一种质谱流式血液肿瘤免疫分型中替代侧向散射光信号的抗体组合及应用的制作方法

1.本发明涉及质谱流式细胞技术领域，具体涉及一种质谱流式血液肿瘤免疫分型中替代侧向散射光信号的抗体组合及应用。


背景技术：

2.血液肿瘤的精准分型是正确选择治疗方案的前提，目前，国际上通用的是细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学分型，即micm分型的方式。其中，免疫学分型的多参数流式细胞术扮演了重要的角色，该方法根据患者肿瘤细胞的免疫标识，提高了对具体的疾病类型鉴别的准确度。
3.多参数流式细胞术通过荧光抗体检测骨髓细胞表面的cd分子，如干/祖细胞抗原，骨髓细胞系相关抗原，红细胞、b细胞、t细胞、nk细胞、巨核细胞等相关抗原。常用的抗体组合通常是三色或者四色方案，使用三种或者四种荧光素分别标记抗体。流式分析血液肿瘤分型，通常会采用圈门的方式进行，即逐级对细胞亚群进行深入区分，比如在t细胞中，先用cd3区分t细胞，再用cd4和cd8区分cd3 cd4 t细胞和cd3 cd8 t细胞。流式细胞仪的侧向散射光(ssc)信号也发挥了很大的作用，目前对于流式检测结果的分析，第一级的圈门策略就是使用cd45和ssc分别作为横纵坐标，区分出cd45阴性的有核红细胞亚群，cd45dimssc低的原始及幼稚细胞亚群，cd45dimssc高的成熟粒细胞亚群，cd45 ssc低的淋巴细胞亚群，以及cd45 ssc中等水平的单核细胞亚群，再通过不同的抗体，对各个亚群进行深入分析。
4.为了完成血液肿瘤分型，往往需要检测30个以上的cd分子抗体以及一些其他的分型用抗体，由于目前临床常用的流式细胞仪是4-6色，也就是单次可以检测一个细胞上的4-6种蛋白质，完成30个以上抗体检测需要将一管骨髓分成8-10管样本分别染色和分析(其中一些抗体需要多次反复检测，用于确定细胞亚群)，样本用量大。流程繁琐，且无法对单个细胞进行30个蛋白以上参数的同步分析。多参数流式细胞术也常受到样本本底荧光的干扰，以及不同荧光素之间发射波长的重叠，即使使用了滤光片，也需要进行补偿调节。
5.质谱流式细胞技术是一种新型的多参数流式细胞术，使用如稀土金属元素等生物体内丰度极低的金属标记抗体，通过飞行时间质谱来精确检测每个细胞上的金属含量，由于质谱仪检测的特性，不同金属信号之间几乎不存在干扰，不需要调整补偿。只需要单管检测，就能够同时在单个细胞上检测43种抗体(包含cd分子)，对于复杂类型的细胞分型具有方法学上的优势，弥补了目前4-6色传统流式的不足，具备作为血液肿瘤免疫检测平台的潜力。
6.传统流式在检测血液肿瘤时，使用cd45和ssc进行圈门，能够快速区分出有核红细胞亚群，原始及幼稚细胞亚群，单核细胞亚群，淋巴细胞亚群，成熟粒细胞亚群等。由于质谱流式使用的是质谱方法学，细胞被完全离子化，因此在检测的过程中不包含传统流式的ssc，在应用到血液肿瘤时，无法进行类似流式的第一级圈门，即cd45和ssc联合圈门，无法区分各大细胞亚群，限制了质谱流式在血液肿瘤领域的临床应用和科学研究，有必要开发
一种抗体组合，能够替代传统的ssc，可以很好地弥补质谱流式的这个不足，更好地发挥其多参数同步检测的优势，使质谱流式能够更好地应用于血液肿瘤的免疫表型检测。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种质谱流式血液肿瘤免疫分型中替代侧向散射光信号的抗体组合及应用，以解决现有技术的不足。
8.本发明采用以下技术方案：
9.本发明第一方面提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型中替代侧向散射光信号的抗体组合，所述抗体组合为lactoferrin(乳铁蛋白)抗体和lysozyme(溶菌酶)抗体，lactoferrin抗体和lysozyme抗体分别带有金属标签，lactoferrin抗体和lysozyme抗体带有的金属标签不同。
10.进一步地，所述金属标签选自89y、115in、139la、141pr、142nd、143nd、144nd、145nd、146nd、147sm、148nd、149sm、150nd、151eu、152sm、153eu、154sm、155gd、156gd、157gd、158gd、159tb、160gd、161dy、162dy、163dy、164dy、165ho、166er、167er、168er、169tm、170er、171yb、172yb、173yb、174yb、175lu、176yb、195pt、197au、198pt、209bi。
11.本发明第二方面提供了上述抗体组合在质谱流式血液肿瘤免疫分型中的应用。
12.进一步地，包括如下步骤：
13.(1)通过lactoferrin抗体和lysozyme抗体区分成熟粒细胞亚群、单核细胞亚群和其他细胞亚群；
14.(2)其他细胞亚群再通过cd45抗体区分，包括原始及幼稚细胞或/和异常细胞亚群、有核红细胞亚群和淋巴细胞亚群；
15.(3)通过其他常用血液肿瘤免疫分型抗体对相关亚群的抗原表达进行分析，判断相关亚群的抗原是否存在异常表达；
16.其中，lactoferrin抗体、lysozyme抗体、cd45抗体、其他常用血液肿瘤免疫分型抗体分别带有金属标签，各抗体带有的金属标签不同。
17.更进一步地，所述金属标签选自89y、115in、139la、141pr、142nd、143nd、144nd、145nd、146nd、147sm、148nd、149sm、150nd、151eu、152sm、153eu、154sm、155gd、156gd、157gd、158gd、159tb、160gd、161dy、162dy、163dy、164dy、165ho、166er、167er、168er、169tm、170er、171yb、172yb、173yb、174yb、175lu、176yb、195pt、197au、198pt、209bi。
18.本发明第三方面提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型的圈门方法，包括如下步骤：
19.(1)通过lactoferrin抗体和lysozyme抗体区分成熟粒细胞亚群、单核细胞亚群和其他细胞亚群；
20.(2)其他细胞亚群再通过cd45抗体区分，包括原始及幼稚细胞或/和异常细胞亚群、有核红细胞亚群和和淋巴细胞亚群；
21.(3)通过其他常用血液肿瘤免疫分型抗体对相关亚群的抗原表达进行分析，判断相关亚群的抗原是否存在异常表达；
22.其中，lactoferrin抗体、lysozyme抗体、cd45抗体、其他常用血液肿瘤免疫分型抗体分别带有金属标签，各抗体带有的金属标签不同。
23.进一步地，所述金属标签选自89y、115in、139la、141pr、142nd、143nd、144nd、145nd、146nd、147sm、148nd、149sm、150nd、151eu、152sm、153eu、154sm、155gd、156gd、157gd、158gd、159tb、160gd、161dy、162dy、163dy、164dy、165ho、166er、167er、168er、169tm、170er、171yb、172yb、173yb、174yb、175lu、176yb、195pt、197au、198pt、209bi。
24.本发明第四方面提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型的试剂盒，由43种带金属标签的单克隆抗体组成，具体如下表所示：
25.编号抗体金属编号抗体金属1ccd389y23kappa160gd2cd3115ln24cd99161dy3cigm139la25cd10162dy4cd56141pr26lysozyme163dy5cd22142nd27cd64164dy6cd235ab143nd28cd2165ho7cd61144nd29cd117166er8cd23145nd30cd1a167er9cd5146nd31cd11c168er10cd15147sm32cd45169tm11cd33148nd33cd7170er12mpo149sm34cd79a171yb13cd14150nd35cd38172yb14lambda151eu36cd138173yb15cd13152sm37cd20174yb16cd41153eu38tdt175lu17lactoferrin154sm39hla-dr176yb18cd123155gd40cd300e195pt19cd34156gd41cd4197au20cd71157gd42cd8198pt21cd19158gd43cd11b209bi22cd9159tb
‑‑‑
26.其中，编号1、3、12、14、17、23、26、34、38为胞内抗体，其它为胞外抗体。
27.本发明第五方面提供了上述试剂盒在质谱流式血液肿瘤免疫分型中的应用。
28.进一步地，包括如下步骤：
29.(1)骨髓样本前处理，去除骨髓样本中的成熟红细胞；
30.(2)通过质谱流式细胞仪检测骨髓样本中43个抗体对应抗原的表达丰度；
31.(3)根据骨髓样本中43个抗体对应抗原的表达丰度，用流式细胞分析软件进行分析，所述流式细胞分析软件包括flowjo分析软件，具体如下：
32.(3.1)通过lactoferrin抗体和lysozyme抗体区分成熟粒细胞亚群、单核细胞亚群和其他细胞亚群；
33.(3.2)其他细胞亚群再通过cd45抗体区分，包括原始及幼稚细胞或/和异常细胞亚
群、有核红细胞亚群和淋巴细胞亚群；
34.(3.3)通过其余抗体对相关亚群的抗原表达进行分析，判断相关亚群的抗原是否存在异常表达。
35.本发明的有益效果：
36.1、本发明提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型中替代侧向散射光信号的抗体组合，利用lactoferrin抗体和lysozyme抗体组成的抗体组合替代传统流式侧向散射光信号，在质谱流式细胞仪中实现了传统流式细胞仪检测ssc的功能。该抗体组合和cd45抗体结合应用于质谱流式对血液肿瘤免疫分型中，可以实现传统流式ssc和cd45二维作图的效果，再结合其他血液肿瘤免疫分型常用抗体，进而能够进行血液肿瘤免疫分型，对骨髓细胞进行大群区分，并且发现异常亚群。
37.2、本发明提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型的圈门方法，先通过lactoferrin抗体和lysozyme抗体区分成熟粒细胞亚群、单核细胞亚群和其他细胞亚群，其他细胞亚群再通过cd45抗体区分原始及幼稚细胞或/和异常细胞亚群、有核红细胞亚群、淋巴细胞亚群，后通过血液肿瘤免疫分型常用的其他抗体对相关亚群的抗原表达进行分析，判断相关亚群的抗原是否存在异常表达，实现质谱流式对血液肿瘤的免疫分型。本发明首次采用lactoferrin抗体和lysozyme抗体，并结合cd45抗体进行两级圈门策略，配合质谱流式细胞仪，能够取代传统流式的cd45/ssc对于骨髓中成熟粒细胞，单核细胞，有核红细胞，淋巴细胞，原始及幼稚细胞，异常细胞亚群等各亚群的区分，突破了质谱流式在血液肿瘤细胞分析中无法检测ssc的技术难题，结合质谱流式多参数高通量的特性，能够提高目前血液肿瘤的免疫分型深度，也便于临床医生按照传统流式模式对血液肿瘤进行分析。
38.3、本发明提供了一种质谱流式血液肿瘤免疫分型的试剂盒，由43种带金属标签的单克隆抗体组成。本发明试剂盒突破了质谱流式在血液肿瘤细胞分析中无法检测ssc的技术难题，实现质谱流式对血液肿瘤细胞的精准分型，能够在单个血液肿瘤细胞上同时检测43个蛋白标志物，增加了检测的灵敏度、准确性和经济性。本发明试剂盒经测试单管检测即可实现传统流式细胞仪需要使用8-10管检测才能实现的效果，扩大了血液肿瘤相关免疫表型分析的范围和能力，无需各通道单染对照，无需调节荧光补偿，减少了实验操作步骤及样本量需求，为进一步实现血液肿瘤免疫分型的智能化和自动化奠定基础。利用本发明试剂盒，并借助质谱流式细胞仪的辅助，可快速准确地分析血液肿瘤细胞的种类、性质、判断阳性细胞的水平，对预后判断和临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。同时节约了检测样本，对单个细胞能够同时检出更多的标志物，也为血液肿瘤的研究工作提供了更丰富的资料。
39.4、利用本发明的抗体组合、圈门方法及试剂盒，利于质谱流式应用于血液肿瘤免疫分型的标准化、规范化、自动化及智能化。
附图说明
40.图1为实施例1健康人骨髓细胞免疫分型。
41.图2为实施例2急性淋巴细胞白血病患者骨髓细胞免疫分型。
42.图3为实施例3急性髓系白血病患者骨髓细胞免疫分型。
43.图4为实施例4骨髓增生异常综合征患者骨髓细胞免疫分型。
44.图5为实施例5多发性骨髓瘤患者骨髓细胞免疫分型。
具体实施方式
45.下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
46.以下实施例涉及的抗体如表1所示：
47.表1
[0048][0049]
其中，编号1、3、12、14、17、23、26、34、38的ccd3、cigm、mpo、lambda、lactoferrin、kappa、lysozyme、cd79a、tdt抗体为胞内抗体，其它为胞外抗体。
[0050]
实施例1健康人骨髓细胞免疫分型
[0051]
1)、准备新鲜健康人的骨髓，去除成熟红细胞。
[0052]
2)、取1-3x10^6个细胞，用pbs重悬，调节体积至1ml，加入50ul-1ml 194pt(0.1-1μm)，室温染色2min，区分细胞死活。
[0053]
3)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入50ul封闭液，冰上封闭20min，其中，封闭液由0.5μl人免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份人免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul小鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份小鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul大鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份大鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul仓鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份仓鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)和48ul牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)组成。
[0054]
4)、加入50ul胞外抗体混合液(表1中34种胞外抗体各0.5μl，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)33ul)，重悬细胞，冰上染色30min。
[0055]
5)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入含有0.5v/v
‰
单细胞指示剂191/193ir的固定-破膜溶液1ml，重悬细胞，4℃过夜。
[0056]
6)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清；对照组加入50ul固定-破膜溶液作为空白对照，实验组加入50ul胞内抗体混合液(表1中9种胞内抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)45.5ul)，重悬细胞，冰上放置30min。
[0057]
7)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0058]
8)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0059]
9)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0060]
10)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0061]
11)、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
[0062]
分析结果如图1所示，使用lysozyme和lactoferrin作图，该骨髓样本分为三群，其中lactoferrin 和lysozyme 的细胞群为成熟粒细胞亚群，表达成熟粒细胞标志cd33，cd11b，cd15；lactoferrin中等强度，lysozyme 的细胞群为单核细胞亚群，表达单核细胞标志cd14，cd64；lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群为有核红细胞亚群和淋巴细胞亚群。使用cd45对lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群进行下一级圈门，得到cd45 的淋巴细胞亚群和cd45-的有核红细胞亚群。使用cd19和cd3对cd45 淋巴细胞进行分群，得到cd3 cd19-的t细胞，cd3-cd19 的b细胞，以及cd3-cd19-的nk细胞。
[0063]
实施例2急性淋巴细胞白血病患者骨髓细胞免疫分型
[0064]
1)、准备新鲜急性淋巴细胞白血病患者的骨髓，去除成熟红细胞。
[0065]
2)、取1-3x10^6个细胞，用pbs重悬，调节体积至1ml，加入50ul-1ml 194pt(0.1-1μm)，室温染色2min，区分细胞死活。
[0066]
3)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入50ul封闭液，冰上封闭20min，其中，封闭液由0.5ul人免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份人免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul小鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份小鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul大鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份大鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul仓鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份仓鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)和48ul牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)组成。
[0067]
4)、加入50ul胞外抗体混合液(表1中34种胞外抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)33ul)，重悬细胞，冰上染色30min。
[0068]
5)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入含有0.5v/v
‰
单细胞指示剂191/193ir的固定-破膜溶液1ml，重悬细胞，4℃过夜。
[0069]
6)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清；对照组加入50ul固定-破膜溶液作为空白对照，实验组加入50ul胞内抗体混合液(表1中9种胞内抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)45.5ul)，重悬细胞，冰上放置30min。
[0070]
7)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0071]
8)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0072]
9)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0073]
10)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0074]
11)、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
[0075]
分析结果如图2所示，使用lysozyme和lactoferrin作图，该骨髓样本分为三群，其中lactoferrin 和lysozyme 的细胞群为成熟粒细胞亚群；lactoferrin中等强度，lysozyme 的细胞群为单核细胞亚群；lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群为异常细胞亚群和淋巴细胞亚群。使用cd45对lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群进行下一级圈门，得到cd45 的淋巴细胞亚群、cd45弱阳性的异常细胞亚群。该异常细胞表达cd34，cd117，hla-dr，cd19。
[0076]
实施例3急性髓系白血病患者骨髓细胞免疫分型
[0077]
1)、准备新鲜急性髓系白血病患者的骨髓，去除成熟红细胞。
[0078]
2)、取1-3x10^6个细胞，用pbs重悬，调节体积至1ml，加入50ul-1ml 194pt(0.1-1μm)，室温染色2min，区分细胞死活。
[0079]
3)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入50ul封闭液，冰上封闭20min，其中，封闭液由0.5ul人免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份人免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul小鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份小鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul大鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份大鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul仓鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份仓鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)和48ul牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)组成。
[0080]
4)、加入50ul胞外抗体混合液(表1中34种胞外抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)33ul)，重悬细胞，冰上染色30min。
[0081]
5)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入含有0.5v/v
‰
单细胞指示剂191/193ir的固定-破膜溶液1ml，重悬细胞，4℃过夜。
[0082]
6)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清；对照组加入50ul固定-破膜溶液作为空白对照，实验组加入50ul胞内抗体混合液(表1中9种胞内抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)45.5ul)，重悬细胞，冰上放置30min。
[0083]
7)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0084]
8)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0085]
9)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0086]
10)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0087]
11)、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
[0088]
分析结果如图3所示，使用lysozyme和lactoferrin作图，该骨髓样本分为三群，其中lactoferrin 和lysozyme 的细胞群为成熟粒细胞亚群；lactoferrin中等强度，lysozyme 的细胞群为单核细胞亚群；lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群为有核红细胞亚群、异常细胞亚群和淋巴细胞亚群。使用cd45对lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群进行下一级圈门，得到cd45 的淋巴细胞亚群、cd45弱阳性的异常细胞亚群以及cd45阴性的有核红细胞亚群。该异常细胞表达cd34，cd117，hla-dr，cd33，cd13，cd123。
[0089]
实施例4骨髓增生异常综合征(mds)患者骨髓细胞免疫分型
[0090]
1)、准备新鲜骨髓增生异常综合征患者的骨髓，去除成熟红细胞。
[0091]
2)、取1-3x10^6个细胞，用pbs重悬，调节体积至1ml，加入50ul-1ml 194pt(0.1-1μm)，室温染色2min，区分细胞死活。
[0092]
3)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入50ul封闭液，冰上封闭20min，其中，封闭液由0.5ul人免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份人免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul小鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份小鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul大鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份大鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul仓鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份仓鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)和48ul牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)组成。
[0093]
4)、加入50ul胞外抗体混合液(表1中34种胞外抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)33ul)，重悬细胞，冰上染色30min。
[0094]
5)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入含有0.5v/v
‰
单细胞指示剂191/193ir的固定-破膜溶液1ml，重悬细胞，4℃过夜。
[0095]
6)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清；对照组加入50ul固定-破膜溶液作为空白对照，实验组加入50ul胞内抗体混合液(表1中9种胞内抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)45.5ul)，重悬细胞，冰上放置30min。
[0096]
7)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0097]
8)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0098]
9)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0099]
10)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0100]
11)、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
[0101]
分析结果如图4所示，使用lysozyme和lactoferrin作图，该骨髓样本分为三群，其中lactoferrin 和lysozyme 的细胞群为成熟粒细胞亚群；lactoferrin中等强度，lysozyme 的细胞群为单核细胞亚群；lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群为异常细胞亚群和淋巴细胞亚群。使用cd45对lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群进行下一级圈门，得到cd45 的淋巴细胞亚群、cd45弱阳性的异常细胞亚群。该异常细胞表达cd33，cd15，cd13，cd11b，cd19，cd64。
[0102]
实施例5多发性骨髓瘤患者骨髓细胞免疫分型
[0103]
1)、准备新鲜多发性骨髓瘤患者的骨髓，去除成熟红细胞。
[0104]
2)、取1-3x10^6个细胞，用pbs重悬，调节体积至1ml，加入50ul-1ml 194pt(0.1-1μ
m)，室温染色2min，区分细胞死活。
[0105]
3)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入50ul封闭液，冰上封闭20min，其中，封闭液由0.5ul人免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份人免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul小鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份小鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul大鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份大鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)、0.5ul仓鼠免疫球蛋白溶液(包括15～25质量份仓鼠免疫球蛋白、0.15～0.25质量份叠氮化钠、0.75～1.25体积份磷酸盐缓冲液)和48ul牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)组成。
[0106]
4)、加入50ul胞外抗体混合液(表1中34种胞外抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)33ul)，重悬细胞，冰上染色30min。
[0107]
5)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，500g/5min离心，吸除上清，加入含有0.5v/v
‰
单细胞指示剂191/193ir的固定-破膜溶液1ml，重悬细胞，4℃过夜。
[0108]
6)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清；对照组加入50ul固定-破膜溶液作为空白对照，实验组加入50ul胞内抗体混合液(表1中9种胞内抗体各0.5ul，各抗体浓度为0.1-1μg/μl，及牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)45.5ul)，重悬细胞，冰上放置30min。
[0109]
7)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0110]
8)、加入2ml牛血清白蛋白溶液(包括375～625质量份牛血清白蛋白、15～25质量份叠氮化钠、75～125体积份磷酸盐缓冲液)，800g/5min离心，吸除上清。
[0111]
9)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0112]
10)、加入2ml去离子水，800g/5min离心，吸除上清。
[0113]
11)、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
[0114]
分析结果如图5所示，使用lysozyme和lactoferrin作图，该骨髓样本分为三群，其中lactoferrin 和lysozyme 的细胞群为成熟粒细胞亚群；lactoferrin中等强度，lysozyme 的细胞群为单核细胞亚群；lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群为异常细胞亚群和淋巴细胞亚群。使用cd45对lactoferrin和lysozyme低表达的细胞群进行下一级圈门，得到cd45 的淋巴细胞亚群、cd45阴性的异常细胞亚群。该异常细胞表达cd38，cd138，kappa，cd20；而cd56，cd45阴性。