脱氢松香胺并方酰胺化合物在抗肿瘤药物开发中的应用及其药物组合物

1.本发明属于抗肿瘤药物开发技术领域，具体涉及一种脱氢松香胺并方酰胺化合物在抗肿瘤药物开发中的应用。


背景技术：

2.近年来，天然产物因其显著的抗肿瘤、抗菌和抗真菌活性而被广泛研究。其中，松香因其具有优良的生物活性而受到越来越多的关注。脱氢松香胺是松香的重要改性产物之一。而脱氢松香胺衍生物的抗肿瘤、抗菌、抗真菌、细胞毒和抗寄生虫活性是近年来森林化学领域的研究热点。
3.此外，方酸是一种有趣的小分子，具有近乎完美的方形形状，其类似物由于具有重要的氢键供体和受体而具有多种生物活性。方酰胺由于具有氢键选择性结合的能力，在不对称有机催化领域得到了广泛的研究。除了在催化方面的应用，方酰胺作为分子识别受体的能力目前正在药物化学方面进行探索。本课题拟对脱氢松香胺结合方酰胺合成一系列脱氢松香胺衍生物并对其生物活性进行评价，为新药发现提供可用的候选化合物。


技术实现要素：

4.本发明涉及抗肿瘤药物领域，脱氢松香胺并方酰胺衍生物作为一类新型二萜类结构，通过体外抗肿瘤活性实验研究，本发明化合物均显示出不同程度的抗肿瘤细胞增殖活性，低浓度时即可强效抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞产生g1期阻滞，并诱导肿瘤细胞凋亡。体内抗肿瘤实验研究表明，本发明化合物能够明显抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长。该类化合物的制备过程简单易行，原料价格低廉，易于获取；因此，这类新型脱氢松香胺并方酰胺结构为抗肿瘤新药开发提供了基础，具有良好的临床应用前景。
5.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
6.脱氢松香胺并方酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述脱氢松香胺并方酰胺化合物的制备路线及结构如下：
7.路线一：
[0008][0009]
路线二：
[0010][0011]
注：脂肪胺取代的脱氢松香胺并方酰胺采用路线一方法合成，方酰胺取代的脱氢松香胺并方酰胺采用路线二方法合成。
[0012]
化合物的体外抗肿瘤活性评价
[0013]
供试肿瘤细胞：人类肝癌细胞hepg2、人类肺癌细胞a549、人类前列腺癌细胞du145、人类结肠癌细胞ht29、人类结肠癌细胞hct15。
[0014]
细胞培养：dmem、dmem-f12、mem、rpmi 1640和mccoys5a培养基，10％胎牛血清和1％青-链霉素配制成培养液。培养的细胞株置于37℃、5％co2饱和湿度下常规培养传代，实验均用处于对数生长期的细胞。
[0015]
体外抗肿瘤活性评价(mtt法)：
[0016]
将以上肿瘤细胞分别铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，以未经药物作用的细胞作为空白对照，每组设8个复孔，继续培养48h。显微镜目测并分别记录细胞状况，每孔加mtt(5mg/ml)10μl继续培养4h，弃上清液，每孔加100μl dmso，37℃孵育10min，酶标仪检测490或者570nm波长处的吸光值。按以下公式计算平均抑制率：
[0017]
抑制率＝(对照组平均od值-药物组平均od值)/对照组平均od值)
×
100％。
[0018]
测试结果表明，制备的十一种脱氢松香胺并方酰胺类化合物对供试肿瘤细胞均表现出十分优越的抑制活性，其半数抑制浓度(ic
50
)均小于8μm。其具体结果如下表1所示，其中化合物2(r＝(1s，2s)-2-nh
2-cyclohexyl)的抗肿瘤效果最佳。
[0019]
表1脱氢松香胺并酰胺类化合物对肿瘤细胞的抑制活性(ic
50
)
[0020][0021]
本技术人进一步实施了化合物2诱导肿瘤细胞凋亡试验，试验情况如下：对数生长期的ht29细胞铺板6孔板，长满单层后分别加入含2.5μm、10μm、15μm化合物2的细胞维持液孵育，设定不加药物处理的细胞对照，24h后，收集细胞，运用annexin-fitc/pi凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。
[0022]
实验结果如图1所示表明，化合物2可以强效诱发以上被检测肿瘤细胞的凋亡。
[0023]
本发明的目的在于提供脱氢松香胺并方酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述结构包括且不限于1-11。
[0024]
进一步地，所述的药物为治疗包含且不限于前列腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌等；
[0025]
进一步地，所述的脱氢松香胺并方酰胺类化合物优选为1-3。
[0026]
进一步地，所述的药物为引起肿瘤细胞产生g1期阻滞、细胞凋亡及调控肿瘤细胞自噬的药物；
[0027]
本发明的脱氢松香胺并方酰胺类化合物与常规药用载体制成的药物组合物。
[0028]
本发明的脱氢松香胺并方酰胺类化合物可通过常规方法制备成各种实用型药剂，如颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂的药物。
[0029]
本发明通过对所述的脱氢松香胺并方酰胺化合物体外抗肿瘤活性评价及引起的肿瘤细胞凋亡活性评价，证实所述的脱氢松香胺并方酰胺类化合物具有明显的抑制不同种肿瘤细胞增殖的作用，其中具有最佳抑制效果的化合物2的抗肿瘤活性明显优于对照药物。
[0030]
本发明通过对所述的脱氢松香胺并方酰胺化合物2体内抗肿瘤活性评价，证实该化合物2具有明显的抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长的活性。
[0031]
鉴于该类化合物的制备过程简单易行，原料价格低廉，易于获取；系列化合物可以通过构效关系研究来寻求其抗肿瘤作用靶点，为进一步药物开发提供有价值的导向作用。因此，本发明所述的脱氢松香胺并方酰胺类化合物为新药筛选提供了基础。
[0032]
本发明所述的肿瘤包括且不限于前列腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌等；
[0033]
所述的药物为引发肿瘤细胞产生g1期阻滞、细胞凋亡及调控肿瘤细胞自噬的药物；
[0034]
所述的脱氢松香胺并方酰胺类化合物包括且不限于1-11。
[0035]
一种脱氢松香胺并方酰胺化合物与药物组合物，其特征在于脱氢松香胺并方酰胺类化合物与常规药用载体制成，通过常规方法制备成各种实用型药剂，如颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂的药物。
[0036]
有益效果
[0037]
脱氢松香胺并方酰胺衍生物作为一类新的具有生物活性的结构，通过体外抗肿瘤活性实验研究，这类化合物均显示出不同程度的抗肿瘤细胞增殖活性，其中化合物2(r＝(1s，2s)-2-nh
2-cyclohexyl)显示出最强活性，低浓度时即可强效抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞产生g1期阻滞，并诱导肿瘤细胞凋亡。体内抗肿瘤实验研究表明，化合物2能够明显抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长。该类化合物的制备过程简单易行，原料价格低廉，易于获取；因此，这类新型脱氢松香胺并方酰胺结构为抗肿瘤新药开发提供了基础，具有良好的临床应用前景。
附图说明：
[0038]
图1：化合物2引发肿瘤细胞凋亡的检测图；
[0039]
图2：化合物2引发肿瘤细胞周期阻滞的检测图；
[0040]
图3：化合物2引发肿瘤细胞自噬的电镜图；
[0041]
图4：化合物2影响荷瘤鼠体内肿瘤生长的时间-肿瘤体积与体重变化曲线图；
[0042]
图5：化合物2影响荷瘤鼠体内肿瘤生长两周后的肿瘤重量箱型图与实体瘤解剖
图。
具体实施方式
[0043]
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。此外，在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
[0044]
实施例1：化合物的体外抗肿瘤活性评价
[0045]
供试肿瘤细胞：人类肝癌细胞hepg2、人类肺癌细胞a549、人类前列腺癌细胞du145、人类结肠癌细胞ht29、人类结肠癌细胞hct15。
[0046]
细胞培养：dmem、dmem-f12、mem、rpmi 1640和mccoys5a培养基，10％胎牛血清和1％青-链霉素配制成培养液。培养的细胞株置于37℃、5％co2饱和湿度下常规培养传代，实验均用处于对数生长期的细胞。
[0047]
体外抗肿瘤活性评价(mtt法)：
[0048]
将以上肿瘤细胞分别铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，以未经药物作用的细胞作为空白对照，每组设8个复孔，继续培养48h。显微镜目测并分别记录细胞状况，每孔加mtt(5mg/ml)10μl继续培养4h，弃上清液，每孔加100μl dmso，37℃孵育10min，酶标仪检测490或者570nm波长处的吸光值。按以下公式计算平均抑制率：
[0049]
抑制率＝(对照组平均od值-药物组平均od值)/对照组平均od值)
×
100％。
[0050]
测试结果表明，制备的十一种脱氢松香胺并方酰胺类化合物对供试肿瘤细胞及耐药株细胞均表现出十分优越的抑制活性，其半数抑制浓度(ic
50
)均小于8μm。其具体结果如下表1所示，其中化合物2的抗肿瘤效果最佳。
[0051]
表1脱氢松香胺并方酰胺类化合物对肿瘤细胞的抑制活性(ic
50
)
[0052][0053]
实施例2：化合物2引起的肿瘤细胞凋亡活性评价
[0054]
本技术人进一步实施了化合物2诱导肿瘤细胞凋亡试验，试验情况如下：对数生长期的ht29细胞铺板6孔板，长满单层后分别加入含2.5μm、10μm、15μm化合物2的细胞维持液孵育，设定不加药物处理的细胞对照，24h后，收集细胞，运用annexin-fitc/pi凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。
[0055]
实验结果如图1所示表明，15μm化合物2可以强效诱发以上被检测肿瘤细胞的凋
亡。
[0056]
实施例3：化合物2引起的肿瘤细胞g1活性评价
[0057]
本技术人进一步实施了化合物2诱导肿瘤细胞凋亡试验，试验情况如下：对数生长期的ht29细胞铺板6孔板，长满单层后分别加入含2.5μm、10μm、15μm化合物2的细胞维持液孵育，设定不加药物处理的细胞对照，24h后收集细胞，运用pi/rnase染色液在流式细胞仪上进行细胞周期的分析。
[0058]
实验结果如图2所示表明，2.5μm、10μm、15μm化合物2可以强效诱发以上被检测肿瘤细胞产生g1期阻滞。
[0059]
实施例4：化合物2引起的肿瘤细胞自噬评价
[0060]
本技术人进一步实施了化合物2诱导肿瘤细胞自噬试验，试验情况如下：对数生长期的ht29细胞铺满150mm2细胞培养皿，长满单层细胞后加入含5μm、10μm化合物2的细胞维持液孵育，设定不加药物处理的细胞对照，24h后收集细胞，制作切片于电镜下观察。
[0061]
实验结果如图3所示表明，5μm、10μm化合物2可以强效诱发ht29细胞发生自噬。
[0062]
实施例5：化合物2的体内抗肿瘤活性评价
[0063]
本技术人进一步实施了化合物2的体内抗肿瘤活性评价，试验情况如下：对ht29异种移植瘤裸鼠模型进行31天的灌胃给药及腹腔注射给药，每天监测肿瘤生长情况，末次给药后将瘤块取出，称重。
[0064]
实验结果如图4所示表明，与对照组相比，化合物2可以明显减缓ht29异种移植瘤裸鼠模型中瘤块生长速率，表现出良好的体内抗肿瘤活性。
[0065]
综上所述，新型脱氢松香胺并方酰胺类化合物具有良好的抑制不同种肿瘤细胞增殖作用，对于多种肿瘤细胞，化合物2表现出了优良的抗肿瘤活性，特别是对结肠癌ht29细胞，显示了大的应用潜力。此外，化合物2在异种移植瘤裸鼠模型中同样表现出良好的抑制肿瘤生长活性，如果进一步在临床上进行研究，有望制备成一种有效对抗肿瘤疾病的药物。