一种大米中硒形态的分析检测方法与流程

1.本发明涉及食品成分分析技术领域，具体涉及一种大米中硒形态的分析检测方法。


背景技术：

2.硒是人体生命活动中必需的微量元素之一，有机硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等大分子硒，以及硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代乙硫氨酸等小分子硒化物。目前，大米中的有机形态的硒，如硒蛋白、硒代氨基酸、硒多肽和硒多糖在人体内转变为生理活性物质，为人体所吸收利用。
3.目前，用于大米中硒的检测方法有原子荧光光谱法(afs)、原子吸收光谱法(aas)和电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)等方法，在食品硒测定的国家标准中，gb 5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》在旧国标的基础上增加了icp-ms法为第三法，以及gb 5009.268-2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》第一法采用icp-ms法，与两种分光光度法和电感耦合等离子体发射光谱法(icp-oes)相比，具有更快速、灵敏和试剂毒性低等优点。
4.然而，根据以上检测技术的不同，大米中的有机形态的硒经过消解的样品可直接进行总硒测定，多以总硒含量-无机硒含量＝有机硒含量，测定过程较为繁琐，只能获得总有机硒含量，无法直接获得具体不同形态的有机硒的含量。
5.同时，以上现有的检测方法，由于硒的第一电离能较高(i1＝9.75ev)使得离子化效率相对较低，且存在多种多原子离子的干扰，如
40
ar
36
ar

对
76
se、
40
ar
38
ar

对
78
se、
40
ar
37
ar

对
77
se、
37
cl
37
cl

对
74
se及
81
br1h对
82
se等，这些多原子离子的干扰降低了icp-ms技术对硒测定的灵敏度与准确度，无法实现大米中硒形态的完全分离和在线测定。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明解决现有的分析检测方法在测定大米中硒形态时，灵敏度与准确度低，导致难以实现大米中硒形态的完全分离和在线测定的情况的问题。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种大米中硒形态的分析检测方法，包括以下步骤：
8.取大米，对所述大米进行总硒消解制样，若总硒消解制样后的所述大米为富硒大米，则对大米进行粉碎制样，得到大米样品；
9.将用于酶解的提取液对所述大米样品进行酶解处理，得到大米硒形态分析样液；
10.采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪对所述大米硒形态分析样液进行定性和定量分析，分析出大米中的硒形态。
11.优选的，所述总硒消解制样的方法采用微波消解法、湿法消解或高压消解法中的一种。
12.优选的，所述提取液由纯水、胰蛋白酶、蛋白酶k和链蛋白酶混合制成。
13.优选的，按质量份数计，所述提取液中的组分为：
14.纯水：22-28份；胰蛋白酶：8-12份；蛋白酶k：8-12份；链蛋白酶8-12 份。
15.优选的，所述酶解处理的具体步骤为：将所述提取液加入所述大米样品中，采用40℃-65℃的温度进行水浴振荡4h-6h。
16.优选的，所述高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪采用加氧模式se(m/z 80-》96)，色谱柱为hamilton prp-x100分析柱，流动相为ph5.0 的5mmol/l的柠檬酸溶液。
17.优选的，所述高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪使用的具体参数值为：
18.射频功率为1550w，射频电压为1.30v，采样深度为8.0-10.0mm，载气流速为0.77-1.07l/min，氧气比例为10％-30％，氦气流速为2-5l/min，碰撞模式为o2，检测元素为
78
se和
80
se，质量迁移为
78
se
16
o(m/z 78-》94)，
80
se
16
o (m/z 80-》96)。
19.优选的，所述定性和定量分析的时间为15-20分钟。
20.优选的，所述高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪的具体的操作方法为：
21.所述大米硒形态分析样液经hplc液相分离，进入电感耦合等离子体串联质谱仪雾化器雾化，雾化后的样液经高压电离成等离子体；
22.等离子体经锥孔进入第一级四级杆q1进行第一步质量筛选，筛出的等离子体进入碰撞池，碰撞池通入氧气m/z＝16，进行碰撞反应；
23.碰撞反应后的离子经第二级四级杆q2进行第二步质量筛选，进行质量迁移，筛出符合的等离子体。
24.与现有技术相比，本方案产生的有益效果是：
25.通过提取液对所述大米样品进行酶解后得到大米硒形态分析样液，再采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪对大米硒形态分析样液进行定性和定量分析，能够实现在一次进样中实现大米中的硒形态的完全分离和在线测定，能够满足快速准确检测出大米中secys2、mesecys、se(iv)、semet 和se(vi)的含量。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
27.图1为本发明一种大米中硒形态的分析检测方法中使用的微波消解法的程序表；
28.图2为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的5种混合硒形态的标准溶液配制表；
29.图3为实施例2中的方法对大米进行分析检测中混合硒形态的标准溶液配制表；
30.图4为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的semet-硒代蛋氨酸的检出限和精密度的检测表；
31.图5为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的secys
2-硒代胱氨酸的检出限和精密度的检测表；
32.图6为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的me-secys-甲基硒代半胱氨酸的
检出限和精密度的检测表；
33.图7为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的se(iv)-亚硒酸根的检出限和精密度的检测表；
34.图8为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的se(vi)-硒酸根的检出限和精密度的检测表；
35.图9为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的5种硒形态的完整时间范围的离子流图；
36.图10为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的5种硒形态的完整时间范围的保留时间图；
37.图11为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的secys2单标定位图；
38.图12为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的mesecys单标定位图；
39.图13为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的se(iv)单标定位图；
40.图14为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的semet单标定位图；
41.图15为实施例2中的方法对大米进行分析检测出的se(vi)单标定位图；
42.图16为本发明一种大米中硒形态的分析检测方法中高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪的操作流程图；
43.图17为本发明中使用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪的不同模式的检测效果对比图。
具体实施方式
44.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
45.实施例1
46.一种大米中硒形态的分析检测方法，包括以下步骤：
47.步骤一、取大米，对大米进行总硒消解制样，若总硒消解制样后的大米为富硒大米，则对大米进行粉碎制样，得到大米样品。
48.本步骤中，请一并参阅表1，选取的大米的重量可为0.5g；同时，采用微波消解法对大米进行消解制样，得到消解制样后的大米样液50ml。从而通过大米样液能够确认选取的大米是否为富硒的大米。其中，微波消解法也可替换为湿法消解或高压消解法。
49.步骤二、将用于酶解的提取液对大米样品进行酶解处理，得到大米硒形态分析样液。
50.本步骤中，提取液由纯水、胰蛋白酶、蛋白酶k和链蛋白酶混合制成。
51.其中，按质量份数计，提取液中的组分为：
52.纯水：22份；胰蛋白酶：12份；蛋白酶k：8份；链蛋白酶12份。即提取液中具体的组分为纯水：22ml，胰蛋白酶：12mg；蛋白酶k：8mg；链蛋白酶12mg。
53.其中，酶解处理的具体步骤为：将提取液加入大米样品中，采用40℃的温度进行水浴振荡6h。
54.步骤三、采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪对大米硒形态分
析样液进行定性和定量分析，分析出大米中的硒形态。
55.本步骤中，请一并参阅图9，高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪具体选用安捷伦8900电感耦合等离子体串联质谱仪。
56.同时，高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪采用加氧模式se (m/z 80-》96)，色谱柱为hamilton prp-x100分析柱，流动相为ph5.0的 5mmol/l的柠檬酸溶液。
57.高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪使用的具体参数值为：
58.射频功率为1550w，射频电压为1.30v，采样深度为8.0-10.0mm，载气流速为0.77-1.07l/min，氧气比例为10％-30％，氦气流速为2-5l/min，碰撞模式为o2，检测元素为
78
se和
80
se，质量迁移为
78
se
16
o(m/z 78-》94)，
80
se
16
o (m/z 80-》96)。
59.请一并参阅图8，高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪的具体的操作方法为：
60.大米硒形态分析样液经hplc液相分离，进入电感耦合等离子体串联质谱仪雾化器雾化，雾化后的样液经高压电离成等离子体，等离子体经锥孔进入第一级四级杆q1进行第一步质量筛选m/z＝78，筛选出的质量数离子进入碰撞池，碰撞池通入氧气m/z＝16，进行碰撞反应，未被筛选，则直接筛出。
61.同时，碰撞反应后的离子经第二级四级杆q2进行第二步质量筛选m/z＝94，进行质量迁移，筛出不符合的质量数离子，消除干扰；同时，没被筛出的质量数离子不进入q2系统。从而得出高灵敏度的等离子体。通过高效液相色谱
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电感耦合等离子体串联质谱联用仪采用加氧模式，检测出的计数值(cps)和浓度值均更灵敏。
62.同时，使用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪 (hplc-icp-ms/ms)进行定性和定量分析的时间为15分钟。
63.实施例2
64.在实施例1的基础上，请参阅图1-图17，本实施例与实施例1的区别如下：
65.步骤二中，按质量份数计，提取液中的组分为：
66.纯水：22份；胰蛋白酶：12份；蛋白酶k：8份；链蛋白酶12份。即提取液中具体的组分为纯水：25ml，胰蛋白酶：10mg；蛋白酶k：10mg；链蛋白酶10mg。使用以上的提取液能够更快的对大米进行酶解。
67.其中，酶解处理的具体步骤为：将提取液加入大米样品中，采用60℃的温度进行水浴振荡4.5h。
68.步骤五中，使用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪进行定性和定量分析的时间为18分钟。
69.实施例3
70.在实施例1的基础上，本实施例与实施例1的区别如下：
71.步骤二中，按质量份数计，提取液中的组分为：
72.纯水：28份；胰蛋白酶：8份；蛋白酶k：12份；链蛋白酶8份。即提取液中具体的组分为纯水：28ml，胰蛋白酶：8mg；蛋白酶k：12mg；链蛋白酶8mg。使用以上的提取液能够更快的对大米进行酶解。
73.其中，酶解处理的具体步骤为：将提取液加入大米样品中，采用65℃的温度进行水浴振荡4h。
74.步骤五中，高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪的具体的操作方法为：
75.大米硒形态分析样液经hplc液相分离，进入电感耦合等离子体串联质谱仪雾化器雾化，雾化后的样液经高压电离成等离子体，等离子体经锥孔进入第一级四级杆q1进行第一步质量筛选m/z＝80，筛选出的质量数离子进入碰撞池，碰撞池通入氧气m/z＝16，进行碰撞反应，没被筛选直接筛出。
76.同时，碰撞反应后的离子经第二级四级杆q2进行第二步质量筛选m/z＝96，进行质量迁移，筛出不符合的质量数离子，消除干扰；同时，没被筛出的质量数离子不进入q2系统。从而得出高灵敏度的等离子体。
77.使用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪进行定性和定量分析的时间为20分钟。
78.通过以上的实施例1-实施例3，使用提取液对大米样品进行酶解后得到大米硒形态分析样液，再采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪 (hplc-icp-ms/ms)对大米硒形态分析样液进行定性和定量分析，能够在一次进样中实现大米中5中硒形态的完全分离和在线测定，能够满足快速和准确的检测出大米中5中硒形态包括secys2、mesecys、se(iv)、semet、和se(vi) 的含量。
79.通过以上实施例2中的分析检测方法对大米进行分析检测，结论如下：
80.检测的结果见图1至图8，得出secys2、mesecys、se(iv)、semet和 se(vi)检出限分别为(0.002，0.004，0.005，0.002，0.001)mg/kg。曲线范围： 0-20μg/l。
81.通过图9至图17，可得，通过本方法的线性范围相关系数r值在 0.9996-1.000之间，线性范围好，精密度高。从而实现能够在一次进样中实现完全分离和在线测定，能够满足快速准确检测secys2、mesecys、se(iv)、 semet、和se(vi)的含量。
82.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。