可高效入胞的智能骨靶向递送药物的制备方法及其应用

技术特征：
1.可高效入胞的智能骨靶向递送药物的制备方法，包括以下步骤：s1：骨靶向亲水材料peg-aln的合成；s101：以聚乙二醇(nh
2-peg
(2000)-cooh)、顺式乌头酸酐和阿仑膦酸钠(aln)为原料制备一系列不同量顺式乌头酸酐修饰的骨靶向亲水材料peg-aln；s102：采用透析以及冷冻干燥的方法对反应产物进行分离和纯化，采用波谱学手段对反应产物的结构进行鉴定；s2：肺癌细胞靶向材料crgd-pamam的合成；s201：以g5代pamam、琥珀酸酐和crgd为原料制备高效入胞靶向材料crgd-pamam；s202：采用透析以及冷冻干燥的方法对反应产物进行分离和固化，采用波谱学手段对反应产物的结构进行鉴定；s3：纳米粒dtx@rppa的制备及其性能评价；s301：称取一定量的dtx及crgd-pamam溶于甲醇或者水，搅拌反应12h，旋转蒸发除去甲醇，2000rpm离心5min，取上清获得dtx@crgd-pamam，随后将不同浓度peg-aln溶液逐滴加入到dtx@rp溶液，涡旋1min，静置30min，即得纳米粒dtx@crgd-pamam-peg-aln，简写为dtx@rppa；s302：建立hplc方法测定dtx的工作曲线，精密称取一定量的冻干纳米粒，溶于一定量dmso中，用适量乙腈稀释，充分振荡后取20μl，注入hplc系统进行分析，根据工作曲线计算乙腈溶液中dtx浓度，最后根据称量重量可计算出dtx载药量；s303：取分散于双蒸水中的各组纳米粒溶液2ml，用zeta电位及纳米粒度分析仪测定纳米粒的粒径分布、zeta电位以及多分散系数，取分散于双蒸水中的各组纳米粒溶液适量滴至覆盖有支持膜的筛网上，自然干燥后，磷钨酸染色，透射电镜下观察；s304：称取一定量的纳米粒dtx@rppa，充分溶于蒸馏水中，hplc法测定初始dtx含量，然后加入100mg的ha搅拌孵育，分别在30min、1h、2h和4h于3000rmp离心10min，吸取上清液20μl注入hplc系统检测dtx含量，以dtx、无peg-aln修饰的纳米粒dtx@rp、单纯pamam载药纳米粒dtx@p作为对照；s305：将纳米粒dtx@rppa分散于5ml ph为5.0、6.5和7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将含有纳米粒的缓冲液转移至透析袋中，置于50ml相同ph值的磷酸盐缓冲液中避光透析，分别于1、2、3、4、5、12、24、48、96、120h取出0.1ml透析袋外的溶液，同时补充0.1ml新的缓冲液，取出的溶液样品用hplc法测定dtx的含量，绘制体外累计释放曲线，以dtx、无peg-aln修饰的纳米粒dtx@rp、单纯pamam载药纳米粒dtx@p作为对照。2.可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，该应用方法包括以下步骤：s4：纳米粒dtx@rppa的体外抗肿瘤活性研究；s401：mtt法观察纳米粒dtx@rppa在不同ph值条件下对a549的细胞毒性；s402：香豆素-6标记纳米粒，采用流式细胞仪观察在不同ph值条件下a549细胞对纳米粒dtx@rppa的摄取；s5：纳米粒dtx@rppa的体内抗肿瘤活性研究；s501：建立裸鼠肺癌骨转移瘤模型；s502：检测纳米粒dtx@rppa对肺癌骨转移瘤裸鼠的治疗效果；s503：检测纳米粒dtx@rppa治疗对骨质的影响。
3.根据权利要求1所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的制备方法，其特征在于：所述s301中还需要相同方法制备无peg-aln修饰的纳米粒dtx@crgd-pamam，简写为dtx@rp；制备单纯pamam载药纳米粒dtx@pamam，简写为dtx@p，分别作为对照药物进行研究。4.根据权利要求2所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，其特征在于：所述s401中取对数生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，接种于96孔板，其细胞浓度1
×
104/ml，接种体积200μl。5.根据权利要求2所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，其特征在于：所述s402中取对数生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，接种于载有盖玻片的6孔板中，其细胞浓度为1
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106/ml，体积为2ml。6.根据权利要求2所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，其特征在于：所述s501中取对数生长期的a549细胞，经洗涤、消化、离心后得到浓缩细胞，然后加入无血清dmem培养液稀释细胞使其浓度达到1
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107/ml待用。7.根据权利要求2所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，其特征在于：所述s502选取20天的荷瘤裸鼠，每组4只，随机分为6组，分别为空白组、dtx组、无peg-aln修饰的纳米粒dtx@rp组、单纯pamam载药的纳米粒dtx@p和纳米粒dtx@rppa组。8.根据权利要求2所述的可高效入胞的智能骨靶向递送药物的应用，其特征在于：所述s503采用micro-ct观察骨损伤情况。

技术总结
本发明公开了可高效入胞的智能骨靶向递送药物的制备方法及其应用，S1：骨靶向亲水材料PEG-ALN的合成；S101：以聚乙二醇(NH


技术研发人员：叶威良 韩江帆 秦向阳 周四元 曹琼 袁晓峰
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2022.01.18
技术公布日：2022/7/8