变体的降解；
32.(3)本发明提供了sc75741作为制备c-abl抑制剂的新用途；
33.(4)本发明提供了sc75741作为制备有效预防和/或治疗神经退行性疾病药物的新用途；
34.(5)本发明通过神经系统模型证明了sc75741对肌萎缩性侧索硬化症的治疗或改善的效果显著。
35.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
36.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
37.图1是根据本发明实施例中sc75741对tdp-43蛋白及其相关聚集物的降解图；
38.图2是本发明实施例中sc75741对tdp-43蛋白及其相关聚集物的降解的荧光图；
39.图3是本发明实施例中sc75741对tdp-43蛋白及其相关聚集物的降解的荧光图的统计图；
40.图4是本发明实施例中sc75741对肌萎缩性侧索硬化症相关蛋白聚集物sod1的降解图；
41.图5是本发明实施例中sc75741对肌萎缩性侧索硬化症相关蛋白聚集物sod1的降解的荧光图；
42.图6是本发明实施例中sc75741对tdp-43及其相关蛋白聚集物的降解不依赖于其靶点nf-κb；
43.图7是本发明实施例中sc75741体外激酶实验对c-abl蛋白的半数抑制曲线(ic50)图；
44.图8是本发明实施例中sc75741及pp-121、imatinib对tdp-43蛋白及其相关聚集物的降解图；
45.图9是本发明实施例中sc75741促进tfeb进入细胞核，并提高自噬相关基因的转录实验图；
46.图10是本发明实施例中tdp-43蛋白及其相关聚集物通过溶酶体发生降解图；
47.图11是本发明实施例中sh-sy5ykt25细胞用sc75741处理后活细胞拍摄激光共聚焦图；
48.图12是本发明实施例中hek293 p62敲除细胞用sc75741处理后抑制tdp-43相关聚集物的降解图；
49.图13是本发明实施例中hek293 atg8敲除细胞用sc75741处理后过表达lc3c促进tdp-43相关聚集物的降解图；
50.图14是本发明实施例中用sc75741处理神经系统模型图。
具体实施方式
51.本发明人在研究中发现，tdp43、tdp25和sod1等蛋白异常可能致使患肌萎缩性侧索硬化症的风险增加。但是已上市的治疗患肌萎缩性侧索硬化症的药物并不能够靶向清除这些蛋白或其突变体。本发明人通过大量实验，意外发现c-abl抑制剂可以靶向肌萎缩性侧索硬化症致病基因表达的蛋白或其突变体的聚集体，对治疗肌萎缩性侧索硬化症意义重大。
52.进一步地，本发明人还通过大量药物筛选，意外发现了sc75741可以作为c-abl抑制剂有效抑制c-abl蛋白磷酸化。
53.进一步地，本发明人通过神经系统模型数据验证了sc75741可治疗肌萎缩性侧索硬化症。
54.sc75741常被应用于作为nf-κb抑制剂，可抑制h5n1流感病毒，本发明在研究中发现，sc75741可通过抑制c-abl蛋白，促进tfeb进入细胞核增强自噬相关基因的转录表达进而促进tdp43蛋白聚集体通过自噬途径降解。
55.术语
56.除非另有指明，否则本文中所用的术语“sc75741”指的是下式所示化合物，中文名为：n-(6-苯甲酰基-1h-苯并咪唑-2-基)-2-(1-噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基-4-哌啶基)-4-噻唑甲酰胺，其cas号为：913822-46-5，
[0057][0058]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“c-abl抑制剂”指的是一种非受体型酪氨酸激酶的抑制剂，可抑制非受体型酪氨酸激酶磷酸化。
[0059]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“自噬相关基因”指的是参与细胞自噬调控的基因，例如：atg1、atg3、atg4、atg5、atg6、atg7、atg8、atg10、atg12、和atg16；更优选地，所述参与细胞自噬调控的基因为可以转录形成自噬蛋白的基因，例如：lamp1、map1lc3和sqstm1。
[0060]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“溶酶体”指的是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器，具有单层膜包被的囊状结构，内含多种水解酶，专为分解各种外源和内源的大分子物质。
[0061]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“自噬蛋白”指的是参与自噬过程的任意蛋白，例如：p62蛋白和lc3c蛋白。
[0062]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“tfeb”是一种细胞功能调控的重要转录因子，其激活可以引起自噬水平的提高。本发明的一个实施例中，c-abl抑制剂通过促进tfeb进入细胞核激活自噬相关基因的表达。
[0063]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“p62蛋白”指的是sqstm1蛋白，包括个结构域pb1、tb、lir和uba，是自噬蛋白的一种，在细胞中发挥自噬和调往的作用。
[0064]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“map1lc3”指的是，是自噬相关蛋白的一种。
[0065]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“sqstm1”指的是sequestosome-1，是一种重要的选择性自噬接头蛋白，其含有泛素相关结构域、kelch样环氧氯丙烷相关蛋白的作用区、微管相关蛋白1a/1b轻链3作用域、肿瘤坏死因子受体相关因子6、phox和bem1p结构域和zz型锌指区6个功能区域。
[0066]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“lamp1”指的是溶酶体关联膜蛋白1，属于lamp家族的单程i型膜蛋白。lamp1主要在细胞的内体-溶酶体膜中表达，它可以在溶酶体、内体和质膜之间穿梭。
[0067]
除非另有指明，否则本文中所用的术语“药学上可接受的盐”可以是指由药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备的药学上可接受的加成盐。在某些情况下，药学上可接受的盐是通过使本文所述的化合物与酸反应而获得的。术语“药学上可接受的盐”还
可以指通过使具有酸性基团的化合物与碱反应形成盐或通过先前确定的其他方法制备的药学上可接受的加成盐。药理学上可接受的盐没有特别限制，只要它可以用于药物中。本文所述的化合物与碱形成的盐的实例包括以下：其与无机碱如钠、钾、镁、钙和铝的盐；其与有机碱如甲胺、乙胺和乙醇胺的盐；或与二环己胺、n-甲基-d-葡糖胺或三(羟甲基)甲基胺反应形成的；其与碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸的盐；以及铵盐。所述盐可以是酸加成盐，其具体示例为与以下的酸加成盐：无机酸，如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸和磷酸；有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸和乙磺酸；酸性氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸。
[0068]
除非另有指明，否则本文中术语“预防”不应当被理解为限制了完全的成功，即完全的保护或完全的预防。更确切地说，本文中的预防是指在检测症状性病症之前给予的措施，其目的是通过帮助延迟，减轻或避免该特定病症来保持健康。
[0069]
除非另有指明，否则本文中，在治疗疾病或障碍的背景下，术语“治疗(treat、treating和treatment)”意指包括缓解或消除障碍、疾病或病症，其中本文所用的术语“障碍”应始终理解为意指“障碍、疾病或病症”或与障碍相关的症状中的一个或多个；或减慢障碍或病症或其一个或多个症状的进展、扩散或恶化。
[0070]
除非另有指明，否则本文中术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。
[0071]
除非另有指明，否则本文中术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的c-abl抑制剂。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随c-abl抑制剂的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
[0072]
药物和施用方法
[0073]
本发明的药物包含安全、有效量范围内的本发明c-abl抑制剂(活性成分)及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物中含有0.001-1000mg的活性成分/剂，较佳地0.05-300mg的活性成分/剂，更佳地，含有0.5-200mg的活性成分/剂。
[0074]
本发明的活性成分及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明的活性成分或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。活性成分的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
[0075]
除非另有指明，否则本文中术语“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0076]
施用本发明药物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
[0077]
本发明药物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0078]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的活性成分适用于需要治疗的哺乳
动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0079]
本发明的一个优选的实施方式中提供了c-abl蛋白作为靶标在筛选预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。
[0080]
本发明的一个优选的实施方式中提供了c-abl抑制剂在制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症药物中的应用。
[0081]
在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂通过诱导肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白及其突变体的降解实现预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
[0082]
在一些优选的方案中，肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白包括tdp-43、tdp-25或sod1。
[0083]
在一些优选的方案中，所述诱导肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白和/或其突变体的降解通过下述任一种或几种方式：
[0084]
促进自噬相关基因转录，并吞噬所述肌萎缩性侧索硬化症致病基因表达的蛋白和/或其突变体；和
[0085]
激活溶酶体分解所述肌萎缩性侧索硬化症相关致病基因表达的蛋白和/或其突变体；和
[0086]
促进自噬蛋白表达，并吞噬所述肌萎缩性侧索硬化症致病基因表达的蛋白和/或其突变体。
[0087]
在一些优选的方案中，所述自噬蛋白包括：p62蛋白和/或lc3c蛋白。
[0088]
在一些优选的方案中，所述自噬相关基因为转录行为受tfeb调控的基因，优选地，所述自噬相关基因为lamp1、map1lc3和sqstm1。
[0089]
在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂包括sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体。
[0090]
本发明的一个优选的实施方式中提供了sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体的用途，用于：
[0091]
(1)制备c-abl抑制剂；和/或
[0092]
(2)治疗性地或体外非治疗性地抑制c-abl蛋白；和/或
[0093]
(3)制备tdp-43抑制剂；和/或
[0094]
(4)治疗性地或体外非治疗性地抑制tdp-43蛋白或其突变体，或者降低tdp-43或其突变体的聚集物水平；和/或
[0095]
(5)制备sod1 g93a抑制剂；和/或
[0096]
(6)治疗性地或体外非治疗性地抑制sod1 g93a蛋白或其突变体，或者降低sod1 g93a的聚集物水平；和/或
[0097]
(7)制备tfeb入核促进剂或者自噬相关基因转录促进剂；和/或
[0098]
(8)治疗性地或体外非治疗性地促进tfeb入核，并促进自噬相关基因的转录；和/或
[0099]
(9)制备预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物；和/或
[0100]
(10)预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
[0101]
本发明的一个优选的实施方式中提供了一种预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症的方法，所述方法包括步骤：向患者施用c-abl抑制剂。
[0102]
在一些优选的方案中，所述c-abl抑制剂包括sc75741或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体、同位素变体或互变异构体。
[0103]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0104]
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本技术的示例性实施方式。
[0105]
实施例1、sc75741降解tdp-43及其相关蛋白聚集物实验
[0106]
sh-sy5y细胞以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。24小时后，转染gfp，gt43wt(tdp-43)，gt35(tdp-35)，gt25(tdp-25)，gt43 a315t(tdp-43a315t)质粒。24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。用200μl 2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#em1607-31；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色，见图1。
[0107]
如图1所示，sc75741可以降解野生型tdp-43和突变体tdp-43，而对gfp没有降解作用。
[0108]
sh-sy5y细胞以1*105个/ml密度接种于预先放入细胞爬片的12孔板中，每孔1ml。24小时后，转染gfp，gt43wt(tdp-43)，gt35(tdp-35)，gt25(tdp-25)，gt43 a315t(tdp-43a315t)质粒。转染24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。弃培养基，用pbs洗涤细胞2遍，再用4％多聚甲醛室温固定20分钟。弃固定液，用pbs室温静置洗涤2遍，每次2分钟。吸干pbs，封片，用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光，见图2。
[0109]
如图2所示，sc75741明显降低tdp-43及其突变体的聚集物。
[0110]
每一个样品重复6次，利用imagej软件分析荧光强度，并用prism 8.0进行双尾t检验，图像为平均值
±
标准差，****为p值小于0.0001，ns为没有显著差异，结果见图3。
[0111]
如图3所示，对图2的统计结果显示，sc75741可以显著降低tdp-43及其相关蛋白聚集物的量。
[0112]
实施例2、sc75741降解肌萎缩性侧索硬化症相关蛋白聚集物sod1
[0113]
sh-sy5y细胞以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。24小时后，转染gfp，gfp-sod1 g93a(sod1 g93a突变产生聚集物)质粒。24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。用200μl 2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10
μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1小时，以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色，见图4。
[0114]
如图4所示，sc75741明显降低sod1 g93a的聚集物，而不影响gfp的量。
[0115]
注：抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#et1607-31；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)。
[0116]
sh-sy5y细胞以1*105个/ml密度接种于预先放入细胞爬片的12孔板中，每孔1ml。24小时后，转染gfp，gfp-sod1 g93a质粒。转染24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。弃培养基，用pbs洗涤细胞2遍，再用4％多聚甲醛室温固定20分钟。弃固定液，用pbs室温静置洗涤2遍，每次2分钟。吸干pbs，封片，用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光，见图5。
[0117]
如图5所示，sc75741明显降低sod1 g93a的聚集物。
[0118]
实施例4、sc75741靶点nf-κb不参与sc75741诱导的tdp-43及其相关蛋白聚集物的降解
[0119]
h4gt25细胞(本实验构建的在h4细胞中受强力霉素(dox)诱导表达tdp-25的细胞株)以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。加入1μg/μl dox处理24h。分别加入sc75741(5μm),nf-κb抑制剂：cape(10μm),jsh-23(10μm)处理24小时。用200μl2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#em1607-31；phospho-c-abl(tyr245)购自cell signaling#2861；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色，见图6。
[0120]
如图6所示，抑制nf-κb并不会造成tdp-43及其相关蛋白聚集物的降解，且sc75741抑制了c-abl的磷酸化。说明，sc75741并不通过抑制其靶点nf-κb造成tdp-43及其相关蛋白聚集物的降解。
[0121]
实施例5、sc75741抑制c-abl的活力
[0122]
步骤1，制备1x激酶碱性缓冲液和终止缓冲液，用于测试激酶
[0123]
1)1x激酶碱性缓冲液：50毫米hepes，ph值7.5 0.0015％brij-35。
[0124]
2)终止缓冲液：100mm hepes，ph值7.5，0.015％brij-35
[0125]
0.2％涂层试剂#3，50mm edta。
[0126]
步骤2，配制化合物
[0127]
1)用100％二甲基亚砜将化合物稀释至反应中最终所需最高抑制剂浓度的50倍。将100μl该化合物稀释液转移至96孔板中的孔中。
[0128]
2)对于所有化合物，将管中的化合物转移到96孔储存板上的一个孔中，并连续稀
释。将20μl至60μl的100％二甲基亚砜转移到下一孔中，以此类推，共稀释成10个梯度浓度。
[0129]
3)准备中间板
[0130]
将10μl化合物从源板转移至新的96孔板作为中间板。向中间板的每个孔中添加90μl1x激酶缓冲液。在摇床上将化合物在中间板中混合10分钟。
[0131]
步骤3，准备分析板
[0132]
1)从96孔中间板向384孔板转移5μl各孔，一式两份。例如，96孔板的a1转移至384孔板的a1和a2。96孔板的a2为转移到384孔板的a3和a4等。
[0133]
步骤4，激酶反应
[0134]
1)配制2.5倍酶溶液；在1x激酶碱基缓冲液中加入激酶。
[0135]
2)制备2.5倍肽溶液；在1x激酶缓冲液中添加fam标记的肽和atp。
[0136]
3)分析板中已含有5μl 10％二甲基亚砜中的化合物。
[0137]
4)将2.5倍酶溶液转移至分析板中，向384孔分析板的每个孔中添加10μl2.5倍酶溶液。
[0138]
5)在室温下培养10分钟。
[0139]
6)将2.5倍肽溶液转移至分析板
[0140]
向384孔分析板的每个孔中添加10μl 2.5倍肽溶液。
[0141]
7)激酶反应和停止
[0142]
在28℃下培养一段时间。添加25μl停止缓冲液以停止反应。
[0143]
步骤5，卡尺读数
[0144]
收集卡尺上的数据。
[0145]
步骤6，曲线拟合
[0146]
1)从卡尺程序复制转换数据。
[0147]
2)将转换值转换为抑制值。
[0148]
抑制率＝(最大转换)/(最大-最小)*100。
[0149]“max”代表二甲基亚砜控制；“min”表示低控制。
[0150]
3)在xlfit excel加载项版本5.4.0.8中拟合数据以获得ic50值。
[0151]
使用的公式为：y＝底部 (顶部-底部)/(1 (ic50/x)^斜率)
[0152]
如图7所示，sc75741以浓度依赖的方式抑制c-abl激酶活力。ic50＝263nm。
[0153]
实施例6、c-abl抑制剂降解tdp-43及其相关蛋白聚合物：
[0154]
sh-sy5y细胞以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。24小时后，转染gfp，gt43wt(tdp-43)，gt35(tdp-35)，gt43 a315t(tdp-43a315t)质粒。24小时后，分别加入sc75741，pp-121，imatinib处理细胞24小时，终浓度为5μm。用200μl 2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#et1607-31；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色，见图8。
[0155]
如图8所示，c-abl抑制剂pp-121，imatinib显著降低tdp-43及其突变体的蛋白量。
[0156]
实施例7、sc75741促进tfeb入核，并促进自噬相关基因的转录：
[0157]
用1μg/ml dox预处理h4gt25细胞24小时，用5μm sc75741处理或用5μm sc75741再处理24小时，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，用0.5ml 0.5％triton x-100裂解缓冲液(50mm tris-hcl(ph 7.5)、0.5％triton x-100、137.5mm nacl、10％甘油、5mm乙二胺四乙酸(edta)和蛋白酶抑制剂混合物(bimake)在冰中裂解细胞15分钟，轻轻摇动。通过在4℃下以13000rpm离心15分钟来清除细胞裂解物，以产生细胞溶质和膜部分。对第一次离心收集的上清液进行分析。然后，用裂解缓冲液洗涤所得颗粒两次。在0.1ml的裂解缓冲液中重新悬浮该颗粒，补充0.5％十二烷基硫酸钠(sds)，并在低温室中以低输出量超声3次，以剪切基因组dna。通过在4℃下以13000rpm离心15分钟来清除细胞裂解物，以生成细胞核核组分。免疫印迹的方法如本专利方法相似，抗体采用tfeb(#a7311)abclonal。
[0158]
如图9a所示，通过比较细胞质组分和细胞核组分的tfeb蛋白量，表明经过sc75741处理tfeb在h4gt25细胞核内的含量有显著提高。
[0159]
使用rna分离试剂盒(vazyme)提取h4gt25细胞的总rna，并使用hiscript iii第一链cdna合成试剂盒(vazyme)将其反转录为cdna。使用b818-480ii(罗氏应用科学公司)进行实时pcr检测。使用的寡核苷酸如下：
[0160]
gapdh：
[0161]
正向引物:5'-attgtcgtcatgggtgaa-3'(seq id no.1)，
[0162]
反向引物：5'-agggtgctagagagttggt-3'(seq id no.2)，
[0163]
dpp7：
[0164]
正向物:5'-cggagcaggacctgagtgg-3'(seq id no.3)，
[0165]
反向引物：5'-cggagcaggatctgg-3'(seq id no.4)，
[0166]
ctsd：
[0167]
正向引物:5'-cttcgacaccatgcacc-3'(seq id no.5)，
[0168]
反向引物：5'-tacttggagcc-3'(seq id no.6)，
[0169]
mcoln1：
[0170]
正向引物:5'-tgttctgcgacaagttc-3'(seq id no.7)，
[0171]
反向引物：5'-tgttctcttccggaatgtc-3'(seq id no.8)，
[0172]
lamp1：
[0173]
正向引物:5'-ccaatctgctgctctc-3'(seq id no.9)，
[0174]
反向引物：5'-agcaatcaccagagagactgggg-3'(seq id no.10)。
[0175]
ctsf：
[0176]
正向引物:5'-acagagggttccgcacta-3'(seq id no.11)，
[0177]
反向引物：5'-gcttgcttcatcttgttgcca-3'(seq id no.12)，
[0178]
atp6v0e1：
[0179]
正向引物:5'-cattgtgatgaggcgtgttctgg-3'(seq id no.13)，
[0180]
反向引物：5'-aactccccggttagaccctta-3'(seq id no.14)，
[0181]
sqstm1：
[0182]
正向与引物:5'-caggtccaagttgagg-3'(seq id no.15)，
[0183]
反向引物：5'-ataaaacaggccattgc-3'(seq id no.16)，
[0184]
map1lc3：
[0185]
正向引物:5'-aggctacaaggtgagaa-3'(seq id no.17)，
[0186]
反向引物：5'-gttcacacaggagag-3'(seq id no.18)。
[0187]
如图9b所示，通过qpcr测定，tfeb下游的自噬相关基因lamp1、map1lc3、sqstm1的mrna水平有显著提高。
[0188]
实施例8、sc75741通过溶酶体途径降解tdp-43及其相关聚集物
[0189]
h4gt25细胞(本实验构建的在h4细胞中受强力霉素(dox)诱导表达tdp-25的细胞株)以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。加入1μg/μl dox处理24h。加入sc75741(5μm)单独或联用溶酶体抑制剂如：bafilomycin a1(100nm),nhcl(20mm) leupeptin(100nm),e64d(10μm)处理8小时。用200μl 2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#em1607-31；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色。
[0190]
如图10所示，溶酶体抑制剂可以显著抑制sc75741对tdp-25蛋白聚集物的降解作用，说明sc75741通过溶酶体途径降解tdp-43及其相关蛋白聚集物。
[0191]
sh-sy5ykt25细胞(为本实验构建稳定表达tdp-25-keima的细胞株)以1.5*105个/ml种于活细胞专用培养皿中，每皿2ml。24小时后用lysogreen(溶酶体特异探针)(1000x)染色30分钟，替换新鲜培养基后，加入sc75741，终浓度5μm，3小时后置于奥林巴斯fv3000激光共聚焦显微镜下采集图像。
[0192]
如图11所示，sc75741可以明显诱导tdp-25-keima与溶酶体共定位，说明sc75741降解tdp-43及其相关蛋白聚集物通过溶酶体途径。
[0193]
实施例9、sc75741降解tdp-43及其相关蛋白聚集物依赖p62和lc3c蛋白
[0194]
hek293t wt和p62敲除细胞以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。24小时后，转染gfp-tdp25质粒。24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。用200μl 2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#et1607-31；p62抗体购自proteintech tm，##18420-1-ap；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色。
[0195]
如图12所示，p62敲除阻止了sc75741对tdp-25的降解，说明sc75741降解tdp-43及其相关蛋白聚集体依赖于p62。
[0196]
hela atg8敲除细胞以2*105个/ml，密度种于6孔板中，每孔2ml。24小时后，共同转染gfp-tdp25和lc3c质粒。24小时后，加入sc75741处理细胞24小时，终浓度为5μm。用200μl2xsds上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳100v2h；转膜300ma，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(gfp抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#et1607-31；ha-tag抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#0906-1；tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#m1305-2)以一定稀释比(tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，pbst(磷酸盐缓冲液 0.1％tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(goat anti-mouse igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31430；goat anti-rabbit igg(h l)二抗购自thermo fisher scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，pbst洗涤3遍每次10分钟。ecl显色。
[0197]
如图13所示，lc3c蛋白本身过表达促进了tdp-25的降解，其加强了sc75741对tdp-25的降解，这说明sc75741对tdp-43及其相关蛋白聚集物的降解依赖lc3c。
[0198]
实施例10、tdp25转导小鼠初级皮质神经元，sc75741处理可以减轻tdp25的神经毒性
[0199]
图14所示，在第3天用tdp25或gfp转导皮质神经元，然后在指定时间用1μm或2.5μmsc75741处理。在第10天对细胞形态(bf)和gfp荧光进行成像。比例尺，40μm。细胞来自e16.5小鼠皮层的原代小鼠皮层神经元，在补充有b-27(thermofisher，1750444)、glutax(thermofisher，35050061)和青霉素链霉素(thermofisher，15070063)的神经基础培养基(thermofisher，21103049)中培养。实验所用神经元细胞以350000个细胞/孔的密度接种于铺有12mm聚d-赖氨酸涂层(0.1％wt/vol)玻璃盖玻片(bioland，cgs010-12c)的24孔板中。3天后，在神经元特异性人突触蛋白1启动子的控制下，用表达egfp_tdp25或acgfp的慢病毒感染神经元。在感染后24小时(1μm)和96小时(2.5μm)加入sc75741处理神经元。
[0200]
如图14所示，与gfp对照组相比，tdp25积累可导致轴突变性和神经细胞死亡。与未经处理的神经元相比，经sc75741处理的神经元保持了广泛的突起生长，表明其具有更好的生存能力。这些结果表明sc75741可以减轻tdp25的神经毒性。
[0201]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。