一种具有可控尺寸蛋白质基纳米颗粒的抗菌液

1.本发明属于医用材料技术领域，具体涉及到一种具有可控尺寸蛋白质基纳米颗粒的抗菌液，对于细菌、真菌均有很强的杀菌能力，并且也有很强的抗病毒能力。


背景技术：

2.细菌感染作为全球十大死亡原因之一，威胁着无数人的生命。上世纪20年代青霉素的发现，开创了抗生素抗菌的新篇章，是20世纪最伟大的发明。但是随后抗生素的滥用也大大促进了细菌耐药性的发展。每一种新型抗生素在临床的使用都会带来新的耐药株，甚至产生多重耐药的“超级耐药菌”。抗生素耐药性在世界范围内都是一个日益严重的问题。据世界卫生组织统计，全球病患中由于感染而导致的死亡，其中85％以上是由于耐药菌的感染导致的，这一恶性的结果给人类的生命健康和经济带来了极大的负担。每年有超过70万以上的人死于耐药性疾病。“后抗生素时代”的威胁迫切需要新型抗菌材料和方法来替代抗生素，应对这一危机。
3.抗菌酶如溶菌酶、溶葡球菌酶等，由于其生物相容性高，近些年来得到了越来越多的关注。但是其抗菌能力的局限性也限制了它的发展。因此，能否对其进行改性，保留其生物相容性的同时，还能进一步提高它的抗菌性能，成为了很大的挑战。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服抗生素耐药性的缺点，提供一种制备简单，生物安全，不会引起细菌耐药，且可有效清除细菌生物膜的多功能抗菌液。
5.针对上述目的，本发明采用的抗菌液是将改性剂和蛋白质溶于水中，并用naoh调节ph至3～8后，室温反应5～10小时得到的具有可控尺寸蛋白质基纳米颗粒的分散液。
6.上述蛋白质为溶菌酶、乳白蛋白、胰岛素、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、α-乳白蛋白、纤维蛋白原、β-淀粉样蛋白、转铁蛋白、胶原蛋白、胃蛋白、角蛋白、肌红蛋白、血红蛋白、大豆蛋白、乳铁蛋白、清蛋白、白蛋白、甲状腺乳球蛋白、朊蛋白、aβ肽、α-突触核蛋白、α-淀粉酶、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶、核糖核酸酶a、细胞色素c、胱抑素c、dna聚合酶、干酪素、亨廷顿蛋白、免疫球蛋白轻链中任意一种或多种。
7.上述改性剂为半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、谷胱甘肽、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二巯基丁二酸、亚硫酸钠、β-巯基乙醇、双氧水、臭氧、高铁酸钠、三价钴盐、氯酸盐、高锰酸钾、过硫酸盐、重铬酸钾、浓硫酸、盐酸、硝酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、氟气、氯气、铋酸钠、高碘酸、二氯化铅、盐酸胍、尿素、三氟乙醇、六氟异丙醇、三氟乙酸中任意一种或多种。
8.上述抗菌液，优选蛋白质与改性剂的质量比为1：0.5～2。
9.上述抗菌液，优选溶于水中的蛋白质浓度为1～50mg/ml、改性剂浓度为1～50mg/ml。
10.上述抗菌液中，所述蛋白质基纳米颗粒的尺寸为10～200nm。
11.将上述抗菌液旋涂或者喷涂至不同的待改性基材表面，即可得到抗菌涂层。其中，
所述待改性基材可以为现有的任何用于成膜的材料，几乎不限于形状和材质。具体可以包括：(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金等；(2)无机材料：二氧化硅、二氧化钛、碳素材料、硅、氮化钛等无机材料等；(3)高分子材料：涤纶(pet)、聚乙烯醇(pvalc)、聚乙烯(pe)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)、聚氨酯(pu)、聚丙烯(pp)、聚酰胺、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯腈、聚丙烯酸(paa)及其衍生物、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯等；(4)天然生物材料：可塑性淀粉基材料(psm)、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸钠、明胶等；(5)人工合成多肽类水凝胶材料：聚l-谷胺酸、聚l-赖氨酸等。基材的种类不限于以上材料，也可以为以上几种材料的混合材料。
12.将质量分数为5％～30％的高分子化合物溶于上述抗菌液，即可得到抗菌凝胶。其中，所述高分子化合物包括淀粉、纤维素、明胶、果胶、魔芋胶、卡拉胶、阿拉伯胶、琼脂、海藻胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、角叉胶、多糖衍生物、胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸中任意一种或多种。
13.将上述抗菌液透析1天后冻干，即可得到抗菌粉末制剂；将粉末制剂在压片机压片，即可得到抗菌片制剂。
14.本发明的有益效果如下：
15.1.本发明抗菌液无需添加抗生素发挥抗菌作用，可有效避免因不恰当使用抗生素所致细菌耐药，且自身不会使细菌产生耐药性。
16.2.本发明抗菌液带净正电荷，具有良好的生物相容性和纳米材料的高杀菌性能，除了对于细菌、真菌有很好的抗菌效果外，还具有很高的抗病毒性能。
17.3.本发明抗菌液可有效抑制生物膜的形成，同时对于已形成的生物膜有很好的清除效果。
18.4.本发明抗菌液可抑制米、中药等在潮湿环境下的发霉。
19.5.本发明抗菌液的制备方法简单，生物安全，纳米颗粒尺寸可控，可做成抗菌涂层、凝胶、粉末、压片等各种形式的抗菌剂，其使用方式也比较多样化，包括口服、肌肉注射、静脉注射、贴片、微针、雾化吸入、喷涂、含漱液、牙膏、食品添加剂等多种使用方式。
附图说明
20.图1是实施例1抗菌液中纳米颗粒的尺寸分布图。
21.图2是实施例2抗菌液中纳米颗粒的尺寸分布图。
22.图3是实施例1抗菌液对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、热带念珠菌的杀菌率分布图。
23.图4是实施例1抗菌液对于腺病毒的抗病毒效果图。
24.图5是实施例1抗菌液的溶血实验结果。
25.图6是金黄色葡萄球菌对于实施例1抗菌液的耐药性实验结果。
26.图7是实施例1抗菌液对大米防霉实验结果。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于
这些实施例。
28.实施例1
29.在室温下，将5mg/mll-半胱氨酸水溶液和5mg/ml溶菌酶水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液分别调节ph至6.5、7.0、7.5，室温下反应8小时，得到抗菌液。由图1可见，所得抗菌液其纳米颗粒实现10nm到100nm可控。
30.实施例2
31.在室温下，将10mg/ml谷胱甘肽水溶液和10mg/ml溶菌酶水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液分别调节ph至6.5、7.0、7.5，室温下反应8小时，得到抗菌液。由图2可见，所得抗菌液中纳米颗粒同样实现10nm到200nm可控。
32.实施例3
33.在室温下，将5mg/ml牛血清白蛋白水溶液和5mg/ml三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液按体积比为2：1混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液分别调节ph至7.0、7.5、8.0，室温下反应5小时，得到抗菌液。
34.实施例4
35.在室温下，将5mg/ml谷胱甘肽水溶液和5mg/ml溶菌酶水溶液按体积比为1：2混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至7.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。
36.实施例5
37.在室温下，将15mg/ml三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液水溶液和15mg/ml乳白蛋白水溶液按体积比为1：2混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至8.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。
38.实施例6
39.在室温下，将10mg/ml l-半胱氨酸水溶液和10mg/ml溶菌酶水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至6.5，室温下反应8小时，得到抗菌液。将该抗菌液旋涂于石英片上，即可得到抗菌涂层。
40.实施例7
41.在室温下，将10mg/ml谷胱甘肽水溶液和10mg/ml溶菌酶水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至7.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。将该抗菌液喷涂至pp表面，即可得到抗菌涂层。
42.实施例8
43.在室温下，将5mg/ml三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液和5mg/ml胰岛素水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至8.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。将该抗菌液喷涂至不锈钢表面，即可得到抗菌涂层。
44.实施例9
45.在室温下，将5mg/ml二硫苏糖醇水溶液和5mg/ml人血清白蛋白水溶液按体积比为2：1混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至8.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。将0.15g明胶溶于1ml抗菌液，即可得到抗菌凝胶。
46.实施例10
47.在室温下，将10mg/ml巯基乙醇水溶液和10mg/ml溶菌酶水溶液等体积混合后，用1mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至7.0，室温下反应8小时，得到抗菌液。将0.2g壳聚糖溶于
1ml抗菌液，即可得到抗菌凝胶。
48.为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1的抗菌液进行了各种性能测试，具体实验如下：
49.1、抗菌活性测试
50.基于菌落计数法评估上述抗菌液的抗菌活性，使用两种细菌(金刚色葡萄球菌atcc6538和大肠杆菌atcc25922)和一种真菌(热带念珠菌atcc1369)。在进行体外抗菌测试之前，将菌液在70rpm的摇动下于37℃在50ml mhb培养基的离心管中过夜培养。使细菌或真菌处于对数生长期。离心收集菌，并用pbs缓冲液洗三次去除残留的培养基，再以108cfu/ml的浓度重悬于pbs缓冲液中。取100μl重悬后菌液加入900μl抗菌液中，37℃下孵育8小时，将细菌或真菌悬液连续稀释并铺在mha板上。将这些mha板在37℃下孵育24小时后，记录菌落数。抗菌活性由杀菌率表示，杀菌率根据以下公式计算：
[0051][0052]
其中c0表示空白pbs中菌落数目，c为抗菌液中菌落数。实验结果如图3所示。结果表明，该抗菌液对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及热带念珠菌均有很高的杀菌率。
[0053]
2、抗病毒性能
[0054]
用完全培养基制备2ml密度为3～5
×
104个/ml的293t细胞悬液，接种到6孔板中，37℃培养16～24小时，至细胞汇合度达到30％，弃去孔板中上清液，加入1ml完全培养基，再加入腺病毒溶液(用基础培养基将腺病毒稀释至统一滴度1
×
108tu/ml)，其中三个孔内加入10μl pbs缓冲溶液，另外三个孔内加入10μl抗菌液。混匀后继续培养。48小时后在荧光显微镜下拍照并统计gfp阳性的细胞个数，计算感染率。图4结果表明，加了10μl抗菌液的细胞没有被病毒感染，说明该抗菌液有很好的抗病毒能力。
[0055]
3、溶血实验
[0056]
将新鲜的血液离心，收集血红细胞，用pbs缓冲液洗三次。将血红细胞以5％(v/v)分散于pbs缓冲液中。将抗菌液稀释至不同浓度后，将100μl血红细胞分散液加入900μl不同浓度的抗菌液中，37℃下孵育1小时。100μl血红细胞分散液加入900μl pbs缓冲液中为空白组，100μl血红细胞分散液加入900μl二次水中为阳性对照组。离心后，取上清液测od
540
。溶血率的计算公式如下：
[0057][0058]
图5结果表明，当抗菌液达到10mg/ml，其溶血率依旧很低，由此可见，抗菌液的血液相容性良好。
[0059]
4、耐药性测试
[0060]
取10ml在mhb中处于对数生长期的金黄色葡萄球菌，用mhb将其稀释至105cfu/ml作为工作液。将抗菌液以不同浓度分散于mhb中，然后取100μl与100μl工作液混合后加入96孔板。将孔板置于酶标仪中，37℃下测其od590，观察细菌生长情况。其中能抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌液最低抑菌浓度(mic)。然后以0.125
×
mic培养细菌。再将处于对数期的细菌重复以上过程。即可得到图6。结果表明，所得抗菌液并不会诱导细菌产生耐药性。
[0061]
5、大米防霉变实验
[0062]
取10g大米平均分成两组，一组用去离子水浸泡0.5h，为空白组；另一组用实施例1中ph＝7.0的抗菌液浸泡0.5h，为实验组。将两组大米晾干后置于恒温恒湿箱(25℃，99％rh)，每天观察两组大米霉变情况。结果如图7所示，空白组大米在第10天已有明显霉变，其中第34天已经有了很大的霉斑，当到62天时，空白组大米已经被霉菌完全覆盖，而实验组大米62天时仍与第一天保持一致。因此，该抗菌液可有效抑制大米的霉变。
[0063]
上述实施例中的蛋白质也可以为β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、纤维蛋白原、β-淀粉样蛋白、转铁蛋白、胶原蛋白、胃蛋白、角蛋白、肌红蛋白、血红蛋白、大豆蛋白、乳铁蛋白、清蛋白、白蛋白、甲状腺乳球蛋白、朊蛋白、aβ肽、α-突触核蛋白、α-淀粉酶、胃蛋白酶、辣根过氧化物酶、核糖核酸酶a、细胞色素c、胱抑素c、dna聚合酶、干酪素、亨廷顿蛋白、免疫球蛋白轻链中任意一种或多种，改性剂也可以为二巯基丁二酸、亚硫酸钠、β-巯基乙醇、双氧水、臭氧、高铁酸钠、三价钴盐、氯酸盐、高锰酸钾、过硫酸盐、重铬酸钾、浓硫酸、盐酸、硝酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、氟气、氯气、铋酸钠、高碘酸、二氯化铅、盐酸胍、尿素、三氟乙醇、六氟异丙醇、三氟乙酸中任意一种或多种。
[0064]
将本发明抗菌液旋涂或者喷涂至不同的基材表面，均可得到抗菌涂层。所述基材可以为现有的任何用于成膜的材料，几乎不限于形状和材质。具体可以包括：(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金等；(2)无机材料：二氧化硅、二氧化钛、碳素材料、硅、氮化钛等无机材料等；(3)高分子材料：涤纶(pet)、聚乙烯醇(pvalc)、聚乙烯(pe)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)、聚氨酯(pu)、聚丙烯(pp)、聚酰胺、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯腈、聚丙烯酸(paa)及其衍生物、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯等；(4)天然生物材料：可塑性淀粉基材料(psm)、海藻酸钠、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸钠、明胶等；(5)人工合成多肽类水凝胶材料：聚l-谷胺酸、聚l-赖氨酸等。基材的种类不限于以上材料，也可以为以上几种材料的混合材料。
[0065]
将质量分数为5％～30％的高分子化合物溶于本发明抗菌液，可得到抗菌凝胶。其中，所述高分子化合物包括淀粉、纤维素、明胶、果胶、魔芋胶、卡拉胶、阿拉伯胶、琼脂、海藻胶、海藻酸、透明质酸、壳聚糖、角叉胶、多糖衍生物、胶原、聚l-赖氨酸、聚l-谷胺酸中任意一种或多种。
[0066]
将本发明抗菌液透析1天后冻干，即可得到抗菌粉末制剂；将粉末制剂在压片机压片，即可得到抗菌片制剂。