一种具有保肝降酶作用的提取物组合物

1.本发明涉及一种具有保肝降酶作用的提取物组合物，更具体地涉及一种由释迦核水提取物、百香果皮醇提取物和荔枝壳水提取物组合而成的具有保肝降酶作用的提取物组合物。


背景技术：

2.肝脏在调节各种生理学功能的过程中起到重要的作用。药物滥用、酒精成瘾以及长期暴露于有毒环境都会造成各种肝脏疾病。由于目前能够刺激肝功能，修复受损肝细胞这类有效的预防手段和药物治疗的缺乏，肝脏疾病已成为全球性的高死亡率疾病。
3.急性肝损伤(acute liver injury，ali)是指在短期内因各种原因引起的肝功能突发异常的疾病。药物中毒、病毒感染、免疫反应、缺血-再灌注等是ali最常见的诱发因素，其中药物中毒引起的肝损伤占ali患者比例最大。ali可诱发一系列并发症，也能加剧其他疾病的进展，应积极预防和治疗。多数ali患者可以通过药物治疗恢复，但仍有部分患者会进展为高致死率的急性肝衰竭，且多数保肝降酶药物会引起水、电解质代谢紊乱、外周血管硬化，停药容易反弹等。因此，保肝降酶新药一直是药物研发领域的热点，具有良好的社会效益和市场前景。
4.释迦果又称为番荔枝、洋波罗、佛头果，属于番荔枝科番荔枝属植物，释迦果为落叶或半落叶性小乔木，原产于热带美洲，我国广东、广西、云南、海南等地均有引种栽培。释迦核褐色光滑、细小，几乎30％的水果质量由种子组成。一般来说，单一水果中存在20～40粒释迦核。释迦果中含有多种不同类型的活性物质，包括生物碱、萜类、环肽、萜甾和糖苷等，结构多样、特别是在抗癌、抗肿瘤、抗寄生虫等方面表现出很好的活性。同时，释迦核还具有杀虫、调节血压等功能，还是一种抗抑郁剂和广谱抗生素。
5.百香果又名西番莲、鸡蛋果，为半木质藤本攀缘或多年生常绿草质植物，在我国台湾、海南、广东、福建等地种植历史较长。其富含果胶、多糖、黄酮类、生物碱类、多酚类、维生素a和c、膳食纤维以及矿物质等160多种有益成份，具有生津止渴、护肤养颜、化痰止咳、防癌抗衰、安神抗焦虑、抗炎抑菌等多种医药保健功效，因而也被誉为“果中之王”。百香果种植业的迅速发展，但百香果皮水分含量高，贮藏困难、易腐烂变质等问题也存在。整个百香果鲜果中，果皮约占50％～55％。而现阶段国内加工企业对百香果的产品开发主要集中在果肉饮料加工，果皮则作为副产物直接舍弃或加工为牲畜饲料。百香果皮中含有大量的生物活性物质，如多糖、果胶、黄酮等。因而，百香果皮未经深加工即舍弃，不仅是资源的严重浪费，更由于其纤维含量大易成为环境的负担。
6.荔枝为无患子科荔枝属常绿乔木，是热带和亚热带的特色水果，主要分布于中国广东、广西、福建、四川、台湾等亚热带地区。荔枝壳，又称荔枝皮，为荔枝的外果皮，含有多种活性成分，如花青素、红色素、黄酮类、酚酸和多糖类等多种活性成分，具有抗氧化活性，对高血压、肿瘤等有良好的辅助疗效，潜在利用价值巨大。其中黄酮类化合物具有保护心血管、抗氧化、抗炎抗病毒、调节免疫力等功能。因其具有广泛的药理活性和低毒性，成为了天
然药物研究开发的热点。因此，对荔枝壳中活性成分进行进行开发利用，对于提高农产品附加值具有重要意义。
7.近年来发现，天然植物在预防和治疗ali中发挥着非常重要的作用。本发明人对多种水果废弃资源进行活性筛选，并经过大量配方比例的研究实验，最后获得了本发明最佳比例的具有保肝降酶作用的提取物组合物，并证明了其在保肝降酶中的积极作用，由此完成了本发明。本发明提供了一种具有保肝降酶作用的提取物组合物，该提取物组合物可以显著降低四氯化碳(carbon tetrachloride，ccl4)诱导的ali小鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,alt)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ast)含量，降低小鼠肝匀浆液中促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,tnf-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)的水平，通过对小鼠肝脏苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin,he)染色，发现该提取物可以改善肝脏的病理损害，从而达到保肝降酶的效果。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种保肝降酶提取物组合物，该保肝降酶的提取物组合物均来自水果废弃资源，来源丰富易得，提取方法简单，具有良好的保肝降酶效果，还可以充分利用废弃资源，提高水果的利用价值，提高经济附加值，既能产生较高的社会效益，又具有良好的经济前景。
9.本发明提供的一种具有保肝降酶作用的提取物组合物，由迦核水提取物、百香果皮醇提取物、荔枝壳水提取物按照4:3:1的比例组成。
10.优选地，上述具有保肝降酶作用的提取物组合物中释迦核水提取物的制备方法是：
11.取释迦核，干燥，粉碎，过80目筛，置于圆底烧瓶中，加入5倍量的蒸馏水浸泡48h后，置于电热套上煮沸2h，过滤取滤液，滤液减压浓缩至相对密度为1.2的浓缩液，加入85％乙醇使含醇量达到55％，静置24h，过滤取滤液，置于旋转蒸发仪中减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相当于生药材1.5g/ml，用真空干燥器减压干燥，即得释迦核水提取物；
12.上述具有保肝降酶作用的提取物组合物中百香果皮醇提取物的制备方法是：
13.取百香果皮，干燥，粉碎，过60目筛，置于具塞三角瓶中，分别加入3倍量60％乙醇，于超声震荡器中超声震荡提取3次，每次25min，超声频率30khz，温度为55℃，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味，浓缩至相当于生药材1.2g/ml，用真空干燥器减压干燥，即得百香果皮醇提取物；
14.上述具有保肝降酶作用的提取物组合物中荔枝壳水提取物的制备方法是：
15.取荔枝壳，干燥，粉碎，过80目筛，置圆底烧瓶中，加入6倍量的蒸馏水，然后加入0.12％的纤维素酶，用盐酸调节ph至5.0后，置于50℃恒温振荡器中酶解80min，转入微波动态萃取设备料桶中，设置微波功率为280w，微波辐射20min，微波间歇辐射2次，取出冷却、过滤，合并两次滤液，置于旋转蒸发仪中，浓缩至相当于生药材1.2g/ml，用真空干燥器减压干燥，即得荔枝壳水提取物；
16.按比例选取释迦核水提取物、百香果皮醇提取物、荔枝壳水提取物，混合均匀，即得一种具有保肝降酶作用的提取物组合物。
60％，定时进行通风换气。
35.1.2实验药品与试剂
36.按上述实施方案分别制备释迦核水提取物、百香果皮醇提取物、荔枝壳水提取物，按4：3：1的比例制备本发明具有保肝降酶作用的提取物组合物(样品1)。按相同比例同法制成迦核水提取物、百香果皮醇提取物的组合物(样品2，荔枝壳水提取物用等量淀粉代替)；释迦核水提取物、荔枝壳水提取物的组合物提取液(样品3，百香果皮醇提取物用等量淀粉代替)；百香果皮醇提取物、荔枝壳水提取物的组合物提取液(样品4，释迦核水提取物用等量淀粉代替)；上述提取物组合物分别用蒸馏水溶解配制成1g/ml的溶液备用。
37.ccl4油溶液的配制：取0.125ml的ccl4，以等量递加法加入100ml灭菌花生油，充分搅拌均匀，配成0.125％ccl4溶液。
38.alt和ast试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；il-6和tnf-α的elisa试剂盒购自上海信裕生物制品有限公司。
39.1.3实验仪器
40.匀浆机，离心机，电子称，鼠笼、灌胃针，分析天平。
41.1.4动物分组与给药
42.将48只雄性昆明种小鼠随机分为6组：空白对照组、模型组、样品1组、样品2组、样品3组、样品4组，每组8只。样品1组、样品2组、样品3组、样品4组分别给予相应的样品溶液灌胃(0.1ml/10g体重)，空白对照组和模型组给予等量生理盐水，连续给药7天。末次给药2h后除空白对照组腹腔注射等量灭菌花生油溶液外，其余各组小鼠分别腹腔注射0.125％ccl4溶液(0.1ml/10g体重)建立肝损伤模型。
43.1.5标本采集与指标测定
44.小鼠腹腔注射16h后禁食不禁水，腹腔注射24h后摘眼球取血，全血静置2h后，3000r/min离心15min，取上层血清，通过试剂盒测定血清中alt和ast的活性。然后立即处死小鼠并剖取肝脏，滤纸檫试，剪取部分肝右叶，用冷生理盐水制成10％的肝匀浆，离心，取上清液，用elisa试剂盒测定il-6和tnf-α和的活性。另取部分肝左叶，以10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，he染色，光镜下观察肝组织损伤程度。
45.实验获取的数据以均值
±
标准差表示。统计分析使用spss17.0进行单因素方差分析。p《0.05被认为具有统计学意义。
46.2.实验结果与分析
47.2.1本发明提取物组合物对ccl4致肝损伤小鼠血清转氨酶的影响
48.试验结果如表1所示，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中alt、ast活性明显高于空白对照组，具有显著性差异(p＜0.01)，提示腹腔注射ccl4可造成小鼠急性肝损伤；与模型组相比，各样品组小鼠血清中alt、ast活性均有不同程度的降低，其中样品1组和样品3组有统计学意义(分别是p《0.01和p《0.05)，而样品2组和样品4组无显著性差异(p》0.05)。同时，样品1组小鼠的alt、ast活性明显低于其他三个样品组(p《0.01)，而与空白对照组相比无显著性差异(p》0.0)。结果提示，本发明的提取物组合物能显著降低ccl4致肝损伤所致小鼠血清alt和ast的升高，缺少任何一种都会使其作用明显下降。
49.表1各提取物组合物对ccl4致肝损伤小鼠血清转氨酶的影响
[0050][0051][0052]
与空白对照组相比，*p《0.05，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与样品1组相比，
▽
p《0.05，
▽▽
p《0.01。
[0053]
2.2本发明提取物组合物对ccl4致肝损伤小鼠促炎细胞因子的影响：
[0054]
试验结果如表2所示，与空白对照组相比，模型组小鼠肝匀浆液中il-6和tnf-α的水平明显高于空白对照组(p＜0.01)，提示腹腔注射ccl4可造成小鼠急性炎性肝损伤；与模型组相比，各样品组小鼠肝匀浆液中il-6和tnf-α水平均有不同程度地下降，其中所有样品组的il-6具有统计学意义(p《0.01或p《0.05)，样品1组和样品2组的tnf-α具有统计学意义(分别为p《0.01或p《0.05)；此外，样品1组小鼠肝匀浆液中il-6和tnf-α水平均显著低于其他三个样品组(p《0.01)，而与对照组无显著差异(p》0.05)。结果说明，本发明的提取物组合物能显著抑制ccl4致肝损伤小鼠肝匀浆液中il-6和tnf-α水平的升高，缺少任何一种都会导致效果明显下降。
[0055]
表2各提取物组合物对ccl4致肝损伤小鼠促炎细胞因子的影响
[0056][0057]
与空白对照组相比，*p《0.05，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与样品1组相比，
▽
p《0.05，
▽▽
p《0.01。
[0058]
2.3本发明提取物组合物对ccl4致肝损伤小鼠肝脏病理损伤的影响
[0059]
从图1可以发现，经肝脏he染色观察小鼠肝脏病理，结果发现，空白对照组小鼠肝细胞形态正常，肝小叶结构正常，未见炎性细胞，未见肝细胞变性、坏死等，(见图1-a)。模型组小鼠肝细胞广泛变性，有明显的点状和灶状坏死，肝小叶结构紊乱，大量炎性细胞浸润(见图1-b)。给予样品1后小鼠肝脏结构无明显破坏，未见肝细胞变性、坏死等，肝小叶结构也趋于正常，与空白对照组相比无明显差异(见图1-c)。而给予样品2、样品3和样品4后，仍存在不同程度的肝细胞变性、坏死，肝小叶结构紊乱或不清，伴有炎性细胞浸润(见图1-d、1-e和1-f)。由此可见，本发明的提取物组合物能显著改善腹腔注射ccl4引起的小鼠急性肝
损伤，缺少其中任何一种都会导致作用明显下降。
[0060]
3.结论
[0061]
本发明的提取物组合物能显著降低ccl4致急性肝损伤小鼠的血清alt和ast水平，降低肝组织匀浆液中il-6和tnf-α水平，明显改善肝脏病理损伤，具有良好的保肝降酶作用，缺少其中任何一种都会导致作用明显下降。