一种北柴胡皂苷类成分HPLC指纹图谱的构建方法和应用

一种北柴胡皂苷类成分hplc指纹图谱的构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及柱色谱法，具体涉及一种北柴胡皂苷类成分hplc指纹图谱的构建方法及其在质量检测中的应用。


背景技术：

2.北柴胡为伞形科植物北柴胡的干燥根，主要有解表退热，疏肝解郁，升举阳气的功效。主治表证发热，少阳证，肝郁气滞，气虚下陷，脏器脱垂，退热截疟，含有皂苷、黄酮、多糖、挥发油、油酸、亚麻酸、硬脂酸等多种化学成分。主产于我国河北、河南、山西、辽宁、陕西、吉林等地。现行《中国药典》对柴胡质量控制方法以柴胡皂苷a与柴胡皂苷d的总含量作为药材质量评价的指标，难以从整体上反映药材的质量。
3.指纹图谱技术作为一种多组分化学成分样品的有效质量控制方法，能够从整体上反映出待测样品的整体性、特征性，目前被广泛应用于中草药的质量控制。已有较多文献报道了柴胡的皂苷类指纹图谱，但存在以下弊端：第一，指纹图谱运行时间较长，如崔凤侠等（柴胡的hplc指纹图谱研究，华西药学杂志，第28卷，第1期，2013）建立柴胡指纹图谱方法运行时间为90min；第二，流动相组成复杂，如张威等（秦岭地区北柴胡指纹图谱，中成药，第41卷，第4期，2019年）建立的方法使用乙腈-0.1%磷酸的流动相系统。在指纹图谱分析中，检测时间长以及流动相组成复杂均会导致方法的重现性降低。因此，为了准确评价北柴胡药材的质量，需要建立一种运行时间短、色谱组成简单、重现性好的皂苷类hplc指纹图谱。


技术实现要素：

4.本发明针对现有柴胡的皂苷类指纹图谱分析检测时间长以及流动相组成复杂导致的重现性降低等问题，提供一种能全面反映北柴胡皂苷类成分的hplc指纹图谱的构建方法，具有运行时间短，流速小，流动相系统稳定且重现性较好，易推广的优势。
5.本发明通过如下技术方案实现：一种北柴胡皂苷类成分hplc指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：第一步，测试溶液的制备：取过四号筛的柴胡粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，30℃水温超声（功率200w，频率40khz）处理30min，滤过，用20ml甲醇分两次洗涤锥形瓶及滤渣，洗液和滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；第二步，吸取测试溶液至高效液相色谱检测，所述液相色谱检测条件如下：十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；柱温为25-35℃，流速为0.6-1.2ml/min，检测波长为203-230 nm，流动相为乙腈和水条件下梯度洗脱；第三步，测定，精密吸取测试溶液10μl，注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，得到指纹图谱。
6.进一步地，所述柱温为30℃，流速为0.8 ml/min，检测波长为210nm。
7.进一步地，所述梯度洗脱条件为0-30 min，30%-55% a相，30-36 min，55%-66% a
相，36-40min，66%-87% a相，40-50min，87%-96% a相，50-53min，96%-100% a相，53-65min，100%-100% a相，其中a相为乙腈，b相为水。
8.进一步地，所述指纹图谱有11个共有峰，以5号峰为参照峰，相对保留时间如下：1号峰：0.505
±
0.002；2号峰：0.535
±
0.001；3号峰：0.711
±
0.001；4号峰：0.886
±
0.001； 6号峰：1.097
±
0.005；7号峰：1.475
±
0.001；8号峰：1.596
±
0.001；9号峰：1.616
±
0.002；10号峰：1.670
±
0.001；11号峰：1.999
±
0.001。
9.所述得到的北柴胡皂苷类指纹图谱应用于北柴胡质量检测。
10.本发明的有益效果如下：1. 样本前处理采取了2020版《中国药典》的方法，实现1次备样既可以进行含量测定也可以进行指纹图谱分析，节约了实验成本；2. 色谱运行时间短（65min），流速低（0.8ml/min），节约色谱试剂，降低了分析成本；3. 流动相组成简单，采用了乙腈-水的流动相系统，重现性好。建立的北柴胡指纹图谱有11个共有峰，且5个皂苷类成分已被指认，可用于更准确地评价北柴胡的药材质量。
附图说明
11.图1为乙腈-水流动相条件下的北柴胡hplc指纹图谱，图中1-11号共有峰在紫外210nm下检测；从左到右分别是共有峰1-11。
12.图2为北柴胡指纹图谱运行时长优化对比色谱图。
13.图3为不同产地北柴胡药材指纹图谱对比。
具体实施方式
14.下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。各实施例中使用到的试剂和器材如下：1. 仪器agilent 1260高效液相色谱仪（agilent公司），g7111a四元梯度泵，g7129a自动进样器，g7117c紫外检测器，超声波清洗器(kq5200e，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱venusil xbp c18（250mm
×
4.6mm
×
5μm）。
15.2. 试剂乙腈（色谱纯，fisher公司），超纯水，其余试剂均为分析纯。
16.表1 不同产地柴胡药材信息及相似度计算结果
实施例1色谱运行时间的确定及共有峰的指认1. 色谱运行时间的确定80min可以实现较好的色谱分析，进一步对梯度进行优化并缩短运行时间，发现60min与55min在色谱运行后期，色谱峰分离度变差，故最佳运行时长定为65min（如附图2）2. 共有峰的指认经对照品比对，确定北柴胡皂苷类hplc指纹图谱中所选的11个共有峰中包括以下化合物：1号峰：柴胡皂苷c；2号峰：柴胡皂苷f；3号峰：柴胡皂苷a；4号峰：柴胡皂苷e；5号峰：柴胡皂苷d。
17.实施例2指纹图谱方法学考察下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：取柴胡粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含 5%浓氨试液的甲醇溶液 25ml，密塞，30℃水温超声处理(功率200w，频率 40khz)30分钟，滤过，用甲醇 20ml 分 2 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
18.精密度实验：取柴胡药材（5），连续进样6次，把5号峰作为参照峰，记录其余共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各色谱峰的相对保留时间的rsd在0.02%~0.07%；相对峰面积的rsd在0.30%~2.54%，表明柴胡的待测溶液通过高效液相色谱分析，整个检测系统的精密度良好。
19.表2北柴胡皂苷类指纹图谱精密度相对峰面积结果
表3北柴胡皂苷类指纹图谱精密度相对保留时间结果重复性实验：取柴胡药材（5），备样6份，进行高效液相色谱的测定，把5号峰作为参照峰，记录其余共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各色谱峰的相对保留时间的rsd在0.04%~0.23%；相对峰面积的rsd在0.92%~2.90%，表明该方法重现性良好。
20.表4北柴胡皂苷类指纹图谱重复性相对峰面积结果
表5北柴胡皂苷类指纹图谱重复性相对保留时间结果稳定性实验：取柴胡药材（5），分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时进样测定，把5号峰做为参照峰，记录其余共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，样品24h各色谱峰的相对保留时间的rsd在0.05%~0.37%；相对峰面积的rsd在0.35%~1.58%，表明北柴胡的待测溶液在24h内通过高效液相色谱分析稳定性良好。
21.表6北柴胡指纹图谱稳定性相对峰面积结果表7北柴胡指纹图谱稳定性相对保留时间结果实施例3不同产地北柴胡hplc指纹图谱比较利用上述建立的北柴胡hplc指纹图谱条件对10批不同产地北柴胡药材（表1）进行测定。
22.取柴胡粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含 5%浓氨试液
的甲醇溶液 25ml，密塞，30℃水温超声处理(功率200w，频率 40khz)30分钟，滤过，用甲醇 20ml 分 2 次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得待测液。以色谱柱venusil xbp c18（250mm
×
4.6mm
×
5μm）为固定相，按照如下液相条件进行测试：紫外检测波长210nm；柱温为30℃；进样量为10μl；流速为0.8ml/min；梯度洗脱条件为0-30 min，30%-55% a相，30-36 min，55%-66% a相，36-40min，66%-87% a相，40-50min，87%-96% a相，50-53min，96%-100% a相，53-65min，100%-100% a相，其中a相为乙腈，b相为纯水。每次测样完成后，系统平衡5min后再次进样。
23.如附图3所示，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版》对不同产地北柴胡指纹图谱进行分析，找到11个共有峰，生成对照图谱r，进行多点校正后进行相似度评价，结果显示，不同产地北柴胡hplc指纹图谱整体较为接近，本专利所收集的10批北柴胡药材与生成的对照图谱相似度在0.85以上（见表1）。说明，本专利建立的指纹图谱方法可以用于柴胡药材皂苷类成分的整体质量评价。